改變水稻的脂肪酸組成的制作方法
【專利說(shuō)明】
[0001] 本申請(qǐng)是2007年7月13日提交的題為"改變水稻的脂肪酸組成"的中國(guó)專利申 請(qǐng)200780033971. 4的分案申請(qǐng)。 發(fā)明領(lǐng)域
[0002] 本發(fā)明涉及具有改變的油酸、棕櫚酸和/或亞油酸水平的米糠油（rice oil)、米 糠 （rice bran)和水稻種子。本發(fā)明還提供了遺傳修飾水稻植物的方法，由此從中產(chǎn)生的 米糠油、米糠和水稻種子具有改變水平的油酸、棕櫚酸和/或亞油酸。
[0003] 發(fā)曰月背景
[0004] 植物油是人體膳食脂肪的重要來(lái)源，在發(fā)達(dá)國(guó)家占大約25%的熱量攝入（Broun et al.，1999)。目前世界植物油的產(chǎn)量為大約1億1千萬(wàn)噸/年，其中86 %用于人類消 耗。幾乎所有這些油均得自油料種子作物如大豆、油菜、向日葵、棉籽和落花生，或者得自 種植園樹(shù)木（plantation tree)如棕櫚樹(shù)、橄欖樹(shù)和椰子樹(shù)（Gunstone，2001 ;0il World Annual，2004)。關(guān)于食用油的各個(gè)脂肪酸成分對(duì)于人體健康各個(gè)方面的影響的日益增長(zhǎng)的 科學(xué)了解和社會(huì)共識(shí)推動(dòng)了具有改良的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值而同時(shí)保留各種食物應(yīng)用所需的功能性 的修飾的植物油的開(kāi)發(fā)。這些修飾需要關(guān)于植物脂肪酸合成的代謝途徑及編碼這些途徑的 酶的基因的知識(shí)（Liu et al.，2002a;Thelen and 0hlrogge，2002)〇
[0005] 對(duì)于各種脂肪和油的營(yíng)養(yǎng)作用、特別是脂肪和油的組成成分對(duì)于心血管疾病、癌 癥和多種炎癥性疾病的影響給予了很大關(guān)注。飲食中高水平的膽固醇和飽和脂肪酸被認(rèn)為 增加心臟病的風(fēng)險(xiǎn)，這個(gè)結(jié)果已經(jīng)導(dǎo)致減少攝取膽固醇豐富的飽和動(dòng)物脂肪而贊成攝取無(wú) 膽固醇的不飽和植物油的營(yíng)養(yǎng)學(xué)建議（Liu et al.，2002a)。
[0006] 雖然經(jīng)膳食攝取動(dòng)物脂肪中存在的膽固醇可以明顯增加血液總膽固醇水平，但是 也發(fā)現(xiàn)包含所述脂肪和油的脂肪酸自身對(duì)于血清膽固醇水平即可具有顯著作用。特別感興 趣的是膳食脂肪酸對(duì)于血液中不希望的低密度脂蛋白（LDL)和希望的高密度脂蛋白（HDL) 形式膽固醇的作用。通常，飽和脂肪酸、特別是在植物油中存在的主要飽和物豆蔻酸（14: 〇)和棕櫚酸（16:0)具有增加血清LDL-膽固醇水平及隨后增加心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)的不希望 的性質(zhì)（Zock et al.，1994 ;Hu et al.，1997)。然而，已經(jīng)充分確定在植物油中存在的另 一種主要飽和物，硬脂酸（18:0)不增加 LDL-膽固醇水平且也許實(shí)際上可降低總膽固醇水 平（Bonanome and Grundy，1988 ;Dougherty et al·，1995)。因此，通常認(rèn)為硬脂酸對(duì)于心 血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)至少是中性的（Tholstrup，et al.，1994)。另一方面，不飽和脂肪酸如單不 飽和油酸（18 :1)和多不飽和亞油酸（18 :2)以及α -亞麻酸（ALA，18 :3)對(duì)于降低LDL-膽 固醇有益處（Mensink and Katan，1989 ;Roche and Gibney，2000)，因此降低 了心血管疾病 的風(fēng)險(xiǎn)。
[0007] 盡管在營(yíng)養(yǎng)方面是需要的，但是高不飽和油在用于許多食品應(yīng)用中太不穩(wěn)定，特 別是在暴露于長(zhǎng)時(shí)間高溫和氧化條件下的商業(yè)性深度油炸應(yīng)用方面太不穩(wěn)定。在這種條 件下，不飽和油中存在的許多碳雙鍵的氧化性斷裂導(dǎo)致短鏈醛、氫過(guò)氧化物和酮衍生物的 產(chǎn)生，產(chǎn)生不合乎需要的味道且由于極性化合物水平增加而降低油炸性能（Chang et al.， 1978 !Williams et al. ，1999)。
[0008] 油加工商和食品生產(chǎn)商傳統(tǒng)上依賴于氫化以降低油中不飽和脂肪酸的水平，從而 增加其在油炸應(yīng)用中的氧化穩(wěn)定性且還提供了固體脂肪以用于人造黃油和起酥油中。氫 化作用是一個(gè)化學(xué)過(guò)程，通過(guò)將碳雙鍵轉(zhuǎn)變?yōu)樘紗捂I而降低了油的不飽和程度。完全氫化 作用產(chǎn)生完全飽和脂肪。然而，部分氫化過(guò)程導(dǎo)致飽和脂肪酸和單不飽和脂肪酸的水平均 增加。在部分氫化過(guò)程中形成的一些單不飽和物是反式異構(gòu)體形式（如反油酸，油酸的反 式異構(gòu)體），而不是天然發(fā)生的順式異構(gòu)體（Sebedio et al.，1994 ;Fernandez San Juan， 1995)。與順式不飽和脂肪酸相反，現(xiàn)在已知反式脂肪酸與棕櫚酸在增加血清LDL膽固醇水 平（Mensink and Katan，1990 ;Noakes and Clifton，1998)和降低血清 HDL 膽固醇（Zock and Katan，1992)方面具有同樣效力，并因此導(dǎo)致心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)增加 （Ascherio and Willett，1997)。由于對(duì)于反式脂肪酸的反營(yíng)養(yǎng)作用的了解日益增多，現(xiàn)在越來(lái)越多地傾向 于在食品業(yè)中不使用氫化油，而贊成使用既具有營(yíng)養(yǎng)益處且無(wú)需氫化而可提供需要的功能 性的脂肪和油，特別是富含油酸（在需要液態(tài)油的情況中）或者硬脂酸（在優(yōu)選固體或半 固體脂肪的情況中）的那些脂肪和油。
[0009] 植物油幾乎完全由三酰甘油（TAG)分子組成，所述分子由被酯化為甘油主鏈的三 個(gè)脂肪酸（?；╂溄M成且沉積于稱作油質(zhì)體的特定油體結(jié)構(gòu)中（Stymne and Stobart， 1987)。這些貯存脂質(zhì)作為幼苗發(fā)芽的能量來(lái)源，直至其能進(jìn)行光合作用。常用的可食用植 物油通常由5種主要脂肪酸組成-飽和棕櫚酸和硬脂酸、單不飽和油酸和多不飽和亞油酸 以及α-亞麻酸。除了脂肪酸之外，植物油也含有一些重要的微量成分如維生素 E、植物固 醇、萜類和混合的類異戊二烯。對(duì)這些微量成分越來(lái)越感興趣，因?yàn)橐恍┻@樣的成分已經(jīng)示 出對(duì)于皮膚健康、衰老、視力和血液膽固醇發(fā)揮有益作用或者防止乳腺癌或者心血管疾病 (Theriault et al. ，1999 ;Moghadasian and Frohlich，1999)〇
[0010] 種子中的脂肪酸和TAG合成
[0011] 圖1示出了發(fā)育中的種子中脂肪酸合成的代謝途徑示意圖。脂肪酸合成的最初 階段發(fā)生在細(xì)胞的質(zhì)體區(qū)室中，其中脂肪酸碳鏈的合成用C2分子開(kāi)始并且通過(guò)逐步縮合 過(guò)程延伸，從而從丙二?；?ACP貢獻(xiàn)額外的C2碳單位以延長(zhǎng)?；?。這個(gè)程序的第一步 包括用丙二?；?ACP縮合乙酰-CoA且通過(guò)β -酮酯酰合酶III (KASIII)催化。隨后的 縮合循環(huán)由酮酯酰合酶I (KASI)催化，導(dǎo)致最終形成與酰基載體蛋白（ACP)連接的飽 和C16?；?，棕櫚酰-ACP。質(zhì)體內(nèi)的最終延長(zhǎng)由β-酮酯酰合酶II (KASII)催化，形成 飽和C18?；?，硬脂酰-ACP。當(dāng)去飽和發(fā)生時(shí)，第一個(gè)雙鍵通過(guò)質(zhì)體中的可溶酶即硬脂 酰-ACP Δ 9-去飽和酶被導(dǎo)入C18鏈的Δ 9位置，產(chǎn)生單不飽和的C18 :1油酰-ACP。
[0012] 因此合成的脂肪酸保留在質(zhì)體中以進(jìn)一步修飾并摻入質(zhì)體脂質(zhì)（plastidic lipid)中；或者通過(guò)?；?硫酯酶（acyl-thioesterases)從其ACP中釋放，產(chǎn)生游離脂肪 酸，游離脂肪酸被輸出到細(xì)胞溶膠中以進(jìn)一步修飾并最終摻入TAG分子中。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)高等 植物具有至少兩種類型的?；蝓ッ福篎atA，其對(duì)于油酰-ACP (不飽和?；?ACP)具有底 物特異性；以及FatB，其對(duì)于飽和?；?ACP具有偏愛(ài)性（Jones et al. · 1995 ;Voelker et al.，1996) 〇
[0013] 在離開(kāi)質(zhì)體時(shí)，游離脂肪酸被酯化為輔酶A(CoA)，然后可用于轉(zhuǎn)移至三磷酸甘油 (G-3-P)主鏈，形成溶血磷脂酸（LPA)、磷脂酸（PA)和磷脂酰膽堿（PC)。此外，在一些植 物中，特別是蕓苔屬（Brassica)物種中，被酯化為CoA的油酸能被延長(zhǎng)以形成二十碳稀酸 (C20 :1)和芥子酸（C22 :1)。被酯化為PC的油酸可用于進(jìn)一步修飾，之后被摻入TAG中。 在可食用油中，對(duì)PC的主要修飾是分別通過(guò)微粒體△ 12-去飽和酶（Fad2)和△ 15-去飽 和酶（Fad3)進(jìn)行相繼的油酸去飽和形成亞油酸和α-亞麻酸。
[0014] 現(xiàn)有脂肪酸生物合成酶的修飾
[0015] 基因失活方法如轉(zhuǎn)錄后基因沉默方法（PTGS)已經(jīng)成功用于失活脂肪酸生物合成 基因并且在油料種子作物中產(chǎn)生營(yíng)養(yǎng)方面改良的植物油。例如，通過(guò)共抑制Fad2編碼的微 粒體Δ 12-去飽和酶產(chǎn)生了在其種子油中具有80%油酸的大豆品系（Kinney，1996)。這樣 降低了 △ 12-去飽和水平，導(dǎo)致大量油酸聚集。使用相似的方法，基于共抑制的Fad2基因的 沉默用于提高歐洲油菜（Brassica napus)和芥菜（B. juncea)中油酸水平（Stoutjesdijk et al.，2000)。同樣，發(fā)現(xiàn)得自油菜籽的Fad2基因的突變體等位基因在棉籽中的轉(zhuǎn)基因 表達(dá)能抑制內(nèi)源棉花Fad2基因的表達(dá)并導(dǎo)致在大約一半的原始轉(zhuǎn)基因棉花品系中油酸含 量增加 （Chapman et al.，2001)。另外，通過(guò)自身切割核酶終止的Fad2基因在大豆中的 轉(zhuǎn)基因表達(dá)能失活內(nèi)源Fad2基因，導(dǎo)致油酸水平增加 （Buhr et al.，2002)。RNAi-介導(dǎo) 的基因沉默技術(shù)已經(jīng)用于開(kāi)發(fā)具有營(yíng)養(yǎng)改良的脂肪酸組成的油料種子。在棉籽中，靶向 ghFad2-l (棉花Fad2基因家族的種子特異性成員）的發(fā)夾RNA(hpRNA)基因沉默構(gòu)建體的 轉(zhuǎn)基因表達(dá)導(dǎo)致油酸從占油中總脂肪酸的15%的正常水平增加至直至77% (Liu et al.， 2002b)。這種增加的代價(jià)主要是亞油酸從60%的正常水平降低至低如4%。
[0016] 谷物中的脂肪酸
[0017] 與在油料種子中進(jìn)行的脂肪酸生物合成和修飾的大量工作形成對(duì)照，在谷物中相 對(duì)未進(jìn)行油修飾的研究。這可能是由于在谷粒中油的水平較低（大約1.5-6%重量）并且 因此感覺(jué)到人類飲食中來(lái)自谷物的油的重要性較低的緣故。
[0018] 水稻（Oryza sativa L.)在發(fā)展中國(guó)家是最重要的谷物并且廣泛生長(zhǎng)，特別是在 亞洲占全世界產(chǎn)量的大約90 %。世界上絕大多數(shù)水稻以"精白米"形式食用，其基本上是 水稻谷粒的胚乳，通過(guò)對(duì)收獲的谷粒進(jìn)行研磨以除去外層糠皮和胚芽（胚和盾片）而產(chǎn)生。 這樣做主要是因?yàn)?糙米"不好貯存，特別是在熱帶條件下不好保存。
[0019] 谷粒如水稻的油含量相對(duì)于油料種子非常低（4% )，在油料種子中油可以組成 谷粒重量的60% (Ohlrogge and Jaworski，1997)。然而，脂質(zhì)可仍包含直至37%干重的 谷物胚（Choudhury and Juliano 1980)。水稻谷粒中大多數(shù)脂質(zhì)含量在外層糠皮中發(fā)現(xiàn) (Resurreccion et al.，1979)，但是一些脂質(zhì)也存在于胚乳中，至少一些與淀粉相關(guān)（表 1和2)。米糠油中的主要脂肪酸是棕櫚酸（16 :0)(占 TAG中總脂肪酸的大約20% )、油酸 (18 :1)(大約 40%)和亞油酸（18 :2)(大約 34%) (Radcliffe et al，1997)。在不同水稻 栽培種中，例如天然的油酸水平范圍是37. 9% -47. 5%，亞油酸（18 :2)是38. 2% -30. 4% (Taira et al. ,1988)〇
[0020] 表1 :各種植物油的選擇的脂肪酸的典型脂肪酸組成（總脂肪酸的Wt% )
CN 105123532 A 說(shuō)明書(shū) 4/44 頁(yè)
[0022] 雖然FatB基因已經(jīng)示出高親和性催化游離棕櫚酸產(chǎn)生，所述棕櫚酸隨后在油料 種子植物和雙子葉植物中被轉(zhuǎn)變?yōu)樽貦磅?CoA，但是沒(méi)有關(guān)于FatB在水稻或其它谷物中 作用的報(bào)道信息。
[0023] 表2 :與淀粉相關(guān)植物脂質(zhì)的選擇的脂肪酸的脂肪酸組成（總脂肪酸的wt% )
[0025] 數(shù)據(jù)根據(jù) Morrison (1988)改編。
[0026] -些脂肪酸去飽和酶已經(jīng)在水稻中鑒定，但不是Fad2。Akagai et al.，（1995)公 布了水稻染色體4上編碼發(fā)育中種子中硬脂酰-?；d體蛋白去飽和酶的基因的核苷酸 序列。該基因產(chǎn)物參與從硬脂酰ACP產(chǎn)生油酰ACP。Kodama et al. (1997)報(bào)道了水稻中 Fad3的結(jié)構(gòu)、染色體位置和表達(dá)。
[0027] 通過(guò)使用大豆Fad3表達(dá)技術(shù)，水稻種子油中亞麻酸（18 :3)的比例增加了 10倍 (Anai et al.，2003)。近年來(lái)，已經(jīng)報(bào)道了通過(guò)導(dǎo)入來(lái)自細(xì)菌的亞油酸異構(gòu)酶基因在水稻 中產(chǎn)生綴合的亞油酸（Kohno-Murase et al.，2006);據(jù)報(bào)道綴合的亞油酸具有抗癌活性。 也已經(jīng)報(bào)道了使用固定的微生物酶，以相似的機(jī)理（vein)在體外修飾米糠油以摻入癸酸， 這樣在一些疾病中可以改良膳食脂質(zhì)的利用（Jennings and Akoh，2000)。在玉米中，對(duì) Fad2和FA-6去飽和酶基因已經(jīng)被測(cè)序和染色體作圖（Mikkilinen and Rocheford，2003)。 對(duì)于玉米谷粒中油酸/亞油酸比率，F(xiàn)ad2和Fad6克隆不能作圖至任何QTL。沒(méi)有關(guān)于在水 稻、玉米或小麥中鑒定的其它Fad2或FatB基因的公開(kāi)報(bào)道。
[0028] 水稻的貯存
[0029] 水稻在高溫下長(zhǎng)期貯存削弱了谷粒品質(zhì)，這是由于米糠油的水解和氧化變質(zhì) 所致。在收獲期間脫去外殼以產(chǎn)生糙米破壞了外層糠皮，使得油擴(kuò)散至外層。隨后 內(nèi)源的和微生物脂肪酶催化三酰甘油水解為游離脂肪酸（FFA)，其隨后被氧化產(chǎn)生脫 風(fēng)味（ofTHavour) (Yasumatsu et al.，1966，Tsuzuki et al，2004，Zhou et al， 2002Champagne and Grimm,1995)〇
[0030] 己醛是在高溫下貯存的生的和煮熟的糙米的頂部空間中增加的主要成分（Boggs et al·，1964，Shibuya et al·，1974，Tsugita et al·，1983)。然而，己酸自身不是"脫" 風(fēng)味的主要原因，變質(zhì)的稻米的討厭臭味和氣味可能是由于在貯存后增加的混合揮發(fā)物 所致。這些揮發(fā)物包括烷醛、烯醛（alkenals)、芳族醛、酮、2-戊基呋喃、4-乙烯基苯酚等 (Tsugita et al.，1983)。然而，在貯存期間己醛水平示出與糙米中亞油酸（18:2)的氧化 相關(guān)并因此是氧化變質(zhì)的良好指征（Shin et al.，1986)。
[0031] 己醛從亞油酸產(chǎn)生可以通過(guò)脂加氧酶（LOX)催化（St Angelo et al.，1980)。 Suzuki et al. (1999)鑒別了沒(méi)有Lox3的水稻變種并發(fā)現(xiàn)該突變谷粒在35°C貯存8周，在 生的和煮熟的糙米谷粒的頂部空間蒸汽中均形成較少的己醛。他們還發(fā)現(xiàn)突變水稻形成較 少的戊醛和戊醇。
[0032] 通過(guò)磨去水稻谷粒外層獲得的富有營(yíng)養(yǎng)的外層米糠皮是極佳的食物源料，含有 抗氧化化合物如生育三稀酸類和也是植物雌激素的γ-谷維素 （Rukmini and Raghuram， 1991)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)米糠油中存在的生物活性化合物降低人體膽固醇水平（Most et al.， 2005)。這些生物活性成分也已經(jīng)示出改善喂食高膽固醇飲食的大鼠的脂質(zhì)譜（Ha et al.， 2005)。主要在米糠中發(fā)現(xiàn)的另一種重要成分是維生素 A前體。然而，由于對(duì)稻米進(jìn)行研磨 和食用精白米而喪失了這些營(yíng)養(yǎng)和健康益處。
[0033] 仍需要這樣的谷物如水稻的產(chǎn)生具有對(duì)于健康有益的改良的油組成的谷粒的變 種，同時(shí)在貯存時(shí)更加穩(wěn)定，使得在人膳食中可以更多地使用例如糙米。
[0034] 發(fā)明概沐
[0035] -方面，本發(fā)明提供了米糠油，其脂肪酸組成包含大于大約48%的油酸、小于大約 17%的棕櫚酸、小于大約30%的亞油酸和/或其任何組合。
[0036] 在一個(gè)實(shí)施方案中，油酸與亞油酸的比率大于1.5 : 1，優(yōu)選大于2 : 1，更優(yōu)選大 于3 : 1，還更優(yōu)選大于4 : 1。
[0037] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述米糠油的脂肪酸組成包含大于大約48%的油酸、小于 大約17%的棕櫚酸和小于大約30%的亞油酸。
[0038] 在再一個(gè)實(shí)施方案中，所述米糠油的脂肪酸組成包含大于大約40%的油酸，優(yōu)選 大于大約50%的油酸，還更優(yōu)選大于大約60%的油酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述米糠油的 脂肪酸組成的范圍是48-80%的油酸、6-16%的棕櫚酸和10-25%的亞油酸。
[0039] 在又一個(gè)實(shí)施方案中，所述米糠油的脂肪酸組成包含小于大約16 %的棕櫚酸，優(yōu) 選小于大約15 %的棕櫚酸，更優(yōu)選小于大約14 %的棕櫚酸，更優(yōu)選小于大約13 %的棕櫚 酸，還更優(yōu)選小于大約12%的棕櫚酸。
[0040] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述米糠油的脂肪酸組成包含小于大約25%的亞油酸，優(yōu) 選小于大約20%的亞油酸，還更優(yōu)選小于大約15%的亞油酸。
[0041] 另一方面，本發(fā)明提供了米糠，其脂肪酸組成包含大于大約48%的油酸、小于大約 17%的棕櫚酸、小于大約30%的亞油酸和/或其任何組合。
[0042] 在一個(gè)實(shí)施方案中，油酸與亞油酸的比率大于1.5 : 1，優(yōu)選大于2 : 1，更優(yōu)選大 于3 : 1，還更優(yōu)選大于4 : 1。
[0043] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述米糠的脂肪酸組成包含大于大約48%的油酸、小于大 約17%的棕櫚酸和小于大約30%的亞油酸。
[0044] 在再一個(gè)實(shí)施方案中，所述米糠的脂肪酸組成包含大于大約40%的油酸，優(yōu)選大 于大約50%的油酸，還更優(yōu)選大于大約60%的油酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述米糠的脂肪 酸組成處于48-80%的油酸、6-16%的棕櫚酸和10-25%的亞油酸的范圍。
[0045] 在又一個(gè)實(shí)施方案中，所述米糠的脂肪酸組成包含小于大約16%的棕櫚酸，優(yōu)選 小于大約15%的棕櫚酸，更優(yōu)選小于大約14%的棕櫚酸，更優(yōu)選小于大約13%的棕櫚酸， 還更優(yōu)選小于大約12%的棕櫚酸。
[0046] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述米糠的脂肪酸組成包含小于大約25%的亞油酸，優(yōu)選 小于大約20%的亞油酸，還更優(yōu)選小于大約15%的亞油酸。
[0047] 另一方面，本發(fā)明提供了水稻種子，其脂肪酸組成包含大于大約48%的油酸、小于 大約17%的棕櫚酸、小于大約30%的亞油酸和/或其任何組合。
[0048] 在一個(gè)實(shí)施方案中，油酸與亞油酸的比率大于1.5 : 1，優(yōu)選大于2 : 1，更優(yōu)選大 于3 : 1，還更優(yōu)選大于4 : 1。
[0049] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述水稻種子的脂肪酸組成包含大于大約48%的油酸、小 于大約17%的棕櫚酸和小于大約30%的亞油酸。
[0050] 在再一個(gè)實(shí)施方案中，所述水稻種子的脂肪酸組成（即種子內(nèi)的油）包含大于大 約40 %的油酸，優(yōu)選大于大約50 %的油酸，還更優(yōu)選大于大約60 %的油酸。在一個(gè)實(shí)施方 案中，所述水稻種子的脂肪酸組成處于48-80 %的油酸、6-16%的棕櫚酸和10-25%的亞油 酸的范圍。
[0051] 在又一個(gè)實(shí)施方案中，所述水稻種子的脂肪酸組成包含小于大約16%的棕櫚酸， 優(yōu)選小于大約15%的棕櫚酸，更優(yōu)選小于大約14%的棕櫚酸，更優(yōu)選小于大約13%的棕櫚 酸，還更優(yōu)選小于大約12%的棕櫚酸。
[0052] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述水稻種子的脂肪酸組成包含小于大約25%的亞油酸， 優(yōu)選小于大約20%的亞油酸，還更優(yōu)選小于大約15%的亞油酸。
[0053] 在關(guān)于米糠或水稻種子的上述任何實(shí)施方案中，脂肪酸組成典型通過(guò)提取油并通 過(guò)FAME/GC分析加以確定，如實(shí)施例1所述。各個(gè)脂肪酸的組成以占油中總脂肪酸的百分 比（w/w)表示。
[0054] 另一方面，本發(fā)明提供了產(chǎn)生本發(fā)明的米糠油、米糠和/或水稻種子的水稻植物。
[0055] 另一方面，本發(fā)明提供了分離的多核苷酸，當(dāng)其存在于水稻植物的細(xì)胞中時(shí)，與沒(méi) 有所述多核苷酸的細(xì)胞相比下調(diào)Fad2和/或FatB多肽在所述細(xì)胞中的活性水平。
[0056] 優(yōu)選地，所述多核苷酸與能指導(dǎo)所述多核苷酸在水稻植物細(xì)胞中表達(dá)的啟動(dòng)子可 操縱地連接。
[0057] 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述多核苷酸下調(diào)從至少一個(gè)Fad2和/或FatB基因表達(dá)的 mRNA水平。
[0058] 合適的多核苷酸的例子包括但不限于選自如下的多核苷酸：反義多核苷酸，有義 多核苷酸，催化性多核苷酸，微小RNA (microRNA)，編碼結(jié)合Fad2或FatB多肽的多肽的多核 苷酸和雙鏈RNA。
[0059] 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述多核苷酸是反義多核苷酸，其在生理?xiàng)l件下與包含SEQ ID NO :5-8、11-14或者19-25所示任一或多個(gè)核苷酸序列的多核苷酸雜交。
[0060] 在再一個(gè)實(shí)施方案中，所述多核苷酸是催化性多核苷酸，其能切割包含SEQ ID NO :5-8、11-14或者19-25所示任一或多個(gè)核苷酸序列的多核苷酸。
[0061] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述多核苷酸是包含寡核苷酸的雙鏈RNA (dsRNA)分子，所 述寡核苷酸包含SEQ ID NO :5-8、11-14或者19-25所示任一或多個(gè)核苷酸序列的至少19 個(gè)連續(xù)核苷酸，其中所述分子的雙鏈部分長(zhǎng)度為至少19堿基對(duì)且包含所述寡核苷酸。
[0062] 優(yōu)選地，所述dsRNA從單啟動(dòng)子表達(dá)，其中雙鏈部分的鏈通過(guò)單鏈部分連接。構(gòu)建 載體以產(chǎn)生這種dsRNA分子的例子在實(shí)施例5中提供。
[0063] 在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多核苷酸或其鏈在嚴(yán)格條件下能與包含SEQ ID NO: 5-8、11-14或者19-25所示任一或多個(gè)核苷酸序列的多核苷酸雜交。
[0064]另一方面，本發(fā)明提供了一種鑒別多核苷酸的方法，所述多核苷酸存在于水稻植 物細(xì)胞中時(shí)，與沒(méi)有所述多核苷酸的細(xì)胞相比下調(diào)所述細(xì)胞中Fad2和/或FatB多肽的活 性水平，所述方法包括：
[0065] i)確定候選多核苷酸下調(diào)細(xì)胞中Fad2和/或FatB多肽活性水平的能力，及
[0066] ii)選擇下調(diào)細(xì)胞中Fad2和/或FatB多肽活性水平的多核苷酸。
[0067] 步驟i)可依賴于例如分析細(xì)胞中Fad2和/或FatB多肽的量或酶活性或者編碼 Fad2和/或FatB多肽的mRNA量?；蛘?，步驟i)可包括分析細(xì)胞或者包含所述細(xì)胞的種子 或植物的脂肪酸含量。優(yōu)選地，步驟i)包括在植物細(xì)胞、更優(yōu)選在水稻細(xì)胞中導(dǎo)入候選多 核苷酸或者包含與候選多核苷酸可操縱地連接的啟動(dòng)子的嵌合DNA，還更優(yōu)選包括從所述 植物細(xì)胞再生轉(zhuǎn)基因植物以及從轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)生種子的步驟。候選基因可以是一組候選基 因之一，至少為2或3個(gè)。本發(fā)明因此提供了本發(fā)明的多核苷酸在篩選方法中的應(yīng)用。 [0068] 多核苷酸可以是但不限于是反義多核苷酸，有義多核苷酸，催化性多核苷酸，微小 RNA，編碼結(jié)合Fad2或FatB多肽的多肽的多核苷酸和雙鏈RNA。
[0069] 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述反義多核苷酸在生理?xiàng)l件下與包含SEQ ID NO :5_8、 11-14或者19-25所示任一或多個(gè)核苷酸序列的多核苷酸雜交。
[0070] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述催化性多核苷酸能切割包含SEQ ID NO :5-8、11_14或 者19-25所示任一或多個(gè)核苷酸序列的多核苷酸。
[0071] 在再一個(gè)實(shí)施方案中，所述雙鏈RNA (dsRNA)分子包含寡核苷酸，所述寡核苷酸包 含SEQ ID NO :5-8、11-14或者19-25所示任一或多個(gè)核苷酸序列的至少19個(gè)連續(xù)核苷酸， 其中所述分子的雙鏈部分長(zhǎng)度為至少19堿基對(duì)且包含所述寡核苷酸。
[0072] 本發(fā)明還提供了使用本發(fā)明的方法鑒別的分離的多核苷酸。
[0073] 另一方面，本發(fā)明提供包含或者編碼本發(fā)明多核苷酸的載體。
[0074] 優(yōu)選地，所述多核苷酸或者編碼所述多核苷酸的序列與啟動(dòng)子可操縱地連接。優(yōu) 選地，所述啟動(dòng)子賦予所述多核苷酸相對(duì)于水稻植物的至少一種其它組織或器官而優(yōu)先在 所述植物的胚、胚乳、糠皮和/或種子中表達(dá)。
[0075] 本發(fā)明還提供了包含本發(fā)明的載體和/或本發(fā)明的多核苷酸的細(xì)胞。
[0076] 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述多核苷酸或載體被導(dǎo)入所述細(xì)胞或者所述細(xì)胞的祖細(xì)胞 中。
[0077] 在再一個(gè)實(shí)施方案中，所述細(xì)胞是水稻細(xì)胞或者農(nóng)桿菌（Agrobacterium)細(xì)胞。
[0078] 優(yōu)選地，所述多核苷酸被整合進(jìn)所述細(xì)胞的基因組中。
[0079] 另一方面，本發(fā)明提供了包含本發(fā)明細(xì)胞的水稻植物。
[0080] 再一方面，本發(fā)明提供了產(chǎn)生本發(fā)明細(xì)胞的方法，所述方法包括將本發(fā)明的多核 苷酸或者載體導(dǎo)入細(xì)胞中的步驟。
[0081] 優(yōu)選地，所述方法進(jìn)一步包括從所述細(xì)胞再生轉(zhuǎn)基因植物的步驟。
[0082] 本發(fā)明還提供了本發(fā)明的多核苷酸或載體在生產(chǎn)重組細(xì)胞中的應(yīng)用。
[0083] 再一方面，本發(fā)明提供了遺傳修飾的水稻植物，其中與相應(yīng)未修飾的植物相比，所 述植物相中具有Fad2和/或FatB活性的多肽表達(dá)降低。
[0084] 優(yōu)選地，所述植物已經(jīng)被轉(zhuǎn)化為包含本發(fā)明的多核苷酸或者其包含所述多核苷酸 的后代植物。
[0085] 再一方面，本發(fā)明提供了一種產(chǎn)生本發(fā)明米糠油、米糠和/或水稻種子的方法，所 述方法包括將水