0-1 :100的比例加入到50ml的YEP培養(yǎng)基中并在總24 小時內培養(yǎng)18小時，然后測量農桿菌培養(yǎng)物的0D值。將農桿菌培養(yǎng)物放在離心管中，使用 4°C離心將細胞旋轉下來。向收集到的農桿菌沉淀中加入番茄培養(yǎng)基（MS+2mg/L BA+0. lmg/ L NAA+pH 5. 8)，并且基于測量的農桿菌的0D值，將番茄培養(yǎng)基與農桿菌培養(yǎng)基混合，并向 其中添加10-200 yM乙酰丁香酮，之后在28°C以250rpm培養(yǎng)2小時。
[0191] 7-2 :番茄葉外棺體的制備
[0192] 抓住植物的葉柄用鑷子剝離下葉子并將其置于Petri培養(yǎng)皿中。使用刀制備包含 靠近葉柄的主葉脈部分約1. 〇cmx1. 0cm(~0. 5cmx0. 5cm)的外植體。
[0193] 7-3 :共培養(yǎng)
[0194] 分離陽性對照（PC)外植體，放置于共培養(yǎng)基（MS+2mg/L BA+0. lmg/L NAA+pH 5. 8+0. 8%瓊脂）上，然后在暗環(huán)境下于25°C培養(yǎng)7天。將實施例7-2中制備的外植體（排 除陽性對照）加入到實施例7-1制備的培養(yǎng)物中，以后浸沒20分鐘，期間間隔5分鐘溫柔 振蕩，從而用農桿菌接種外植體。取出外植體并且將其放在濾紙上除濕，之后將外植體放置 在共培養(yǎng)基（]^+211^/184+0.111^/1熟4+口115.8+0.8%瓊脂+100 1^43)上并在暗環(huán)境下 于25°C培養(yǎng)3天。
[0195] 7-4 :篩詵
[0196] 使用無菌水洗共培養(yǎng)的外植體3次并用濾紙干燥。從PC分離用做陰性對照（NC) 的外植體。將？(：放置在再生培養(yǎng)基（1^+211^/184+0.111^/1熟4+?115.8+0.8%瓊脂）上，將 %放置在篩選培養(yǎng)基〇\^+211^/184+0.111^/1熟4+?115.8+0.8%瓊脂培養(yǎng)基+1?11110〇11^/ L+cef 500mg/L)上，且剩余的外植體放置于篩選培養(yǎng)基上。
[0197] 在暗環(huán)境中培養(yǎng)3周后，使用16-小時光/8_小時暗循環(huán)培養(yǎng)每個外植體以形 成芽。當形成芽時，僅摘下一個芽并且將其轉移到根形成培養(yǎng)基（MS+kan 100mg/L+cef 500mg/L pH 5.8+0.8%瓊脂）上以形成根。圖14示出了轉基因本氏煙草N.benthamiana 的馴化以及在花盆中生長馴化植株的結果。
[0198] 7-5 :形杰觀察
[0199] 收集3-6個月大的莖并觀察其形態(tài)。為了觀察，橫向截取莖并徑向截取莖，并且 為了區(qū)別組織，通過使用木質部-特異染色試劑間苯三酚一一鹽酸染色觀察莖。如在圖 15中可見，木質部染成紅色，且緊挨木質部之上出現2-4個形成層（Nicotiana tabacum cv. Xanthi是3-6個形成層）。
[0200] 另外，橫向截取轉化有GFP的煙草植物并用GFP過濾器（激發(fā)/阻擋： 460-490/520nm)觀察。結果顯示在圖16中，在形成層區(qū)域的熒光強于在其他組織中的熒 光。
[0201] 7-6 :番茄的轉基閔形成層分牛組織細朐（TCMC)的分離
[0202] 培養(yǎng)4天，在本氏煙草N. benthamiana形成層區(qū)域觀察到細胞分生。培養(yǎng)2周后， 如圖17(A)所示，使用鑷子分離不同于形成層的韌皮組織。如圖17(B)所示，未觀察到韌皮 組織之外的其他組織有細胞分生或損害。對于Nicotiana tabacum cv. Xanthi來說，使用與 描述用于本氏煙草N. benthamiana相同的方法分離形成層分生組織細胞，且如圖18所示， 獲得了相同的結果。
[0203] 7-7 :在煙草形成層分牛組織細朐（TCMC)和煙草棺物中的蛋白表汰分析
[0204] 從轉化有GFP基因的煙草形成層分生組織細胞（TCMC)和煙草植物以及未轉化的 煙草植物中分離總可溶蛋白。
[0205] 將分離的總可溶蛋白進行雙聚丙烯酰胺凝膠SDS-PAGE，并使用半干轉印槽 (BI0-RAD)將其轉移至硝化纖維紙。
[0206] 使用5%脫脂乳封閉過夜，并用TBST洗，之后其繼續(xù)與抗-GFP初級抗體和第二抗 體反應。下一步，使用TBST/?M洗并用顯色劑（BCIP/NBT sol.)顯影，之后分析條帶。
[0207] 結果顯示在圖19中，在非轉基因煙草植物中未檢測到條帶。在轉基因煙草植物和 分離自轉基因煙草植物的煙草形成層分生組織細胞（TCMC)中，在與GFP大小相似的位置檢 測到條帶。
[0208] 另外，在分離自轉基因煙草植物的煙草形成層分生組織細胞（TCMC)中表達的GFP 蛋白比在轉基因煙草植物表達高許多。該結果與圖16的結果一致，提示煙草形成層分生組 織細胞（TCMC)的結果更高。
[0209] 雖然選擇特定的特征來詳細說明本發(fā)明，但對于本領域技術人員顯而易見的是， 根據本發(fā)明的優(yōu)選實施例的描述僅是為了說明的目的，而不是為了限制本發(fā)明的范圍。因 此，本發(fā)明的真實范圍包括所附權利要求中引用的主題的所有改進和等價物。
[0210] 工業(yè)實用性
[0211] 如上所描述的，使用根據本發(fā)明的重組植物細胞表達靶蛋白質的體系可克服傳統 植物細胞培養(yǎng)的問題。另外，其顯示了顯著高的轉化效率，從而可生產高水平的靶蛋白質， 包括生物制藥蛋白質。相應地，其能夠使包括植物來源的蛋白質產品的生物藥品的制備商 業(yè)化。
【主權項】
1. 一種表達靶蛋白質的植物細胞， 其中該植物細胞包括導入其中的含有靶蛋白質編碼基因的重組載體， 其中該植物細胞包括形成層分生組織細胞（CMC)或愈傷組織， 其中該形成層分生組織細胞（CMC)是一類包含分離自植物的固有未分化的細胞的細 胞系，和 其中該細胞系是分離自植物形成層組織并且具有不通過脫分化成為愈傷組織的分生 組織連續(xù)性。2. 根據權利要求1的表達靶蛋白質的植物細胞，其中含有靶蛋白質編碼基因的重組載 體導入植物細胞的形成層分生組織細胞（CMC)中。3. 根據權利要求2的表達靶蛋白質的植物細胞，其中靶蛋白質編碼基因在植物細胞中 轉化從而在植物細胞中瞬時表達革G蛋白質。4. 根據權利要求2的表達靶蛋白質的植物細胞，其中靶蛋白質編碼基因穩(wěn)定轉化到植 物形成層分生組織細胞（CMC)中。5. 根據權利要求2的表達靶蛋白質的植物細胞，其中形成層分生組織細胞（CMC)分離 自具有靶蛋白質編碼基因的轉基因植物。6. 根據權利要求2的表達靶蛋白質的植物細胞，其中靶蛋白質是選自抗原、抗體、抗體 片段、結構蛋白、調控蛋白、轉錄因子、毒蛋白、激素、激素類似物、細胞因子、酶、酶抑制劑、 轉運蛋白、受體、受體片段、宿主防御誘導劑、貯藏蛋白、移動蛋白、攻擊蛋白和報告蛋白所 組成的組中的一種或多種蛋白質。7. 根據權利要求2的表達靶蛋白質的植物細胞，其中植物選自由番前、煙草、胡蘿卜、 紫衫和野生高麗參組成的組。8. -種生產表達靶蛋白質的植物細胞的方法，包括通過共培養(yǎng)包含形成層分生組織細 胞（CMC)或愈傷組織的植物細胞群與含有其中添加了編碼靶蛋白質基因的載體的農桿菌， 用靶蛋白編碼基因轉染或轉化包含形成層分生組織細胞（CMC)或愈傷組織的植物細胞群 的步驟， 其中形成層分生組織細胞（CMC)是一類包含分離自植物的固有未分化的細胞的細胞 系，該細胞系是分離自植物形成層組織并且具有不通過脫分化成為愈傷組織的分生組織連 續(xù)性。9. 根據權利要求8的方法，其中通過共培養(yǎng)形成層分生組織細胞（CMC)和含有轉入編 碼靶蛋白質基因的載體的農桿菌轉染或轉化靶蛋白質編碼基因。10. 根據權利要求8的方法，其中轉染或轉化步驟進一步包括靜態(tài)培養(yǎng)。11. 根據權利要求8的方法，其中轉染或轉化步驟進一步包括單次進行的靜態(tài)培養(yǎng)或 者是間歇進行的靜態(tài)培養(yǎng)。12. 根據權利要求8的方法，其中共培養(yǎng)包括將植物細胞與包含靶蛋白質編碼基因的 載體的農桿菌培養(yǎng)物振蕩培養(yǎng)1分鐘至48小時； 將培養(yǎng)物進行靜態(tài)培養(yǎng)1分鐘至96小時；和 將培養(yǎng)物進行攪拌培養(yǎng)1-14天。13. 根據權利要求8的方法，其中農桿菌的OD 6。。為0. 00001-2. 0。14. 一種從用于表達靶蛋白質的轉基因植物生產靶蛋白質的方法，該方法包括以下步 驟： (a) 培育具有靶蛋白編碼基因的轉基因植物； (b) 從轉基因植物中分離轉基因形成層分生組織細胞（TCMC); (c) 在培養(yǎng)基中培養(yǎng)分離的轉基因形成層分生組織細胞（TCMC);和 (d) 回收在培養(yǎng)的轉基因形成層分生組織細胞（TCMC)中表達的靶蛋白質。15.-種從用于表達靶蛋白質的轉基因植物生產靶蛋白質的方法，該方法包括以下步 驟： (a) 通過共培養(yǎng)包含形成層分生組織細胞（CMC)或愈傷組織的植物細胞群與含有其中 添加了編碼靶蛋白質基因的載體的農桿菌，用靶蛋白編碼基因穩(wěn)定轉化包含形成層分生組 織細胞（CMC)或愈傷組織的植物細胞群或瞬時表達靶蛋白編碼基因， 其中形成層分生組織細胞（CMC)是一類包含分離自植物的固有未分化的細胞的細胞 系，該細胞系是分離自植物形成層組織并且具有不通過脫分化成為愈傷組織的分生組織連 續(xù)性；和 (b) 回收在植物細胞培養(yǎng)物中表達的靶蛋白質，其中農桿菌是通過共培養(yǎng)侵染。
【專利摘要】本發(fā)明涉及表達靶蛋白質的植物細胞、其制備方法和用其生產靶蛋白質的方法。植物細胞中導入了靶蛋白質編碼基因的重組載體，并且植物細胞包含形成層分生組織細胞(CMC)或愈傷組織。形成層分生組織細胞(CMC)是一類包含分離自植物的固有未分化的細胞的細胞系，其中細胞系是分離自植物形成層組織并且具有不通過脫分化成為愈傷組織的分生組織連續(xù)性。使用根據本發(fā)明的重組植物細胞表達靶蛋白質的體系可克服傳統植物細胞培養(yǎng)的問題，其顯示了顯著高的轉化效率，從而可生產大量的靶蛋白質，包括生物制藥蛋白質，相應地，其能夠使包括植物來源的蛋白質產品的生物藥品的制備商業(yè)化。
【IPC分類】C12N5/04, C12N5/10, C12N15/82, A01H5/00
【公開號】CN105120657
【申請?zhí)枴緾N201480019682
【發(fā)明人】陳榮雨, 李銀慶, 張美玉, 樸普邏, 李秀蘭, 梁寶林, 金一淑, 吳一石
【申請人】云火公司, 陳榮雨, 李銀慶
【公開日】2015年12月2日
【申請日】2014年2月28日
【公告號】CA2902808A1, EP2962552A1, WO2014133365A1