G-CSF二聚體在治療嗜中性粒細(xì)胞減少癥中的應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域本發(fā)明涉及生物和醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明涉及重組人G-CSF二聚體在治療嗜中性粒細(xì)胞減少癥中的用途。

背景技術(shù)：
人粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)是一個(gè)含有204個(gè)氨基酸組成并含有30個(gè)氨基酸信號肽的糖蛋白。成熟的G-CSF蛋白被分泌到細(xì)胞外不含信號肽由174個(gè)氨基酸構(gòu)成,分子量為18–20kDa。人體主要由單核細(xì)胞，成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞分泌。G-CSF在生物體內(nèi)主要發(fā)揮三大生物學(xué)功能：1.作用于嗜中性粒前體細(xì)胞和骨髓干細(xì)胞。驅(qū)動嗜中性粒細(xì)胞的分化、增殖和成熟。2.激活成熟的嗜中性細(xì)胞參與免疫反應(yīng)。3.協(xié)同其他血液生長因子，如StemCellFactor，F(xiàn)lt-3配體，GM-CSF發(fā)揮造血功能。G-CSF的受體已證實(shí)主要存在于骨髓造血干細(xì)胞Sca+Lin-Th1low，前體細(xì)胞CD34+，以及定向分化的嗜中性粒前體細(xì)胞(committedgranulocyteprecursor)和成熟的嗜中性粒細(xì)胞。人促嗜中性粒細(xì)胞刺激生長因子受體(G-CSFReceptor，G-CSFR)是一個(gè)單鏈的，對G-CSF有高親合力的特異性受體，含有812個(gè)氨基酸。Tamada等人獲得G-CSF:G-CSFR復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)，并進(jìn)行了2.8埃衍射分析(PNAS，2008，Vol.103:3135-3140)，結(jié)果顯示，G-CSF:G-CSFR復(fù)合物是以2：2比例存在，即2個(gè)配體和2個(gè)受體結(jié)合的狀態(tài)存在。每一個(gè)G-CSF分子結(jié)合一個(gè)受體分子，當(dāng)兩個(gè)都結(jié)合了G-CSF配體的受體，相互靠近相互作用而形成2:2二聚體時(shí)，G-CSF受體的羧基端才能激活下游的信號分子JAK2(Janustyrosinekinase)。JAK2再通過激活STAT3啟動轉(zhuǎn)錄基因，而刺激細(xì)胞增殖。嗜中性粒細(xì)胞減少是指成人外周血液嗜中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)低于1.8x109/L，兒童的嗜中性粒細(xì)胞減少是指嗜中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)低于1.5x109/L。嗜中性粒細(xì)胞減少癥往往是感染的前兆，嗜中性粒細(xì)胞數(shù)越低，被感染的機(jī)會越高。嗜中性粒細(xì)胞數(shù)減少癥的分類如下表所示。嗜中性粒細(xì)減少癥發(fā)生感染的頻率和嚴(yán)重程度還受到其他因素的影響，比如：粘膜和皮膚的完整性，免疫球蛋白，淋巴細(xì)胞，單核細(xì)胞，補(bǔ)體系統(tǒng)的功能和水平等。臨床上常見的嗜中性粒細(xì)胞減少，根據(jù)嗜中性粒細(xì)胞減少的原因可以分為以下幾類：造血系統(tǒng)生成障礙，由藥物、放射、化學(xué)試劑、感染等繼發(fā)因素引起；體內(nèi)分布和循環(huán)改變，使用和周轉(zhuǎn)加快(increasedutilizationandturnover)。腫瘤病人由于化療引起的嗜中性粒細(xì)胞減少程度一般和化療使用的劑量呈依賴關(guān)系，重復(fù)使用化療，可以造成嗜中性粒細(xì)胞減少的累積效應(yīng)。嗜中性粒細(xì)胞減少癥的主要臨床后果是綜合性感染(infectedcomplication)。大多數(shù)病人感染主要是由好氧(aerobic)細(xì)菌感染造成，其中包括革蘭氏陰性菌(大腸桿菌、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapheumoniae)、綠膿假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa))，革蘭氏陽性菌(Staphylococci(葡萄球菌),α-hemolyticStreptococci(溶血性鏈球菌),Straphylococcusaureus(金黃色葡萄球菌)和真菌。腫瘤的細(xì)胞毒性化學(xué)治療(cytotoxic-chemotherapy)方法仍然是目前治療癌癥的主要治療手段之一?；熤委熌[瘤的最大弱點(diǎn)是這種治療方法將快速增殖分化的正常細(xì)胞無區(qū)分地和腫瘤細(xì)胞一起殺死。由其產(chǎn)生毒性的主要表現(xiàn)在造血系統(tǒng)，即嗜中性粒細(xì)胞減少(Neutropenia)，在臨床上稱之為化療引起的嗜中性粒細(xì)胞減少癥(chemotherapy-inducedNeutropenia)。嗜中性粒細(xì)胞減少可以導(dǎo)致下一個(gè)治療周期的延遲，從而直接影響化療的治療效果。嚴(yán)重的嗜中性粒細(xì)胞減少，即嗜中性粒細(xì)胞絕對計(jì)數(shù)ANC(AbsoluteNeutrophilCount)低于0.5x109/L，可導(dǎo)致病人感染、器官衰竭甚至影響生命。重組人促嗜中性粒細(xì)胞刺激生長因子(recombinanthumangranulocytecolony-stimulatingfactor,rhG-CSF)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于化療和放療引起的白細(xì)胞數(shù)減少癥，而作為腫瘤病人化療的標(biāo)準(zhǔn)支持療法。目前市場上已有的治療用的重組人促嗜中性粒細(xì)胞刺激生長因子(rhG-CSF)主要有兩類，第一類包括由大腸桿菌表達(dá)的重組蛋白，含有175個(gè)氨基酸，分子量為19kD，其氨基端為甲硫氨酸(Filgrastim)。也包括哺乳動物細(xì)胞CHO產(chǎn)生的重組蛋白，含有174個(gè)氨基酸，并具有糖基化修飾。這一類的重組rhG-CSF都屬于短效型，需要每天或每周多次注射。第二類是在Filgrastim的蛋白分子的N-端上進(jìn)行了聚乙二醇化修飾(20kD-PEG)，修飾后的Pegfilgrastim分子量增加了約一倍，分子量變大后的Pegfilgrastim減少了腎臟排出速度，使半衰期從Filgrastim的3.5小時(shí)增加到15～80小時(shí)，方便了病人的臨床使用。這兩類的重組人促嗜中性粒細(xì)胞刺激生長因子都是G-CSF單體分子。目前臨床應(yīng)用的短效Filgrastim和長效的Pegfilgrastim仍然不能滿足病人的需要。2008年Sierra等人比較了Filgrastim和Pegfilgrastim在急性白血病人化療中對嗜中性粒細(xì)胞減少的效果(BMCCancer2008,8:195)，該研究設(shè)計(jì)為隨機(jī)雙盲臨床試驗(yàn)，急性粒細(xì)胞白血病患者接受化療一期誘導(dǎo)中(InductionI)，1-3天給化療劑Idarubicin12mg/M2，1-7天給化療劑Cytarabine100mg/M2，每天兩次。病人在6-8天隨機(jī)分組。一組給Filgrastim5μg/kg/day(n=41)，另一組給Pegfilgrastim6.0mg/week(n=42)。結(jié)果顯示，所有病人在化療后，在使用重組人G-CSF治療的第3-4天起，仍發(fā)生重度嗜中性粒細(xì)胞減少而約持續(xù)3周時(shí)間，并且使用兩種重組人G-CSF治療組的療效無明顯差異。這提示，單純延長半衰期似乎不足以獲得令人滿意的治療效果。然而，本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)更有效的治療嗜中性粒細(xì)胞減少癥的藥物，以便有效降低嗜中性粒細(xì)胞減少的程度和/或縮短重度嗜中性粒細(xì)胞減少的時(shí)間。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的就是一種更有效的治療嗜中性粒細(xì)胞減少癥的藥物及其用途。在本發(fā)明的第一方面，提供了一種人集落刺激因子G-CSF的二聚體的用途，它用于制備治療嗜中性粒細(xì)胞減少癥的藥物。在另一優(yōu)選例中，所述的嗜中性粒細(xì)胞減少癥包括：放療、化療所導(dǎo)致的嗜中性粒細(xì)胞減少癥。在另一優(yōu)選例中，所述的嗜中性粒細(xì)胞減少癥是重度嗜中性粒細(xì)胞減少癥。在另一優(yōu)選例中，所述的人集落刺激因子G-CSF的二聚體是式I所示的人粒細(xì)胞集落刺激因子G-CSF的二聚體：M1-L-M2式I式中，M1是人集落刺激因子G-CSF的第一單體；M2是人集落刺激因子G-CSF的第二單體；L是位于所述的第一單體和第二單體之間的，將所述第一單體和第二單體連接在一起的接頭元件，其中，所述的G-CSF二聚體保持了G-CSF的生物活性，并且其血清半衰期是所述第一單體或第二單體的血清半衰期的2倍以上。在另一優(yōu)選例中，所述的接頭元件L選自下組：(i)3-50個(gè)(或5-50)氨基酸的短肽(或連接肽)；(ii)式II所示的多肽元件：-Z-Y-Z-式II式中，Y為載體蛋白；Z為無、或1-30個(gè)氨基酸的短肽；“-”為化學(xué)鍵或共價(jià)鍵。在另一優(yōu)選例中，所述的第一單體和第二單體是相同的。在另一優(yōu)選例中，所述的第一單體和第二單體是不同的。在另一優(yōu)選例中，所述的生物活性包括：(a).作用于嗜中性粒前體細(xì)胞和骨髓干細(xì)胞，驅(qū)動嗜中性粒細(xì)胞的分化、增殖和成熟；(b)激活成熟的嗜中性細(xì)胞參與免疫反應(yīng)。在另一優(yōu)選例中，所述的載體蛋白是白蛋白或人IgG的Fc片段。在另一優(yōu)選例中，所述的人IgG的Fc片段至少缺失鉸鏈區(qū)第1-4位的氨基酸，并且保留至少二個(gè)半胱氨酸。在另一優(yōu)選例中，所述的載體蛋白是二個(gè)IgG的Fc片段之間通過二硫鍵連接而形成。在另一優(yōu)選例中，所述二硫鍵的數(shù)量為2-3個(gè)。在另一優(yōu)選例中，所述的“-”是肽鍵。在另一優(yōu)選例中，所述的G-CSF二聚體的血清半衰期是所述第一單體和/或第二單體的血清半衰期的3倍以上、5倍以上或10倍以上。在另一優(yōu)選例中，所述二聚體是由氨基酸序列如SEQIDNO:2-6所示的單體所構(gòu)成的二聚體。在本發(fā)明的第二方面，提供了一種人集落刺激因子G-CSF的二聚體，所述的二聚體的結(jié)構(gòu)如式I所示，M1-L-M2式I式中，M1是人集落刺激因子G-CSF的第一單體；M2是人集落刺激因子G-CSF的第二單體；L是位于所述的第一單體和第二單體之間的，將所述第一單體和第二單體連接在一起的接頭元件，其中，所述的G-CSF二聚體保持了G-CSF的生物活性，并且其血清半衰期是所述第一單體或第二單體的血清半衰期的2倍以上。在另一優(yōu)選例中，所述的載體蛋白是白蛋白或人IgG的Fc片段。在另一優(yōu)選例中，所述集落刺激因子G-CSF的二聚體采用以下步驟制備：(a)采用包含編碼G-CSF-Fc復(fù)合物的DNA序列的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化哺乳動物細(xì)胞。(b)培養(yǎng)所述哺乳動物細(xì)胞，表達(dá)含G-CSF-Fc復(fù)合物、G-CSF二聚體及其多聚體的表達(dá)產(chǎn)物；和(c)分離純化所述G-CSF二聚體。在本發(fā)明的第三方面，提供了一種藥物組合物，它含有本發(fā)明第二方面中所述的人集落刺激因子G-CSF的二聚體以及藥學(xué)上可接受的載體。在另一優(yōu)選例中，所述藥物組合物中基本上不含有人集落刺激因子G-CSF單體。較佳地，人集落刺激因子G-CSF的二聚體與人集落刺激因子G-CSF單體的重量比≥20:1；更佳地≥30:1，最佳地≥50:1。應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文(如實(shí)施例)中具體描述的各技術(shù)特征可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在此不再一一累述。附圖說明圖1顯示了本發(fā)明一種G-CSF二聚體的示意圖。其中，“-”表示連接肽，G-CSF橢圓形表示G-CSF單體。該G-CSF二聚體的一種序列如SEQIDNO:1所示，其中第1-174位為G-CSF，第175-190位為連接肽，第191-364位為另一G-CSF。圖2A和2B顯示了本發(fā)明G-CSF二聚體的示意圖。其中，“-”表示氨基酸連接肽，G-CSF橢圓形表示G-CSF單體，標(biāo)記為“C”的橢圓形表示載體蛋白，并且G-CSF位于載體蛋白的N-末端。圖2B中顯示二個(gè)Fc通過二硫鍵配對。一種用于構(gòu)成該G-CSF二聚體的、帶有Fc片段的G-CSF單體的序列如SEQIDNO:2所示，其中第1-174位為G-CSF，第175-190位為連接肽，第191-418位為人IgG2的Fc片段。二個(gè)帶有Fc片段的G-CSF單體，通過Fc的配對作用構(gòu)成二聚體。一種用于構(gòu)成該G-CSF二聚體的、帶有Fc片段的G-CSF單體的序列如SEQIDNO:3所示，其中第1-174位為G-CSF，第175-180位為連接肽，第181-408位為人IgG2的Fc片段。二個(gè)帶有Fc片段的G-CSF單體，通過Fc的配對作用構(gòu)成二聚體。圖3A和3B顯示了本發(fā)明G-CSF二聚體的示意圖。其中，“-”表示氨基酸連接肽，G-CSF橢圓形表示G-CSF單體，標(biāo)記為“C”的橢圓形表示載體蛋白，并且G-CSF位于載體蛋白的C-末端。圖3B中顯示二個(gè)Fc通過二硫鍵配對。一種用于構(gòu)成該G-CSF二聚體的、帶有Fc片段的G-CSF單體的序列如SEQIDNO:4所示，其中第1-228位為人IgG2的Fc片段，第229-244位為連接肽，第245-418位為G-CSF。二個(gè)帶有Fc片段的G-CSF單體，通過Fc的配對作用構(gòu)成二聚體。一種用于構(gòu)成該G-CSF二聚體的、帶有Fc片段的G-CSF單體的序列如SEQIDNO:5所示，其中第1-228位為人IgG2的Fc片段，第229-234位為連接肽，第235-418位為G-CSF。二個(gè)帶有Fc片段的G-CSF單體，通過Fc的配對作用構(gòu)成二聚體。圖4顯示了單次注射同摩爾數(shù)G-CSF的重組人G-CSF單體(G-CSF,PEG化G-CSF)和G-CSF二聚體(G-CSF-D)對正常小鼠外周血嗜中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)的作用(均值±標(biāo)準(zhǔn)差)。結(jié)果表明，本發(fā)明的G-CSF二聚體在體內(nèi)能夠更強(qiáng)地促進(jìn)粒系造血細(xì)胞的分化成熟，提高外周血嗜中性粒細(xì)胞的數(shù)量(ANC)。圖5顯示了G-CSF單體和G-CSF二聚體對5-FU誘導(dǎo)的小鼠嗜中性粒細(xì)胞減少模型中嗜中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)的影響。結(jié)果表明，本發(fā)明的G-CSF二聚體(G-CSF-D)治療效果明顯優(yōu)于PEG化的G-CSF單體。圖6顯示了G-CSF單體和G-CSF二聚體對環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的嗜中性粒細(xì)胞減少的食蟹猴模型上的作用。結(jié)果表明，本發(fā)明的G-CSF二聚體(G-CSF-D)治療效果明顯優(yōu)于PEG化的G-CSF單體。圖7A顯示了在非還原條件下，以抗人G-CSF單克隆抗體(R&Dsystems,Cat.MAB214)作為一抗，以辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體作為二抗，細(xì)胞培養(yǎng)上清、純化中間產(chǎn)物和純化的G-CSF二聚體的免疫印跡分析（Westernblot）結(jié)果。各泳道如下：1.分子量標(biāo)準(zhǔn)；2.細(xì)胞培養(yǎng)上清；3.純化中間產(chǎn)物；4.純化的G-CSF二聚體。圖7B顯示了在還原條件下，以抗人G-CSF單克隆抗體(R&Dsystems,Cat.MAB214)作為一抗，以辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體作為二抗，細(xì)胞培養(yǎng)上清、純化中間產(chǎn)物和純化的G-CSF二聚體的免疫印跡分析（Westernblot）結(jié)果。各泳道如下：1.分子量標(biāo)準(zhǔn)；2.細(xì)胞培養(yǎng)上清；3.純化中間產(chǎn)物；4.純化的G-CSF二聚體（G-CSF-Fc單體分子量約為48KD）。具體實(shí)施方式本發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究，首次意外地發(fā)現(xiàn)：與G-CSF單體相比，使用重組人G-CSF二聚體，可以產(chǎn)生更強(qiáng)的受體激活信號而加快骨髓嗜中性粒細(xì)胞的分化和增殖。同時(shí)G-CSF二聚體的藥代(pharmacokinetics)和藥效(pharmacodynamics)性質(zhì)優(yōu)于重組人G-CSF單體，因此在腫瘤病人化療后，可有效降低重度嗜中性粒細(xì)胞減少的程度，并縮短重度嗜中性粒細(xì)胞減少的時(shí)間。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。G-CSF二聚體本發(fā)明的G-CSF二聚體的結(jié)構(gòu)如式I所示。代表性的結(jié)構(gòu)如圖1-3中所示。其中，載體蛋白包括(但并不限于)是指人IgG(1,2,3,4)的Fc片段、或人白蛋白(albumin)。G-CSF位于可用載體蛋白的C-末端，也可用位于載體蛋白的N-末端。如本文所用，術(shù)語“連接肽”(linker)指位于G-CSF單體和G-CSF單體之間的、起連接作用的短肽。連接肽的長度沒有特別限制。連接肽的長度通常為5-50個(gè)氨基酸。通常，連接肽不影響或不顯著影響G-CSF單體和G-CSF單體形成正確的折疊和空間構(gòu)象。一些連接肽的例子包括(但并不限于)：較佳地，所述的連接肽具有選自下組的氨基酸序列：(a)疏水性氨基酸Gly和Pro構(gòu)成的3-16個(gè)氨基酸序列，例如Gly-Pro-Gly-Pro-Gly-Pro;(b)多克隆位點(diǎn)所編碼的氨基酸序列。該序列通常為5-20個(gè)，較佳地10-20個(gè)氨基酸；(c)來自于G-CSF單體之外的蛋白的氨基酸序列，例如來自于IgG或白蛋白的氨基酸序列；(d)由(a)、(b)和(c)組合形成的氨基酸序列。優(yōu)選的連接肽包括：GSGGGSGGGGSGGGGS(SEQIDNO:1中第175-190位)和ASTKGP(SEQIDNO:3中第175-180位)。此外，在融合蛋白的N端或C末端還可添加其他不影響G-CSF單體活性的氨基酸序列。較佳地，這些添加的氨基酸序列有利于表達(dá)(如信號肽)，有利于純化(如6×His序列、釀酒酵母α-因子信號肽切割位點(diǎn)(Glu-Lys-Arg))，或可促進(jìn)融合蛋白的活性。制備方法編碼本發(fā)明G-CSF二聚體或融合蛋白的DNA序列，可以全部人工合成。也可用PCR擴(kuò)增或合成的方法獲得G-CSF第一單體和/或G-CSF第二單體的編碼DNA序列，然后將其拼接在一起，形成編碼本發(fā)明融合蛋白的DNA序列。為了提高宿主細(xì)胞的表達(dá)量，可以對G-CSF二聚體編碼序列進(jìn)行改造，例如采用宿主細(xì)胞偏好的密碼子，消除不利于基因轉(zhuǎn)錄及翻譯的序列。在本發(fā)明中，可以采用酵母細(xì)胞或哺乳動物細(xì)胞偏好的密碼子，并采用計(jì)算機(jī)DNA軟件對G-CSF二聚體基因進(jìn)行檢測，排除在基因中不利于基因轉(zhuǎn)錄及翻譯的序列，包括內(nèi)含子剪切位點(diǎn)，轉(zhuǎn)錄終止序列等。在獲得了編碼本發(fā)明新融合蛋白的DNA序列之后，將其連入合適的表達(dá)載體，再轉(zhuǎn)入合適的宿主細(xì)胞。最后，培養(yǎng)轉(zhuǎn)化后的宿主細(xì)胞，通過分離純化得到本發(fā)明的新的融合蛋白。如本文所用，術(shù)語“載體”包括質(zhì)粒、粘粒、表達(dá)載體、克隆載體、病毒載體等。在本發(fā)明中，可選用本領(lǐng)域已知的各種載體如市售的載體。比如，選用市售的載體，然后將編碼本發(fā)明新融合蛋白的核苷酸序列可操作地連于表達(dá)調(diào)控序列，可以形成蛋白表達(dá)載體。如本文所用，“可操作地連于”指這樣一種狀況，即線性DNA序列的某些部分能夠影響同一線性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信號肽DNA作為前體表達(dá)并參與多肽的分泌，那么信號肽(分泌前導(dǎo)序列)DNA就是可操作地連于多肽DNA;如果啟動子控制序列的轉(zhuǎn)錄，那么它是可操作地連于編碼序列;如果核糖體結(jié)合位點(diǎn)被置于能使其翻譯的位置時(shí)，那么它是可操作地連于編碼序列。一般，“可操作地連于”意味著相鄰近，而對于分泌前導(dǎo)序列則意味著在閱讀框中相鄰。在本發(fā)明中，術(shù)語“宿主細(xì)胞”包括原核細(xì)胞和真核細(xì)胞。常用的原核宿主細(xì)胞的例子包括大腸桿菌、枯草桿菌等。常用的真核宿主細(xì)胞包括酵母細(xì)胞，昆蟲細(xì)胞、和哺乳動物細(xì)胞等。較佳地，該宿主細(xì)胞是真核細(xì)胞，更佳地是哺乳動物細(xì)胞。在獲得轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞后，可在適合表達(dá)本發(fā)明融合蛋白的條件下培養(yǎng)該細(xì)胞，從而表達(dá)出融合蛋白。然后再分離出表達(dá)的融合蛋白。藥物組合物和施用方法由于本發(fā)明G-CSF二聚體可產(chǎn)生更強(qiáng)的受體激活序號并具有優(yōu)異的血清半衰期，因此本發(fā)明G-CSF二聚體以及含有本發(fā)明G-CSF二聚體為主要活性成分的藥物組合物可用于治療嗜中性粒細(xì)胞減少癥。其中，所述的嗜中性粒細(xì)胞減少癥包括：放療、化療所導(dǎo)致的嗜中性粒細(xì)胞減少癥。本發(fā)明的藥物組合物包含安全、有效量范圍內(nèi)的本發(fā)明G-CSF二聚體及藥理上可以接受的賦形劑或載體。其中“安全、有效量”指的是：化合物的量足以明顯改善病情，而不至于產(chǎn)生嚴(yán)重的副作用。通常，藥物組合物含有0.001-1000mg本發(fā)明G-CSF二聚體/劑，較佳地0.05-300mg本發(fā)明G-CSF二聚體/劑，更佳地，含有0.5-200mg本發(fā)明G-CSF二聚體/劑。本發(fā)明的化合物及其藥理上可接受的鹽可制成各種制劑，其中包含安全、有效量范圍內(nèi)的本發(fā)明G-CSF二聚體或其藥理上可接受的鹽及藥理上可以接受的賦形劑或載體。其中“安全、有效量”指的是：化合物的量足以明顯改善病情，而不至于產(chǎn)生嚴(yán)重的副作用?；衔锏陌踩⒂行Я扛鶕?jù)治療對象的年齡、病情、療程等具體情況來確定?！八幚砩峡梢越邮艿馁x形劑或載體”指的是：一種或多種相容性固體或液體填料或凝膠物質(zhì)，它們適合于人使用，而且必須有足夠的純度和足夠低的毒性。“相容性”在此指的是組合物中各組份能與本發(fā)明的化合物以及它們之間相互摻和，而不明顯降低化合物的藥效。藥理上可以接受的賦形劑或載體部分例子有纖維素及其衍生物(如羧甲基纖維素鈉、乙基纖維素鈉、纖維素乙酸酯等)、明膠、滑石、固體潤滑劑(如硬脂酸、硬脂酸鎂)、硫酸鈣、植物油(如豆油、芝麻油、花生油、橄欖油等)、多元醇(如丙二醇、甘油、甘露醇、山梨醇等)、乳化劑(如吐溫)、潤濕劑(如十二烷基硫酸鈉)、著色劑、調(diào)味劑、穩(wěn)定劑、抗氧化劑、防腐劑、無熱原水等。施用本發(fā)明G-CSF二聚體時(shí)，可以口服、直腸、腸胃外(靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)或皮下)、局部給藥。用于口服給藥的固體劑型包括膠囊劑、片劑、丸劑、散劑和顆粒劑。在這些固體劑型中，活性化合物與至少一種常規(guī)惰性賦形劑(或載體)混合，如檸檬酸鈉或磷酸二鈣，或與下述成分混合：(a)填料或增容劑，例如，淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅酸；(b)粘合劑，例如，羥甲基纖維素、藻酸鹽、明膠、聚乙烯基吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯膠；(c)保濕劑，例如，甘油；(d)崩解劑，例如，瓊脂、碳酸鈣、馬鈴薯淀粉或木薯淀粉、藻酸、某些復(fù)合硅酸鹽、和碳酸鈉；(e)緩溶劑，例如石蠟；(f)吸收加速劑，例如，季胺化合物；(g)潤濕劑，例如鯨蠟醇和單硬脂酸甘油酯；(h)吸附劑，例如，高嶺土；和(i)潤滑劑，例如，滑石、硬脂酸鈣、硬脂酸鎂、固體聚乙二醇、十二烷基硫酸鈉，或其混合物。膠囊劑、片劑和丸劑中，劑型也可包含緩沖劑。固體劑型如片劑、糖丸、膠囊劑、丸劑和顆粒劑可采用包衣和殼材制備，如腸衣和其它本領(lǐng)域公知的材料。它們可包含不透明劑，并且，這種組合物中活性化合物或化合物的釋放可以延遲的方式在消化道內(nèi)的某一部分中釋放?？刹捎玫陌窠M分的實(shí)例是聚合物質(zhì)和蠟類物質(zhì)。必要時(shí)，活性化合物也可與上述賦形劑中的一種或多種形成微膠囊形式。用于口服給藥的液體劑型包括藥學(xué)上可接受的乳液、溶液、懸浮液、糖漿或酊劑。除了活性化合物外，液體劑型可包含本領(lǐng)域中常規(guī)采用的惰性稀釋劑，如水或其它溶劑，增溶劑和乳化劑，例知，乙醇、異丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺以及油，特別是棉籽油、花生油、玉米胚油、橄欖油、蓖麻油和芝麻油或這些物質(zhì)的混合物等。除了這些惰性稀釋劑外，組合物也可包含助劑，如潤濕劑、乳化劑和懸浮劑、甜味劑、嬌味劑和香料。除了活性化合物外，懸浮液可包含懸浮劑，例如，乙氧基化異十八烷醇、聚氧乙烯山梨醇和脫水山梨醇酯、微晶纖維素、甲醇鋁和瓊脂或這些物質(zhì)的混合物等。用于腸胃外注射的組合物可包含生理上可接受的無菌含水或無水溶液、分散液、懸浮液或乳液，和用于重新溶解成無菌的可注射溶液或分散液的無菌粉末。適宜的含水和非水載體、稀釋劑、溶劑或賦形劑包括水、乙醇、多元醇及其適宜的混合物。用于局部給藥的本發(fā)明G-CSF二聚體的劑型包括軟膏劑、散劑、貼劑、噴射劑和吸入劑?；钚猿煞衷跓o菌條件下與生理上可接受的載體及任何防腐劑、緩沖劑，或必要時(shí)可能需要的推進(jìn)劑一起混合。本發(fā)明G-CSF二聚體可以單獨(dú)給藥，或者與其他藥學(xué)上可接受的化合物聯(lián)合給藥。(通常，本發(fā)明的G-CSF二聚體不與G-CSF單體聯(lián)用)。使用藥物組合物時(shí)，是將安全有效量的本發(fā)明G-CSF二聚體適用于需要治療的哺乳動物(如人)，其中施用時(shí)劑量為藥學(xué)上認(rèn)為的有效給藥劑量，對于60kg體重的人而言，每次給藥劑量通常為0.01～300mg，優(yōu)選0.5～100mg。當(dāng)然，具體劑量還應(yīng)考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫(yī)師技能范圍之內(nèi)的。本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)在于：1.可產(chǎn)生更強(qiáng)的受體激活信號；2.更強(qiáng)的體內(nèi)生物半衰期。3.在動物模型中已證實(shí)具有顯著的、明顯優(yōu)于現(xiàn)有產(chǎn)品的治療嗜中性粒細(xì)胞減少癥的效果。下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆：實(shí)驗(yàn)室手冊(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實(shí)施例1用常規(guī)方法制備和純化，獲得結(jié)構(gòu)如圖1-圖3所示的G-CSF二聚體(序列為SEQIDNO:1,或單體序列如SEQIDNO:2-5所示)。實(shí)施例2G-CSF二聚體體內(nèi)半衰期大鼠皮下單次注射G-CSF二聚體(由序列如SEQIDNO:2所示的二個(gè)G-CSF單體構(gòu)成的二聚體)100ug/kg，藥代動力學(xué)參數(shù)如下表所示(n=6).單體G-CSF在大鼠的半衰期約2小時(shí)。實(shí)施例3.同摩爾數(shù)G-CSF的G-CSF單體和G-CSF二聚體對正常小鼠嗜中性粒細(xì)胞增生的作用(G-CSF二聚體在體內(nèi)可產(chǎn)生更強(qiáng)的受體激活信號)ICR小鼠，雌性，20-22克，隨機(jī)分為4組，每組6-8只。動物給藥體積為0.1ml/10g體重，各試驗(yàn)組給予同摩爾數(shù)的G-CSF分子劑量(1摩爾二聚體中的G-CSF按2摩爾計(jì)算)，即分別皮下一次注射等體積的溶劑(溶劑對照組)、G-CSF-Peg40μg/kg，rhG-CSF40μg/kg，G-CSF-D100μg/kg。G-CSF-Peg單體為Neulasta(PegylatedFilgrastim，Amgen公司產(chǎn)品)。G-CSF單體為注射用重組人G-CSF(長春金賽藥業(yè)有限公司產(chǎn)品)。G-CSF-D是由序列如SEQIDNO:5所示的二個(gè)G-CSF單體構(gòu)成的二聚體。給藥后各組在相應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)眼眶靜脈叢取血40μL檢測血細(xì)胞計(jì)數(shù)及分類。結(jié)果如圖4所示，與溶劑對照組相比，G-CSF單體(rhG-CSF,Peg化的G-CSF)，和G-CSF二聚體(G-CSF-D)對正常小鼠具有不同程度的促嗜中性粒細(xì)胞增生作用。因?qū)嶒?yàn)動物是正常動物，故給藥后G-CSF單體或二聚體會與嗜中性粒細(xì)胞的受體結(jié)合后被代謝消除，隨之嗜中性粒細(xì)胞數(shù)也相應(yīng)的的降低，在本實(shí)驗(yàn)中，三種藥物均在72hr時(shí)恢復(fù)至基礎(chǔ)水平。值得注意的是，在同摩爾數(shù)G-CSF分子劑量條件下，G-CSF-D組ANC升高倍數(shù)最大，尤其在給藥48小時(shí)，G-CSF二聚體組的嗜中性粒細(xì)胞數(shù)是G-CSF-Peg組的3.1倍，是G-CSF單體組的6.1倍，G-CSF二聚體、G-CSF-Peg、G-CSF單體組的嗜中性粒細(xì)胞數(shù)均值分別為22.14X109/L、7.04X109/L、3.61X109/L，藥效比較結(jié)果：G-CSF-D>G-CSF-Peg>G-CSF，可以說明二聚體的藥效更好。換言之，注射了G-CSF二聚體的小鼠，嗜中性粒細(xì)胞增加的幅度，不僅遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于注射了G-CSF單體的動物組，也遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于注射了半衰期較長的PEG化G-CSF單體的動物組。該試驗(yàn)結(jié)果表明，在動物體內(nèi)，同摩爾數(shù)的G-CSF劑量條件下，G-CSF二聚體生物活性明顯優(yōu)于G-CSF單體的生物活性。實(shí)施例4同摩爾數(shù)的G-CSF單體和G-CSF二聚體對5-FU誘導(dǎo)的小鼠嗜中性粒細(xì)胞減少模型中嗜中性粒細(xì)胞增生的作用(G-CSF二聚體在小鼠動物模型中的治療作用)ICR小鼠，雌雄各半，24-26克，隨機(jī)分組，10只/組。所有動物靜脈注射150mg/kg劑量的5-氟尿嘧啶(5-Fu)造模，24小時(shí)后，模型組動物注射溶劑對照、G-CSF-D(二聚體)組注射重組人G-CSF-D(G-CSF-D是由序列如SEQIDNO:3所示的二個(gè)G-CSF單體構(gòu)成的二聚體)1500μg/kg，G-CSF-Peg(聚乙二醇化的G-CSF單體)組注射Neulasta300μg/kg。試驗(yàn)組的G-CSF劑量為同摩爾數(shù)劑量(1摩爾二聚體中的G-CSF按2摩爾計(jì)算)，皮下注射給藥。各組第1，3，5，7天各給藥1次，注射體積為0.1ml/10g體重。分別于第0，2，4，6，8，天取外周血檢測白細(xì)胞計(jì)數(shù)及分類。結(jié)果如圖5所示，模型組動物靜脈注射5-Fu后，嗜中性粒細(xì)胞值迅速下降，第6天降至最低。注射注射同摩爾數(shù)的重組人G-CSF單體(Peg化G-CSF)和G-CSF二聚體(G-CSF-D)的動物，嗜中性粒細(xì)胞值的最低谷也出現(xiàn)在大約第6天。但是，G-CSF二聚體(G-CSF-D)治療組動物嗜中性粒細(xì)胞值(均值為0.23X109/L)比G-CSF單體(PEG化G-CSF)治療組的嗜中性粒細(xì)胞值(均值為0.05X109/L)高4.6倍。該結(jié)果提示，在化療藥物5-氟尿嘧啶(5-Fu)誘導(dǎo)的嗜中性粒細(xì)胞減少癥(Neutropenia)的小鼠模型中，G-CSF二聚體(G-CSF-D)治療效果明顯優(yōu)于G-CSF單體(PEG化G-CSF)的治療效果。實(shí)施例5G-CSF單體和G-CSF二聚體對環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的嗜中性粒細(xì)胞減少的食蟹猴模型上的作用(G-CSF二聚體在食蟹猴動物模型中的治療作用)正常食蟹猴24只，雌雄各半，靜脈注射兩次(第0天，第1天)60mg/kg劑量的環(huán)磷酰胺(lot：2008040921，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司產(chǎn)品)，導(dǎo)致白細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞減少。隨機(jī)分為3組，雌雄各半。第5天開始，試驗(yàn)組分別單次皮下注射G-CSF二聚體(60μg/kg，相當(dāng)于0.67μM/kg)(G-CSF-D是由序列如SEQIDNO:2所示的二個(gè)G-CSF單體構(gòu)成的二聚體)；或單次皮下注射G-CSF-Peg單體(60μg/kg,相當(dāng)于3.2μM/kg)；或每天注射G-CSF單體(10μg/kg/day，相當(dāng)于0.53μM/kg)連續(xù)注射5天，總劑量為50μg/kg，相當(dāng)于2.65μM/kg。注射體積均為0.2mL/kg。在不同時(shí)間點(diǎn)采集血液樣本，觀察不同劑量的F627對模型食蟹猴外周血液嗜中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)的作用。結(jié)果如圖6所示，模型組動物靜脈注射環(huán)磷酰胺后，嗜中性粒細(xì)胞值減少，第6-8天降至最低。注射約同等劑量的重組人G-CSF單體和Peg化G-CSF單體，嗜中性粒細(xì)胞谷值出現(xiàn)在大約第6-7天。單次注射G-CSF二聚體(G-CSF-D)的動物，在摩爾劑量小于PEG化G-CSF單體的4.8倍時(shí)，防止了嗜中性粒細(xì)胞減少癥狀的發(fā)生。在嗜中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)處于低谷值(給予環(huán)磷酰胺后第8天)時(shí)，單次注射G-CSF二聚體(G-CSF-D)的動物組的嗜中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)分別是G-CSF單體組的3.0倍，是PEG化G-CSF單體注射組的6.9倍，G-CSF-D組的嗜中性粒細(xì)胞數(shù)均值為1.17×109/L，G-CSF單體組為0.39×109/L，PEG化G-CSF單體組為0.17×109/L。該結(jié)果顯示，在化療藥物環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的嗜中性粒細(xì)胞減少癥(Neutropenia)的食蟹猴模型中，G-CSF二聚體(G-CSF-D)治療效果明顯優(yōu)于G-CSF單體和PEG化G-CSF的治療效果，可有效防止化療藥物誘導(dǎo)的嗜中性粒細(xì)胞減少癥狀的發(fā)生，有效降低嗜中性粒細(xì)胞減少的程度和/或縮短重度嗜中性粒細(xì)胞減少。實(shí)施例6由G-CSF-Fc復(fù)合物形成的G-CSF二聚體a．G-CSF二聚體表達(dá)細(xì)胞株的構(gòu)建采用全基因合成G-CSF-Fc復(fù)合物的cDNA序列(如SEQIDNO:7所示)，將人G-CSF單體的基因與IgG2的Fc基因片段連接，5’引入HindIII位點(diǎn)，以及哺乳動物細(xì)胞表達(dá)所需要的元件如Kozak序列和信號肽序列，3’端引入EcoRI位點(diǎn)，克隆到市售的pUC19質(zhì)粒，命名為pG-CSF-Fc，轉(zhuǎn)化E.coliTG1。用HindIII和EcoRI酶切pUC19質(zhì)粒，回收約1400bp的G-CSF-IgG2Fc片段，與經(jīng)HindIII和EcoRI酶切后的pcDNA3(Invitrogen)表達(dá)質(zhì)粒相連接，構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒pEX-G-CSF-Fc。表達(dá)質(zhì)粒pEX-G-CSF-Fc經(jīng)線性化，純化，電穿孔轉(zhuǎn)化CHO細(xì)胞，篩選，ELISA法檢測表達(dá)量，篩選出蛋白產(chǎn)量較高的細(xì)胞株，凍存細(xì)胞，制備細(xì)胞庫。由SEQIDNO.:7獲得G-CSF-Fc單體No.1,其結(jié)構(gòu)為“G-CSF-連接肽-IgG2Fc”，氨基酸序列如SEQIDNO.:6所示。用類似方法構(gòu)建類似的表達(dá)質(zhì)粒，從而表達(dá)不同結(jié)構(gòu)的G-CSF-Fc單體No.2至4（表1）。通過類似的方法表達(dá)獲得不同結(jié)構(gòu)的G-CSF二聚體。表1不同G-CSF-Fc單體b．細(xì)胞規(guī)模培養(yǎng)從細(xì)胞庫取一支細(xì)胞(～1x107cells/ml)，復(fù)蘇后于10cm培養(yǎng)皿，培養(yǎng)于10mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基，37°C,5%CO2培養(yǎng)24hr。種子擴(kuò)增：將10mL培養(yǎng)物傳代至30-40mL培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至細(xì)胞濃度達(dá)1.0-1.5x106cells/mL且存活率≥90%時(shí)，逐級擴(kuò)大至300-400mL培養(yǎng)基中，置于搖瓶中37°C,5%CO2.培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速120rpm。細(xì)胞罐中擴(kuò)增(3L-10L)：細(xì)胞濃度達(dá)1.0–3.0x106cells/mL且存活率≥90%時(shí)，將300-400mL培養(yǎng)物接種至3-10L細(xì)胞罐中培養(yǎng)，培養(yǎng)基pH控制在6.8，溶解氧約50%，轉(zhuǎn)速65-100rpm。細(xì)胞罐生產(chǎn)(30-100L)：3L-10L細(xì)胞罐中的細(xì)胞濃度達(dá)1.0–3.0x106cells/ml且存活率≥90%時(shí)，將3-10L細(xì)胞罐中的培養(yǎng)物接種至30-100L細(xì)胞罐，培養(yǎng)基pH控制在6.8，溶解氧約50%，轉(zhuǎn)速65-100rpm，培養(yǎng)12-48hr開始控制培養(yǎng)基中的葡萄糖濃度(<1g/L)，采用補(bǔ)料培養(yǎng)。c．G-CSF二聚體的分離純化細(xì)胞罐中培養(yǎng)結(jié)束后，收集細(xì)胞上清(含有G-CSF-Fc復(fù)合物、G-CSF二聚體、G-CSF-Fc多聚體及代謝物)，細(xì)胞上清收集后經(jīng)過濾、多級凝膠層析純化，例如，rProteinASepharoseFF(GEHealthcare,cat#17-1279-04)捕獲，用50mM檸檬酸/檸檬酸鈉，0.2MNaCl,pH3.7-3.8的緩沖液洗脫，得到純度>90%的G-CSF二聚體，接下來采用CaptoAdhere層析，用50mMNaAc/HAC,0.2MNaCl,pH4.5-5.0的緩沖液洗脫，再用SPSepharoseFF(GEHeathcareCat#17-0729-04)，10mMPB(pH6.0±0.1)緩沖液平衡，10mMPB,0.2MNaCl(pH7.2±0.1)洗脫液，洗脫液經(jīng)低pH除病毒，過濾等，最終獲得G-CSF二聚體。分離純化的G-CSF二聚體的純度>95%(采用反向HPLC分析)，分子量為47±5Kd(采用還原型SDS-PAGE分析)，O糖基化占整個(gè)分子量的2-10%，等電點(diǎn)為5.8-6.8，紫外吸收光譜為280nm。G-CSF二聚體在體外能激活M-NFS-60細(xì)胞的STAT3，刺激M-NFS-60細(xì)胞的增殖(ED50為0.1-10ng/mL)。G-CSF二聚體(由二個(gè)SEQIDNO.:6所示單體構(gòu)成)純化結(jié)果如圖7A和圖7B所示，顯示純化后獲得了G-CSF二聚體(圖7A中泳道4)。此外，試驗(yàn)顯示，當(dāng)載體蛋白的Fc片段N端部分含有四個(gè)半胱氨酸時(shí)，例如ERKCCVECPPC(SEQIDNO.:2第191－201位)，對于形成正常配對的G-CSF二聚體有一定影響，這提示二個(gè)Fc片段之間宜通過2-3對二硫鍵連接。實(shí)施例7G-CSF二聚體在人體內(nèi)的藥代動力學(xué)24個(gè)正常人隨機(jī)分成4組，分別為30、60、120、240ug/kg劑量組，給予G-CSF二聚體(二聚體由二個(gè)SEQIDNO:6所示單體構(gòu)成)劑量分別為30、60、120、240ug/kg，單次給藥，于給藥后0.5,1,2,4,8,16,24,36,48,72,96小時(shí),第6(120hrs),7,9,11,13,和15天，采血分離血清凍存于-70℃冰箱。采用ELISA法檢測血藥濃度(ELISA,QuantikinehumanG-CSFELISAkit,R&DSystem,Inc.Minneapolis,Min,Cat:PDCS50)。檢測結(jié)果采用非房室模型分析藥代動力學(xué)參數(shù)(軟件WinNonlinv5.2,PharsightCorporation,USA)，結(jié)果如表2所示(表中的括號內(nèi)的數(shù)據(jù)為SD，括號外為均值)。表2藥代動力學(xué)參數(shù)*Tmax用中位數(shù)和范圍表示：括號內(nèi)的數(shù)據(jù)為范圍值，括號外為中位數(shù)。在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請所附權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