一種牡丹組織培養(yǎng)容器苗技術(shù)的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬植物組織培養(yǎng)領(lǐng)域，涉及一種牡丹的組織培養(yǎng)繁殖方法。具體而言，本發(fā)明涉及一種從健壯生長(zhǎng)的牡丹母株上采集無病蟲害的健康飽滿鱗芽作為外植體，以環(huán)境友好的表面消毒方法建立無菌培養(yǎng)體系;在一種WPL增值培養(yǎng)基上擴(kuò)繁試管苗(不定芽)；在組織培養(yǎng)瓶里的營(yíng)養(yǎng)缽生根基質(zhì)中誘導(dǎo)試管苗生根形成組織培養(yǎng)容器苗，經(jīng)環(huán)境適應(yīng)性馴化(過渡和煉苗)過程，組織培養(yǎng)容器苗從適應(yīng)植物組織培養(yǎng)室(簡(jiǎn)稱“組培室”，下同)條件馴化成適應(yīng)田間自然條件的容器苗。本發(fā)明克服了牡丹外植體表面消毒困難，組織培養(yǎng)材料容易褐化死亡，生根小植株移栽煉苗過程大量死亡，植株需在秋季移栽成活的季節(jié)限制，組織培養(yǎng)容器苗植株根系得到完整保護(hù)，隨時(shí)隨地?fù)Q盆、移栽或出圃而不影響植株生存生長(zhǎng)，成為牡丹優(yōu)質(zhì)種苗繁育生產(chǎn)的關(guān)鍵技術(shù)。
【背景技術(shù)】
[0002]牡丹屬于芍藥科(原毛莨科)芍藥屬牡丹組(Sect.Moutan DC.)植物，原產(chǎn)我國(guó)，是我國(guó)傳統(tǒng)名花。一種牡丹，楊山牡丹變種‘鳳丹’，學(xué)名為Paeonia ostii T.Hong etJ.X.Zhang var.lishizhenii B.A.Shen(Paeonia ostii‘Lishizhenii ’)，抗逆性強(qiáng)，適應(yīng)性廣，從東北哈爾濱到西北甘肅、新疆;從南部福建到北部?jī)?nèi)蒙都有引種栽培。
[0003]牡丹的應(yīng)用主要有3個(gè)方面，觀賞和繁殖砧木(嫁接繁殖牡丹重瓣花觀賞品種)；中藥材(丹皮)栽培;牡丹籽油新資源食品(中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部公告2011年第9號(hào))。其中，該牡丹籽油是在21世紀(jì)初發(fā)現(xiàn)，并迅速得到我國(guó)領(lǐng)導(dǎo)人和政府高度重視(習(xí)近平:“今天長(zhǎng)了見識(shí)”，(http: //news.xinhuanet.com/politics/2013_ll/27/c_l 18308353.htm)。我國(guó)食用油對(duì)外依賴度超過60%，牡丹籽油的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用無疑有利于緩解我國(guó)食油窘境。國(guó)家林業(yè)局和國(guó)家農(nóng)業(yè)綜合開發(fā)辦公室已將油用牡丹列為農(nóng)業(yè)綜合開發(fā)的名優(yōu)經(jīng)濟(jì)林等示范項(xiàng)目，建設(shè)靚麗生態(tài)環(huán)境和發(fā)展林下特色經(jīng)濟(jì)(國(guó)家林業(yè)局計(jì)財(cái)司國(guó)家農(nóng)業(yè)綜合開發(fā)辦公室關(guān)于印發(fā)《2016年農(nóng)業(yè)綜合開發(fā)林業(yè)項(xiàng)目申報(bào)指南》的通知，規(guī)山函【2015】242號(hào))。
[0004]牡丹用于群體綠化美麗中國(guó)和油料生產(chǎn)亟需大量?jī)?yōu)質(zhì)種苗。目前生產(chǎn)上繁殖牡丹種苗的方法主要有播種、嫁接、分株和吊包等方法，播種繁殖的實(shí)生苗存在兩個(gè)嚴(yán)重問題，繁殖后代群體變異大，苗木質(zhì)量難以保證；田間播種繁殖的植株大多數(shù)帶有根結(jié)線蟲病，容易導(dǎo)致病疫傳播，嚴(yán)重制約產(chǎn)業(yè)發(fā)展和國(guó)內(nèi)外交流。牡丹無性繁殖方式主要有嫁接、分株、吊包等，這些繁殖方式受到母株品質(zhì)和繁殖材料數(shù)量和質(zhì)量限制，主要用于觀賞牡丹品種繁殖，且種苗大小、長(zhǎng)勢(shì)等參差不齊，難以標(biāo)準(zhǔn)化或量化生產(chǎn)。為解決這些問題，牡丹組織培養(yǎng)技術(shù)被業(yè)界認(rèn)可。觀賞牡丹品種組織培養(yǎng)技術(shù)的研究論文于1984年首次在《科學(xué)通報(bào)》上公開發(fā)表(李玉龍等，1984)，其后英國(guó)、法國(guó)、意大利等外國(guó)科學(xué)家先后開展牡丹組織培養(yǎng)研究，在外植體選擇、無菌培養(yǎng)體系建立、試管苗(不定芽)擴(kuò)繁、不定根發(fā)生、小植株移栽馴化等階段都取得不同程度進(jìn)展，國(guó)內(nèi)外有相關(guān)報(bào)道和專利申報(bào)。而在一個(gè)實(shí)驗(yàn)室建立完整(五個(gè)階段)組織培養(yǎng)體系和實(shí)用技術(shù)仍然是理論探索。
[0005]牡丹組織培養(yǎng)存在的主要問題是:(1)外植體(鱗芽)表面消毒困難，不得不用劇毒消毒劑氯化汞，其殘留對(duì)環(huán)境、操作者和培養(yǎng)材料等會(huì)有影響；(2)不定芽在培養(yǎng)基上容易褐化以至死亡；(3)試管苗生根困難，移栽馴化難以成活。小植株(生根試管苗)從實(shí)驗(yàn)室環(huán)境過渡到適應(yīng)田間環(huán)境的過程中容易死亡，導(dǎo)致牡丹組織培養(yǎng)不能用于生產(chǎn)。
[0006]牡丹播種育苗和種苗移栽受季節(jié)嚴(yán)重限制，必須在秋季進(jìn)行，否則種子沉睡在土里不能萌芽生長(zhǎng)，荒廢土地資源至翌年春季;移栽必須在秋季否則大部分植株死亡，這也限制了牡丹產(chǎn)業(yè)發(fā)展。
[0007]本實(shí)驗(yàn)室根據(jù)植物細(xì)胞全能性原理(植物細(xì)胞具有形成完整植株的全部遺傳信息，在適當(dāng)條件下，一個(gè)細(xì)胞能夠形成完整植株)，研究牡丹分子調(diào)控基礎(chǔ)，克隆到‘鳳丹’抗逆生長(zhǎng)關(guān)鍵基因 DREB、WRKY 和 XET(GenBank 登陸序列號(hào) KT890350、KT890351 和 KT890352)，證實(shí)其具有環(huán)境抗逆適應(yīng)性遺傳基礎(chǔ);研究牡丹細(xì)胞全能性的實(shí)現(xiàn)條件，系統(tǒng)研究組織培養(yǎng)過程關(guān)鍵技術(shù)獲得本發(fā)明成果。該成果提供一種環(huán)境友好的牡丹外植體表面消毒方法，克服劇毒消毒劑氯化汞等的殘留缺陷；一種牡丹組織培養(yǎng)的培養(yǎng)基WPL，培養(yǎng)物葉片綠色正常，未現(xiàn)枯褐，試管苗(不定芽)正常生長(zhǎng)分化;一種牡丹組織培養(yǎng)容器苗方法，在組織培養(yǎng)瓶中形成組織培養(yǎng)容器苗，在從組織培養(yǎng)條件過渡到田間自然條件過程中，小植株根系完整保護(hù)和成活，容器苗正常生長(zhǎng)發(fā)育，克服移栽季節(jié)限制隨時(shí)隨地可移栽應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]根據(jù)植物組織培養(yǎng)的程序(五個(gè)階段)，母株和外植體選擇、無菌培養(yǎng)體系建立、不定芽擴(kuò)繁、不定根發(fā)生、小植株移栽馴化等，解決牡丹組織培養(yǎng)技術(shù)關(guān)鍵。
[0009]本發(fā)明的要點(diǎn)之一，提供一種環(huán)境友好的牡丹外植體表面滅菌消毒方法。消毒液為20 % -30 %過氧化氫或40 %乙氰尿酸鈉或次氯酸鈣5 % -15 %或次氯酸鈉1 % -5 % (視消毒劑供應(yīng)情況選用)與70%_80%乙醇水溶液的混合液，其比例為3:1卜4^為體積，下同)，每100ml消毒液中滴加吐溫-20或吐溫-800.4-lml。外植體表面以刺激性小的嬰兒浴皂液清潔，氯間二苯酚0.1-0.5%濃度預(yù)處理，水沖洗后直接用上述消毒液處理、水洗備用。其特征為不含劇毒品，對(duì)環(huán)境、操作者和培養(yǎng)物等較安全友好;消毒劑乙醇與過氧化氫或次氯酸鈣或次氯酸鈉混合進(jìn)行外植體表面消毒，優(yōu)化消毒程序，提高效率。
[0〇1〇]本發(fā)明的要點(diǎn)之二，提供一種牡丹組織培養(yǎng)基(WPL)。每升培養(yǎng)基水溶液中含有以下成分:(1)基本培養(yǎng)基(無機(jī)物)，NH4N〇3含68〇-720mg，KH2P〇4 136-170mg，KN〇3 808-948mg，Ca(N03).7H20 440-570mg，CaCl2.2H20 404-516mg，MgS〇4.7H20 34〇-406mg，F(xiàn)eS〇4.7H2027.8mg,H3B03 6.2-8mg,MnS04.4H20 22.3mg,ZnS04.7H20 8.6-12mg,CuS04.5H200.025mg，Na2Mo〇4.2H20 0.25mg，KI 0.83mg，CoCl2.6H2O 0.02511^。(2)有機(jī)添加物，肌醇80-100mg、煙酸0.5-lmg、鹽酸硫胺素0.5-lmg、鹽酸卩比咳醇0.1-0.5mg、甘氨酸2g、PVP0.5mg，核黃素 20_30mg，AC 100_200mg。
[〇〇11] WPL增值培養(yǎng)基每升水溶液中還含有:植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)，生長(zhǎng)素類的吲哚乙酸(1八六)或吲哚丁酸(184)或萘乙酸(祖4)0.05-0.111^，細(xì)胞分裂素類的6-芐氨基腺嘌呤(6-BA) 0.5-2mg;蔗糖 20-25g，瓊脂 6-8g。
[0012]'^^培養(yǎng)基以!1(:11111〇1和恥0!11111〇1水溶液調(diào)節(jié)口!1值為6.3。
[〇〇13]本發(fā)明的要點(diǎn)之三，提供一種牡丹組織培養(yǎng)容器苗培養(yǎng)基，其組成為:(1)混合基質(zhì)，木炭(粒徑< 5mm)或珍珠巖與泥炭的比例為2: l(v:v)，每升混合基質(zhì)含活性炭lg; (2)營(yíng)養(yǎng)液，每升營(yíng)養(yǎng)液含1/3-1/2WPL，即WPL基本培養(yǎng)基與水的比例為1: l-2(v:v); (3)植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)，每升營(yíng)養(yǎng)液含吲哚丁酸l_3mg。
[0014]本發(fā)明的要點(diǎn)之四，提供一種牡丹組織培養(yǎng)容器苗方法。包括3個(gè)連續(xù)階段。
[0015]階段1，牡丹無菌培養(yǎng)體系建立，選擇健壯的植株，采集無病蟲害的健康飽滿鱗芽作為外植體。外植體預(yù)處理，以嬰兒浴皂清潔表面，氯間二甲苯酚(商品名:滴露)35-50mg/L浸泡5-10min，自來水沖洗15-30min備用。外植體表面消毒，在無菌條件下，按上述要點(diǎn)一所述的方法處理外植體l〇-25min。無菌水沖洗3-4次，每次3min;鱗芽置于濾紙上瀝干表面水分；用滅菌的鑷子剝離鱗片，取腋芽接種在已滅菌(121°C，0，1 IMPa，15-20min)的WPL增值培養(yǎng)基上;在組培室(光照16h，36ym〇l/m2/s，黑暗8h，23-25°C，下同)培養(yǎng)。每天觀察并剔除微生物污染的培養(yǎng)物，15天后無污染的材料，轉(zhuǎn)移到新配制且滅菌的相同培養(yǎng)基上，在組培室培養(yǎng)，培養(yǎng)材料無污染即無菌培養(yǎng)體系已建立。
[0016]該方法與傳統(tǒng)操作的細(xì)節(jié)不同，其特征在于外植體的清潔避免了刺激性強(qiáng)的洗衣粉等對(duì)材料的傷害，增加了滴露表面預(yù)消毒處理；乙醇作為外植體表皮毛伸展劑(使表皮毛直立起來)，便于消毒液緊密接觸外植體表面，使去污染更徹底;消毒液為無汞環(huán)境友好試劑。
[〇〇17]階段2,牡丹試管苗擴(kuò)繁，牡丹試管苗(不定芽)在WPL增殖培養(yǎng)基上在組培室培養(yǎng)。增殖培養(yǎng)基制備按上述要點(diǎn)之二進(jìn)行，培養(yǎng)基、接種器材(醫(yī)用鑷子、剪刀、手術(shù)刀、濾紙、培養(yǎng)皿等)、潔凈水等進(jìn)行高溫滅菌(121°(3、0.1謂?&、2〇11^11)并以滅菌指示劑(山東新華牌121°C壓力蒸汽滅菌化學(xué)指示卡或3M指示膠帶)監(jiān)控滅菌質(zhì)量(指示劑需變色正常，否則重新配制培養(yǎng)基和滅菌)。其特征在于:(1)試管苗在WPL培養(yǎng)基上葉片綠色正常，無枯褐現(xiàn)象；(2)WPL培養(yǎng)基中的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，細(xì)胞分裂素濃度高于生長(zhǎng)素濃度；(3)在組培室每培養(yǎng)28-35天，分化出新的試管苗，每培養(yǎng)周期增值試管苗2-5倍。
[0018]階段3,牡丹容器苗培養(yǎng)與馴化。(1)無菌容器制備，上述發(fā)明要點(diǎn)之三的生根培養(yǎng)基混合基質(zhì)裝入微型營(yíng)養(yǎng)缽(材質(zhì)耐高溫滅菌121°C，0.11兆帕，20min;大小約3-4.5cm X 3-4.5cm，直徑X高)，置入組織培養(yǎng)瓶(大小為可置入1個(gè)以上營(yíng)養(yǎng)缽，7cm X 10cm的培養(yǎng)瓶可置入2個(gè)營(yíng)養(yǎng)缽)；在組織培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)加入1/3-1/2WPL基本培養(yǎng)基無機(jī)物水溶液至混合基質(zhì)濕潤(rùn)(約40ml);高溫滅菌(121°(3,0.1謂?&，2〇11^11)備用；(2)容器苗培養(yǎng)，在無菌條件下牡丹健壯試管苗(高2 1.5cm，直徑2 2mm)扦插在營(yíng)養(yǎng)缽基質(zhì)中，在組培室培養(yǎng)至植株頂芽或腋芽有生長(zhǎng)跡象即表明試管苗已生根形成組織培養(yǎng)容器苗。(3)容器苗馴化，將載有組織培養(yǎng)容器苗的培養(yǎng)瓶從組培室轉(zhuǎn)移至有散射光(自然光不直射)的室內(nèi)培養(yǎng)2天，逐漸打開培養(yǎng)瓶蓋，依序打開1/4，2/4，3/4各培養(yǎng)兩天到全打開培養(yǎng)5-7天;組織培養(yǎng)容器苗從培養(yǎng)瓶中取出并轉(zhuǎn)移到溫室(夏季適當(dāng)遮陰)條件下養(yǎng)護(hù)，每7d噴施一次營(yíng)養(yǎng)液，營(yíng)養(yǎng)液每升含1/5-1/3WPL無機(jī)物，其余為水;其間噴施一次KH2P〇4葉面肥，每升KH2P〇4葉面肥含KH2P042g，其余為水。小植株在該條件下養(yǎng)護(hù)至木質(zhì)化即成為馴化組織培養(yǎng)容器苗，可適應(yīng)田間自然環(huán)境生存生長(zhǎng)，此時(shí)的容器苗即可按田間