alicum，ACCC30399)，指狀青霉 (Penicilliumdigitatum，ACCC30389)，均來(lái)自中國(guó)農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏中心（ACCC);柑橘 酸腐病菌（Geotrichumcandidum)和柑橘黑腐病菌（Alternariacitri)實(shí)驗(yàn)室從贛南臍 橙病果分離得到。
[0074] 實(shí)驗(yàn)方法：
[0075] 1、瓊脂擴(kuò)散法測(cè)定三顆針提取物對(duì)意大利青霉和指狀青霉的抑菌作用
[0076] 取供試菌接種于試管斜面培養(yǎng)基，28°C培養(yǎng)2-3d，將試管培養(yǎng)基中的供試菌用 PDB培養(yǎng)液將孢子洗入三角瓶中，搖勻，玻璃珠打散，制成孢子懸液，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，使 菌液濃度達(dá)IO6-IO7CfuAiL備用。
[0077] 吸取上述孢子菌懸液5mL混入冷卻至50°C左右PDA培養(yǎng)基，制備帶菌培養(yǎng)基。然 后放置無(wú)菌牛津杯，分別于牛津杯中加入200yL實(shí)施例1和實(shí)施例3制備的三顆針提取物 溶液，置于28°C恒溫箱中培養(yǎng)48h，十字交叉法測(cè)量抑菌圈的大小。重復(fù)測(cè)定三次，計(jì)算抑 菌環(huán)直徑平均值。
[0078] 2、生長(zhǎng)速率法測(cè)定三顆針提取物對(duì)柑橘酸腐病菌和柑橘黑腐病菌的抑菌作用
[0079] 無(wú)菌條件下，以純PDA培養(yǎng)基為對(duì)照，用直徑6_打孔器打取活化好的各供試菌的 菌落邊緣菌塊，分別將其轉(zhuǎn)接到含實(shí)施例1和實(shí)施例3制備的三顆針提取物、三顆針正丁醇 部分的PDA培養(yǎng)基及對(duì)照培養(yǎng)基中，每個(gè)處理重復(fù)三次，并將其置于28°C恒溫培養(yǎng)箱中培 養(yǎng)，5d后記錄各菌落生長(zhǎng)情況，并用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，計(jì)算抑制率。
[0080] 抑制率（％)= 100X(對(duì)照菌落直徑-處理菌落直徑）/對(duì)照菌落直徑
[0081] 3、二倍稀釋法測(cè)定實(shí)施例1的三顆針提取物的最低抑菌濃度（MIC)及最小殺菌濃 度（MFC)
[0082] 將所述實(shí)施例1的三顆針提取物溶液二倍稀釋至1.95mg三顆針?biāo)幉?mL? IOOOmg三顆針?biāo)幉?mL之間的十個(gè)濃度梯度，然后吸取IOmL不同濃度的三顆針乙醇提取物 溶液于含90mL未融化的PDA培養(yǎng)基中，搖勻后倒入平板中，制成含藥培養(yǎng)基，待培養(yǎng)基凝固 后，用平板涂布法將意大利青霉孢子菌懸液均勻涂于含藥PDA培養(yǎng)基上，每個(gè)濃度重復(fù)三 次。并設(shè)置空白對(duì)照組（培養(yǎng)基不接種菌）、菌液對(duì)照組（培養(yǎng)基接種菌但不含三顆針乙醇 提取物）。將試驗(yàn)組和對(duì)照組置于28°C的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2d，試驗(yàn)組中以無(wú)菌生長(zhǎng)的培養(yǎng)皿 的最低含藥濃度為其MIC，將所有無(wú)菌生長(zhǎng)的培養(yǎng)皿繼續(xù)培養(yǎng)7d后觀察，以無(wú)菌生長(zhǎng)的培 養(yǎng)皿的最低含藥濃度為其MFC。
[0083] 4、實(shí)施例1的三顆針提取物對(duì)贛南臍橙的生防效果
[0084] 將贛南臍橙果實(shí)用2%NaClO溶液消毒處理后，再用流水沖洗干凈，晾干備用。用 接種針在果實(shí)腰部刺傷一個(gè)直徑4_，深度3_的傷口，用微量移液器接種20yL不同濃度 的實(shí)施例1的三顆針提取物和20yLIXIO6CFUAiL意大利青霉孢子懸浮液，試驗(yàn)分3個(gè)處 理：①柑橘果實(shí)接種意大利青霉孢子懸浮液，作為試驗(yàn)空白對(duì)照；②三顆針提取物處理柑 橘果實(shí)傷口后再接種意大利青霉孢子懸浮液；③咪鮮胺陽(yáng)性對(duì)照組。
[0085] 果實(shí)置于托盤(pán)上，套上薄膜袋，各處理9個(gè)果實(shí)，重復(fù)3次。保持相對(duì)濕度在95% 左右，27°C培養(yǎng)培養(yǎng)7d后，調(diào)查柑橘果實(shí)病斑直徑，根據(jù)下述公式計(jì)算防治效果。
[0086] 防治效果（％ )=100X(對(duì)照組病斑直徑-處理組病斑直徑）/對(duì)照組病斑直徑
[0087] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0088] 1、三顆針提取物對(duì)供試病原菌的抑制作用
[0089] 1)實(shí)施例1的三顆針提取物對(duì)意大利青霉、指狀青霉、柑橘酸腐病菌和柑橘黑腐 病的抑菌效果參見(jiàn)圖1。所述三顆針提取物在Ig藥材/mL的濃度下對(duì)意大利青霉和指狀青 霉的抑菌圈直徑的大小分別為38. 0±0. 8mm和28. 3±0. 9mm，對(duì)柑橘酸腐病菌的抑制率均 為90. 9%，對(duì)黑腐病菌的抑制率均為69. 2%。同時(shí)以1000倍稀釋的咪鮮胺為陽(yáng)性對(duì)照，發(fā) 現(xiàn)三顆針提取物的抑菌能力與1500倍稀釋的咪鮮胺相當(dāng)。
[0090] 2)實(shí)施例3三顆針正丁醇部分在Ig藥材/mL的濃度下對(duì)意大利青霉的抑菌圈直 徑僅為29. 83mm，但是實(shí)施例3制備的三顆針提取物的抑菌圈直徑的達(dá)到41.OOmm(抑菌實(shí) 驗(yàn)結(jié)果圖片為示出）。正丁醇萃取可以有效除去部分沒(méi)有抑菌活性的成分，從而使正丁醇萃 取后的水相富集了三顆針抗柑橘采后病菌的活性成分。
[0091] 2、實(shí)施例1的三顆針提取物抑制意大利青霉的MIC和MFC
[0092] 實(shí)施例1的三顆針提取物對(duì)意大利青霉最低抑菌濃度（MIC)及最小殺菌濃度 (MFC)分別為12. 5mg三顆針?biāo)幉?mL和50mg三顆針?biāo)幉?mL。
[0093] 3、實(shí)施例1的三顆針提取物對(duì)贛南臍橙的生防效果
[0094] 結(jié)果參見(jiàn)圖2和表1。
[0095] 表1三顆針乙醇提取物對(duì)贛南臍橙的生防效果
[0096]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種三顆針提取物的制備方法，采用超聲波輔助提取技術(shù)，以乙醇為提取溶劑，包括 如下步驟： 將所述三顆針中加入三顆針重量10?40倍的質(zhì)量百分比濃度為40%?100%的乙 醇，在提取溫度為40?60°C，提取時(shí)間為30min?120min，超聲頻率為30?40KHz的條件 下提??；過(guò)濾，回收乙醇，濃縮，干燥或不干燥，得到三顆針乙醇提取物。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于：所述制備方法還包括： 將所述三顆針乙醇提取物溶解于10倍量的蒸餾水中，用正丁醇萃取三次，棄去正丁醇 萃取液，減壓濃縮正丁醇萃取后的水溶液，即得。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2中任一項(xiàng)所述的制備方法，其特征在于：乙醇的重量為所述三 顆針重量30?40倍，優(yōu)選為40倍； 優(yōu)選的，乙醇的質(zhì)量百分比濃度為50%?70%，更優(yōu)選為60% ; 優(yōu)選的，提取時(shí)間為60?90min，更優(yōu)選為60min。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的制備方法，其特征在于：超聲波輔助提取的溫 度為60°C。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的制備方法，其特征在于：乙醇提取前，所述三顆 針40?50°C烘干，粉碎后過(guò)40目篩，取篩下粉末進(jìn)行超聲波輔助提取。
6. 權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)所述的制備方法制備得到的三顆針提取物。
7. 三顆針或三顆針提取物在制備用于防治柑橘采后病原菌的藥物組合物和/或柑橘 采后保鮮劑中的用途；優(yōu)選的，所述三顆針提取物通過(guò)權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)所述的制備 方法制備得到。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的用途，其特征在于，所述柑橘采后病原菌選自意大利 青霉（Penicillium italicum)，指狀青霉（Penicillium digitatum)，柑橘酸腐病菌 (Geotrichum candidum)和柑橘黑腐病菌（Alternaria citri)中的一種或幾種。
9. 一種防治柑橘采后病原菌的藥物組合物，包括權(quán)利要求6所述的三顆針提取物。
10. -種柑橘采后保鮮劑，包括權(quán)利要求6所述的三顆針提取物。
【專利摘要】本發(fā)明提供一種三顆針提取物的制備方法，包括超聲波輔助乙醇提取三顆針。所述制備方法還可以包括棄去正丁醇萃取液后獲得水相提取物。本發(fā)明還提供所述制備方法得到三顆針提取物，以及該三顆針提取物在制備抑制柑橘采后病原菌的藥物組合物中的用途。三顆針提取物對(duì)柑橘采后病原菌具有較強(qiáng)的抑制作用，用于柑橘保鮮后無(wú)化學(xué)殘留，對(duì)人體無(wú)健康危害，對(duì)環(huán)境無(wú)污染，不易產(chǎn)生抗藥性。
【IPC分類】A23B7-154
【公開(kāi)號(hào)】CN104585307
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510002728
【發(fā)明人】陳金印, 陳楚英, 萬(wàn)春鵬
【申請(qǐng)人】江西農(nóng)業(yè)大學(xué)
【公開(kāi)日】2015年5月6日
【申請(qǐng)日】2015年1月5日