本發(fā)明涉及煙草工業(yè)領(lǐng)域，具體是一種生物轉(zhuǎn)化改善再造煙葉感官品質(zhì)的方法。
背景技術(shù)：
：再造煙葉主要由煙末、碎片、煙?；虻痛螣熑~加入膠粘劑和其他添加劑等組成。煙末、碎片、煙梗是煙草工業(yè)的副產(chǎn)物，以前多作棄置處理。我國是煙草大國，每年有數(shù)十萬噸煙末、碎片、煙梗資源被廢棄，既造成環(huán)境污染，同時(shí)也是對自然資源的浪費(fèi)。研究表明，煙末、碎片、煙梗中含有的成分種類與煙葉成分基本一致，但是存在雜氣重、刺激性大和口感不適等吸味缺陷。再造煙葉的細(xì)胞壁物質(zhì)主要有纖維素、半纖維素、果膠、木質(zhì)素等，若細(xì)胞壁物質(zhì)和淀粉含量高，會(huì)造成煙葉粗糙，煙氣刺激大，不和順；細(xì)胞壁物質(zhì)中的過量的纖維素，會(huì)賦予煙氣尖刺和灼熱感并產(chǎn)生嗆咳；而木質(zhì)素的熱裂解對煙草品質(zhì)產(chǎn)生負(fù)面影響，其含量越高，煙葉品質(zhì)越差，具有強(qiáng)烈的刺激性氣味，青雜氣重，吸味辛辣、澀口。同時(shí)木質(zhì)素也是造紙工業(yè)排放黑液COD和色度形成的主要原因，是目前公認(rèn)的微生物難降解芳香化合物之一。生物轉(zhuǎn)化法是在細(xì)胞或酶等生物催化下進(jìn)行的化學(xué)反應(yīng)，既是指利用微生物(微生物的生長細(xì)胞、微生物的休止細(xì)胞)、酶(來自微生物或動(dòng)植物的純酶或粗酶)或植物細(xì)胞，通過簡單的生物轉(zhuǎn)化或生物合成制備所需物質(zhì)的方法。與化學(xué)催化劑相比，生物催化劑專一性更強(qiáng)、催化活性更高、條件更易控制。微生物在增殖過程中可產(chǎn)生龐大的高活性酶系，如多糖水解酶類、蛋白酶類、酯化酶類、氧化還原酶類及裂合酶類等，在酶促作用、化學(xué)作用及微生物體內(nèi)復(fù)雜代謝的協(xié)同作用下，可使植物原料發(fā)生分解、降解、氧化、還原、聚合、偶聯(lián)、轉(zhuǎn)化等作用，形成復(fù)雜的低分子化合物，其中包括各種香味化合物，如醇類、醛類、酮類、酸類、脂類、酚類、吡喃類、吡啶類和萜烯類等，這些香氣物質(zhì)無疑也是煙草或用于煙草的添加劑的香氣組分。阿魏酸酯酶能切斷細(xì)胞壁中多糖一多糖、多糖一木質(zhì)素間的交聯(lián)，有利于細(xì)胞壁物質(zhì)中多糖的降解和木質(zhì)素的釋放，利用阿魏酸酯酶處理植物性的原材料，可以將阿魏酸從植物細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)中游離出來，從而破壞了細(xì)胞壁的骨架結(jié)構(gòu)，使得木質(zhì)素、半纖維素以及纖維素之間的連接被部分打破，結(jié)構(gòu)變得比處理前疏松。阿魏酸存在于烤煙煙葉中。纖維素、淀粉、蛋白質(zhì)可被生物酶定向水解生成葡萄糖、低聚糖、短肽、氨基酸等，能有效降低卷煙的刺激性，減輕雜氣和改善吸味。水溶性糖含量高使煙葉吃味醇和，香氣優(yōu)美，但糖類化合物含量高，焦油釋放量大。以再造煙葉水溶液為底物，采用桔青霉阿魏酸酯酶、木聚糖酶、葡萄糖氧化酶、過氧化氫酶、酚氧化酶協(xié)同作用，并采用食甲醇芽孢桿菌Bacillusmethylotrophicus(VJ4-1)轉(zhuǎn)化，分解再造煙葉中木質(zhì)素、纖維素、蛋白質(zhì)等大分子刺激性物質(zhì)，釋放阿魏酸，并轉(zhuǎn)化阿魏酸為香蘭素等香味前體物質(zhì)，使生產(chǎn)的再造煙葉降低刺激性、減少青雜氣、香氣優(yōu)美、略帶奶香氣，改善再造煙葉感官品質(zhì)，還未見報(bào)道。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種生物技術(shù)提升再造煙葉香氣品質(zhì)的方法，采用食甲醇芽孢桿菌Bacillusmethylotrophicus(VJ4-1)和桔青霉阿魏酸酯酶、木聚糖酶、葡萄糖氧化酶、過氧化氫酶、酚氧化酶等復(fù)合酶協(xié)同作用，以再造煙葉水溶液為底物進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化，再經(jīng)常規(guī)工業(yè)工序生產(chǎn)再造煙葉。其中桔青霉阿魏酸酯酶能釋放再造煙葉細(xì)胞壁中的阿魏酸，使再造煙葉細(xì)胞壁疏松結(jié)構(gòu)，有利于細(xì)胞壁物質(zhì)中多糖的降解和木質(zhì)素的釋放，再利用復(fù)合氧化酶的作用氧化降解木質(zhì)素，食甲醇芽孢桿菌(VJ4-1)能轉(zhuǎn)化阿魏酸生成香蘭素，其酶體系能分解、轉(zhuǎn)化再造煙葉中的大分子刺激性物質(zhì)或難揮發(fā)的香味前體物質(zhì)為小分子香氣物質(zhì)或還原糖等；并且阿魏酸酯酶和木聚糖酶等多糖酶具有協(xié)同作用，這些酶和微生物的復(fù)合生物轉(zhuǎn)化，使生產(chǎn)的再造煙葉降低刺激性、減少青雜氣、煙氣和順、香氣優(yōu)美、略帶奶香氣，改善再造煙葉感官品質(zhì)。本發(fā)明提供一種生物轉(zhuǎn)化改善再造煙葉感官品質(zhì)的方法，包括以下步驟：(1)菌株活化：將食甲醇芽孢桿菌Bacillusmethylotrophicus(VJ4-1)接種到馬鈴薯葡萄糖瓊脂斜面培養(yǎng)基上，在25～38℃、pH5～8條件下，靜置培養(yǎng)24～96h后得到斜面培養(yǎng)物，再接種到種子培養(yǎng)基，在25～38℃，轉(zhuǎn)速100～150rpm/min條件下振蕩培養(yǎng)12～36h，連續(xù)轉(zhuǎn)接1～3次后制得種子培養(yǎng)液；所述的食甲醇芽孢桿菌Bacillusmethylotrophicus(VJ4-1)保藏號為CCTCCNO：2012004，于2012年1月16日保藏于武漢大學(xué)中國典型培養(yǎng)物保藏中心；所述的斜面培養(yǎng)基：馬鈴薯浸液200mL/L，葡萄糖20g/L，瓊脂13g/L。所述的種子培養(yǎng)基：麥芽糖50g/L，蛋白胨10g/L，氯化鈉5g/L。(2)復(fù)合生物轉(zhuǎn)化預(yù)處理：在再造煙葉的萃取工序，將步驟1)所述的種子培養(yǎng)液按質(zhì)量比2～18％接種到再造煙葉水溶液中，并添加占再造煙葉質(zhì)量比的0.15～0.4％的桔青霉阿魏酸酯酶、木聚糖酶、葡萄糖氧化酶、過氧化氫酶、酚氧化酶等復(fù)合酶，攪拌混合均勻，在pH至4.5～6.0，在30～45℃條件下，發(fā)酵1～12小時(shí)，得到再造煙葉生物轉(zhuǎn)化液；(3)再造煙葉常規(guī)生產(chǎn)工序：所述步驟1)的再造煙葉生物轉(zhuǎn)化液，在55～65℃、pH自然條件下萃取反應(yīng)40～60min，碟螺離心分離液渣，將萃取液75～85℃下真空濃縮至固含量40％，得到濃縮液，在此過程中，溫度超過75℃，本發(fā)明的酶和菌失活；而殘?jiān)鼊t通過用干燥機(jī)實(shí)施100～120℃干燥處理，滅活酶和菌，制成質(zhì)量比5～15％水含量的煙草基片；將濃縮液噴涂到煙草基片上卷制成提升香氣品質(zhì)的再造煙葉。進(jìn)一步的，步驟(2)中所述桔青霉阿魏酸酯酶、木聚糖酶、葡萄糖氧化酶、過氧化氫酶、酚氧化酶等復(fù)合酶，為食品級，酶活500u/g～10000u/g，分別占再造煙葉質(zhì)量比的0～0.1％。本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明采用功能微生物和復(fù)合酶對再造煙葉進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化，通過桔青霉阿魏酸酯酶水解煙末、煙梗細(xì)胞壁的阿魏酸甲酯、低聚糖阿魏酸酯和多糖阿魏酸酯中的酯鍵，釋放阿魏酸，有利于細(xì)胞壁物質(zhì)中多糖的降解和木質(zhì)素的釋放，破壞細(xì)胞壁的骨架結(jié)構(gòu)，使木質(zhì)素、半纖維素以及纖維素之間的連接被部分打破，結(jié)構(gòu)變得比處理前疏松，與木聚糖酶協(xié)同作用，降解細(xì)胞壁物質(zhì)；葡萄糖氧化酶、過氧化氫酶、酚氧化酶協(xié)同作用氧化降解木質(zhì)素；功能微生物食甲醇芽孢桿菌Bacillusmethylotrophicus(VJ4-1)能轉(zhuǎn)化阿魏酸生成香蘭素，其復(fù)雜的酶體系能分解、轉(zhuǎn)化再造煙葉中的大分子刺激性物質(zhì)或難揮發(fā)的香味前體物質(zhì)為小分子香氣物質(zhì)或還原糖等；所有這些酶和微生物的復(fù)合生物轉(zhuǎn)化，使生產(chǎn)的再造煙葉降低刺激性、減少青雜氣、煙氣和順、香氣優(yōu)美、略帶奶香氣，改善再造煙葉感官品質(zhì)。本發(fā)明工藝條件溫和易操作，實(shí)現(xiàn)了酶和微生物轉(zhuǎn)化對再造煙葉香氣品質(zhì)的提升，綠色環(huán)保，具有工業(yè)化應(yīng)用的前景。具體實(shí)施方式下面通過具體的實(shí)施例對本發(fā)明中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述。應(yīng)當(dāng)理解，此部分所描述的具體實(shí)施例僅可用于解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。實(shí)施例1一種生物轉(zhuǎn)化改善感官品質(zhì)的再造煙葉的方法，包括以下步驟：(1)菌株活化：將食甲醇芽孢桿菌Bacillusmethylotrophicus(VJ4-1)接種到馬鈴薯葡萄糖瓊脂斜面培養(yǎng)基上，在28℃、pH5條件下，靜置培養(yǎng)28h后得到斜面培養(yǎng)物，再接種到種子培養(yǎng)基，在28℃，轉(zhuǎn)速115rpm/min條件下振蕩培養(yǎng)12h，連續(xù)轉(zhuǎn)接2次后制得種子培養(yǎng)液；所述的斜面培養(yǎng)基：馬鈴薯浸液200mL/L，葡萄糖20g/L，瓊脂13g/L。所述的種子培養(yǎng)基：麥芽糖50g/L，蛋白胨10g/L，氯化鈉5g/L。(2)復(fù)合生物轉(zhuǎn)化預(yù)處理：在再造煙葉的萃取工序，將步驟1)所述的種子培養(yǎng)液按質(zhì)量比5％接種到再造煙葉水溶液中，并添加占再造煙葉質(zhì)量比的0.18％的桔青霉阿魏酸酯酶、木聚糖酶、葡萄糖氧化酶、過氧化氫酶、酚氧化酶等復(fù)合酶，攪拌混合均勻，在pH5、30℃條件下，發(fā)酵4小時(shí)，得到再造煙葉生物轉(zhuǎn)化液；所述桔青霉阿魏酸酯酶、木聚糖酶、葡萄糖氧化酶、過氧化氫酶、酚氧化酶等復(fù)合酶，為食品級，酶活1000u/g，各占再造煙葉質(zhì)量比的0.05％、0.05％、0.03％、0.03％、0.02％；(3)再造煙葉常規(guī)生產(chǎn)工序：所述步驟2)所得的再造煙葉生物轉(zhuǎn)化液，在55℃、pH自然條件下萃取反應(yīng)55min，碟螺離心分離液渣，將萃取液78℃下真空濃縮至固含量40％，得到濃縮液，在此過程中，溫度超過78℃，本發(fā)明的酶和菌失活；而殘?jiān)鼊t通過用干燥機(jī)實(shí)施102℃干燥處理，滅活酶和菌，制成質(zhì)量比12％水含量的煙草基片；將濃縮液噴涂到煙草基片上卷制成提升香氣品質(zhì)的再造煙葉。實(shí)施例2一種生物轉(zhuǎn)化改善感官品質(zhì)的再造煙葉的方法，包括以下步驟：(1)菌株活化：將食甲醇芽孢桿菌Bacillusmethylotrophicus(VJ4-1)接種到馬鈴薯葡萄糖瓊脂斜面培養(yǎng)基上，在30℃、pH5.5條件下，靜置培養(yǎng)36h后得到斜面培養(yǎng)物，再接種到種子培養(yǎng)基，在30℃，轉(zhuǎn)速120rpm/min條件下振蕩培養(yǎng)18h，連續(xù)轉(zhuǎn)接3次后制得種子培養(yǎng)液；所述的斜面培養(yǎng)基：馬鈴薯浸液200mL/L，葡萄糖20g/L，瓊脂13g/L。所述的種子培養(yǎng)基：麥芽糖50g/L，蛋白胨10g/L，氯化鈉5g/L。(2)復(fù)合生物轉(zhuǎn)化預(yù)處理：在再造煙葉的萃取工序，將步驟1)所述的種子培養(yǎng)液按質(zhì)量比9％接種到再造煙葉水溶液中，并添加占再造煙葉質(zhì)量比的0.3％的桔青霉阿魏酸酯酶、木聚糖酶、葡萄糖氧化酶、過氧化氫酶、酚氧化酶等復(fù)合酶，攪拌混合均勻，在pH至5.5，在32℃條件下，發(fā)酵6小時(shí)，得到再造煙葉生物轉(zhuǎn)化液；所述桔青霉阿魏酸酯酶、木聚糖酶、葡萄糖氧化酶、過氧化氫酶、酚氧化酶等復(fù)合酶，為食品級，800u/g，分別占再造煙葉質(zhì)量比的0.1％、0.1％、、0.05％、0.03％、0.02％；(3)再造煙葉常規(guī)生產(chǎn)工序：所述步驟2)所得的再造煙葉生物轉(zhuǎn)化液，在58℃、pH自然條件下萃取反應(yīng)55min，碟螺離心分離液渣，將萃取液80℃下真空濃縮至固含量40％，得到濃縮液，在此過程中，溫度達(dá)到80℃，本發(fā)明的酶和菌失活；而殘?jiān)鼊t通過用干燥機(jī)實(shí)施105℃干燥處理，滅活酶和菌，制成質(zhì)量比13％水含量的煙草基片；將濃縮液噴涂到煙草基片上卷制成提升香氣品質(zhì)的再造煙葉。實(shí)施例3一種生物轉(zhuǎn)化改善感官品質(zhì)的再造煙葉的方法，包括以下步驟：(1)菌株活化：將食甲醇芽孢桿菌Bacillusmethylotrophicus(VJ4-1)接種到馬鈴薯葡萄糖瓊脂斜面培養(yǎng)基上，在32℃、pH6條件下，靜置培養(yǎng)72h后得到斜面培養(yǎng)物，再接種到種子培養(yǎng)基，在32℃，轉(zhuǎn)速125rpm/min條件下振蕩培養(yǎng)30h，連續(xù)轉(zhuǎn)接2次后制得種子培養(yǎng)液；所述的斜面培養(yǎng)基：馬鈴薯浸液200mL/L，葡萄糖20g/L，瓊脂13g/L。所述的種子培養(yǎng)基：麥芽糖50g/L，蛋白胨10g/L，氯化鈉5g/L。(2)復(fù)合生物轉(zhuǎn)化預(yù)處理：在再造煙葉的萃取工序，將步驟1)所述的種子培養(yǎng)液按質(zhì)量比12％接種到再造煙葉水溶液中，并添加占再造煙葉質(zhì)量比的0.25％的桔青霉阿魏酸酯酶、木聚糖酶、葡萄糖氧化酶、過氧化氫酶、酚氧化酶等復(fù)合酶，攪拌混合均勻，在pH6.0、32℃條件下，發(fā)酵8小時(shí)，得到再造煙葉生物轉(zhuǎn)化液；所述桔青霉阿魏酸酯酶、木聚糖酶、葡萄糖氧化酶、過氧化氫酶、酚氧化酶等復(fù)合酶，為食品級，酶活1500u/g，分別占再造煙葉質(zhì)量比的0.08％、0.08％、0.04％、0.03％、0.02％；(3)再造煙葉常規(guī)生產(chǎn)工序：所述步驟2)所得的再造煙葉生物轉(zhuǎn)化液，在62℃、pH自然條件下萃取反應(yīng)45min，碟螺離心分離液渣，將萃取液82℃下真空濃縮至固含量40％，得到濃縮液，在此過程中，溫度達(dá)到82℃，本發(fā)明的酶和菌失活；而殘?jiān)鼊t通過用干燥機(jī)實(shí)施110℃干燥處理，滅活酶和菌，制成質(zhì)量比11％水含量的煙草基片；將濃縮液噴涂到煙草基片上卷制成提升香氣品質(zhì)的再造煙葉。試驗(yàn)例1：感官評吸效果對比試驗(yàn)將實(shí)施例1、2、3制備的生物轉(zhuǎn)化改善感官品質(zhì)的再造煙葉與未經(jīng)處理的對照樣品卷制成煙支，放入恒溫恒濕箱內(nèi)(22℃+1、相對濕度為60％+2％)平衡48h，請專家評吸小組評吸。經(jīng)評吸小組反復(fù)評吸，表1表明：本發(fā)明制備的生物轉(zhuǎn)化改善感官品質(zhì)的再造煙葉，復(fù)合酶和功能菌株的生物轉(zhuǎn)化作用下，降解、分解、轉(zhuǎn)化再造煙葉萃取液和基片中的蛋白質(zhì)、木質(zhì)素、果膠、淀粉、纖維素等大分子物質(zhì)為還原糖、香蘭素及其香味前體物質(zhì)，使生產(chǎn)的再造煙葉降低刺激性、減少青雜氣、煙氣和順、香氣優(yōu)美、略帶奶香氣，改善再造煙葉感官品質(zhì)。表1.生物技術(shù)提升香氣品質(zhì)的再造煙葉的感官評吸效果對比試驗(yàn)例2：再造煙葉木質(zhì)素含量的檢測采用測定木質(zhì)素含量的經(jīng)典方法Klason法來檢測再造煙葉中的木質(zhì)素含量，其原理是用72％硫酸除去纖維素，難溶的木質(zhì)素經(jīng)過濾、洗滌、干燥稱重、計(jì)算等步驟可得到其含量，本發(fā)明的生物轉(zhuǎn)化改善感官品質(zhì)的再造煙葉中的木質(zhì)素含量均有降低，結(jié)果如表2。表2.綜合方法全面提升品質(zhì)的再造煙葉的木質(zhì)素含量實(shí)驗(yàn)組木質(zhì)素含量木質(zhì)素降低率空白對照3.32％/實(shí)施例1組2.82％15.06％實(shí)施例2組2.80％15.66％實(shí)施例3組2.75％17.16％試驗(yàn)例3：再造煙葉生物轉(zhuǎn)化液香蘭素HPLC檢測再造煙葉生物轉(zhuǎn)化液，經(jīng)0.22μm微孔濾膜過濾后用高效液相色譜檢測，用AgilentEclipseXDB-C8色譜柱(5μm,4.6*150mm)，流動(dòng)相為甲醇/0.5％冰乙酸＝30/70，流速1mL/min，檢測波長280nm，進(jìn)樣量10μL，檢測時(shí)間40min。用50％甲醇溶液配制1g/L的標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液，稀釋成一系列不同濃度,每次進(jìn)樣10μL,以峰面積對標(biāo)準(zhǔn)樣品濃度作圖，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。表3.再造煙葉生物轉(zhuǎn)化液中香蘭素的濃度實(shí)驗(yàn)組香蘭素濃度(mg/L)未處理對照/實(shí)施例1組121實(shí)施例2組262實(shí)施例3組209以上所述，僅為本發(fā)明的具體實(shí)施方式，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不局限于此，任何屬于本
技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)人員在本發(fā)明揭露的技術(shù)范圍內(nèi)，可輕易想到的變化或替換，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。因此，本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)該以權(quán)利要求的保護(hù)范圍為準(zhǔn)。當(dāng)前第1頁1 2 3