本發(fā)明涉及蛋白工業(yè)，具體涉及一種膠原蛋白凍干粉及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、膠原蛋白是動(dòng)物體內(nèi)含量最豐富的一類結(jié)構(gòu)蛋白，廣泛存在于皮膚、骨骼、軟骨、血管等結(jié)締組織中。它由三條多肽鏈組成三股螺旋結(jié)構(gòu)，具有良好的生物相容性和機(jī)械強(qiáng)度，在維持組織結(jié)構(gòu)完整性、支撐細(xì)胞生長(zhǎng)等方面發(fā)揮重要作用。

2、目前，工業(yè)化生產(chǎn)的膠原蛋白主要來(lái)源于牛、豬等哺乳動(dòng)物組織。傳統(tǒng)的制備工藝通常包括堿處理去除非膠原蛋白、酸性條件下提取可溶性膠原、鹽析和透析純化等步驟。然而，動(dòng)物源性膠原蛋白存在病原體污染風(fēng)險(xiǎn)、質(zhì)量不穩(wěn)定、提取過程復(fù)雜等問題。此外，特定人群對(duì)動(dòng)物源性產(chǎn)品的接受度較低。

3、為克服上述局限，研究人員嘗試?yán)没蚬こ碳夹g(shù)開發(fā)重組人源膠原蛋白。通過在大腸桿菌、酵母、昆蟲、哺乳動(dòng)物、植物等宿主細(xì)胞中表達(dá)膠原基因，可獲得與天然膠原蛋白在結(jié)構(gòu)和功能上相似的重組蛋白。不同表達(dá)系統(tǒng)各有優(yōu)缺點(diǎn)，如大腸桿菌表達(dá)量高但缺乏翻譯后修飾，哺乳動(dòng)物細(xì)胞修飾完全但產(chǎn)量低、成本高。目前商業(yè)化應(yīng)用的重組膠原主要來(lái)自酵母和昆蟲細(xì)胞系統(tǒng)。

4、除直接表達(dá)外，還可通過基因工程構(gòu)建可溶性重組膠原肽段。這些多肽保留了天然膠原的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域，具備成纖維、成凝膠、促進(jìn)細(xì)胞粘附生長(zhǎng)等生物學(xué)功能，在組織工程支架材料、傷口敷料、化妝品添加劑等領(lǐng)域具有廣闊應(yīng)用前景。但其機(jī)械強(qiáng)度和熱穩(wěn)定性不及完整膠原分子。

5、水解是制備膠原多肽的另一重要途徑。通過酶解、酸堿水解等方法，可將動(dòng)物源性膠原蛋白降解為分子量較小的多肽片段，稱為水解膠原或明膠。水解膠原具有良好的水溶性和生物利用度，作為營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑對(duì)皮膚、骨關(guān)節(jié)健康有益。但其結(jié)構(gòu)和功能與天然膠原差異較大。

6、近年來(lái)，隨著合成生物學(xué)和蛋白質(zhì)工程技術(shù)的發(fā)展，定向進(jìn)化和理性設(shè)計(jì)策略被用于優(yōu)化重組膠原的產(chǎn)量和性能。通過篩選高效表達(dá)宿主、優(yōu)化密碼子、引入輔助因子等，可提高重組膠原的產(chǎn)量和翻譯后修飾水平。此外，定點(diǎn)突變和嵌合技術(shù)可賦予重組膠原新的生物學(xué)功能，如調(diào)控降解速率、引入細(xì)胞粘附位點(diǎn)等。這為開發(fā)新型可控釋放載體、仿生支架材料等提供了思路。

7、總的來(lái)說(shuō)，重組膠原蛋白技術(shù)經(jīng)過30多年的發(fā)展已趨于成熟，為替代動(dòng)物源性膠原提供了。但受限于表達(dá)系統(tǒng)、產(chǎn)量、成本等因素，其在生物醫(yī)藥和功能食品領(lǐng)域的應(yīng)用仍面臨挑戰(zhàn)。未來(lái)，隨著合成生物學(xué)等新興技術(shù)的進(jìn)步，有望突破瓶頸，實(shí)現(xiàn)重組膠原的規(guī)?；a(chǎn)和廣泛應(yīng)用。同時(shí)，對(duì)重組膠原的質(zhì)量安全性、免疫原性、臨床療效等仍需深入評(píng)估。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、有鑒于此，本發(fā)明提供了一種膠原蛋白凍干粉及其制備方法和應(yīng)用，按重量份計(jì)包括以下步驟：

2、(1)粗提取：首先，將0.1-0.5份的乳化劑與30-50份新鮮魚皮加入到料液槽中；接著，向料液槽中加入100-160份去離子水，進(jìn)行混合攪拌，并水浴加熱至60-80℃保持恒定2-6h；然后，向料液槽中加入15-20份丙烯酸酯衍生物及1-3份阻聚劑，機(jī)械攪拌乳化15-30min；最后，加入10-20份穩(wěn)定劑，在35-50℃下反應(yīng)8-12h，超聲2-4h，制得懸浮液，然后將10-20份懸浮液分散在100-120份無(wú)水乙醇中，接著在50-70℃蒸發(fā)乙醇4-6h，得到粗提取的產(chǎn)物；

3、(2)精提?。禾峁?-7份弱堿、1-2份干燥的氯化物及1-2份緩沖劑并與步驟(1)得到的粗提取的產(chǎn)物混合，均質(zhì)處理；接著，轉(zhuǎn)移至密封容器中，在氮?dú)夥諊挛⒉ㄌ幚?0-40min，所述微波的功率為200-400w，收集固體產(chǎn)物并使用酸漂洗，再使用去離子水沖洗后烘干，得到精提取的產(chǎn)物；

4、(3)凍干成品：向20-40份聚醚衍生物中添加2-5份步驟(2)得到的粗提取的產(chǎn)物，接著超聲處理使其形成懸液，然后加入1-3份多巴胺類似物，攪拌均勻后，勻速滴加銨鹽溶液，40-60℃下攪拌反應(yīng)2-3h，接著120000-160000rpm下離心20-30min以集有機(jī)相，加入兩倍體積的4℃丙酮，超聲混勻后，置于烘箱干燥處理，得到干粉。

5、所述膠原蛋白凍干粉的制備方法，步驟(1)中所述乳化劑為單硬脂酸甘油酯、蔗糖脂肪酸酯、大豆卵磷脂、山梨醇酐單硬脂酸酯、聚氧乙烯失水山梨醇脂肪酸酯中的一種；所述丙烯酸酯衍生物為氨基丙烯酸酯、3-氨基丙烯酸甲酯、氨基丙烯酸十二烷基酯酰胺中的一種；所述阻聚劑為納米二氧化鈦、納米氧化鎂、納米氯化鈉中的一種；所述穩(wěn)定劑為硫酸鉀、二丁基錫二月桂酸酯、二辛基錫硫代甘醇酸酯中的一種。

6、所述膠原蛋白凍干粉的制備方法，步驟(1)中所述混合攪拌的轉(zhuǎn)速為300rpm；所述機(jī)械攪拌的轉(zhuǎn)速為600rpm；所述超聲的方式為水浴超聲，所述超聲的功率為250-350w，所述超聲的溫度為15℃以下。

7、所述膠原蛋白凍干粉的制備方法，步驟(2)中所述弱堿為碳酸氫鈉、氫氧化銨中的一種；所述氯化物為氯化鎂、氯化鋅、氯化鈣中的一種；所述緩沖劑為pbs、tris-hcl、醋酸鈉中的一種；所述酸漂洗為鹽酸漂洗，其中鹽酸的濃度為1mm。

8、所述膠原蛋白凍干粉的制備方法，步驟(2)中所述均質(zhì)處理的壓強(qiáng)為1mpa-3mpa，所述均質(zhì)處理的時(shí)間為2h-4h；所述氮?dú)獾牧髁繛?00ml/min-200ml/min；所述烘干的溫度為40-60℃。

9、所述膠原蛋白凍干粉的制備方法，步驟(3)中所述聚醚衍生物為聚醚醚酮、聚醚酰亞胺、聚醚砜、聚醚砜醚酮中的一種；所述多巴胺類似物為鹽酸多巴胺、多巴胺-3-磷酸酯、巰基聚乙二醇多巴胺中的一種；所述銨鹽溶液為氯化銨溶液、碳酸銨溶液、磷酸銨中的一種，所述銨鹽溶液的濃度為10mm。

10、所述膠原蛋白凍干粉的制備方法，步驟(3)中所述超聲的方式為水浴超聲，所述超聲的功率為80-250w；所述攪拌均勻的轉(zhuǎn)速為180rpm；所述勻速滴加的速率為0.1-0.3份/min，所述勻速滴加的溶液總量為4-8份；所述超聲混勻的溫度為40-50℃，所述超聲混勻的功率為100-300w；所述烘箱干燥處理的溫度為45-60℃。

11、采用上述所述膠原蛋白凍干粉的制備方法制得干粉。

12、采用上述所述膠原蛋白凍干粉在制備抗氧化制劑的應(yīng)用。

13、根據(jù)提供的信息，這項(xiàng)發(fā)明的主要技術(shù)效果可以總結(jié)如下：

14、1.高得率和高純度：實(shí)施例中制備的膠原蛋白凍干粉得率在93.4％-94.2％之間，純度在98.2％-99.2％之間，遠(yuǎn)高于對(duì)比例的結(jié)果。

15、2.優(yōu)異的ace抑制活性：實(shí)施例產(chǎn)品的ace抑制活性(ic50值)在0.042-0.059mg/ml之間，顯著優(yōu)于對(duì)比例產(chǎn)品。這表明該產(chǎn)品具有良好的降血壓潛力。

16、3.關(guān)鍵工藝參數(shù)的優(yōu)化：

17、-添加丙烯酸酯衍生物顯著提高了產(chǎn)品質(zhì)量和活性。

18、-使用弱堿而非強(qiáng)堿有利于保持產(chǎn)品活性。

19、-采用聚醚衍生物和多巴胺類似物提高了產(chǎn)品性能。

20、-使用丙酮代替純水在最后處理步驟中提高了產(chǎn)品質(zhì)量。

21、4.潛在應(yīng)用價(jià)值：由于具有良好的ace抑制活性，該產(chǎn)品可能用于開發(fā)高血壓患者的食療藥膳。

22、5.工藝的可控性和重復(fù)性：通過詳細(xì)規(guī)定各步驟的參數(shù)(如溫度、時(shí)間、ph值等)，保證了工藝的可控性和產(chǎn)品質(zhì)量的一致性。

23、總的來(lái)說(shuō)，這項(xiàng)技術(shù)通過優(yōu)化提取和純化工藝，成功制備出高質(zhì)量、高活性的膠原蛋白凍干粉，具有潛在的健康和醫(yī)療應(yīng)用價(jià)值。

24、本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)將會(huì)在下面的說(shuō)明書中部分闡明，一部分根據(jù)說(shuō)明書是顯而易見的，或者可以通過本發(fā)明實(shí)施例的實(shí)施而獲知。