重組植物細胞、其制備方法以及用其生產(chǎn)靶蛋白質(zhì)的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及表達靶蛋白質(zhì)的植物細胞、其制備方法和用其生產(chǎn)靶蛋白質(zhì)的方法。 此外，本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)入包含靶蛋白質(zhì)編碼基因的載體的植物細胞、其生產(chǎn)方法和通過該植 物細胞大規(guī)模生產(chǎn)靶蛋白質(zhì)的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 此處使用的術(shù)語"生物制藥"指的是從生物材料生產(chǎn)的藥物。更廣義的，該術(shù)語可 指基于生物基因工程技術(shù)生產(chǎn)的藥物，包括遺傳重組、細胞融合和細胞培養(yǎng)等先進的生物 技術(shù)。這樣的生物制藥分為蛋白藥物、治療抗體、疫苗、基因治療藥劑和細胞治療藥劑。
[0003] 最近，使用真核宿主細胞如動物細胞或昆蟲細胞或者通過微生物如酵母或細菌已 生產(chǎn)出大多數(shù)重組蛋白。然而，培養(yǎng)這樣的動物細胞的缺點在于培養(yǎng)基昂貴，被可傳染人 類的病毒污染的可能性高，以及需要清除可能被引入的牛血清來源蛋白質(zhì)的分離純化工藝 (Huang 和 McDonald 2009)。
[0004] 由于這個原因，植物細胞培養(yǎng)作為生產(chǎn)重組蛋白的替代體系最近受到關(guān)注。植物 細胞被看作安全的生產(chǎn)體系，因為這些植物細胞不被病毒或動物源病原體感染而且沒有整 合動物源材料的可能性。
[0005] 然而，相比于包括動物細胞的其他宿主細胞的培養(yǎng)，植物細胞培養(yǎng)顯示出相對低 的蛋白表達水平和低生長速度。因此，對于植物來源生物制藥學(xué)的商業(yè)化，需要開發(fā)通過培 養(yǎng)新植物細胞來生產(chǎn)重組蛋白的新體系。
[0006]
【背景技術(shù)】部分公開的信息僅在于增強對于本發(fā)明背景的理解，因此不包含對于本 領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的構(gòu)成現(xiàn)有技術(shù)的信息。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 技術(shù)問題
[0008] 本發(fā)明的目的在于提供具有優(yōu)異的大規(guī)模生產(chǎn)能力的生產(chǎn)靶蛋白質(zhì)的方法。
[0009] 技術(shù)方案
[0010] 為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種用于表達靶蛋白質(zhì)的植物細胞，其中該植物 細胞包括含有轉(zhuǎn)入靶蛋白質(zhì)編碼基因的重組載體，其中該植物細胞包含形成層分生組織細 胞（CMC)或愈傷組織，其中形成層分生組織細胞（CMC)是一類包含分離自植物的固有未分 化的細胞的植物來源細胞系，并且其中該細胞系是分離自植物形成層組織并且具有不通過 脫分化成為愈傷組織的分生組織連續(xù)性。
[0011] 本發(fā)明還提供一種生產(chǎn)表達靶蛋白質(zhì)的植物細胞的方法，該方法包括通過共培養(yǎng) 包含形成層分生組織細胞（CMC)或愈傷組織的植物細胞群與含有其中添加了編碼靶蛋白 質(zhì)基因的載體的農(nóng)桿菌，用靶蛋白編碼基因轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化包含形成層分生組織細胞（CMC)或 愈傷組織的植物細胞群的步驟，其中形成層分生組織細胞（CMC)是一類含有分離自植物的 固有未分化的細胞的細胞系，該細胞系是分離自植物形成層組織并且具有不通過脫分化成 為愈傷組織的分生組織連續(xù)性。
[0012] 本發(fā)明還提供一種通過表達靶蛋白質(zhì)的植物細胞來生產(chǎn)靶蛋白質(zhì)的方法，該方法 包含以下步驟：
[0013] (a)通過共培養(yǎng)包含形成層分生組織細胞（CMC)或愈傷組織的植物細胞群與含有 其中添加了編碼靶蛋白質(zhì)基因的載體的農(nóng)桿菌，用靶蛋白編碼基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)化包含形成層分 生組織細胞（CMC)或愈傷組織的植物細胞群或瞬時表達靶蛋白編碼基因，其中形成層分生 組織細胞（CMC)是一類包含分離自植物的固有未分化的細胞的細胞系，該細胞系是分離自 植物形成層組織并且具有不通過脫分化成為愈傷組織的分生組織的連續(xù)性；及
[0014] (b)從植物細胞培養(yǎng)物中回收靶蛋白質(zhì)，其中農(nóng)桿菌是通過共培養(yǎng)侵染。
[0015] 本發(fā)明還提供一種從表達靶蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)靶蛋白質(zhì)的方法，該方法包 括以下步驟：
[0016] (a)培育轉(zhuǎn)化有靶蛋白編碼基因的植物；
[0017] (b)從轉(zhuǎn)基因植物中分離轉(zhuǎn)基因形成層分生組織細胞（TCMC);
[0018] (c)在培養(yǎng)基中培養(yǎng)分離的轉(zhuǎn)基因形成層分生組織細胞（TCMC);和
[0019] (d)回收在培養(yǎng)的轉(zhuǎn)基因形成層分生組織細胞（TCMC)中表達的靶蛋白質(zhì)。
【附圖說明】
[0020] 圖1A是植物材料（番茄莖）的照片，和圖1B是示出誘導(dǎo)形成層分生組織細胞 (CMC)并且開始將它和源自其他組織的愈傷組織層分離的照片。
[0021] 圖2是一組示出在依據(jù)本發(fā)明的番茄形成層分生組織細胞（CMC ;圖2A)和番茄愈 傷組織（圖2B)中觀察細胞聚集程度的結(jié)果的顯微照片。
[0022] 圖3是示出依據(jù)本發(fā)明的番茄形成層分生組織細胞（CMC)和番茄愈傷組織各自的 生長速度的圖。
[0023] 圖4是示出綠色熒光蛋白（GFP)瞬時表達的照片，表明共培養(yǎng)5天后，農(nóng)桿菌侵染 了 90 %或更多的番茄形成層分生組織細胞（CMC)。
[0024] 圖5是示出與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)10天后，在野生高麗參形成層分生組織細胞（CMC)中 瞬時表達綠色熒光蛋白（GFP)的照片。
[0025] 圖6是示出與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)10天后，在胡蘿卜形成層分生組織細胞（CMC)中瞬時 表達綠色熒光蛋白（GFP)的照片。
[0026] 圖7是示出在紫外線下觀察的作為穩(wěn)定轉(zhuǎn)化到番茄形成層分生組織細胞（CMC)的 結(jié)果來表達GFP的團塊與未轉(zhuǎn)化的團塊的結(jié)果的照片。
[0027] 圖8是穩(wěn)定轉(zhuǎn)化GFP的番茄形成層分生組織細胞（CMC)的熒光顯微照片。
[0028] 圖9是一組示出通過連續(xù)傳代培養(yǎng)所篩選的簇來增殖GFP-表達細胞的結(jié)果照片， 其被確認發(fā)出熒光。
[0029] 圖10是一組示出進行沉淀和未進行沉淀的情況下，穩(wěn)定轉(zhuǎn)化到番茄形成層分生 組織細胞（CMC)或愈傷組織比較的照片。
[0030] 圖11是一組示出進行沉淀和未進行沉淀的情況下，穩(wěn)定轉(zhuǎn)化到胡蘿卜形成層分 生組織細胞（CMC)或愈傷組織比較的照片。
[0031] 圖12是一組示出進行沉淀和未進行沉淀的情況下，穩(wěn)定轉(zhuǎn)化到野生高麗參形成 層分生組織細胞（CMC)或愈傷組織比較的照片。
[0032] 圖13是示出在3升生物反應(yīng)器中，紫外線照射細胞培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因GFP番茄轉(zhuǎn)基因形 成層分生組織細胞（TCMC)后，表達GFP的結(jié)果的照片。
[0033] 圖14是示出馴化轉(zhuǎn)基因本氏煙草Nicotianabenthamiana并且在花盆中生長馴 化植物的結(jié)果的照片。
[0034]圖15是示出觀察收集的番茄莖的形態(tài)的結(jié)果的照片。
[0035]圖16是示出橫向截取轉(zhuǎn)化GFP的煙草植物并觀察的結(jié)果的照片。
[0036] 圖17是示出從轉(zhuǎn)基因本氏煙草Nicotiana benthamiana的形成層區(qū)域分離轉(zhuǎn)化 的形成層分生組織細胞（TCMC)的結(jié)果的照片。
[0037] 圖18是示出從轉(zhuǎn)基因Nicotiana tabacum cv. xanthi的形成層區(qū)域分離形成層 分生組織細胞（TCMC)的結(jié)果的照片。
[0038] 圖19是示出對于從轉(zhuǎn)基因GFP植物和分離自植物的形成層分生組織細胞（TCMC) 提取的總可溶蛋白質(zhì)的Western印跡分析結(jié)果的照片。
[0039] 用于實施發(fā)明的最佳方式
[0040] 除非另有定義，本發(fā)明使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本領(lǐng)域普通技術(shù)人員的 普通的理解相同的含義。一般地，本發(fā)明使用的系統(tǒng)命名法被本領(lǐng)域公知和普遍采用。
[0041] 表達靶蛋白質(zhì)的植物細胞轉(zhuǎn)入了含靶蛋白質(zhì)編碼基因的重組載體并且該植物細 胞包括形成層分生組織細胞（CMC)或愈傷組織。
[0042] 在一個實施方式中，植物細胞可以是轉(zhuǎn)入了含靶蛋白質(zhì)編碼基因的重組載體的轉(zhuǎn) 基因形成層分生組織細胞（TCMC)。
[0043] 本發(fā)明已經(jīng)發(fā)現(xiàn)將靶蛋白質(zhì)編碼基因?qū)胄纬蓪臃稚M織細胞（CMC)使克服由 現(xiàn)有技術(shù)中愈傷組織培養(yǎng)所引發(fā)的慢生長速度和低蛋白表達水平所帶來的問題成為可能。 另外，本發(fā)明已經(jīng)發(fā)現(xiàn)如果通過轉(zhuǎn)化植物形成層分生組織細胞（CMC)生產(chǎn)重組蛋白，其轉(zhuǎn) 化效率相對于之前已知的植物細胞顯著提高，從而可能顯著提高應(yīng)用靶蛋白的瞬時表達技 術(shù)進行重組蛋白的生產(chǎn)，并且可建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)化。
[0044] 此處，形成層分生組織細胞（CMC)是一類含分離自植物的固有未分化的細胞的細 胞系。該細胞系是分離自植物形成層組織并且具有不通過脫分化成為愈傷組織的分生組織 連續(xù)性。
[0045] 在本發(fā)明中，愈傷組織是通過利用損傷使已分化組織脫分化形成的無固定性狀的 細胞團塊。脫分化后，愈傷組織丟失其原有特性并且表現(xiàn)出未分化狀態(tài)。本發(fā)明中使用的 植物形成層分生組織細胞（CMC)不同于愈傷組織之處在于其不經(jīng)過脫分化而保留固有的 未分化狀態(tài)。
[0046]本發(fā)明的一些發(fā)明人首次從植物形成層分離植物形成層分生組織細胞（CMC)，其 不同于脫分化的愈傷組織而是固有的未分化細胞（KR 10-1064519B1)。這些植物形成層分 生組織細胞可通過包含以下步驟的方法分離：（a)從植物中收集包含形成層的組織；(b)在 培養(yǎng)基中培養(yǎng)所收集的包含形成層的組織；和（c)從培養(yǎng)的包含形成層的組織分離形成層 細胞，其既不包含形成層之外的部分也不包含源自形成層之外的愈傷組織。此處，步驟（a) 中的包含形成層的組織可以是滅菌的。
[0047] 這里使用的術(shù)語"載體"意為這樣的DNA構(gòu)建體，其包含有效地連接到可在合適宿 主中實現(xiàn)DNA表達的合適的調(diào)控序列的DNA。該載體可以是質(zhì)粒、噬菌體顆?；騼H是潛在的 基因組插入物。一旦整合進合適的宿主，該載體可復(fù)制并且獨立于宿主基因組發(fā)揮功能，或 者可能在某些情況下，整合進入宿主基因組。在本詳述中，"質(zhì)粒"和"載體"有時可互換使 用，因為質(zhì)粒是最常用的載體形式。
[0048] 為了本發(fā)明的目的，優(yōu)選使用質(zhì)粒載體。為了此目的使用的典型質(zhì)粒載體包含： (a)以每個宿主細胞產(chǎn)生幾百個質(zhì)粒載體的程度有效發(fā)生復(fù)制的復(fù)制起點；(b)可以選擇 轉(zhuǎn)化有質(zhì)粒載體的宿主細胞的抗生素抗性基因；和（c)可插入外源DNA片段的限制性酶切 位點。即使載體中不存在合適的限制性酶切位點，使用常規(guī)的合成的寡核苷酸連接物或接 頭也能夠容易地連接載體和外源DNA片段。連接后，載體應(yīng)該轉(zhuǎn)化到合適的宿主細胞中。轉(zhuǎn) 化可通過氯化I丐或電穿孔方法容易地實現(xiàn)（Neumann,etal.，EMBO J.，1:841，1982)。
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