本發(fā)明涉及一種酸奶，尤其是涉及一種促進(jìn)傷口愈合酸奶的制備方法。

背景技術(shù)：

創(chuàng)傷愈合是指機(jī)體遭受外力作用，皮膚等組織出現(xiàn)離斷或缺損后的愈復(fù)過程，為包括各種組織的再生和肉芽組織增生、瘢痕組織形成的復(fù)雜組合，表現(xiàn)出各種過程的協(xié)同作用。一般小傷口會(huì)很容易愈合，但對于這些傷口較大同時(shí)伴隨失血較多等情況，病人或傷者身體抵抗力恢復(fù)力下降致使傷口難以愈合甚至被感染。所以快速便捷的補(bǔ)充一些營養(yǎng)物來提高身體的抵抗力恢復(fù)能力尤為重要。在術(shù)后病人一般很虛弱難以通過正常的飲食來補(bǔ)充相應(yīng)的營養(yǎng)物質(zhì)，這時(shí)就需要一種便捷易吸收并富含所需營養(yǎng)的流體食品來促進(jìn)病人的傷口恢復(fù)。

針對術(shù)后病人傷口難以愈合的特點(diǎn)，可以補(bǔ)充蛋白質(zhì)、糖類、脂質(zhì)、維生素（c、a、b2等）、微量元素（鋅、鐵、鈣等）來促進(jìn)造血提高免疫力，促進(jìn)細(xì)胞分裂生長，防止傷口感染最終達(dá)到促進(jìn)傷口愈合的目的。蛋白質(zhì)類物質(zhì)、糖類、脂質(zhì)都是細(xì)胞生長代謝分裂過程中不可缺少的營養(yǎng)物質(zhì)。維生素、微量元素在調(diào)解人體代謝免疫方面具有很好的作用。當(dāng)然鋅、鐵、鈣等微量元素也是細(xì)胞的重要組成物質(zhì)，具有促進(jìn)細(xì)胞生長的功能。這些營養(yǎng)物也是身體產(chǎn)生血液不可或缺的，而人體免疫力和血液有著很大的聯(lián)系。在酸奶中加入這些物質(zhì)含量高的原料無疑可以加快傷口周圍細(xì)胞的分裂生長，進(jìn)而促進(jìn)傷口愈合。

番茄能清熱止渴，養(yǎng)陰涼血、生津止渴。生吃能補(bǔ)充維生素c。煮熟后食用，所含的番茄紅素和其他抗氧化劑含量會(huì)顯著上升，起到降低心臟病的風(fēng)險(xiǎn)和抗衰老的作用?？墒秤貌糠?7%。每l00g中含能量79kj，水分94.4g、蛋白質(zhì)0.9g、脂肪0.2g，膳食纖維0.5g，碳水化合物3.5g、胡蘿卜素550μg、視黃醇當(dāng)量92μg、硫胺素0.03mg、核黃素0.03mg、尼克酸0.6mg；維生素19mg，維生素e0.57mg；鉀163mg、鈉5mg、鈣10mg、鎂9mg，鐵0.4mg，錳0.08mg、鋅0.13mg、銅0.06mg，磷2mg；硒0.15μg。且含腺嘌呤、膽堿、番茄堿以及抗炎、利尿、降壓的成分。

菠菜為莧科植物菠菜的帶根全草，菠菜有潤肺滑腸、清熱除煩的功效。菠菜營養(yǎng)成分極其豐富，菠菜葉含鋅56～68mg/kg(干重)，葉酸1.22ug/g，氨基酸和葉黃素、β-胡蘿卜素、新-β-胡蘿卜素b、新-β-胡蘿卜素。菠菜素u等類胡蘿卜素、還含α-菠菜甾醇、膽甾醇以及甾醇酯和甾醇甙、萬壽菊素、菠葉素，和一種青紫色螢光物質(zhì)2-乙?；?3-對羥基苯丙烯酰基內(nèi)消旋酒石酸。菠菜含水分、碳水化合物、蛋白質(zhì)、脂肪、膳食纖維、胡蘿卜素、維生素b1、維生素b2、維生素c、鉀、鈉、鈣、磷、銑、鎂等營養(yǎng)元素。菠菜還可以促進(jìn)人體健康，防止衰老，防治缺鐵性貧血;菠菜中的維生素c和葉酸含量豐富，可以增強(qiáng)產(chǎn)婦對鐵元素的吸收力，是缺鐵性貧血的理想食物，菠菜中的膳食纖維能起到很好的通便作用。菠菜具有促進(jìn)培養(yǎng)細(xì)胞增殖的作用。菠菜中所含的胡蘿卜素，在人體內(nèi)轉(zhuǎn)變成維生素a，能維護(hù)正常視力和上皮細(xì)胞的健康，增加預(yù)防傳染病的能力。

研究發(fā)現(xiàn)，每100克黑豆中：水分9.9g、灰分：4.6g、維生素e(t)1736mg、鋅4.8mg、熱量381kj、膳食纖維10.2g、鈣：224mg、硒6.79ug、能量1594kj、胡蘿卜素30mg、磷500mg、銅156mg、蛋白質(zhì)36g、硫胺素ug、鉀1377mg、錳2.83mg、脂肪15.9g、核黃素0.33mg、鈉3mg、鐵7mg、碳水化合物33.6mg、尼克酸2mg、鎂243mg、維生素a5mg，含粗脂肪高達(dá)12g以上，檢測發(fā)現(xiàn)其中含有至少19種脂肪酸，而且不飽和脂肪酸含量竟然高達(dá)80%，其中亞油酸含量就占了約55.08%。亞油酸作為不飽和脂肪酸的一種，是人體中十分重要的必須脂肪酸，對膽固醇代謝具有至關(guān)重要的調(diào)節(jié)作用，只有當(dāng)膽固醇與亞油酸結(jié)合時(shí)才能在體內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)而進(jìn)行正常代謝。而當(dāng)亞油酸缺乏時(shí),膽固醇將與飽和脂肪酸結(jié)合并在人體內(nèi)沉積，導(dǎo)致動(dòng)脈硬化的發(fā)生。因此，亞油酸又有“血管清道夫”的美譽(yù)。

蘄艾葉主要成份為乙酸乙酯、1.8~桉葉油素、水合莰烯、樟腦、2~松油醇、葛縷酮等化學(xué)物，其精油的出油率蘄艾（1.06%）為一般艾（0.54%）的兩倍。同時(shí)，蘄艾含側(cè)柏酮（15.6%）和異側(cè)柏酮（2.7%），而一般艾則未見此成份。蘄艾油有明顯的平喘、鎮(zhèn)咳、祛痰及清炎作用?，F(xiàn)代實(shí)驗(yàn)研究證明，艾葉具有抗菌及抗病毒作用，艾草還具有散寒除濕，調(diào)經(jīng)止血的功效，對女性月經(jīng)不調(diào)、經(jīng)痛腹痛都有一定的療效。

蜂蜜中含有果糖、葡萄糖、酶、蛋白質(zhì)、維生素及多種礦物質(zhì)。常吃可以防治貧血、心臟病、腸胃病等，并能提高人體免疫力。單糖：葡萄糖和果糖可直接被人體消化吸收。酶類：各種酶能夠促進(jìn)人體對多種物質(zhì)的消化吸收。乙酰膽堿：消除疲勞、興奮神經(jīng)、提高記憶力。黃酮：抗氧化，提高機(jī)體免疫力。蜂蜜是被廣泛認(rèn)知的天然營養(yǎng)食品。試驗(yàn)表明，蜂蜜中含有與人體血清濃度相似的各種無機(jī)鹽，如鐵、鈣、銅、錳、鉀、磷等，還有多種維生素和有機(jī)酸，因此蜂蜜被稱為“血清之王”。此外，蜂蜜還具有護(hù)膚美容、抗菌消炎、促進(jìn)組織再生、促進(jìn)長壽、改善睡眠、保肝作用、抗疲勞、促進(jìn)兒童生長發(fā)育、保護(hù)心血管、潤肺止咳等作用。目前，具有促進(jìn)傷口愈合功效的功能性酸奶尚未見報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種能提高機(jī)體免疫避免傷口感染，抗氧化，促進(jìn)造血，促進(jìn)傷口細(xì)胞分裂生長、延長酸奶保質(zhì)期的促進(jìn)傷口愈合的酸奶及其制備方法。

本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案為：一種促進(jìn)傷口愈合酸奶的制備方法，包括以下步驟：

（1）復(fù)原乳的制作：將奶粉與60～70℃的溫水按質(zhì)量比15：100的比例混合后，充分?jǐn)嚢枞芙猓M(jìn)行巴氏滅菌，得到復(fù)原乳；

（2）混合漿汁的制備：將西紅柿汁、菠菜汁、艾葉汁、黑豆?jié){汁和蜂蜜水按質(zhì)量比1：1：1：1：1混合形成混合漿汁，充分?jǐn)嚢杈鶆颍?/p>

（3）混合液制備：將復(fù)原乳與混合漿汁按體積比3：1比例充分混合均勻后，再加入復(fù)原乳質(zhì)量6～7％的白砂糖，攪拌均勻得到混合液；

（4）均質(zhì)殺菌：將混合液加入到高壓均質(zhì)機(jī)中，控制混合液溫度為65-75℃，均質(zhì)壓力為15-25mpa；將均質(zhì)過的混合液于90～95℃高溫殺菌，保持5min，得到混合發(fā)酵原料；

（5）功能性發(fā)酵劑的制備：分別將保藏于-40℃冰箱中的干酪乳桿菌xs1和植物乳桿菌rub1菌種，放于室溫解凍，按質(zhì)量體積比1%的接種量加入滅菌后的mrs液體培養(yǎng)基中，置于37℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)8h，得到中間發(fā)酵劑；再吸取中間發(fā)酵劑以質(zhì)量體積比2%的接種量加入滅菌后的mrs液體培養(yǎng)基中，置于37℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)8h，即分別得到干酪乳桿菌xs1發(fā)酵劑和植物乳桿菌rub1發(fā)酵劑；

（6）接種：在步驟（4）得到的混合發(fā)酵原料中按質(zhì)量比0.1%～0.11%的接種量加入酸奶發(fā)酵劑菌粉，然后按質(zhì)量體積比1～2%的接種量加入干酪乳桿菌xs1以及質(zhì)量體積比1～2%的接種量加入植物乳桿菌rub1發(fā)酵劑，攪拌5min后，裝入經(jīng)高壓蒸汽滅菌后的瓶中封口；

（7）發(fā)酵：在42℃的恒溫培養(yǎng)箱中靜置發(fā)酵4～5h，停止發(fā)酵后，于0～5℃下冷藏，即得到促進(jìn)傷口愈合的酸奶。后熟的目的以防止過酸，促進(jìn)芳香物質(zhì)的產(chǎn)生。

步驟（2）所述的西紅柿汁的制備過程為選取新鮮西紅柿洗凈切塊，用榨汁機(jī)榨汁3分鐘，經(jīng)8層紗布過濾后獲得西紅柿汁；所述的菠菜汁的制備過程為選取新鮮的菠菜洗凈切碎，用榨汁機(jī)榨汁3分鐘，經(jīng)8層紗布過濾后獲得菠菜汁；所述的艾葉汁的制備過程為選取新鮮的艾葉洗凈，用榨汁機(jī)榨汁3分鐘，經(jīng)8層紗布過濾獲得艾葉汁；所述的黑豆?jié){的制備過程為選擇顆粒飽滿且無雜質(zhì)的黑豆，用濃度0.5wt％的nahco3溶液20℃浸泡10～12h后，將黑豆用溫度為80℃、濃度為0.5wt％的nahco3溶液漂燙10min，迅速冷卻，脫去種皮，按黑豆與水的質(zhì)量比為1：3的比例，磨漿得黑豆?jié){，再將黑豆?jié){煮沸5分鐘，最后將黑豆?jié){用8層紗布過濾；所述的蜂蜜水的制備過程為將品質(zhì)良好的蜂蜜取50ml加150ml的溫開水化開。

步驟（6）中所述的酸奶發(fā)酵劑菌粉由保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌按質(zhì)量比1：1的比例混合而成。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：本發(fā)明一種促進(jìn)傷口愈合酸奶的制備方法，首次在酸奶中添加了艾葉，艾葉具有的抗菌作用，而且酸奶的酸性環(huán)境可以提高艾葉中揮發(fā)油的抗菌作用，同時(shí)在功能性發(fā)酵劑的抑菌的雙重作用下，使酸奶的保質(zhì)期延長至40-50d；由于蜂蜜富含有機(jī)糖類，它的加入促進(jìn)了黑豆中黃酮類物質(zhì)的溶解與保護(hù)，使得本酸奶在促進(jìn)傷口愈合的同時(shí)也具有很好的抗氧化作用。每100ml酸奶中大約含有2.5~3.0mg的fe元素。該酸奶促進(jìn)細(xì)胞分裂提高了20%~25%。本酸奶能調(diào)解培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞分泌tnf-α（腫瘤壞死因子α）和il-1β（白細(xì)胞介素1β）的量（p<0.05）。具有改善便秘，預(yù)防和治療貧血、增強(qiáng)免疫、抑菌抗炎，促進(jìn)傷口愈合的功效。

綜上所述，本發(fā)明促進(jìn)傷口愈合酸奶的制備方法，以西紅柿、菠菜、艾葉、黑豆、蜂蜜這些食品為原料，添加于牛奶中，生產(chǎn)促進(jìn)傷口愈合的酸奶，簡化了生產(chǎn)工藝，最大限度的保留的原料的營養(yǎng)價(jià)值，降低了成本，各營養(yǎng)物質(zhì)之間又相互促進(jìn)吸收提高了產(chǎn)品的營養(yǎng)價(jià)值和經(jīng)濟(jì)效益。所得到的促進(jìn)傷口愈合的酸奶顏色淡黃，質(zhì)地均勻，有黑豆的豆香、蔬菜艾葉的清香、食用時(shí)能感覺到豆沙的質(zhì)感，不粗糙、不澀口；口感酸甜適宜，回味有蜂蜜的甘甜，富含營養(yǎng)成分、維生素、微量元素能提高機(jī)體免疫避免傷口感染，抗氧化，促進(jìn)造血，促進(jìn)傷口細(xì)胞分裂生長、保質(zhì)期延長的酸奶，有助于傷口愈合，減少手術(shù)或受傷病人的痛苦。

分類命名為植物乳桿菌(lactobacillusplantarum)，菌株為rub1，保藏號為cgmccno.8211，于2013年09月17日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所。

分類命名為干酪乳桿菌(lactobacilluscasei)，菌株為xs1，保藏號為cgmccno.8213，于2013年09月17日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所。

上述植物乳桿菌rub1（保藏編號為cgmccno.8211）與干酪乳桿菌xs1（保藏編號為cgmccno.8213）具有很好的抑菌作用，對沙門氏菌、單增李斯特菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和蠟樣芽孢桿菌等致病菌有很好的抑制作用。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。

一、實(shí)驗(yàn)方法

受傷后常伴有失血，而fe元素在造血的過程中扮演著重要的角色。傷口的愈合的過程中需要上皮細(xì)胞的分裂生長來實(shí)現(xiàn)。一般細(xì)菌感染導(dǎo)致的炎癥是抑制傷口愈合的重要因素。所以本實(shí)驗(yàn)通過測定酸奶中fe元素的含量，促進(jìn)小鼠腸上皮細(xì)胞的分裂生長以及培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞分泌的炎癥因子tnf-α和il-1β的量作為檢測標(biāo)準(zhǔn)來確定該酸奶的功能。

1、酸奶中fe元素含量的測定

（1）儀器和材料：原子吸收分光光度計(jì)（aa-6800日本島津公司），馬弗爐，鐵元素的空心陰極燈等。本專利的酸奶，普通酸奶，雙氧水，濃硫酸，硝酸，超純水，鐵元素的標(biāo)準(zhǔn)工作液等

（2）實(shí)驗(yàn)檢測：在室溫下用移液管移取4ml樣品與干鍋中，加入4ml濃硫酸2ml雙氧水，靜置約10min,然后放在電爐上加熱至冒出白煙為止。待其冷卻至50~60℃。再向坩堝中加入2ml濃硫酸，蓋上坩堝蓋。將裝有預(yù)處理樣品的坩堝依次放入馬弗爐中完全灰化。調(diào)溫至600~650℃，約2h后取出，觀察坩堝中的樣品是否已成純白色的灰分，如果是則已經(jīng)完全灰化。冷卻后，用稀硝酸充分溶解灰分，并移入100ml容量瓶中，用超純水定容，搖勻備用。同時(shí)做樣品空白。

表1標(biāo)準(zhǔn)溶液系列

表2儀器工作條件

注：空氣流量為8.0l/min。

回收率和精密度試驗(yàn)：去同一樣品3份，分別加入一定量標(biāo)準(zhǔn)溶液，與其他標(biāo)準(zhǔn)樣品同樣方法消化處理，進(jìn)行樣品加標(biāo)準(zhǔn)回收率試驗(yàn)以檢驗(yàn)測定結(jié)果的可靠性。取樣品重復(fù)測定3次，以檢驗(yàn)方法的精密度每個(gè)樣品處理完分別加上測定3次，取其平均值為檢測結(jié)果。

樣品中fe元素的含量：據(jù)儀器測定的線性范圍，適當(dāng)稀釋或濃縮樣品溶液，測其吸光度。經(jīng)回歸分析得出回歸方程，將測得的吸光度值代人回歸方程，計(jì)算出該樣品中fe元素的含量，以5次平行測定的平均值表示樣品中fe元素的含量。

2、該酸奶對促進(jìn)腸上皮細(xì)胞分裂生長的檢測

（1）細(xì)胞培養(yǎng)：應(yīng)用含有200ml/l胎牛血清、青霉素-鏈霉素雙抗液、ph值為7.2的dmem培養(yǎng)液在37℃、50ml/lco2條件下培養(yǎng)小鼠腸上皮細(xì)胞，每天換液一次；

（2）采用細(xì)胞計(jì)數(shù)法檢測該酸奶對腸上皮細(xì)胞分裂生長的作用：當(dāng)細(xì)胞生長達(dá)融合狀態(tài)時(shí)，消化傳代，計(jì)數(shù)，均勻傳代3瓶，放入37℃50ml/lco2孵箱培養(yǎng)24h，細(xì)胞貼壁后，在①號瓶中加入適量該酸奶，在②號瓶中加入普通酸奶，③號瓶做空白對照。分別在第1、2、3、4天消化計(jì)數(shù)細(xì)胞。

3、培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞株的tnf-α和il-1β分泌量檢測

本方案通過建立脂多糖（lps）刺激巨噬細(xì)胞株raw246.7活化的體外炎癥模型來確定酸奶的抗炎作用。lps的誘導(dǎo)，能導(dǎo)致相關(guān)炎癥因子如tnf-α、il-1β量的變化，通過測定巨噬細(xì)胞上清液中各種炎癥因子的分泌量造模前后、給酸奶提取物前后的變化來判定酸奶是否具有抗感染作用。

（1）主要溶液及配制

①1640培養(yǎng)基：用90ml超純水溶解13.4gdmem干粉型培養(yǎng)基，磁力攪拌使干粉完全溶解，加2.23gnahco3及3.08ghepes，調(diào)整ph值至7.2~7.4，加水定容至1000ml，0.22μm濾膜過濾除菌后分裝，-20℃保存；

②0.25%的胰蛋白酶：稱取胰蛋白酶0.5g，加入200mlpbs中，磁力攪拌使其完全溶解，0.22μm濾膜過濾除菌后分裝，-20℃保存；

③酸奶提取物：取100ml酸奶進(jìn)行冷凍離心（10000r/min，10min），用0.2μm濾膜兩遍,取上清液；

④儀器：sorvallst16r冷凍離心機(jī)（美國thermofishrscientific公司）；小鼠tnf-αelisa試劑盒（美國r＆d公司，批號：201207）；小鼠il-1βelisa試劑盒（美國r＆d公司，批號：201207。

（2）細(xì)胞培養(yǎng)

①源性巨噬細(xì)胞株raw264.7培養(yǎng)于rpmi1640培養(yǎng)基中（含10%新生牛血清、100μg/ml鏈霉素、100μ/ml青霉素）。培養(yǎng)條件為37℃，二氧化碳濃度為5%，連續(xù)培養(yǎng)；

②細(xì)胞用0.25%的胰蛋白酶消化，在鏡下觀察變圓后加入冷的培養(yǎng)基停止消化，反復(fù)吹打后離心取沉淀用培養(yǎng)基重懸，接種于培養(yǎng)皿，接種初始密度2×105/ml，培養(yǎng)至80%融合后用于實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)前無血清12小時(shí)處理使細(xì)胞同步化；

③酸奶提取物按不同濃度加入，預(yù)先孵育2h，溶劑對照為dmso，后加入200ng/ml的lps（終濃度）刺激不同時(shí)間，分別取上清液培養(yǎng)，細(xì)胞用于不同指標(biāo)檢測。

（3）mtt比色法檢測

原理：mtt商名為噻唑藍(lán)，為淡黃色，它可以被活細(xì)胞線粒體內(nèi)的琥珀酸脫氫酶還原成難溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶紫物甲瓚并沉積在細(xì)胞體內(nèi)，但在死細(xì)胞內(nèi)mtt不能還原為藍(lán)紫色結(jié)晶物。該結(jié)晶可被二甲基亞砜（dmso）或酸化異丙醇等溶解后在560-610nm處有一個(gè)較寬的最大的吸收峰，用酶標(biāo)儀可定量測定570nm處的光吸收。由于甲瓚的生成量與線粒體琥珀酸脫氫酶活性呈正相關(guān)，可用光吸收度的大小反映脫氫酶活性，從而間接反映活細(xì)胞的數(shù)量，活細(xì)胞越多，紫色產(chǎn)物越多，則光吸收（od值）越高。

方法：用96孔板培養(yǎng)細(xì)胞，按照實(shí)驗(yàn)分組加入不同濃度的酸奶提取物（0.8，4,20,40,80μm），在37℃、含5%co2的培養(yǎng)箱內(nèi)孵育18h，加入終濃度為0.5mg/ml的mtt，孵育4h后，吸棄上清液，每孔加入二甲基亞砜（dmso），室溫振蕩10min，待紫色結(jié)晶物充分溶解，用全自動(dòng)酶標(biāo)儀讀取570nm處光密度值，每組重復(fù)5孔。計(jì)算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率=（檢測孔的od值/對照孔的od值）×100%。

（4）該酸奶對raw264.7細(xì)胞分泌tnf-α量影響的檢測

酸奶提取物按不同濃度加入（0.8,4,20μm），預(yù)先孵育2h，其它組加入溶劑做對照，換液去除酸奶后加入200ng/ml的lps（終濃度）刺激18h，分別取上清培養(yǎng)液，置于-20℃保存至檢測。每個(gè)標(biāo)本做復(fù)孔測定。測定步驟如下：

①每孔加入樣品0.1ml，酶標(biāo)板加上蓋，37℃反應(yīng)90分鐘；

②反應(yīng)后用甩去酶標(biāo)板內(nèi)的液體，再對著吸水紙拍幾下，不洗；

③將準(zhǔn)備好的生物素抗tnf-α抗體工作液按每孔0.1ml依次加入。37℃反應(yīng)60分鐘；

④每孔加入0.01mpbs0.35ml洗滌3次，每次浸泡1分鐘左右；

⑤將準(zhǔn)備好的abc工作液按每孔0.1ml依次加入，（tmb空白顯色孔除外）。37℃反應(yīng)30分鐘；

⑥每孔加入0.01mpbs0.35ml洗滌5次，每次浸泡1~2分鐘左右；

⑦按每孔90μl依次加入已在37℃平衡30分鐘的tmb顯色液，37℃避光反應(yīng)15分鐘；

⑧按每孔0.1ml依次加入tmb終止液，此時(shí)藍(lán)色轉(zhuǎn)黃色。用酶標(biāo)儀在50nm測定od值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算相應(yīng)的濃度。

（5）細(xì)胞上清液il-1β檢測

采用小鼠il-1βelisa試劑盒，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作，步驟如下：

①標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋與加樣：在酶標(biāo)包被板上設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔10孔，子1、2孔中分別加標(biāo)準(zhǔn)品100μl，然后在第1、2孔中加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50μl，混勻；然后從第1、2孔中各取100μl分別加到第3、4孔，再于第3、4孔中分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50μl，混勻；然后在第3、4孔中各取50μl棄去，再各取50分別加到第5、6孔中，于第5、6孔中分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50μl，混勻；從第5、6孔中各取50分別加到7、8孔中，再于7、8孔中分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50μl，混勻；從第7、8孔中各取50μl分別加到第9、10孔中，再于第9、10孔中分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50μl混勻，然后在第9、10孔中各取50μl棄去。稀釋后各孔加樣品量均為50μl，濃度分別為90ng/l、60ng/l、30ngμg/l、15ng/l、7.5ng/l；

②加樣：分別設(shè)置白孔（不加樣品及酶標(biāo)試劑，其余各步驟操作相同）、待測樣品孔。在待測樣品孔中各加樣品稀釋液40μl，然后再分別加待測樣品10μl（樣品最終稀釋度為5倍）。加樣將樣品加于酶標(biāo)儀板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動(dòng)混勻；

③溫育：以封板膜封板后置于電熱恒溫培養(yǎng)箱37°c溫育30分鐘；

④配液：將30（48t的20倍）倍濃縮洗滌液用蒸餾水30（48t的20倍）倍稀釋后備用；

⑤洗板：取出酶標(biāo)板，小心揭去封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗板液，靜置30秒后棄去，如此重復(fù)5次，拍干；

⑥加酶：每孔加入酶標(biāo)試劑50μl，空白孔除外；

⑦溫育：以封板膜封板后置于電熱恒溫培養(yǎng)箱37°c溫育30分鐘；

⑧洗板：取出酶標(biāo)板，小心揭去封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗板液，靜置30秒后棄去，如此重復(fù)5次，拍干；

⑨顯色：每孔先加入50μl顯色劑a，再加入50μl顯色劑b，輕輕震蕩混勻，37°c避光顯色15分鐘；

⑩終止：每孔加終止液50μl終止顯色反應(yīng)。以空白孔調(diào)零，450nm波長依序測定各孔吸光度。測定應(yīng)在加終止液后15分鐘以內(nèi)進(jìn)行。

計(jì)算：根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度及對應(yīng)的od值，計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程，在根據(jù)樣品的od值，在回歸方程上計(jì)算出對應(yīng)的樣品濃度，最終濃度為實(shí)際濃度乘以稀釋倍數(shù)。

二、具體實(shí)施例

實(shí)施例1

一種促進(jìn)傷口愈合酸奶的制備方法，包括以下步驟：

（1）復(fù)原乳的制作：將奶粉與65℃的溫水按質(zhì)量比15：100的比例混合后，充分?jǐn)嚢枞芙猓M(jìn)行巴氏滅菌，得到復(fù)原乳；

（2）混合漿汁的制備：將西紅柿汁、菠菜汁、艾葉汁、黑豆?jié){汁和蜂蜜水按質(zhì)量比1：1：1：1：1混合形成混合漿汁，充分?jǐn)嚢杈鶆?；其?/p>

西紅柿汁的制備過程為選取新鮮西紅柿洗凈切塊，用榨汁機(jī)榨汁3分鐘，經(jīng)8層紗布過濾后獲得西紅柿汁；菠菜汁的制備過程為選取新鮮的菠菜洗凈切碎，用榨汁機(jī)榨汁3分鐘，經(jīng)8層紗布過濾后獲得菠菜汁；艾葉汁的制備過程為選取新鮮的艾葉洗凈，用榨汁機(jī)榨汁3分鐘，經(jīng)8層紗布過濾獲得艾葉汁；黑豆?jié){的制備過程為選擇顆粒飽滿且無雜質(zhì)的黑豆，用濃度0.5wt％的nahco3溶液20℃浸泡10～12h后，將黑豆用溫度為80℃、濃度為0.5wt％的nahco3溶液漂燙10min，迅速冷卻，脫去種皮，按黑豆與水的質(zhì)量比為1：3的比例，磨漿得黑豆?jié){（以使黑豆組織細(xì)胞破裂、蛋白質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)溶于水中，黑豆纖維沉淀），再將黑豆?jié){煮沸5分鐘，最后將黑豆?jié){用8層紗布過濾；蜂蜜水的制備過程為將品質(zhì)良好的蜂蜜取50ml加150ml的溫開水化開；

（3）混合液制備：將復(fù)原乳與混合漿汁按體積比3：1比例充分混合均勻后，再加入復(fù)原乳質(zhì)量6～7％的白砂糖，攪拌均勻得到混合液；

（4）均質(zhì)殺菌：將混合液加入到高壓均質(zhì)機(jī)中，控制混合液溫度為70℃，均質(zhì)壓力為20mpa；將均質(zhì)過的混合液于92℃高溫殺菌，保持5min，得到混合發(fā)酵原料；

（5）功能性發(fā)酵劑的制備：分別將保藏于-40℃冰箱中的干酪乳桿菌xs1和植物乳桿菌rub1菌種，放于室溫解凍，按質(zhì)量體積比1%的接種量加入滅菌后的mrs液體培養(yǎng)基中，置于37℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)8h，得到中間發(fā)酵劑；再吸取中間發(fā)酵劑以質(zhì)量體積比2%的接種量加入滅菌后的mrs液體培養(yǎng)基中，置于37℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)8h，即分別得到干酪乳桿菌xs1發(fā)酵劑和植物乳桿菌rub1發(fā)酵劑；

（6）接種：在步驟（4）得到的混合發(fā)酵原料中按質(zhì)量比0.105%的接種量加入酸奶發(fā)酵劑菌粉（由保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌按質(zhì)量比1：1的比例混合而成），然后按質(zhì)量體積比1.5%的接種量加入干酪乳桿菌xs1以及質(zhì)量體積比1.5%的接種量加入植物乳桿菌rub1發(fā)酵劑，攪拌5min后，裝入經(jīng)高壓蒸汽滅菌后的瓶中封口；

（7）發(fā)酵：在42℃的恒溫培養(yǎng)箱中靜置發(fā)酵4.5h，停止發(fā)酵后，于0～5℃下冷藏，即得到促進(jìn)傷口愈合的酸奶。后熟的目的以防止過酸，促進(jìn)芳香物質(zhì)的產(chǎn)生。

實(shí)施例2

同上述實(shí)施例1，其區(qū)別在于：

步驟（1）中將奶粉與60℃的溫水混合后；

步驟（4）中控制混合液溫度為65℃，均質(zhì)壓力為15mpa；將均質(zhì)過的混合液于9095℃高溫殺菌，保持5min；

步驟（6）中混合發(fā)酵原料中按質(zhì)量比0.1%%的接種量加入酸奶發(fā)酵劑菌粉，然后按質(zhì)量體積比1%的接種量加入干酪乳桿菌xs1以及質(zhì)量體積比1%的接種量加入植物乳桿菌rub1發(fā)酵劑；

步驟（7）中：在恒溫培養(yǎng)箱中靜置發(fā)酵4h。

實(shí)施例3

同上述實(shí)施例1，其區(qū)別在于：

步驟（1）中將奶粉與70℃的溫水混合后；

步驟（4）中控制混合液溫度為75℃，均質(zhì)壓力為25mpa；將均質(zhì)過的混合液于95℃高溫殺菌，保持5min；

步驟（6）中混合發(fā)酵原料中按質(zhì)量比0.11%的接種量加入酸奶發(fā)酵劑菌粉，然后按質(zhì)量體積比2%的接種量加入干酪乳桿菌xs1以及質(zhì)量體積比2%的接種量加入植物乳桿菌rub1發(fā)酵劑；

步驟（7）中在恒溫培養(yǎng)箱中靜置發(fā)酵5h。

當(dāng)然，以上述說不是對本發(fā)明的限制，本發(fā)明也并不限于上述舉例。本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明的實(shí)質(zhì)范圍內(nèi)，做出的變化、改型、添加或替換，也應(yīng)屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。