[0035] 可如他處所述進(jìn)行用于選擇內(nèi)源性目標(biāo)序列和生成靶向這類序列的TALE-核酸 酶的方法。參見例如，PCT公開號(hào)WO 2011/072246,其通過引用全文納入本文。在一些實(shí)施 方式中，可使用特異識(shí)別TALE-核酸酶識(shí)別位點(diǎn)的軟件例如（Doyle等，Nucleic Acids Res 40:W117-122, 2012)〇
[0036] 轉(zhuǎn)錄活化樣（TAL)效應(yīng)子發(fā)現(xiàn)于黃單胞菌屬（Xanthomonas)中的植物病原性細(xì)菌 中。這些蛋白質(zhì)通過結(jié)合宿主DNA并激活效應(yīng)器特異性宿主基因在疾病或觸發(fā)防衛(wèi)方面起 重要作用（參見例如，Gu 等，Nature 435:1122-1125, 2005 ;Yang 等，？1〇(3.恥七1.4〇3(1.5(^. USA 103:10503-10508, 2006 ;Kay 等，Science 318:648-651，2007 ;Sugio 等，Proc. Natl. Acad.Sci.USA104:10720-10725, 2007 ;和Rfmier等，Science318:645-648, 2007)。特異 性取決于效應(yīng)子-可變不完善數(shù)目（effector-variable number of imperfect)，通常是34 個(gè)氨基酸重復(fù)（Schornack 等，J. Plant Physiol. 163:256-272,2006 ;和 TO 2011/072246)。 多態(tài)性主要發(fā)生在重復(fù)位置12和13,本文將其稱為重復(fù)可變雙殘基（RVD)。
[0037] TAL效應(yīng)子的RVD以直接、線性形式對(duì)應(yīng)于其靶位點(diǎn)的核苷酸，一種RVD對(duì)應(yīng)于一 種核苷酸，有一些簡并性且沒有明顯的環(huán)境依賴性。該蛋白質(zhì)-DNA識(shí)別機(jī)制能針對(duì)新的靶 標(biāo)特異性TAL效應(yīng)子進(jìn)行靶位點(diǎn)預(yù)測(cè)，以及靶位點(diǎn)選擇和對(duì)與所選位點(diǎn)具有結(jié)合特異性的 新TAL效應(yīng)子進(jìn)行工程改造。
[0038] TAL效應(yīng)子DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域可與其他序列（如核酸內(nèi)切酶序列）融合，生成靶向特 定、經(jīng)選擇的DNA序列的嵌合核酸內(nèi)切酶并導(dǎo)致在被靶向的序列處或附近的后續(xù)DNA切割。 DNA中的這類切割（即雙鏈斷裂）可通過例如NHEJ或同源重組在野生型DNA序列中誘導(dǎo)突 變。在一些情況下，TALE-核酸酶可用于促進(jìn)復(fù)雜基因組中的定點(diǎn)誘變，高度準(zhǔn)確且高效地 敲除或改變基因功能。如下文實(shí)施例所述，靶向馬鈴薯VInv基因的TALE-核酸酶可用于誘 變內(nèi)源性基因，生成不具有VInv的可檢測(cè)表達(dá)的植物。可使用一些內(nèi)切核酸酶（如FokI) 以二聚物形式起作用的現(xiàn)象來提高TALE-核酸酶的靶標(biāo)特異性。例如，在一些情況下，可使 用靶向不同DNA序列的一對(duì)TALE-核酸酶單體（如圖1中所示帶下劃線的靶序列）。當(dāng)兩 個(gè)TALE-核酸酶識(shí)別位點(diǎn)緊鄰時(shí)，如圖1所示，無活性的單體可聚集在一起以生成切割DNA 的功能性酶。通過需要DNA結(jié)合來激活核酸酶，可建立高度位點(diǎn)特異性的限制性酶。
[0039] 使用TALE-核酸酶來生成在內(nèi)源性基因中具有突變的馬鈴薯植物、植物細(xì)胞或植 物部分的方法包括，例如，本文實(shí)施例中所述的那些。例如，可將一種或多種編碼靶向所選 VInv序列（如圖1所示的VInv序列）的TALE-核酸酶的核酸轉(zhuǎn)化至植物細(xì)胞（如原生質(zhì) 體）中，該核酸在其中表達(dá)。在一些情況中，可將一種或多種TALE-核酸酶蛋白導(dǎo)入植物細(xì) 胞（例如原生質(zhì)體）。隨后可以例如如上文所述通過基于核酸的試驗(yàn)或基于蛋白質(zhì)的試驗(yàn) 檢測(cè)表達(dá)水平，或者使用基于核酸的試驗(yàn)（例如PCR和DNA測(cè)序，或PCR之后的T7E1試驗(yàn)； Mussolino等，Nucleic Acids Res. 39:9283-9293, 2011)檢測(cè)基因組基因座處的突變，從而 對(duì)細(xì)胞或細(xì)胞生成的植物細(xì)胞系或植物部分進(jìn)行后續(xù)分析以確定是否已將突變導(dǎo)入靶位 點(diǎn)。在T7E1試驗(yàn)中，可從匯集的愈傷組織中分離基因組DNA，并可對(duì)VInv的TALE-核酸酶 識(shí)別位置的側(cè)接序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增。然后擴(kuò)增產(chǎn)品可變性或重新退火。若所述重新退火的 片段形成異源雙鏈體，則T7內(nèi)切核酸酶I在錯(cuò)配位置進(jìn)行切割?？赏ㄟ^凝膠電泳觀察消化 的產(chǎn)物，以定量TALE-核酸酶的誘變活性。
[0040] 近期，已基于II型原核CRISPR(成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列）適應(yīng)性 免疫系統(tǒng)的RNA-引導(dǎo)的Cas9核酸酶開發(fā)新的基因組工程改造工具（參見例如，Belahj 等，Plant Methods 9:39, 2013)。本系統(tǒng)可用于切割側(cè)接有短序列基序（稱為前間區(qū)序列 鄰近基序（PAM))的DNA序列。通過工程改造與靶序列互補(bǔ)的特異crRNA來實(shí)現(xiàn)切割，其可 與釀膿鏈球菌（S. pyogenes)中異源表達(dá)的內(nèi)切核酸酶Cas9關(guān)聯(lián)入活細(xì)胞。crRNA/Cas9復(fù) 合物中，雙tracrRNA:crRNA結(jié)構(gòu)作為引導(dǎo)RNA將內(nèi)切核酸酶Cas9導(dǎo)向關(guān)聯(lián)的靶序列。由 于Vinv基因的核苷酸序列中存在數(shù)種PAM基序，可將對(duì)Vinv基因特異的crRNA設(shè)計(jì)為在 轉(zhuǎn)染有并表達(dá)Cas9內(nèi)切核酸酶和crRNA的茄屬植物細(xì)胞內(nèi)的全部或部分Vinv等位基因引 入突變或使其失活。本方法在一些示例中可用作TALE核酸酶的替代，從而獲得本文所述的 植物。
[0041] 本文還涵蓋可引入其他茄屬基因中的突變，從而例如：
[0042] -通過改良天冬酰胺合成中涉及的基因表達(dá)進(jìn)一步降低丙烯酰胺；
[0043] -通過降低多酚氧化酶-5的表達(dá)來防止黑點(diǎn)瘀青；
[0044] -通過降低elF4E基因表達(dá)防止馬鈴薯病毒Y ;
[0045] _防止晚疫?。换?br>[0046] -改善線蟲、除草劑或昆蟲抗性。
[0047] 因此，本文所述方法可用于獲得茄屬特性疊加的基因。
[0048] 本文還提供用馬鈴薯植物品種生產(chǎn)食品產(chǎn)品的方法以及該方法生產(chǎn)的食品產(chǎn)品， 所述馬鈴薯植物品種具有降低的CIS。本文提供的方法可包括例如提供或制備馬鈴薯植物 或植物部分，所述植物或植物部分在兩個(gè)或更多內(nèi)源Vinv等位基因中含TALE-核酸誘導(dǎo)的 突變并經(jīng)歷冷儲(chǔ)存；以及使用標(biāo)準(zhǔn)烹飪和/或生產(chǎn)方法從所述植物或植物部分生產(chǎn)食品產(chǎn) 品（包括但不限于薯片、油炸薯?xiàng)l、馬鈴薯薄片和土豆泥）。在一些實(shí)施方式中，CIS降低可 表現(xiàn)為其苦味和/或深色素與對(duì)照植物或植物部分生產(chǎn)的食品產(chǎn)品中觀察到的苦味和/或 深色素相比減少，所述對(duì)照植物或植物部分不含突變的Vinv等位基因并且經(jīng)歷冷儲(chǔ)存。在 一些實(shí)施方式中，所述食品產(chǎn)品（例如用本發(fā)明方法如烹飪植物或植物部分生產(chǎn)的食品產(chǎn) 品）的丙烯酰胺水平與內(nèi)源Vinv等位基因中不具有突變且經(jīng)歷冷儲(chǔ)存的馬鈴薯植物或植 物部分所生產(chǎn)的食品產(chǎn)品中的丙烯酰胺水平相比降低。在一些情況匯總，該食品產(chǎn)品的丙 烯酰胺水平與不經(jīng)歷冷儲(chǔ)存的馬鈴薯植物或植物部分所生產(chǎn)的食品產(chǎn)品中的丙烯酰胺水 平相當(dāng)。
[0049] 以下實(shí)施例進(jìn)一步描述了本發(fā)明，這些實(shí)施例并不限制權(quán)利要求書所述的本發(fā)明 范圍。 實(shí)施例
[0050] 實(shí)施例1-工稈改誥序列特異的核酸酶以誘奪Vinv基_
[0051] 為使馬鈴薯中Vinv基因的等位基因完全失活或敲除，設(shè)計(jì)了序列特異性核酸 酶，其靶向起始密碼子附近的蛋白質(zhì)編碼區(qū)。使用特異識(shí)別TALE-核酸酶識(shí)別位點(diǎn)的軟 件設(shè)計(jì)三種TALE-核酸酶對(duì)以在編碼序列的前200bp內(nèi)靶向Vinv基因家族。Vinv基因 的TALE核酸酶識(shí)別位點(diǎn)在圖1中帶下劃線并列于表1。使用與他處所述的那些方法類似 的方法合成 TALE 核酸酶（Cermak 等，Nucleic Acids Res. 39:e82, 2011 ;Reyon 等，Nat. Biotechnol. 30:460-465, 2012 ;和 Zhang 等，Nat. Biotechnol. 29:149-153, 2011) 〇
[0052] 實(shí)施例2-酵母中VinvTALE-核酸酶活件
[0053] 為評(píng)估革El向VInv基因的TALE-核酸酶的活性，通過與他處所述方法（Christian 等，Genetics 186:757-761,2010)類似的方法在酵母中進(jìn)行活性試驗(yàn)。對(duì)于這些試驗(yàn)，構(gòu) 建靶質(zhì)粒，其中將TALE-核酸酶識(shí)別位點(diǎn)克隆至非功能性半乳糖苷酶報(bào)告基因中。靶 位點(diǎn)側(cè)接0 _半乳糖苷酶編碼序列的直接重復(fù)，從而如果報(bào)告基因被TALE-核酸酶切割，則 在直接重復(fù)之間會(huì)發(fā)生重組并修復(fù)半乳糖苷酶基因的功能。因此，半乳糖苷酶活 性被用于測(cè)量TALE-核酸酶切割活性。
[0054] 在酵母試驗(yàn)中，所有VInv TALE-核酸酶對(duì)（VInv_T01、VInv_T02和VInv_T03)在兩 種不同溫度條件（即37°C和30°C )下具有高切割活性。將切割活性對(duì)基準(zhǔn)核酸酶I-Scel 進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。結(jié)果總結(jié)在表2中。
[0055] 實(shí)施例3-馬鈐薯中VInvTALE-核酸酶在其內(nèi)源靶位詈的活件
[0056] 通過在原生質(zhì)體中表達(dá)TALE-核酸酶并研究TALE-核酸酶靶位點(diǎn)的通過NHEJ 導(dǎo)入的突變，來測(cè)量馬鈴薯中內(nèi)源性靶位點(diǎn)處TALE-核酸酶活性。原生質(zhì)體制備的方 法如他處所述進(jìn)行（Shepard, Genetic Improvement of Crops/Emergent Techniques 《作物/新興技術(shù)的遺傳改良》（185-219頁），Rubenstein，Gengenbach，Philips, 和Green(編輯）