常規(guī)養(yǎng)護管理和隨時隨地按需要出圃。其特征在于:試管苗在組織培養(yǎng)瓶中形成容器苗；環(huán)境適應(yīng)性馴化過程是將容器苗轉(zhuǎn)移至不同的環(huán)境中養(yǎng)護，不發(fā)生移栽、斷根、傷根或根系脫落等事件;最大限度保持小植株根系完整性，保證小植株馴化至適應(yīng)田間環(huán)境而獨立存活，生長發(fā)育，克服牡丹移栽的季節(jié)限制，隨時隨地可換盆、移栽或造林應(yīng)用?！揪唧w實施方式】[〇〇19] 實施例一
[0020]牡丹無菌培養(yǎng)體系的建立
[0021]牡丹‘鳳丹’(Paenoia ostti T.Hong et J.X.Zhang var.Lishizhenii B.A.Shenin Acta Phytota.Sin.1ggTJSHhSGCUGl)^ 明星’(Paenoia suffruticosa Andr.‘Mingxing’)，‘文公紅’(Paenoia suffruticosa Andr.‘Wengonghong’)等，選擇生長健壯的植株，在當(dāng)年10月-翌年3月采集無病蟲害的健康飽滿鱗芽作為外植體，以柔軟毛刷蘸嬰兒浴皂水清潔表面，氯間二甲苯酚(商品名:滴露)水溶液(每升含氯間二甲苯酚35-50ml)浸泡5-10min(其間輕柔震蕩)，流水沖洗20min，在無菌條件下加入28%過氧化氫與70%乙醇的混合液(3:1，體積比)，滴入土溫-80(每50ml混合液滴入0.2ml S卩1滴)，滅菌8-15min，無菌水沖洗3-4次，每次3min。鱗芽置于已滅菌的濾紙上瀝干表面水分，以醫(yī)用剪刀、鑷子、解剖刀剝離鱗片，取出鱗片包裹的腋芽，切除形態(tài)學(xué)下端傷口表面部分，接種在預(yù)制的WPL增值培養(yǎng)基上(每升WPL基本培養(yǎng)基中加入植物生長調(diào)節(jié)劑IAA 0.05mg，細胞分裂素6-BA
0.5mg，鹿糖20g，瓊脂6.5g，pH以HC1和NaOH的lmol每升水溶液調(diào)至6.3，每只直徑2.5cm的試管灌裝10ml培養(yǎng)基)，在組培室(溫度23-25°C，光照36ymol/m2/s，光暗節(jié)律為:光16h/d，暗8h/d)培養(yǎng)，每天檢查并挑出被微生物污染的材料試管；10-15d后沒被污染的培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到新配制的WPL增值培養(yǎng)基上(配方和配制方法同上)，在組培室培養(yǎng);頂芽或腋芽開綻生長且無微生物污染，無菌培養(yǎng)體系已建成。
[〇〇22]實施例二
[0023]牡丹試管苗(不定芽)組織培養(yǎng)擴繁
[0024]優(yōu)選的牡丹‘風(fēng)丹 ’(Paeonia osti i T.Hong et J.X.Zhang var.1 ishizheni iB.A.Shen)、‘明星’(Paenoia suffruticosa Andr.‘Mingxing’)植株，在1 月份米集健康飽滿的鱗芽按實施例一所述方法建立無菌培養(yǎng)體系;腋芽在WPL增值培養(yǎng)基上(培養(yǎng)基配方和配制方法同上)，在組培室培養(yǎng)，組培室條件為溫度23-25°C，光照36ymol/m2/s，日光照節(jié)律為16h/8h(光/暗)，醋酸纖維膜過濾空氣通風(fēng)。培養(yǎng)物在該條件下培養(yǎng)28天，每個培養(yǎng)物分化出不定芽2-5個。理論繁殖量根據(jù)計算公式y(tǒng) = xn(y為繁殖量，X增值倍數(shù)，η年均增值次數(shù)= 365/28)，1個繁殖材料年產(chǎn)試管苗不低于8000株。
[〇〇25]其特征WPL增值培養(yǎng)基每升含:(1)無機物，ΝΗ4Ν03含680mg，KH2P〇4 170mg，ΚΝ〇3
808mg，Ca(N03).7Η20 470mg，CaCl2.2Η20 440mg，MgS〇4.7Η20 370mg，F(xiàn)eS〇4.7Η2027.8mg，H3B〇3 6.2mg，MnS〇4*4H2〇 22.3mg，ZnS〇4*7H2〇 8.6mg，CuS〇4*5H2〇 0.025mg，Na2Mo〇4.2H2〇 0.25mg，KI 0.83mg，CoCl2.6H20 0.02511^。(2)有機物，肌醇 100mg、煙酸0.5mg、鹽酸硫胺素lmg、鹽酸卩比咳醇0.5mg、甘氨酸2g、PVP 0.5-lmg，核黃素20-30mg，AC100-200mg，(3)植物生長調(diào)節(jié)劑細胞分裂素6-BA 0.3-2mg，生長素IAA 0.05-2.2mg;(4)蔗糖20-30g，(5)瓊脂6-8g，pH 6.3。
[0〇26]實施例三
[〇〇27]牡丹組織培養(yǎng)容器苗
[0028]牡丹‘風(fēng)丹’(Paenoia ostt i T.Hong et J.X.Zhang var.Li shi zheni iB.A.Shen)按上述實施例一和二獲得試管苗。試管苗通過以下3個階段培養(yǎng)成適應(yīng)田間環(huán)境的組織培養(yǎng)容器苗。(1)容器苗培養(yǎng)，試管苗生根形成容器苗經(jīng)過以下培養(yǎng)過程:生根混合基質(zhì)[木炭(粒徑< 5mm)或珍珠巖與泥炭(2:1，v:v)，活性炭lg/L]裝入黑色聚乙稀營養(yǎng)缽(3-4.5cm X 3-4.5cm，直徑X高)，營養(yǎng)缽置入透明組織培養(yǎng)瓶(約7.5cm X 10cm，直徑X高)內(nèi)；培養(yǎng)瓶內(nèi)加入生根培養(yǎng)液40ml [每升含1/3-1/2WPL無機物，吲哚丁酸l-3mg，其余為水];高溫滅菌(溫度121°C，壓力0.11MPa，20min)備用。在無菌條件下將試管苗1株扦插到已滅菌處理的營養(yǎng)缽生根基質(zhì)中；在組培室培養(yǎng)(溫度23-25°C，光照36ym〇l/m2/s，16h/d，醋酸纖維膜過濾通風(fēng))約25天，植株頂芽萌動生長，隨機抽樣檢查確認試管苗已生根形成容器苗。
(2)容器苗過渡煉苗，將組織培養(yǎng)容器苗從組培室轉(zhuǎn)移至散射光照射的室內(nèi)培養(yǎng)2-3天，依次打開1/4，2/4，3/4培養(yǎng)瓶蓋各培養(yǎng)2天，至全打開瓶蓋培養(yǎng)5天；(3)容器苗馴化煉苗，將過渡鍛煉的組織培養(yǎng)容器苗轉(zhuǎn)移至溫室條件下養(yǎng)護(夏季需要遮陰)，控制小植株容器內(nèi)水分使之逐漸減低至田間正常持水量，每7天噴施一次1/5-1/5WPL無機鹽水溶液，其間噴施一次2%〇的KH2P〇4水溶液。小植株培養(yǎng)25-30天已木質(zhì)化，可適應(yīng)田間自然環(huán)境獨立存活生長;容器苗按正常田間日常管理養(yǎng)護，根據(jù)植株大小隨時可更換較大營養(yǎng)缽，移栽到田間或出圃應(yīng)用。
[0029]其特征在于試管苗(不定芽)在無菌條件下扦插生根形成無菌容器苗;試管苗不經(jīng)過常規(guī)組織培養(yǎng)的移栽和緩苗過程，通過移動容器苗至不同環(huán)境下馴化小植株的環(huán)境適應(yīng)性;克服了傳統(tǒng)組織培養(yǎng)的小植株在移栽馴化過程中不可避免地斷根、傷根和脫落導(dǎo)致植株死亡的缺陷，最大限度保持植株根系完整性，小植株從實驗條件馴化到適應(yīng)田間自然條件獨立存活、生長發(fā)育；克服牡丹移栽的季節(jié)限制，隨時隨地根據(jù)生產(chǎn)需要移栽或造林;為廣袤地區(qū)綠化美化和牡丹籽油原料生產(chǎn)提供組織培養(yǎng)優(yōu)質(zhì)種苗。
【主權(quán)項】
1.一種牡丹組織培養(yǎng)容器苗方法，包括:a)選擇母株外植體進行表面消毒；b)試管苗(不定芽)增殖培養(yǎng)；c)小植株容器苗培養(yǎng)馴化。2.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于一種不含劇毒物，環(huán)境友好的外植體表面消毒方法，消毒液為20 % -30 %過氧化氫或次氯酸媽5 % -15 %或次氯酸鈉1 % -5 %和70 % -80 %乙醇，按3:1 (v: v，體積比)混合，每100ml混合液加入吐溫20或吐溫800.4-lml。外植體經(jīng)表面清潔，預(yù)處理，直接用消毒液處理l〇_25min、無菌水洗、瀝干、用于接種在培養(yǎng)基上建立無菌培養(yǎng)體系。3.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于一種牡丹組織培養(yǎng)的基本培養(yǎng)基(WPL)無機物組成。每升培養(yǎng)基含NH4NO3 68〇-720mg，KH2P〇4 136-170mg，KN03 808-948mg，Ca(N03).7H2O 440-570mg，CaCl2.2H2O 404-516mg，MgS〇4.7H2O 34〇-406mg，F(xiàn)eS〇4.7H2O 27.8mg，H3BO3 6.2-8mg,MnS〇4.4H20 22.3mg,ZnS04.7H20 8.6-12mg,CuS04.5H20 0.025mg,Na2Mo〇4*2H2〇 0.25mg，KI 0.83mg，CoCl2.6H20 0.025mg，其余為水。4.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于一種牡丹組織培養(yǎng)的基本培養(yǎng)基(WPL)有機添加物為，每升培養(yǎng)基含肌醇80-100mg、煙酸0.5-lmg、鹽酸硫胺素0.5-lmg、鹽酸啦咳醇0.1-0.5mg、甘氨酸2g、PVP 0.5mg，核黃素20-30mg，AC 100-200mg，其余為水。5.按照權(quán)利要求1，3和4所述的方法，其特征在于一種牡丹增值培養(yǎng)基，含WPL無機物和有機物，植物生長調(diào)節(jié)劑生長素類的吲哚乙酸(IAA)或吲哚丁酸(IBA)0.05-3mg/L或萘乙酸(NAA)0.05-0.1mg/L，細胞分裂素類的6-芐氨基腺嘌呤(6-BA)0-2mg/L，蔗糖20-25g，瓊脂6-8g，滴加IMol的HC1或NaOH水溶液調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH值至6.3。6.按照權(quán)利要求1和3所述的方法，其特征在于牡丹組織培養(yǎng)容器苗生根培養(yǎng)基，由混合基質(zhì)和生根營養(yǎng)液組成?；旌匣|(zhì)中木炭(粒徑< 5mm)或珍珠巖與泥炭的比例為2: l(v:v，體積比)，活性炭lg每升混合基質(zhì);生根營養(yǎng)液每升含1/3-1/2WPL無機物，B引噪丁酸(IBA)l-3mg，其余為水。7.按照權(quán)利要求1至6所述的方法，其特征在于一種牡丹容器苗組織培養(yǎng)方法，包括3個組織培養(yǎng)連續(xù)階段。(1)無菌培養(yǎng)體系建立，外植體用氯間二苯酚(商品名為滴露)預(yù)處理之后，以權(quán)利要求2所述消毒液進行表面消毒，接種在WPL增值培養(yǎng)基上，篩選無微生物污染的培養(yǎng)物。(2)試管苗(不定芽)擴繁，試管苗在WPL增值培養(yǎng)基上在組培室進行無菌繼代培養(yǎng)，不受環(huán)境季節(jié)等影響持續(xù)按幾何指數(shù)擴大試管苗繁殖數(shù)量。(3)容器苗培養(yǎng)與馴化，試管苗在無菌營養(yǎng)缽基質(zhì)上誘導(dǎo)生根形成小植株容器苗;小植株馴化只將容器苗轉(zhuǎn)移至散射光、溫室等環(huán)境下養(yǎng)護，不發(fā)生移栽、傷根、斷根或根系脫落事件;最大限度保持植株根系完整性;保證馴化至適應(yīng)自然環(huán)境自立生活，生長發(fā)育;克服季節(jié)限制，隨時隨地可換盆、移栽或造林應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明屬于植物組織培養(yǎng)領(lǐng)域，特別涉及一種牡丹組織培養(yǎng)容器苗方法。從健壯生長的牡丹‘鳳丹’、‘明星’等的母株上采集無病蟲害、健康飽滿的鱗芽作為外植體，以一種環(huán)境友好的外植體表面消毒方法進行表面消毒，接種在一種特制的牡丹培養(yǎng)基上建立無菌培養(yǎng)體系；試管苗在增殖培養(yǎng)基上以每28天-35天為一個繼代周期進行繼代擴繁；試管苗在培養(yǎng)瓶里的營養(yǎng)缽基質(zhì)上誘導(dǎo)生根形成小植株容器苗；經(jīng)過環(huán)境適應(yīng)性馴化形成適應(yīng)自然環(huán)境的組織培養(yǎng)容器苗，可隨時隨地換盆、移栽和出圃應(yīng)用。本發(fā)明的主要特征在于：一種環(huán)境友好的牡丹外植體表面消毒方法；一種牡丹組織培養(yǎng)的基本培養(yǎng)基；一種牡丹容器苗的組織培養(yǎng)基和培養(yǎng)方法；為牡丹工廠化繁育優(yōu)質(zhì)種苗的關(guān)鍵技術(shù)。
【IPC分類】A01H4/00
【公開號】CN105494105
【申請?zhí)枴緾N201610029796
【發(fā)明人】王華芳, 霍瑾茹, 張倩, 卜祥潘, 鄧舒雨, 修宇, 唐文思, 王蒙蒙
【申請人】北京林業(yè)大學(xué)
【公開日】2016年4月20日
【申請日】2016年1月18日