0088] a.概述：
[0089] 檢測按照在先的實施例就抗除草劑咪唑啉酮篩選并鑒定為含有抗性決定因素的 大麥（Hordeum vulgare L)突變株系，以確認并表征突變株系，乙酰輕酸合酶（AHAS)基因 的疑似突變等位基因，并重測序來鑒定DNA堿基改變。核對所述DNA序列，并將其與野生型 序列和已知突變體作比較。
[0090] b.實驗方法和結(jié)果：
[0091] 植物材料由野生型基因型、Buloke和Buloke衍生的編號為VBHT0802 (NCMB 41547)、VBHT0805 (NCHMB 41549)、VBHT0806 (NCHMB 41550)和 VBHT0810 (未保藏）的 4 個 突變株系組成。從Genbank集合AHAS基因的公開參考序列。所述序列是從一系列單子葉 植物種（包括大麥）中獲得的，用于在所述基因保守區(qū)域設(shè)計PCR引物來確保引物起到最 佳作用。總共設(shè)計了 20個正向和反向引物以使能最大覆蓋可獲得的基因序列，提供多種引 物配對選擇以降低引物不良表現(xiàn)的可能性。
[0092] 對提供的全部DNA模板進行使用標(biāo)準(zhǔn)條件的PCR擴增檢測。用所有可能的引物組 合進行的擴增結(jié)果不佳，并且導(dǎo)致產(chǎn)生多種產(chǎn)物，這通過在瓊脂糖凝膠上解析得知。使用嵌 套PCR來降低擴增產(chǎn)物的復(fù)雜性并增加反應(yīng)的特異性。使用嵌套PCR策略特異地擴增得到 AHAS基因的一個區(qū)域，并使用在Abi 3730x1上解析的BigDye 3.1對其進行直接測序。然 后用Sequencher v3. 7對所述序列進行比對并評估多態(tài)性。
[0093] 鑒定得到一些堿基突變的變種。在堿基坐標(biāo)1431處，株系VBUT0810的G轉(zhuǎn)變?yōu)?A。但是，這個改變可能不是觀察到的除草劑抗性表型的原因，因為這個具體的核苷酸是三 聯(lián)體密碼的第三個堿基并且編碼同一氨基酸因此是同義的。
[0094] 株系 νΒΗΤ0805(Ν(ΠΜΒ 41549)和 VBHT0806(NCnffi 41550)在堿基坐標(biāo) 1742 處的 G突變?yōu)锳，也是一個轉(zhuǎn)換。這引起所得氨基酸由絲氨酸轉(zhuǎn)換為天冬酰胺（圖1)。
[0095] 使用跨種對比分析，發(fā)現(xiàn)已在株系νΒΗΤ0805(Ν(ΠΜΒ 41549)和νΒΗΤ0806(Ν(ΠΜΒ 41550)中被突變的絲氨酸在其他種中高度保守（圖2)。
[0096] 將此絲氨酸向天冬酰胺的特異性變化與已知的使植物具有除草劑抗性的因果突 變（causal mutation)相比較，發(fā)現(xiàn)該變化符合先前鑒定和表征的變化（Li et al 2008; Jander et al. 2004 ；Sathasivan et al. 1990)〇
[0097] c.結(jié)論：
[0098] 突變體株系 VBHT0805(NCnffi 41549)和 VBHT0806(NCnffi 41550)可能由于坐標(biāo) 1742處由G轉(zhuǎn)換為A而表現(xiàn)出除草劑抗性，此改變使氨基酸從絲氨酸改變?yōu)樘於０?。?突變被稱作SER653。本發(fā)明的大麥表現(xiàn)的咪唑啉酮除草劑抗性與其他種中發(fā)現(xiàn)的水平相比 不同尋常地高。這是出乎意料的，不囿于任何理論，其可能是由于大麥中AHAS基因的高拷 貝數(shù)造成的。
[0099] 造成株系 VBHT0802、VBHT0803、VBHT0807、VBHT0809 和 VBHT0810 具有除草劑抗 性的突變目前未知。突變可能是在AHAS基因的未測序部分并且可能具有其他抗性機制。 VBHT0802與VBHT0805和VBHT0806相比對抗性有不同的遺傳調(diào)節(jié)并且沒有突變SER653。
[0100] 實施例 9 :對 VBHT0802、VBHT0803、VBHT0805、VBHT0806、VBHT0807、VBHT0809 和 VBHT0810的進一步測序。
[0101] 使用與實施例8相似的標(biāo)準(zhǔn)測序技術(shù)進行進一步的工作，以表征參與賦 予 VBHT0802 (NCIMB 41547)、VBHT0803(NCIMB 41548)、VBMT0805(NCIMB 41549)、 VBHT0806 (NCHMB 41550)、VBHT0807 (未保藏）、VBTIT0809 (NCHMB 41551)和 VBHT0810 (未 保藏）咪唑啉酮抗性的AHAS基因和其他可能的相關(guān)基因。
[0102] 即使在 νΒΗΤ0805(Ν(ΠΜΒ 41549)和 VBHT0806(NCnffi 41550)中鑒定到 SER653 突 變，也要對其進行進一步的測序，因為相信在所述基因的未測序部分可能還有其他突變。
[0103] 實施例10 :麥芽生產(chǎn)的適宜性
[0104] Buloke目前在澳大利亞被視為麥芽制造栽培種。根據(jù)歐洲釀造協(xié)會（European Brewing Congress)的標(biāo)準(zhǔn)方法對麥芽生產(chǎn)的適宜性進行測試。表8中顯示的結(jié)果證明 VBHT0805(NCnffi 41549)在麥芽制造適宜性方面與Buloke相同。
[0105] 參考文獻：
[0106] Li D. , Barclaya I. , Jose K. , Stefanova K. , Appels R. 2008. A mutation at the Alal22 position of acctohydroxyacid synthase(AHAS)located on chromosome 6D of wheat ；improved resistance to imidazolinone and a faster assay for marker selectiou. Mol Breeding. Published Online early.
[0107] Jander G.，Baerson S.，Hudak J.，Gonzalez K.，Gruys K.，Last R. 2003 Ethylmethanesulfonate Saturation Mutagenesis in Arabidopsis to Determine Frequency of Herbtcide Resistance. Plant Physiologyl31 pl39_16.
[0108] Sathasivan K. , Haughn G. , Murai N. 1990 Nucleotide sequence ofa mutant acetolactate synthase gone from an imidazolinone-resistant Arabidopsis thaliana var. Columbia. Nucleic Acids Research 18 2188.
【主權(quán)項】
1. 一種抑制大麥植物周圍的雜草生長的方法，包括： 種植： (a) -種由以NCHMB保藏編號NCHMB 41547或NCHMB 41551保藏的種子衍生的非天然 存在的大麥植物，所述非天然存在的大麥植物與野生型大麥植物相比具有增強的對咪唑啉 酮除草劑的抗性； (b) 由（a)的大麥植物的種子衍生的大麥植物；或 (c) 由（b)的大麥植物的種子衍生的大麥植物或大麥植物的后代；并且 向所述大麥植物及其周圍施用足以抑制雜草生長的咪唑啉酮。2. 權(quán)利要求1的方法，其中所述方法包括種植一種由以NCHMB保藏編號NCHMB 41547 或ΜΠΜΒ 41551保藏的種子衍生的非天然存在的大麥植物，所述非天然存在的大麥植物與 野生型大麥植物相比具有增強的對咪唑啉酮除草劑的抗性。3. 權(quán)利要求1或2的方法，其中咪唑啉酮以在出苗后施用的咪草啶酸和滅草煙的組合 的形式使用。4. 權(quán)利要求3的方法，其中咪草啶酸和滅草煙的施用比例分別為12. 375g每公頃和 5. 625g每公頃；分別為24. 75和11. 25g每公頃；分別為41. 25和18. 75g每公頃；或分別為 49. 5和22. 5g每公頃。5. 權(quán)利要求1或2的方法，其中咪唑啉酮以甲咪唑煙酸和滅草煙的組合的形式使用。6. 權(quán)利要求5的方法，其中甲咪唑煙酸和滅草煙的施用比例分別為26. 25和8. 75g每 公頃；或分別為42和14g每公頃。7. -種種植大麥作物的方法，包括： 播種NCHMB保藏編號為NCHMB 41547或NCHMB 41551的種子；并且 在合適條件下培育所述種子和得到的植物來生產(chǎn)作物。8. 權(quán)利要求7的方法，其中施用咪唑啉酮除草劑以抑制作物中雜草的生長。9. 咪唑啉酮除草劑用于抑制大麥植物周圍的雜草生長的用途，其中將所述咪唑啉酮施 用于與野生型大麥植物相比對咪唑啉酮除草劑抗性增強的大麥植物及其周圍，所述大麥植 物為： (a) 由以NCHMB保藏編號NCHMB 41547或NCHMB 41551保藏的種子衍生的大麥植物； (b) 由（a)的大麥植物的種子衍生的大麥植物；或 (c) 由（b)的大麥植物的種子衍生的大麥植物或大麥植物的后代。10. 權(quán)利要求9的用途，其中所述與野生型大麥植物相比對咪唑啉酮除草劑抗性增強 的大麥植物是由以NCHMB保藏編號ΜΠΜΒ41547或NCHMB 41551保藏的種子衍生的大麥植 物。11. 權(quán)利要求9或10的用途，其中所述咪唑啉酮除草劑包括咪草啶酸和滅草煙的組合。12. 權(quán)利要求9或10的用途，其中所述咪唑啉酮除草劑包括甲咪唑煙酸和滅草煙的組 合。13. 權(quán)利要求9或10的用途，其中所述咪唑啉酮除草劑在出苗后施用。14. 權(quán)利要求11的用途，其中所述咪唑啉酮除草劑在出苗后施用。15. 權(quán)利要求12的用途，其中所述咪唑啉酮除草劑在出苗后施用。
【專利摘要】本申請公開對除草劑，特別是對咪唑啉酮除草劑的抗性增強的非自然存在的大麥植物。還公開大麥植物種子自身、包含賦予咪唑啉酮抗性的核酸序列的分離的核酸、抑制大麥植物周圍的雜草生長的方法和種植大麥作物的方法。種子保藏于NCIMB。NCIMB 4154720080418
【IPC分類】A01G1/00, A01H5/00
【公開號】CN105284628
【申請?zhí)枴緾N201510575739
【發(fā)明人】M·梅特尼, C·皮塔克, D·穆迪
【申請人】維多利亞農(nóng)業(yè)服務(wù)控股公司
【公開日】2016年2月3日
【申請日】2009年5月6日
【公告號】CA2723105A1, CA2723105C, CN102202494A, CN102202494B, EP2288254A1, EP2288254A4, US8889951, US20110126327, US20150075070, WO2009135254A1