中展示，其中箭頭所指 的樣品顯示急劇減少的變粉紅色變色。圖框B:確認了與顯示清楚的變色反應的對照樣品 相比，粉紅色變色的形成幾乎不存在（中間位置中的樣品）的圖框A中指出的選擇的個體 的再檢測。
[0132] 圖10:M2窩宦植物的表型。通過使用根據(jù)本發(fā)明的測定法，標記有1、2、4、5、7、10 和12的植物顯示減少的粉紅色葉盤變色。植物3、6、8、9和11是顯示與野生型對照相當?shù)?粉紅色葉盤變色的水平的植物。植物1是顯示粉紅色變色的急劇減少和正常生長習性的突 變體的唯一例子。植物2、4、5、7、10和12顯示減少的粉紅色變色和矮小、變白的表型。
[0133] 圖11:顯示減少的變色的窩宦的突變體的后代檢測。在左邊，顯示25個顯示正常 的損傷誘導的變色反應的樣品。在右邊，顯示采自一系列來源于單個突變體的35個后代植 物的樣品組，所述突變體顯著地減少了其損傷誘導的變色反應。
[0134] 圖12.基于采自成熟窩宦植物的葉子中脈部分的褐色變色的篩選的輸出表型的 代表性圖像。圖像顯示在16°C下溫育3天后窩宦邊葉中脈的組織盤。可在損傷表面清楚地 觀察到常見的褐色變色。各培養(yǎng)皿包含3個在中脈的不同位置（綠色、淡綠色和白色）采 集的葉盤。培養(yǎng)皿上方的數(shù)字表示向濾器中加入的L半脫氨酸的ml濃度。
[0135] 圖13:窩宦葉表面的L-DOPA至黑色素的轉(zhuǎn)化。圖框A顯示1.SmML-DOPA溶液中 的測定。上管是陰性對照，其他3個管相同。圖框B顯示包含1.5mML-DOPA的濕潤濾紙之 間的葉盤的溫育的結果。
[0136] 圖14:在中脈褐變上顯示減少的損傷誘導的粉紅色變色的窩宦突變體的后代檢 。圖框A顯示減少的變粉紅的突變體的編號為1至8的8株后代植物的中脈葉盤（每植 物3個葉盤）。圖框B顯示編號為9至16的顯示正常褐變反應的8株對照植物的中脈葉盤 (每植物3個葉盤）。
[0137] 圖15:在環(huán)境大氣下切割和包裝后，顯示減少的損傷誘導的粉紅色變色或褐變反 應的窩宦的突變體的評估。對照植物的葉球的葉碎片示于左邊，減少的變色的突變體的葉 碎片示于右邊。將鮮切葉材料在4°C下膽存6天。可在對照樣品中清楚地觀察到褐色變色， 然而突變體樣品保持不變。
[0138] 圖 16:苦宦kichoriumendivia)(左圖框）和菊宦（Cichoriumintybus)(右圖 框）中變粉紅色測定。
[0139] 圖17:窩宦葉盤上的綠原酸測定。
[0140] 圖18:切開的茄子中的褐變反應。
[0141] 圖19:窩宦（上行）和茄子（下行）的種子上的L-DOPA測定。
[0142] 圖20:窩宦的萌發(fā)的種子上的L-DOPA測定。
[0143] 圖21:窩宦的萌發(fā)的種子上的兒茶酪測定。 實施例
[0144] 實施例1
[0145] 使用ems進行的窩宦的遺傳修飾
[0146] 將窩宦品種Troubadour、Apache、Yo;rv;Lk和Roderick的大約2000粒種子在室溫 下在24小時期間于0.05% (w/v)或0.07% (w/v)的ems的充氣溶液中進行溫育。在ems 處理后，用水漂洗Ml種子，然后在20°C下在16小時光照、8小時黑暗的方案下種植在溫室 中，讓其長成成熟的植物，誘導抽苔和開花W產(chǎn)生M2種子。在成熟后，收獲M2種子，將聚集 成堆和膽藏W待進一步使用?；诰哂邪谆谋硇偷膫€體植物（所述植物的葉綠素生物合 成被擾亂）的相對數(shù)目估計突變頻率。
[0147] 實施例2
[014引基于粉紅色色素形成診斷窩宦的損傷誘導的變色的表型篩選的發(fā)展
[0149] 發(fā)展其中可容易地評估由損傷誘導的窩宦的葉變色的表型測定法。該方法允許針 對變色進行幼小植物的篩選。從幼小或成熟的植物采集直徑5mm的葉盤并且將其置于培養(yǎng) 皿中的濕潤的濾紙之間。將系統(tǒng)在5°C下溫育7天。在溫育過程中，變得如在濾紙上打印的 圓一樣清楚可見的粉紅色染料在葉盤的損傷位置產(chǎn)生（圖2)。
[0150] 為了證明粉紅色染料的產(chǎn)生需要活性苯基丙酸類通路，在該測定中檢測PAL(肉 桂醒，圖3)和PPCKL半脫氨酸，圖4)的抑制劑的效應。當在測定過程中使用肉桂醒時，粉 紅色變色在0.Ol%或更高的濃度被完全抑制。
[0151] 使用0.001%和更高的濃度的L半脫氨酸獲得相似的結果，然而其他氨基酸如L亮 氨酸或L丙氨酸不顯示任何效果。運證明L半脫氨酸可抑制窩宦葉盤的變粉紅色反應并且 L半脫氨酸的抑制作用是特異性的。
[015引為了證明L半脫氨酸在該系統(tǒng)中確實用作PPO活性的抑制劑，將窩宦葉盤與PPO底物心3, 4-二徑基苯丙氨酸化-D0PA) -起溫育。盡管認為L-DOPA不是窩宦PPO的天然 底物，但在損傷表面觀察到暗褐色至黑色的變色，所述變色是通過PPO形成黑色素的表現(xiàn)。 當同時使用ImM或更高濃度的L半脫氨酸時，如圖5中所示，變色被完全抑制。
[0153] 通過在誘導損傷反應前使用熱激來進一步表征窩宦葉盤變粉紅色的反應。在21、 40、50和60°C的溫度下在90秒的期間溫育分離的葉。在該處理后，采集葉盤，針對變粉紅 色對其進行測定。當在5(TC或更高的溫度下進行熱激時，變粉紅色反應被完全抑制。該結 果顯不于圖6中。
[0154] 由于已知L半脫氨酸通過將它們轉(zhuǎn)化回無色的二酪而與作為PPO產(chǎn)物的鄰釀反 應，因此確定L半光氨酸對來自窩宦葉盤的粉紅色染料的影響。平行地，在與L-DOPA溫育 后，確定L半脫氨酸對黑色素形成的影響。
[01巧]根據(jù)上述方法采集和溫育葉盤。在完成損傷反應后，向葉盤加入一系列濃度的L 半脫氨酸，監(jiān)測顏色的變化。結果示于圖7中。該實驗清楚地證明L半脫氨酸將粉紅色染 料轉(zhuǎn)化回無色化合物，然而L-DOPA測定中形成的黑色的黑色素不受L半脫氨酸影響。運證 明粉紅色染料很可能是由窩宦多酪氧化系統(tǒng)形成的鄰釀。
[0156] 為了證明體外觀察到的反應反映生理上相關的反應，將基于L半脫氨酸的變色用 于田間生長的植物材料。運可通過從田間栽培的窩宦植物收獲沿著葉脈顯示強烈的變粉紅 色癥狀的葉子來進行。當例如通過嚴重水浸的條件脅迫植物時，通常觀察到該現(xiàn)象。葉子 用于制備葉盤，所述葉盤立即用ImML半脫氨酸進行溫育。在室溫下進行在大約30分鐘的 溫育后，如圖8中所示，粉紅色變色消失。
[0157] 綜合起來，運些實驗數(shù)據(jù)顯示，可通過損傷誘導窩宦葉盤W產(chǎn)生PAL和PPO依賴性 的粉紅色變色。該表型允許用于窩宦突變體的有效率的和有效的篩選方法，所述窩宦突變 體具有改變的、通過PALPPO或兩者介導的損傷反應誘導的變色。
[015引 實施例3
[0159] 篩選具有減少的損傷誘導的變色的突變體
[0160] 為了鑒定具有低損傷誘導的酶促褐變或變粉紅色潛能的窩宦突變體，將實施例2 中描述的葉盤測定法用于窩宦突變體群體的植物。
[0161] 在溫室中栽培12000株植物（位置：DeLier, 3月28日播種；4月18日種植；在 常規(guī)的窩宦的生長條件下進行生長），從各個體植物采集葉盤（從5月15日開始采樣），將 葉盤作為（平均）25個樣品的庫在5°C下在濕潤的濾紙之間溫育7天。依賴于粉紅色變色 的強度給每一個葉盤進行視覺評分?；谠撛u估，選擇其葉盤顯示沒有或顯示具有相對低 程度的損傷表面變色的植物。將具有幾乎看不到的痕量變色的植物編號為06D. 210202。
[0162] 在12000株植物中，最終選擇1株只顯示痕量的、幾乎看不見的變色的植物和11 株顯示相對低變色水平的植物。運些測定中的一個測定的結果示于圖9。
[0163] 對最初選擇的12個個體重復變色測定，對于大多數(shù)個體情況，確認了最初的結 果。只選擇確認的個體進行進一步的分析和種子生產(chǎn)。
[0164] 實施例4
[0165] 篩選具有減少的損傷誘導的變色的突變體
[0166] 為了鑒定具有低損傷誘導的酶促褐變潛能的窩宦突變體，將實施例2中描述的葉 盤測定法用于窩宦突變體群體的植物。將8500株植物栽培在溫室中直至3周齡化-8葉 期），然后從各個體植物采集葉盤，將所述葉盤在5°C下于濕潤的濾紙之間溫育7天。
[0167] 依賴于粉紅色變色的強度給予各葉盤視覺評分?；谠撛u估，選擇其葉盤顯示沒 有或顯示相對低程度的損傷表面變色的植物。在8500株植物中，選擇8株不顯示任何可見 變色的植物和10株顯示相對低的變色的植物。對18個最初選擇的個體重復變色測定，對 于大多數(shù)個體情況，確認了最初的結果。12個個體示于圖10中。只選擇確認的個體用于 進行進一步的分析和種子生產(chǎn)。給1株不具有多效副作用（例如，變白、變矮）的突變植物 賦予編號05化202539。通過該植物的自交產(chǎn)生的種子被編號為05化810596。通過3株從 05化810596的種子生長而來的植物的自交產(chǎn)生的種子編號為07G. 9979并且保藏在NCIMB。 NCIMB號是41441 (于2006年10月10日保藏）。
[016引 實施例5
[0169] 選擇的顯示減少的損傷誘導的變色的突變體的表型分析
[0170] 在選自實施例3中提供的篩選的12個突變體中，6個顯示急劇減少的生長表型和 變白。其他突變體發(fā)育正常，即與誘變實驗的起始群體的類型一致。
[017。 變矮和變白的突變體的葉綠體功能可能被擾亂。由于PPO存在于運些細胞器中， 運可W解釋葉盤測定中相對低的反應。由于該多效突變是不希望的，因此運些突變體被認 為是不太適切的。
[0172] 顯示最強的葉盤變色的減少的突變植物06化210202顯示了正常表型，因此突變 被認為是對于變色是特異性的，不具有強多效性效應。
[0173] 實施例6
[0174] 后代中幾乎不存在變色表型的確認
[01巧]為了證明窩宦突變體如來自實施例3和5的植物06化210202的減少的變色是 由通過本文中描述的誘變處理產(chǎn)生的遺傳效應引起的，通過自交產(chǎn)生種子。通過植物 06化210202的自交產(chǎn)生的種子編號為06化819784。將種子在±壤中萌發(fā)，使用葉盤變粉紅 色測定法針對變色檢測植物。
[0176] 該實驗清楚地顯示改變的表型具有遺傳基礎，因為所有后代植物都顯示相似的表 型，即粉紅色變色的急劇減少，與用于產(chǎn)生種子的突變體相似。在圖11中舉例說明了該結 果。
[0177] 通過3株從06化819784的種子生長的植物的自交產(chǎn)生的種子編號為06化863B2， 然后在NCIMB保藏。NCIMB號為41454(于2007年1月3日保藏）。
[017引實施例7
[0179] 基于褐色色素形成診斷窩宦的損傷誘導的變色的表型篩選的發(fā)展
[0180] 將窩宦栽培至成熟，通過從葉脈組織切取葉盤來采集邊葉的部分。將葉盤在16°C 下于濕潤的濾紙上進行溫育。在大約72小時后，損傷表面轉(zhuǎn)變成褐色。在IOmML半脫氨 酸存在的情況下，褐變反應被抑制，運表明觀察到的變色是PPO介導的。運樣的實驗的代表 性結果顯示于圖12中。
[0181] 由于如圖12中展示的反應是PPO介導的褐變反應，因此為了篩選顯示減少的在窩 宦的加工過程中發(fā)生的褐色變色的突變體，如本實施例中描述的篩選方法可W認為是有效 的和無偏性的。
[0182] 實施例8
[0183] 基于心3, 4-二徑基苯丙氨酸化-D0PA)轉(zhuǎn)化回稱為黑色素的黑色色素診斷窩宦的 損傷誘導的變色的表型篩選的發(fā)展
[0184] 除了在廣義上闡明損傷誘導的變色的測定外，根據(jù)本發(fā)明的方法也允許W