本發(fā)明屬于乳酸菌和乳品加工的技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種可提高人體免疫力的多糖發(fā)酵乳及其制備方法。

背景技術(shù)：

研究已經(jīng)證實(shí)，真菌多糖作具有調(diào)節(jié)免疫、降血脂、抗衰老和抗腫瘤等多種生理功能，深受人們的重視，極具開(kāi)發(fā)價(jià)值。發(fā)酵乳因具有極佳的口感和營(yíng)養(yǎng)成分，被認(rèn)為是添加功能性成分、實(shí)現(xiàn)產(chǎn)品功能的最佳載體之一。乳酸菌在人體內(nèi)有極其重要的生理功能，其數(shù)量的多少，影響著人體健康乃至人的壽命。而乳酸菌在人體中所發(fā)揮重要生理功能則主要通過(guò)其所產(chǎn)生的有機(jī)酸、細(xì)菌素、細(xì)菌表面成分和特殊酶系這4類物質(zhì)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。乳酸菌的生理功能主要包括：(1)賦予食品良好的風(fēng)味，提高食品營(yíng)養(yǎng)價(jià)值；(2)促進(jìn)胃液的分泌，促進(jìn)胃腸的蠕動(dòng)，防治消化不良和習(xí)慣性便秘；(3)能夠抵御外來(lái)細(xì)菌的入侵，抑制病原性細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖，維持腸道菌群的平衡；(4)增強(qiáng)機(jī)體免疫力，抑制腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移；(5)降低血清中膽固醇的含量，預(yù)防心血管疾病的發(fā)生。發(fā)酵乳因含有活的益生菌或乳酸菌和活性成分，在改善人體健康有重要作用，近年來(lái)受到極大關(guān)注。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，真菌多糖能應(yīng)用于發(fā)酵乳，例如將金針菇多糖、黑木耳多糖、姬松茸多糖、香菇多糖和云芝多糖應(yīng)用于發(fā)酵乳中，結(jié)果表明，真菌多糖具有促進(jìn)乳酸菌的生長(zhǎng)、提高發(fā)酵產(chǎn)生乳酸的速度、減少發(fā)酵周期，還可以增加乳酸菌的活菌數(shù)量。

多汁乳菇(lactariusvolemusfr.)，俗名紅奶漿菌、牛奶菇、奶汁菇，是可食用的野生真菌，對(duì)其中的活性多糖的提取、活性成分的評(píng)價(jià)及其多糖在發(fā)酵乳中的應(yīng)用，但未曾有報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明針對(duì)多汁乳菇多糖免疫活性不明及其在發(fā)酵乳中應(yīng)用的現(xiàn)狀，提供一種可提高免疫力的多汁乳菇多糖嗜酸乳桿菌發(fā)酵乳及其制備方法。

本發(fā)明采用了如下技術(shù)方案：

通過(guò)對(duì)上述發(fā)酵乳添加劑、質(zhì)構(gòu)不穩(wěn)定等問(wèn)題進(jìn)行了深入研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在發(fā)酵乳的制備工序中添加多汁乳菇多糖，使其作為益生元因子在發(fā)酵過(guò)程中發(fā)生作用，與不添加多汁乳菇多糖時(shí)相比，可在不影響發(fā)酵乳固有風(fēng)味的前提下顯著增強(qiáng)發(fā)酵乳中的活菌總數(shù)及質(zhì)構(gòu)的穩(wěn)定性。因此，本發(fā)明在優(yōu)化配方的基礎(chǔ)上同時(shí)改進(jìn)工藝：添加多汁乳菇多糖進(jìn)行發(fā)酵，促進(jìn)發(fā)酵劑的生長(zhǎng)繁殖，延長(zhǎng)保存發(fā)酵乳的保存期，制備風(fēng)味獨(dú)特、質(zhì)地細(xì)膩、口感順滑的發(fā)酵乳產(chǎn)品，減少了乳清析出。

一種多汁乳菇多糖的嗜酸乳桿菌發(fā)酵乳的制備方法，將發(fā)酵用奶液與多汁乳菇多糖和嗜酸乳桿菌發(fā)酵劑，混合均勻后發(fā)酵，發(fā)酵后制成含多汁乳菇多糖的發(fā)酵乳；所述發(fā)酵用奶液還經(jīng)均質(zhì)和消毒預(yù)處理，或者發(fā)酵用奶液與多汁乳菇多糖混合后再經(jīng)均質(zhì)和消毒預(yù)處理。

所述多汁乳菇多糖的制備方法為：先將多汁乳菇原料進(jìn)行預(yù)處理得到多汁乳菇細(xì)粉，經(jīng)脫脂后，再用水進(jìn)行多糖提??；之后經(jīng)脫蛋白質(zhì)處理；用95％乙醇沉淀多糖，所得濃縮液用75％乙醇洗滌多糖并真空冷凍干燥，制得多汁乳菇多糖。

所述多汁乳菇多糖的制備包含如下步驟：

(1)原材料預(yù)處理：洗滌多汁乳菇，將其烘干去柄，用子實(shí)體部分磨粉，然后過(guò)150目～200目篩網(wǎng)，得到多汁乳菇細(xì)粉；

(2)脫脂：向多汁乳菇細(xì)粉中加入無(wú)水乙醇及石油醚，在85℃～95℃回流3h～4h，抽濾得到濾渣；

(3)用水進(jìn)行多糖提取：向?yàn)V渣中加入蒸餾水，浸泡1h～2h后，100w超聲波處理10min～20min，于90℃～95℃的水浴條件下浸提3h～5h；用150目～200目濾袋過(guò)濾，收集浸提液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行濃縮，得到15倍～25倍濃縮的多汁乳菇多糖濃縮液；

(4)脫蛋白質(zhì)處理：將多汁乳菇多糖濃縮液與1/3～1/5倍體積的sevag試劑混合，靜置20min～40min后分層，再低溫離心得上層浸提液，用蒸餾水稀釋再用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀去除有機(jī)溶劑，得到脫蛋白的多汁乳菇多糖濃縮液i；

(5)用95％乙醇沉淀多糖：在多汁乳菇多糖濃縮液i中，加入2倍～4倍體積預(yù)冷95％乙醇，于1℃～4℃下放置10h～20h，再進(jìn)行低溫離心得到絮狀沉淀，為多汁乳菇多糖濃縮液ii；

(6)用75％乙醇洗滌多糖：用75％乙醇將多汁乳菇多糖濃縮液ii進(jìn)行3次洗滌后，重新溶解于水用低溫離心去除不溶物，上清液預(yù)凍后進(jìn)行真空冷凍干燥，得到多汁乳菇多糖粉。

所述多汁乳菇多糖的含量為0.05％～0.15％，優(yōu)選含量為0.1％。

所述發(fā)酵溫度為35℃～43℃。

加入多汁乳菇多糖溶液時(shí)還經(jīng)過(guò)膜處理。

所述發(fā)酵用奶液組成為：

全脂乳粉的復(fù)原奶與蔗糖、穩(wěn)定劑按比例配制而成；

或脫脂奶粉和稀奶油的復(fù)原奶與蔗糖、穩(wěn)定劑按比例配制而成；

或鮮奶與蔗糖、穩(wěn)定劑按比例配制而成。

制備嗜酸乳桿菌(lactobacillusacidophilus,簡(jiǎn)稱lap1.1878)發(fā)酵劑包含如下步驟：

(1)采用mrs液體培養(yǎng)基進(jìn)行嗜酸乳桿菌凍干菌粉活化培養(yǎng)2～3次，得活化菌液；

(2)將活化菌液接種于活化用奶液中活化處理，得到嗜酸乳桿菌發(fā)酵劑。

所述活化用奶液為10.0％～12.5％的全脂乳粉、7.5％～8.5％蔗糖混合后，經(jīng)均質(zhì)和消毒而成。

本發(fā)明與現(xiàn)有的技術(shù)相比，具有如下的優(yōu)點(diǎn)：

(1)本發(fā)明采用的多汁乳菇多糖，為純天然物質(zhì)，具有良好的免疫活性，在發(fā)酵乳中性質(zhì)穩(wěn)定，能耐受巴氏消毒強(qiáng)度，不會(huì)影響發(fā)酵乳的保質(zhì)期和口感。

(2)相比于未添加多糖的發(fā)酵乳，本發(fā)明的多糖發(fā)酵乳具有很好的流變學(xué)特性、持水力、酸甜適中、含有較豐富的必需氨基酸和游離氨基酸等，乳酸菌活菌數(shù)高達(dá)10¹⁰cfu/ml；香氣成分較濃郁，口感較好，色澤、口感等感官性質(zhì)均符合發(fā)酵乳國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)gb19302-2010中的各項(xiàng)指標(biāo)。

(3)本發(fā)明的發(fā)酵乳的原料豐富，可以是全脂乳粉的復(fù)原奶與蔗糖、穩(wěn)定劑等發(fā)酵乳原料按比例配制而成，也可以是脫脂奶粉和稀奶油的復(fù)原奶與蔗糖、穩(wěn)定劑等發(fā)酵乳原料按比例配制而成，還可以是鮮奶與蔗糖、穩(wěn)定劑等發(fā)酵乳原料按比例配制而成。

(4)生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單和容易控制，口感細(xì)膩，香氣濃郁，乳酸菌的活菌數(shù)高，質(zhì)構(gòu)較好，粘稠度適宜，持水力較好，無(wú)乳清析出。

附圖說(shuō)明

圖1是多汁乳菇多糖嗜酸乳桿菌發(fā)酵乳剪切掃描流變學(xué)特性曲線，圖1a為表觀粘度隨剪切速率的變化，圖1b為剪切應(yīng)力歲剪切速率的變化。

圖2是多汁乳菇多糖嗜酸乳桿菌發(fā)酵乳頻率掃描流變學(xué)特性曲線。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明，但是本發(fā)明要求保護(hù)的范圍并不局限于此。

實(shí)施例1

多汁乳菇多糖的提取

洗滌多汁乳菇，將其烘干去柄，用子實(shí)體部分磨粉，然后過(guò)200目篩網(wǎng)，得到多汁乳菇細(xì)粉，在90℃回流3.5h進(jìn)行脫脂后，按料液比1:30浸泡1.5h后，用100w超聲波處理15min，于95℃水浴浸提4h，用200目濾袋過(guò)濾，收集浸提液，于55℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中濃縮至20倍，再加入1/5倍體積的sevag試劑(正丁醇:氯仿的體積比為1:4)脫蛋白質(zhì)，在低溫下用5000rpm離心5min后得到上層浸提液，用適量的蒸餾水稀釋，再用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀去除有機(jī)試劑，于多汁乳菇多糖濃縮液i中加入3倍體積的95％乙醇，于4℃放置20h后用5000rpm離心5min得多汁乳菇多糖濃縮液ii，再用75％乙醇洗滌多汁乳菇多糖濃縮液ii數(shù)3次，重新溶解于水后在低溫下用5000rpm離心5min去除不溶物，再將上清液其預(yù)凍后進(jìn)行真空冷凍干燥，得多汁乳菇多糖粉iii，置于密封袋中4℃保存，多糖得率為2.18％(以干重計(jì))。

實(shí)施例2

在體內(nèi)多汁乳菇多糖提高免疫力作用評(píng)價(jià)

(1)小鼠分組：7～8周齡spf級(jí)近交系balb/c小鼠72只，體重18～22g，根據(jù)小鼠的體重隨機(jī)分為6組，詳細(xì)分組信息如表1。并經(jīng)過(guò)spss17.0軟件進(jìn)行顯著性差異分析，顯示組別之間無(wú)顯著性差異。所有小鼠由專業(yè)人員飼養(yǎng)，4只/籠。在溫度22～24℃、濕度50％～60％的條件下，每天光照12h，黑暗12h。實(shí)驗(yàn)期間，小鼠自由飲水和進(jìn)食，每天上午9：00對(duì)各實(shí)驗(yàn)組小鼠進(jìn)行灌胃，灌胃量均為200ml/(kg·bw·d)，cp^-和cp⁺組是提前7天在小鼠的腹腔注射免疫系統(tǒng)損傷藥物環(huán)磷酰胺(簡(jiǎn)稱cp)，每天注射30mg/(kg·bw)的cp，連續(xù)注射7天，第25天再注射80mg/(kg·bw)的cp。

表1小鼠分組信息表

(2)各種免疫指標(biāo)測(cè)定

①遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)測(cè)定：在飼喂25個(gè)日齡后，每只小鼠腹腔注射0.2ml的2％的srbc綿羊紅細(xì)胞，免疫5天后，小鼠稱重并測(cè)量左后足跖部厚度(h0)，于測(cè)量部位注射20μl的20％的srbc綿羊紅細(xì)胞，24h后測(cè)定同一部位的左后足跖部厚度(h)，注射前后足跖部厚度之差表示為dth＝h-h0，單位為mm。

②碳廓清指數(shù)測(cè)定：第30日測(cè)量結(jié)束，尾部靜脈注射33％的印度墨汁，注射量為0.1ml/(kg·bw)，分別于注射完2min、10min后，從內(nèi)眥靜脈取血20μl，并立即加于盛有2ml0.1％na2co3的ep管中，測(cè)定od600nm并計(jì)算相應(yīng)的吞噬速率k＝(lgod1-lgod2)/(t2-t1)和吞噬指數(shù)a＝(體重*k^1/3)/(肝重+脾重)，碳廓清指數(shù)即是吞噬指數(shù)a。

③臟器系數(shù)測(cè)定：在實(shí)驗(yàn)終止時(shí)，將全部小鼠禁食一夜，摘除眼珠取小鼠全血，然后頸部脫臼處死小鼠，分離肝臟、脾臟、胸腺，用生理鹽水洗滌臟器表面血污并用濾紙吸干稱重，臟器系數(shù)指肝臟系數(shù)、脾臟系數(shù)和胸腺系數(shù)，計(jì)算公式為：臟器重量(mg)/體重(g)。對(duì)于碳廓清受試小鼠的臟器而言，6個(gè)組別的顏色均呈暗紅色，未代謝完印度墨汁，肉眼可觀察到cp^-比劑量組的色澤狀態(tài)更暗沉，代謝情況要差于lp、mp和hp等3個(gè)多糖劑量組和ck組，可判定多汁乳菇多糖液具備一定的免疫功效性。經(jīng)計(jì)算，得到各組小鼠臟器系數(shù)結(jié)果如表2所示。lp、mp和hp等3個(gè)多糖劑量組與ck比較，小鼠的體重和肝臟系數(shù)、脾臟系數(shù)和胸腺系數(shù)等3項(xiàng)免疫器官系數(shù)有明顯升高，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)，而cp^-與ck比較，小鼠的體重和3項(xiàng)免疫器官系數(shù)有明顯下降，這驗(yàn)證了小鼠免疫模型建立，cp^-與cp⁺比較，小鼠的免疫力略有恢復(fù)，說(shuō)明多汁乳菇粗多糖有免疫提高作用。

表2第4周(d28)各組小鼠的體重(g)及免疫臟器系數(shù)(m±sd，n＝12)

注:臟器系數(shù)＝臟器重量/體重，單位為mg/g。不同符號(hào)(a～d)表示同一列數(shù)據(jù)之間具有顯著性差異(p<0.05)；顯著性差異采用spss17.0中的dunan’s分析法。

如表3所示，第4周時(shí)，對(duì)小鼠進(jìn)行足跖部過(guò)敏腫脹(dth)和碳廓清試驗(yàn)，lp、mp和hp等3個(gè)多糖劑量組與ck比較，小鼠的足跖部過(guò)敏腫脹癥狀更為明顯，同時(shí)，其巨噬細(xì)胞清除碳粒的能力(吞噬指數(shù)a)也更強(qiáng)，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)，而cp^-與ck比較，小鼠的足跖腫脹程度及巨噬細(xì)胞功能遠(yuǎn)不如ck組，這驗(yàn)證了小鼠免疫損傷模型的建立；cp^-與cp⁺比較，小鼠的免疫力略有恢復(fù)，說(shuō)明多汁乳菇粗多糖有免疫提高作用。

表3第4周(d28)各組小鼠dth及碳廓清指數(shù)檢測(cè)結(jié)果(m±sd，n＝12)

注:足跖部過(guò)敏腫脹程度用dth表示，單位為mm；碳廓清指數(shù)指吞噬指數(shù)a。注：不同字母(a～f)表示同一列數(shù)據(jù)之間具有顯著性差異(p<0.05)；顯著性差異采用spss17.0中的dunan’s分析法。

④全血分析：將小鼠全血立即送檢中山大學(xué)東校區(qū)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心進(jìn)行十八項(xiàng)全血自動(dòng)分析，重點(diǎn)分析其中的淋巴細(xì)胞及白細(xì)胞數(shù)量，小鼠全血中淋巴細(xì)胞數(shù)量及白細(xì)胞數(shù)量如表4所示，lp、mp和hp等3個(gè)多糖劑量組的淋巴細(xì)胞占比明顯高于其他組，與正常組水平相當(dāng)，且lp的白細(xì)胞數(shù)量和淋巴細(xì)胞數(shù)量均顯著高于其他組(p＜0.05)。而cp^-與正常組比較，小鼠的白細(xì)胞數(shù)量和淋巴細(xì)胞數(shù)量都有所下降，這也驗(yàn)證了小鼠免疫損傷模型的建立；另外，cp⁺與cp^-相比較，小鼠的免疫指標(biāo)略有恢復(fù)，介于cp^-和ck之間，表明多汁乳菇多糖顯示出免疫提高作用。cp⁺的白細(xì)胞數(shù)量和淋巴細(xì)胞數(shù)量也都顯著高于cp^-，這表明當(dāng)小鼠受到抗原的襲擊時(shí)，多糖可以明顯增強(qiáng)小鼠細(xì)胞免疫功能且低劑量的促進(jìn)效果最顯著。

表4第4周(d28)各組小鼠全血檢測(cè)結(jié)果(m±sd，n＝12)

注:不同字母(a～e)表示同一列數(shù)據(jù)之間具有顯著性差異(p<0.05)；顯著性差異采用spss17.0中的dunan’s分析法。wbc表示白細(xì)胞數(shù)量，單位為10⁹個(gè)/l；lym表示淋巴細(xì)胞數(shù)量，單位為10⁹個(gè)/l；lym％表示淋巴細(xì)胞占全血細(xì)胞的百分比。

實(shí)施例3

多汁乳菇多糖在發(fā)酵乳中的應(yīng)用

第一步發(fā)酵劑制備：用1ml無(wú)菌水重懸嗜酸乳桿菌(編號(hào)cgmcc1.1878，lactobacillusacidophilus1.1878，中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心保藏，地址：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，郵編：100101)凍干粉，然后全部轉(zhuǎn)接至mrs液體培養(yǎng)基中，于37℃下培養(yǎng)16h，再以5％～10％接種量轉(zhuǎn)接至新鮮的mrs液體培養(yǎng)基中活化3次，于4000rpm低溫離心收集菌體，并將其全部轉(zhuǎn)接至活化用奶液在37℃下活化培養(yǎng)2～3次，即得嗜酸乳桿菌發(fā)酵劑；所述活化用奶液為12.5％的全脂乳粉、8.5％蔗糖混合后，經(jīng)消毒而成。

第二步發(fā)酵用奶液制備及與多糖混合：將12.5％的全脂乳粉、8.5％的蔗糖、0.1％的穩(wěn)定劑粉，按質(zhì)量體積比加入0.00％、0.05％、0.10％、0.15％的多汁乳菇多糖粉混合均勻后，預(yù)熱至60℃在18mpa下均質(zhì)，并于95℃消毒5min后降溫至43℃，備用；

第三步接種和發(fā)酵：按體積比10％的嗜酸乳桿菌發(fā)酵劑加入發(fā)酵用奶液中，于43℃進(jìn)行發(fā)酵，當(dāng)?shù)味ㄋ岫冗_(dá)到75°t后終止發(fā)酵，得到多汁乳菇多糖發(fā)酵乳。

第四步多汁乳菇多糖發(fā)酵乳各項(xiàng)指標(biāo)評(píng)價(jià)

(1)感官質(zhì)量評(píng)價(jià)按照發(fā)酵乳國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)gb19302-2010的要求進(jìn)行，具體評(píng)定項(xiàng)目如表5所示，總分為100分，其中風(fēng)味指標(biāo)和口感指標(biāo)各占30分，外觀指標(biāo)滿分為15分，質(zhì)地指標(biāo)滿分為25分。每項(xiàng)指標(biāo)按照可接受程度分三個(gè)評(píng)分段：不太接受、一般接受、喜歡接受，分值分布如表5。評(píng)分結(jié)果如表6，從風(fēng)味、口感、外觀和質(zhì)地看，多糖含量0.10％的發(fā)酵乳比較好，0.15％的發(fā)酵乳顏色有點(diǎn)深，完全偏離了發(fā)酵乳原有的顏色。多糖含量0.05％的發(fā)酵乳也可以接受。

表5發(fā)酵乳感官評(píng)價(jià)指標(biāo)

表6多汁乳菇多糖添加量對(duì)發(fā)酵乳感官的影響

注：不同字母(a～g)表示同一列數(shù)據(jù)之間具有顯著性差異(p<0.05)；顯著性差異采用spss17.0中的dunan’s分析法。

(2)多汁乳菇多糖發(fā)酵乳理化指標(biāo)評(píng)價(jià)測(cè)定發(fā)酵結(jié)束后發(fā)酵乳的ph、持水力、游離氨基酸、乳酸菌活菌數(shù)、流變學(xué)性質(zhì)

ph不同多糖含量對(duì)發(fā)酵乳的ph的影響如表7，可看出，隨著多糖濃度的增加，發(fā)酵乳的ph也隨之下降，這表明添加多糖可以促進(jìn)嗜酸乳桿菌的產(chǎn)酸能力，這可能與多糖可促進(jìn)乳酸菌的生長(zhǎng)有關(guān)。

持水力稱量15ml的ep管的質(zhì)量記為w0，分別再稱量每種酸奶樣品10g于ep管中，5000rpm離心5min，棄乳清后倒置ep管10min后，稱量總質(zhì)量記為w。平行測(cè)3次取平均值，持水力＝(w-w0)/10×100％。不同多糖含量對(duì)發(fā)酵乳持水力的影響如表7，從中可以看出，添加多糖不會(huì)影響發(fā)酵乳的持水力，均約在99.0％左右。

表7多糖含量對(duì)嗜酸乳桿菌發(fā)酵乳的ph、持水力、活菌數(shù)的影響

乳酸菌活菌數(shù)取出上述制備的發(fā)酵乳樣品1ml與9ml滅菌的生理鹽水混合，即此時(shí)稀釋倍數(shù)為10¹，再依次取前一個(gè)稀釋樣品1ml與9ml滅菌的生理鹽水混合，即得到稀釋倍數(shù)為10²的樣品，依此類推，稀釋至10¹⁰倍，取稀釋后的發(fā)酵乳1ml于平皿中，然后傾入mrs固體培養(yǎng)基覆蓋于菌液表面，置于37℃恒溫培養(yǎng)24h后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。多糖含量對(duì)發(fā)酵乳的嗜酸乳桿菌的影響如表7，隨多糖含量增加，乳酸菌的活菌數(shù)在增加，再次證實(shí)多汁乳菇多糖可以促進(jìn)嗜酸乳桿菌的生長(zhǎng)繁殖，多糖含量為0.15％時(shí)，活菌數(shù)最大為2.14×10¹⁰cfu/ml，4種配方的發(fā)酵乳都滿足發(fā)酵乳國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)gb19302-2010的要求。

游離氨基酸稱取10g的酸奶與5ml的蒸餾水混合，充分?jǐn)嚢韬螅?500rpm冷凍離心5min，取上清4ml與1ml的15％的磺基水楊酸溶液混合，于4℃放置6h以上，然后于10000rpm離心15min，取上清，重復(fù)離心一次，通過(guò)凱氏定氮法確定樣品含氮量后，再將樣品稀釋至含氮量在0.6～1.0％之間。用0.22μm過(guò)濾膜過(guò)濾后裝進(jìn)樣品瓶中，使用c18的柱子，四元泵，紫外檢測(cè)，opa自動(dòng)衍生裝置，自動(dòng)進(jìn)樣分析。多糖含量對(duì)嗜酸乳桿菌發(fā)酵乳中游離氨基酸的影響如表8，當(dāng)多糖含量為0.05％和0.10％時(shí)，必需氨基酸的含量比對(duì)照組(不加多糖)各增加了5.56％和6.02％，主要是纈氨酸含量在增加，從12.56nmol/l增加到22.31nmol/l和31.02nmol/l。與對(duì)照組相比，總的游離氨基酸含量也在增加，分別有547.96nmol/l、545.97nmol/l。再次表明，多汁乳菇多糖能促進(jìn)嗜酸乳桿菌的生長(zhǎng)繁殖，從而更多地產(chǎn)生了必需氨基酸和游離氨基酸，提高了發(fā)酵乳生物效價(jià)。

表8多糖對(duì)嗜酸乳桿菌發(fā)酵乳中17種游離氨基酸的影響(m±sd)(nmol/l)

流變學(xué)性質(zhì)取發(fā)酵乳5ml于哈克流變儀的載物臺(tái)，選擇適宜的程序?qū)悠返目剐巫兡芰梆ざ鹊葏?shù)進(jìn)行測(cè)定，每做完一組程序，打開(kāi)探頭，小心處理掉探頭及載物臺(tái)上的樣品，更換試樣，保存所有的測(cè)定數(shù)據(jù)，應(yīng)用origin8.5對(duì)其進(jìn)行分析處理。多糖含量對(duì)嗜酸乳桿菌發(fā)酵乳的流變學(xué)性質(zhì)影響如圖1和圖2?？芍?，隨著剪切速率的增大，表觀粘度(圖1a)和剪切應(yīng)力均呈現(xiàn)減小的趨勢(shì)，且各組發(fā)酵乳的表觀粘度區(qū)別不大。當(dāng)剪切速率控制在20s^-1以上三時(shí)，添加多糖可提高發(fā)酵乳的剪切應(yīng)力(圖1b)，當(dāng)多糖含量為0.15％時(shí)，其表觀粘度和剪切應(yīng)力均最高且變化較為緩慢，多糖可增加乳酸菌的活力，改善發(fā)酵乳的質(zhì)構(gòu)。圖2為嗜酸乳桿菌發(fā)酵乳經(jīng)頻率掃描、剪切掃描后的測(cè)定結(jié)果，g′、g″分別表示彈性模量和粘性模量，可分別表征發(fā)酵乳抗形變能力和黏度。從圖2可以看出，多糖添加量為0.10％嗜酸乳桿菌發(fā)酵乳抗形變能力最好，黏度最大，交聯(lián)情況最佳，這可能與多糖促進(jìn)乳酸菌產(chǎn)生大量的胞外多糖所致，從而改善了發(fā)酵乳的交聯(lián)結(jié)構(gòu)。綜合上述，在嗜酸乳桿菌發(fā)酵乳中，多糖乳菇多糖的添加量推薦為0.50％～0.10％。

實(shí)施例4

多汁乳菇多糖提取和在發(fā)酵乳中的應(yīng)用

第一步洗滌多汁乳菇，將其烘干去柄，用子實(shí)體部分磨粉，然后過(guò)150目篩網(wǎng)，得到多汁乳菇細(xì)粉，在85℃回流4h進(jìn)行脫脂后，按料液比1:30浸泡2h后，用100w超聲波處理10min，于90℃水浴浸提5h，用150目濾袋過(guò)濾，收集浸提液，于55℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中濃縮至15倍，再加入1/3倍體積的sevag試劑(正丁醇:氯仿的體積比為1:4)脫蛋白質(zhì)，在低溫下用5000rpm離心5min后得到上層浸提液，用適量的蒸餾水稀釋，再用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀去除有機(jī)試劑，于多汁乳菇多糖濃縮液i中加入2倍體積的95％乙醇，于4℃放置18h后用5000rpm離心5min得多汁乳菇多糖濃縮液ii，再用75％乙醇洗滌多汁乳菇多糖濃縮液ii數(shù)2～3次，重新溶解于水后在低溫下用5000rpm離心5min去除不溶物，再將上清液其預(yù)凍后進(jìn)行真空冷凍干燥，得多汁乳菇多糖粉iii，置于密封袋中4℃保存，多糖得率為2.01％(以干重計(jì))。

第二步發(fā)酵劑制備及與多糖混合：用1ml無(wú)菌水重懸嗜酸乳桿菌凍干粉，然后全部轉(zhuǎn)接至mrs液體培養(yǎng)基中，于37℃下培養(yǎng)16h～20h，再以5％～10％接種量轉(zhuǎn)接至新鮮的mrs液體培養(yǎng)基中活化3次，于4000rpm低溫離心收集菌體，并將其全部轉(zhuǎn)接至發(fā)酵用奶液在35℃下活化培養(yǎng)2～3次，即得嗜酸乳桿菌發(fā)酵劑；所述活化用奶液為12.5％的全脂乳粉、8.5％蔗糖混合后，經(jīng)消毒而成。

第三步發(fā)酵用奶液制備：將鮮奶、8.5％的蔗糖、0.1％的穩(wěn)定劑粉，按質(zhì)量體積比加入0.05％多汁乳菇多糖粉iii混合均勻后，預(yù)熱至60℃在18mpa下均質(zhì)，并于95℃消毒5min后降溫至35℃，備用；

第四步接種和發(fā)酵：按體積比5％的嗜酸乳桿菌發(fā)酵劑加入發(fā)酵用奶液中，于35℃進(jìn)行發(fā)酵，當(dāng)?shù)味ㄋ岫冗_(dá)到75°后終止發(fā)酵，得到多汁乳菇多糖發(fā)酵乳，發(fā)酵終點(diǎn)的ph、持水力和活菌數(shù)分別為3.85、99.10％和1.56×10¹⁰cfu/ml，口感質(zhì)量符合要求。若將經(jīng)過(guò)上述步驟得到的凝固型發(fā)酵乳，經(jīng)過(guò)蠕動(dòng)泵破乳，即為攪拌型發(fā)酵乳。

實(shí)施例5

多汁乳菇多糖提取和在發(fā)酵乳中的應(yīng)用

第一步洗滌多汁乳菇，將其烘干去柄，用子實(shí)體部分磨粉，然后過(guò)150目篩網(wǎng)，得到多汁乳菇細(xì)粉，在95℃回流3h進(jìn)行脫脂后，按料液比1:30浸泡1h后，用100w超聲波處理20min，于93℃水浴浸提3.5h，用200目濾袋過(guò)濾，收集浸提液，于55℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中濃縮至25倍，再加入1/4倍體積的sevag試劑(正丁醇:氯仿的體積比為1:4)脫蛋白質(zhì)，在低溫下用5000rpm離心5min后得到上層浸提液，用適量的蒸餾水稀釋，再用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀去除有機(jī)試劑，于多汁乳菇多糖濃縮液i中加入4倍體積的95％乙醇，于3℃放置15h后用5000rpm離心5min得多汁乳菇多糖濃縮液ii，再用75％乙醇洗滌多汁乳菇多糖濃縮液ii數(shù)2～3次，重新溶解于水后在低溫下用5000rpm離心5min去除不溶物，再將上清液其預(yù)凍后進(jìn)行真空冷凍干燥，得多汁乳菇多糖粉iii，置于密封袋中4℃保存，多糖得率為2.15％(以干重計(jì))。

第二步發(fā)酵劑制備：用1ml無(wú)菌水重懸嗜酸乳桿菌凍干粉，然后全部轉(zhuǎn)接至mrs液體培養(yǎng)基中，于37℃下培養(yǎng)16h～20h，再以5％～10％接種量轉(zhuǎn)接至新鮮的mrs液體培養(yǎng)基中活化3次，于4000rpm低溫離心收集菌體，并將其全部轉(zhuǎn)接至發(fā)酵用奶液在35℃下活化培養(yǎng)2～3次，即得嗜酸乳桿菌發(fā)酵劑；所述活化用奶液為10.0％的全脂乳粉、7.5％蔗糖混合后，經(jīng)消毒而成。

第三步發(fā)酵用奶液制備及與多糖混合：將鮮奶、8.5％蔗糖、0.1％穩(wěn)定劑粉，按質(zhì)量體積比加入0.05％多汁乳菇多糖粉iii混合均勻后，預(yù)熱至60℃在18mpa下均質(zhì)，并于95℃消毒5min后降溫至37℃，備用；

第四步接種和發(fā)酵：按體積比5％的嗜酸乳桿菌發(fā)酵劑加入發(fā)酵用奶液中，于37℃進(jìn)行發(fā)酵，當(dāng)?shù)味ㄋ岫冗_(dá)到75°后終止發(fā)酵，得到多汁乳菇多糖發(fā)酵乳，發(fā)酵終點(diǎn)的ph、持水力和活菌數(shù)分別為3.91、99.03％和1.47×10¹⁰cfu/ml，口感質(zhì)量符合要求。若將經(jīng)過(guò)上述步驟得到的凝固型發(fā)酵乳，經(jīng)過(guò)蠕動(dòng)泵破乳，即為攪拌型發(fā)酵乳。

實(shí)施例6

多汁乳菇多糖提取和在發(fā)酵乳中的應(yīng)用

第一步洗滌多汁乳菇，將其烘干去柄，用子實(shí)體部分磨粉，然后過(guò)180目篩網(wǎng)，得到多汁乳菇細(xì)粉，在90℃回流3.5h進(jìn)行脫脂后，按料液比1:30浸泡2h后，用100w超聲波處理18min，于95℃水浴浸提3h，用200目濾袋過(guò)濾，收集浸提液，于55℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中濃縮至20倍，再加入1/3倍體積的sevag試劑(正丁醇:氯仿的體積比為1:4)脫蛋白質(zhì)，在低溫下用5000rpm離心5min后得到上層浸提液，用適量的蒸餾水稀釋，再用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀去除有機(jī)試劑，于多汁乳菇多糖濃縮液i中加入3.5倍體積的95％乙醇，于4℃放置15h后用5000rpm離心5min得多汁乳菇多糖濃縮液ii，再用75％乙醇洗滌多汁乳菇多糖濃縮液ii數(shù)2～3次，重新溶解于水后在低溫下用5000rpm離心5min去除不溶物，再將上清液其預(yù)凍后進(jìn)行真空冷凍干燥，得多汁乳菇多糖粉iii，置于密封袋中4℃保存，多糖得率為2.05％(以干重計(jì))。

第二步發(fā)酵劑制備：用1ml無(wú)菌水重懸嗜酸乳桿菌凍干粉，然后全部轉(zhuǎn)接至mrs液體培養(yǎng)基中，于37℃下培養(yǎng)16h～20h，再以5％～10％接種量轉(zhuǎn)接至新鮮的mrs液體培養(yǎng)基中活化3次，于4000rpm低溫離心收集菌體，并將其全部轉(zhuǎn)接至發(fā)酵用奶液在41℃下活化培養(yǎng)2～3次，即得嗜酸乳桿菌發(fā)酵劑；所述活化用奶液為11.0％的全脂乳粉、8.0％蔗糖混合后，經(jīng)消毒而成。

第三步發(fā)酵用奶液制備及與多糖混合：將8.5％脫脂奶粉、3.0％稀奶油、7.5％的蔗糖、0.1％的穩(wěn)定劑粉，按質(zhì)量體積比加入0.10％多汁乳菇多糖粉iii混合均勻后，預(yù)熱至60℃在18mpa下均質(zhì)，并于95℃消毒5min后降溫至41℃，備用；

第四步接種和發(fā)酵：按體積比5％的嗜酸乳桿菌發(fā)酵劑加入發(fā)酵用奶液中，于41℃進(jìn)行發(fā)酵，當(dāng)?shù)味ㄋ岫冗_(dá)到75°后終止發(fā)酵，得到多汁乳菇多糖發(fā)酵乳，發(fā)酵終點(diǎn)的ph、持水力和活菌數(shù)分別為3.88、99.20％和1.35×10¹⁰cfu/ml，口感質(zhì)量符合要求。若將經(jīng)過(guò)上述步驟得到的凝固型發(fā)酵乳，經(jīng)過(guò)蠕動(dòng)泵破乳，即為攪拌型發(fā)酵乳。