用于選擇顯示減少的損傷誘導(dǎo)的表面變色的方法
【專利說明】用于選擇顯示減少的損傷誘導(dǎo)的表面變色的方法
[0001] 本申請是申請?zhí)枮?00780006285. 8的專利申請的分案申請。 發(fā)明領(lǐng)域
[0002] 本發(fā)明設(shè)及用于針對其中存在的個體篩選植物或植物部分的群體的方法，所述個 體與對照植物或植物部分相比，顯示減少的損傷誘導(dǎo)的表面變色。
[000引發(fā)明背景
[0004] 由于不斷增加的需要，新鮮產(chǎn)品例如窩宦、意大利紅生菜（radicchio)、苦宦和其 他蔬菜的加工近年來獲得長足的發(fā)展。葉類蔬菜的收獲和加工包括葉子的大量切割，運(yùn)誘 導(dǎo)了強(qiáng)烈的損傷反應(yīng)。該損傷反應(yīng)導(dǎo)致加工的產(chǎn)品的快速變質(zhì)。該變質(zhì)表現(xiàn)在由于損傷表 面上和周圍的酶促褐變或變粉紅引起的變色、呼吸和由于蒸騰作用引起的變干。特別地，酶 促褐變或變粉紅據(jù)認(rèn)為是非常重要的，其直接或間接決定了鮮切包裝的葉類蔬菜如窩宦和 意大利紅生菜的總體質(zhì)量。
[0005] 此外，作為變質(zhì)的結(jié)果，微生物的數(shù)量可顯著增加，運(yùn)可W危害食品安全。加工的 窩宦的高度易腐壞的性質(zhì)導(dǎo)致消費(fèi)者感覺到強(qiáng)烈的變色（off-colour)、異味（off-odour) 和質(zhì)地改變，運(yùn)妨礙了比所謂的便利市場的流通增長更快速的增長。
[0006] 其他蔬菜如馬鈴馨、磨茹、塊根芹菜、朝鮮劑和茄子，還有果實(shí)和花可經(jīng)歷不希望 的變色。例如，果實(shí)如香蕉、蘋果、梨子、鱷梨、芒果、桃子和杏子等，當(dāng)切成薄片或剝皮時，很 快變成褐色。當(dāng)W加工的形式例如薄切片、切成的小方塊、去皮的形式或在果實(shí)沙拉中提供 運(yùn)些果實(shí)時，必須采取措施。
[0007] 切花花莖（化tflowerstem)(例如來自大下草或菊花）也可容易地變色，所述變 色從商業(yè)的觀點(diǎn)來看是不希望的，因?yàn)橄M(fèi)者認(rèn)為變色使花喪失了吸引力，從而減少了產(chǎn) 品的可銷售性。
[0008] 為了抑制蔬菜例如窩宦中的變質(zhì)過程，已發(fā)展了可用于減緩加工的窩宦的變質(zhì)的 許多化學(xué)或物理的收獲后處理方法。
[0009] 在運(yùn)些方法當(dāng)中包括在改變的大氣下包裝鮮切的葉類蔬菜、使用可食用的涂層、 熱激處理和加入抑制酶促褐變的化學(xué)物質(zhì)。
[0010] 當(dāng)在低溫下在減少氧氣的大氣下包裝鮮切窩宦時，可顯著地減少酶促褐變。然而， 運(yùn)樣的改變的、低氧環(huán)境導(dǎo)致無氧呼吸，運(yùn)產(chǎn)生了令人感覺非常討厭的產(chǎn)品的異味和臭味。
[0011] 可食用的涂層是用作物理隔離屏障和有效保護(hù)產(chǎn)品免受各種變質(zhì)例如蒸發(fā)和褐 變侵害的材料的薄層。運(yùn)些涂層可W例如由樹脂、多糖或蛋白質(zhì)制成。
[0012] 已進(jìn)一步證明，可通過在加工后即刻在45°C下使用90秒的短暫熱激來防止鮮切 窩宦的褐變。熱激很可能使蛋白質(zhì)的生物合成從參與變色的酶轉(zhuǎn)向熱激蛋白，從而減少了 酶促褐變的能力?？蛇x擇地，可用參與變色通路的酶的熱敏感性（thermosensitivity)來 解釋熱激處理對褐變的作用。
[0013] 可使用的化學(xué)物質(zhì)可W是例如還原劑如維生素C、馨合劑如邸TA、絡(luò)合劑如環(huán)糊 精和酶抑制劑如L半脫氨酸。化學(xué)物質(zhì)在新鮮食品中的應(yīng)用明顯地牽設(shè)到食品安全性問題 和需要法規(guī)批準(zhǔn)（regulatcxryapproval)?？蒞考慮上述收獲后技術(shù)的組合，最終，使用的 方法是技術(shù)功效、成本和食品安全性之間的平衡結(jié)果。
[0014] 不論所使用何種技術(shù)，加工的蔬菜、果實(shí)和花的收獲后質(zhì)量的提高來之不易，從而 在本領(lǐng)域存在提供可選擇的技術(shù)來消除或減少對使用物理或化學(xué)收獲后技術(shù)的需要的明 確需要。
[001引發(fā)明概述
[0016] 本發(fā)明的目的是提供篩選方法，所述方法用于選擇顯示減少的損傷誘導(dǎo)的變色反 應(yīng)的植物，從而提供對收獲后的加工障礙例如酶促褐變或變粉紅具有抗性的植物和從其產(chǎn) 生的后代。也可在植物的部分例如莖、種子、果實(shí)、葉、花、塊莖、枝等中看到損傷引起的變 色。因此本發(fā)明的進(jìn)一步目的是提供選擇在它們的植物部分顯示減少的損傷誘導(dǎo)的變色反 應(yīng)的植物的篩選方法。
[0017] 因此本發(fā)明提供了用于針對其中存在的個體（所述個體與對照植物相比，顯示減 少的變色）篩選植物或植物部分的群體的方法，所述方法包括：
[0018] a)提供植物群體或來自該群體的植物的部分；
[0019] b)任選地在植物或植物部分上產(chǎn)生損傷表面；
[0020] C)溫育植物或植物部分或在其上產(chǎn)生的損傷表面W允許在其內(nèi)或其上發(fā)生變 色；
[0021] d)在植物或植物部分內(nèi)或上觀察變色；
[0022] e)將觀察到的變色與在對照植物或植物部分中觀察到的變色進(jìn)行比較，從而鑒定 顯示沒有變色的或顯示與對照植物或植物部分相比減少的變色的植物或植物部分。
[0023] 本發(fā)明的方法具有兩個主要的實(shí)施方案。在第一實(shí)施方案中，變色是內(nèi)源性底物 轉(zhuǎn)化的結(jié)果。該變色將在一定的環(huán)境下溫育植物或植物部分一定量的時間后自發(fā)地產(chǎn)生。 該情況下的變色是損傷誘導(dǎo)的。本發(fā)明特別地設(shè)及天然發(fā)生的酶促變粉紅色和褐變反應(yīng)。 本發(fā)明的篩選方法意欲用于鑒定不顯示該反應(yīng)或與對照相比顯示減少的反應(yīng)的植物。
[0024] 在第二實(shí)施方案中，變色由外源加入的底物的轉(zhuǎn)化引起，當(dāng)植物中的反應(yīng)發(fā)生時， 所述底物可被轉(zhuǎn)化成變成可見的有色底物。運(yùn)樣的顏色反應(yīng)可W是或可W不是損傷誘導(dǎo) 的。其也發(fā)生在例如完整的種子的種皮中。本發(fā)明的篩選方法意欲用于鑒定不顯示該反應(yīng) 或顯示與對照相比減少的反應(yīng)的植物。
[0025] 后一種施用方案更特別地設(shè)及用于就針對其中存在的個體（所述個體與對照植 物或植物部分相比，顯示減少的變色）篩選植物或植物部分的群體的方法，所述方法包括：
[0026] a)提供植物群體或來自該群體的植物的部分；
[0027] b)將植物或植物部分與底物一起溫育，所述底物可轉(zhuǎn)化成有色色素從而允許在其 內(nèi)或其上發(fā)生變色；
[0028] C)在植物或植物部分內(nèi)或上觀察變色；
[0029] d)將觀察到的變色與在對照植物或植物部分中觀察到的變色進(jìn)行比較，從而鑒定 顯示沒有變色或顯示與對照植物或植物部分相比減少的變色的植物或植物部分。
[0030] 本發(fā)明的方法可用于可經(jīng)歷變色的任何植物，但特別適合用于產(chǎn)品，特別是用 于蔬菜或果實(shí)或用于花。該方法尤其適合于用于葉類蔬菜例如窩宦、意大利紅生菜或苦 宦，適合用于塊莖，如馬鈴馨或甘馨（sweetpotato),適合用于根類植物，例如塊根芹菜 (celeriac)，適合用于枝條類（shoots),例如witloof或適合用于磨茹。此外方法可用于 果實(shí)，例如蘋果、香蕉、鱷梨、桃子、梨子、杏子、芒果、茄子和適合用于花類或花莖類（flower stem)，例如大下草莖、菊花、朝鮮劑基部等。
[0031] 本發(fā)明的篩選方法意欲用于鑒定在一個或多個它們的部分或組織中具有減少的 損傷誘導(dǎo)的表面變色的植物。因此，為了進(jìn)行篩選，使用易于變色的部分或組織是非常實(shí)用 的。在窩宦中，運(yùn)樣的部分或組織可W是葉或其部分例如葉的打孔部分，在香蕉中，可合適 地使用去皮果實(shí)的切片，在花類植物中，莖的切片是非常實(shí)用的受試載體（testvehicle)。
[0032] 然而，已發(fā)現(xiàn)還可在未受損傷的組織上檢測變色。在實(shí)施例中，顯示了完整的種皮 和根尖能夠在外源加入的底物存在的情況下誘導(dǎo)顏色反應(yīng)，所述底物在未受傷的情況下可 被轉(zhuǎn)化成有色色素。該顏色反應(yīng)的減少或不存在可用于篩選具有減少的變色的植物。
[0033] 在特定的實(shí)施方案中，該方法特別適合用于選擇屬于菊科（Asteraceae)的植 物，特別是窩宦屬化ac化Ca)的植物和更特別地屬于窩宦化ac化Casativa)種的植物 或?qū)儆诰栈聦伲–ichorium)的植物，和特別地屬于菊宦（Cichoriumintybus)種和苦宦 (Cichoriumendivia)種的植物，所述植物顯示不存在或減少的損傷誘導(dǎo)的表面變色
[0034] 使用本發(fā)明的方法篩選的植物群體可W是任何植物群體，但優(yōu)選是具有許多不同 成員的變異植物群體，W增加發(fā)現(xiàn)顯示減少的損傷誘導(dǎo)的變色的植物的機(jī)會?？赏ㄟ^使用 例如化學(xué)物質(zhì)和/或福射的誘變處理產(chǎn)生運(yùn)樣的變異群體，所述變異群體在本文中被稱為 突變體植物群體?？蛇x擇的群體是種質(zhì)集合體，所述集合體是顯示天然變異的植物的集合 體。此外，還可使用轉(zhuǎn)基因植物的群體。
[0035] 適合地使用具有損傷表面的植物部分來進(jìn)行本發(fā)明的方法。非常有用的受試樣品 是通過對葉子穿孔產(chǎn)生的盤，即所謂的葉盤。可選擇地，可使用有葉脈的葉類蔬菜的中脈組 織。合適地，從此類葉脈切取葉盤。在果實(shí)中，可評估分成二半的果實(shí)的切面或可選擇地薄 切片或小方塊的切面。對于花，莖的切片是非常有用的受試樣品。
[0036] 合適地在水性環(huán)境中進(jìn)行溫育?？捎迷跐駶櫟臑V紙上或?yàn)V紙間溫育的葉盤很好地 進(jìn)行本發(fā)明的方法。然后在濾紙上可W非常清楚地看到圍繞損傷的邊緣的顏色反應(yīng)。
[0037] 可選擇地，水性環(huán)境包括水或溶液。在將在下面進(jìn)一步說明的特定的實(shí)施方案中， 溶液包含底物，例如心3, 4-二徑基苯丙氨酸。該化合物通過多酪氧化酶轉(zhuǎn)化成黑色的色素 黑色素的產(chǎn)物?？捎糜谠谠摲矫婧Y選窩宦植物的可選擇的化合物包括但不限于綠原酸、異 綠原酸、L酪氨酸和兒茶酪。
[0038] 還可使用親本植物（所述親本植物顯示不存在或減少的損傷誘導(dǎo)的葉變色）的后 代進(jìn)行本發(fā)明，從而證明后代仍然具有與在親本植物中發(fā)現(xiàn)的相同的不存在或減少的損傷 誘導(dǎo)的葉變色。
[0039] 本發(fā)明還可在植物的部分上進(jìn)行。植物部分如窩宦或苦宦的葉球或葉通常是具有 切面（所述切面可經(jīng)歷變色）的部分。其他部分是果實(shí)、枝、根、種子、塊莖、花、莖等。
[0040] 在本發(fā)明的其他實(shí)施方案中，種子或萌發(fā)的種子可用作在外源加入的底物存在的 情況下在其上進(jìn)行篩選方法的載體（vehicle)。在萌發(fā)的種子的情況下，幼根尖參與顏色反 應(yīng)。
[0041] 就鑒定可用于加工的蔬菜的市場的突變體植物而言本發(fā)明在商業(yè)上具有極大的 吸引力。如上面所解釋的，產(chǎn)品特別是新鮮果實(shí)和蔬菜的變色被認(rèn)為是不想要的，因?yàn)橄M(fèi) 者拒絕變色的產(chǎn)品。
[004引發(fā)明詳述
[0043] 當(dāng)通過切割收獲和加工窩宦時，產(chǎn)生許多葉損傷表面，所述葉損傷表面導(dǎo)致植物 或植物部分的顯著反應(yīng)，表現(xiàn)為損傷表面上或附近的褐色或粉紅色變色。還可在遠(yuǎn)離葉的 中脈W及柄上的損傷表面的位置上觀察到變粉紅色。有時還可在即將收獲前的階段觀察到 變粉紅色，運(yùn)據(jù)認(rèn)為是由于農(nóng)作物的非生物脅迫或過度成熟造成的。
[0044] 其他植物，特別是其他蔬菜、果實(shí)和花也易于變色。因此本發(fā)明的方法也是鑒定顯 示減少的損傷誘導(dǎo)的變色反應(yīng)的其他植物特別是其他蔬菜或果實(shí)或花的非常方便的篩選 方法。
[0045] 不同形式的變色受到酶活性的影響，所述酶活性由于損傷而獲得強(qiáng)烈的增強(qiáng)且產(chǎn) 生了幾種形式的多酪和來源于其的反應(yīng)產(chǎn)物。
[0046] 參與褐變反應(yīng)的重要的酶活性是PP0。與酶促褐變相關(guān)的PPO活性不限定于窩宦， 已描述了該P(yáng)PO活性在許多其他植物物種中如蘋果、香蕉和馬鈴馨中與收獲后變質(zhì)有關(guān)。 事實(shí)上，PPO被公認(rèn)為是與許多加工的新鮮果實(shí)和蔬菜的收獲后變質(zhì)有關(guān)的最重要的酶之 O
[0047] 因此，PPO-直是目的在于減少或預(yù)防其活性W增加食品的收獲后質(zhì)量的許多技 術(shù)的祀標(biāo)。PPO催化將存在于植物組織中的多酪氧化，從而形成鄰釀的反應(yīng)。然后，酶促和 非酶促反應(yīng)導(dǎo)致褐色或黑色色素的形成。
[0048] 在許多植物種中，PPO由小的基因家族編碼，所述基因家族的個體成員可具有指示 功能趨異的不同的時間和空間表達(dá)