Hsp70作為酶促活性調(diào)節(jié)物的應(yīng)用本申請是申請?zhí)枮?00980131985.9，申請日為2009年6月26日，發(fā)明名稱為“Hsp70作為酶促活性調(diào)節(jié)物的應(yīng)用”的中國專利申請的分案申請。本申請為2008年6月26日提交的丹麥專利申請PA200800885的非臨時申請，丹麥專利申請PA200800885通過引用整體并入本文。在該臨時申請或本申請中引用的所有專利文獻(xiàn)和非專利文獻(xiàn)也都通過引用整體并入本文。技術(shù)領(lǐng)域本發(fā)明涉及通過利用分子伴侶Hsp70和溶酶體的磷脂二(單?；视?磷酸酯(BMP，還被稱為LBPA)之間的相互作用來調(diào)節(jié)酶活性的領(lǐng)域。Hsp70-BMP相互作用調(diào)節(jié)了溶酶體區(qū)室中與BMP相互作用的酶的活性，因此本發(fā)明提供了用于逆轉(zhuǎn)溶酶體貯積病理的方式(means)。

背景技術(shù)：
分子伴侶見于發(fā)生蛋白構(gòu)象重排的細(xì)胞的所有區(qū)室中，雖然蛋白合成是細(xì)胞內(nèi)不折疊肽的主要來源，但當(dāng)面臨高溫或可能使蛋白結(jié)構(gòu)易變并由此易于不折疊和集聚的其它刺激物的沖擊時，細(xì)胞利用包括產(chǎn)生保護(hù)蛋白在內(nèi)的特定細(xì)胞反應(yīng)進(jìn)行應(yīng)對。這種反應(yīng)是可以在從原核生物至真核生物的各種細(xì)胞類型中觀察到的現(xiàn)象，被稱為熱休克反應(yīng)或熱應(yīng)激反應(yīng)。由這種反應(yīng)誘導(dǎo)的蛋白被稱為熱休克蛋白(HSP)，其具有幾個家族。伴侶分子家族的主要實例是Hsp70蛋白。除了作為伴侶分子外，最近還發(fā)現(xiàn)該家族參與細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的其它方面——最明顯地通過其抗凋亡性質(zhì)，其在免疫中的功能以及癌細(xì)胞對Hsp70上調(diào)的明顯依賴性。此外，Hsp70還可以在保護(hù)溶酶體完整性方面發(fā)揮作用。然而其分子機(jī)制仍不清楚。溶酶體貯積病是一類罕見疾病，特征是物質(zhì)在溶酶體區(qū)室中集聚并引起溶酶體區(qū)室不穩(wěn)定，由此對受影響的個體具有破壞性作用。由于物質(zhì)代謝中涉及的酶缺陷而使該物質(zhì)在溶酶體區(qū)室中集聚。迄今為止，對于多數(shù)溶酶體貯積病還沒有可用的治療方法。這類疾病的根本原因是特定溶酶體酶不能夠高效地代謝諸如脂質(zhì)的特定溶酶體物質(zhì)。因此，已經(jīng)針對這些疾病中包括戈謝病(Gaucherdisease)和法布里病(Fabrydisease)的亞組采用通過向患者提供重組酶的酶替代療法(ERT)。然而，ERT是一種費用非常昂貴的治療形式，這可能限制了其在某些領(lǐng)域的應(yīng)用，并且ERT還僅對已經(jīng)產(chǎn)生重組酶的特定類型的疾病有效。本發(fā)明旨在提供用于治療溶酶體貯積癥的新方法。

技術(shù)實現(xiàn)要素：
在本發(fā)明中，通過提供對Hsp70和細(xì)胞膜(尤其是質(zhì)膜和溶酶體膜)結(jié)合的分子基礎(chǔ)的理解，公開了Hsp70促進(jìn)溶酶體膜穩(wěn)定性的分子基礎(chǔ)。由文獻(xiàn)已知Hsp70可以在保護(hù)溶酶體完整性中發(fā)揮作用，然而其分子機(jī)制仍不清楚。此外，對于是否這種作用是主要的應(yīng)激可誘導(dǎo)的Hsp70(HspA1A/A1B，在本研究中稱為Hsp70)所特有的或者是否其它Hsp70家族成員也可能具有相同性質(zhì)的問題，仍未得到解答。這些未解答的問題促成了本發(fā)明的主要目的之一，即研究Hsp70的溶酶體保護(hù)作用的分子基礎(chǔ)。為此，建立了產(chǎn)生重組Hsp70及其突變體的方法，即基于碘克沙醇梯度超離心的亞細(xì)胞分級(subcellularfractionation)方案。在光致氧化誘導(dǎo)的溶酶體通透化的基礎(chǔ)上建立了直接評價溶酶體膜完整性的實驗，該實驗使得可進(jìn)行實時顯微法評價Hsp70和其它成分敏化或保護(hù)溶酶體膜的能力的作用。在包括脂質(zhì)體90°光散射測定、色氨酸熒光移位和表面等離子共振(BIAcore)的多種體外系統(tǒng)中都對重組Hsp70和突變體與多種脂質(zhì)之間的相互作用進(jìn)行了研究。Hsp70的計算機(jī)(insilico)靜電表面模建有助于Hsp70-BMP相互作用的概念性模型的建立。為了證明在體外系統(tǒng)中證實的脂質(zhì)相互作用的體內(nèi)相關(guān)性，著眼于關(guān)于BMP和Hsp70兩個組分的BMP-Hsp70相互作用。為了進(jìn)一步證明利用這種機(jī)制的可行性，對施用順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡模型進(jìn)行了表征，并在癌細(xì)胞系和未轉(zhuǎn)化細(xì)胞系兩種細(xì)胞系中的所述細(xì)胞死亡系統(tǒng)中靶向溶酶體Hsp70。為了解決Hsp70對溶酶體膜穩(wěn)定性的作用的分子基礎(chǔ)，本發(fā)明人試圖建立可消除胞質(zhì)的Hsp70的影響的系統(tǒng)，即需要使Hsp70直接靶向溶酶體。Nylandstedetal.的電子顯微照片顯示Hsp70可存在于溶酶體內(nèi)，因此本發(fā)明人決定建立用于產(chǎn)生重組人Hsp70(rHsp70)的方法，并期望利用細(xì)胞內(nèi)吞機(jī)器作為直接向溶酶體遞送rHsp70的途徑。本發(fā)明人在此繞開了向Hsp70添加可能破壞功能的溶酶體分選信號的需要，并避免了由于過表達(dá)而可能引起的并發(fā)癥。內(nèi)吞方法還可以滴定rHsp70的量，并且從更長遠(yuǎn)的觀點出發(fā)開啟了研究細(xì)胞外Hsp70的攝取機(jī)制的可能性。為了驗證Hsp70的內(nèi)吞，在建立Hsp70產(chǎn)生方法后，用熒光團(tuán)AlexaFluor488對其進(jìn)行標(biāo)記(Hsp70-AF488)。共聚焦成像顯示，確實可以這種方式使rHsp70靶向至溶酶體。為了評價對溶酶體膜穩(wěn)定性的影響，本發(fā)明人接著建立了在單個溶酶體的水平上定量溶酶體膜通透化的方法，并利用該方法評價了細(xì)胞內(nèi)吞的rHsp70的作用。這些方法形成了實施例1和2的基礎(chǔ)，在實施例1和2中，本發(fā)明人證明，Hsp70通過與內(nèi)溶酶體(endo-lysosomal)陰離子磷脂二(單酰基-甘油)磷酸酯(BMP)的pH依賴性高親和結(jié)合而對溶酶體進(jìn)行穩(wěn)定，從而增強(qiáng)了細(xì)胞的存活。Hsp70帶正電荷的ATPase結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)結(jié)合，但還需要底物結(jié)合功能域以有效穩(wěn)定溶酶體。有趣的是，這種相互作用以及其產(chǎn)生的保護(hù)作用取決于位于ATPase結(jié)構(gòu)域的帶正電荷的楔形內(nèi)的色氨酸90。重要的是，所述細(xì)胞保護(hù)作用可以通過rHsp70的細(xì)胞內(nèi)吞遞送而獲得，并且尤其是通過BMP抗體或Hsp70抑制劑的細(xì)胞外施用而逆轉(zhuǎn)。此外，本發(fā)明人還試圖將Hsp70的溶酶體膜保護(hù)機(jī)制與腫瘤產(chǎn)生和程序性細(xì)胞死亡相關(guān)聯(lián)。因此，本發(fā)明人表征了通過施用常規(guī)化療劑順鉑啟動的細(xì)胞死亡程序，并發(fā)現(xiàn)其與caspases無關(guān)，但特征在于蛋白酶的溶酶體釋放。轉(zhuǎn)基因Hsp70以及細(xì)胞內(nèi)吞的Hsp70能夠通過穩(wěn)定溶酶體膜而增強(qiáng)細(xì)胞在面臨順鉑攻擊時的存活。有趣的是，本發(fā)明人證明，靶向溶酶體Hsp70本身或者其在溶酶體中的相互作用物二(單?；?甘油)磷酸酯(BMP)使轉(zhuǎn)化的前列腺細(xì)胞系對順鉑變得敏感(未轉(zhuǎn)化的細(xì)胞沒有這種變化)，從而為利用BMP-Hsp70相互作用作為癌癥治療的藥理學(xué)靶標(biāo)提供了實驗證據(jù)。有趣的是，雖然Hsp70-2與Hsp70具有86％的氨基酸同源性，但Hsp70-2不能直接保護(hù)溶酶體膜。然而，缺失Hsp70-2也導(dǎo)致溶酶體膜通透化，并促進(jìn)細(xì)胞的程序性死亡。這種作用不依賴于Hsp70-2與溶酶體區(qū)室之間的直接相互作用，而是通過晶狀體上皮源性生長因子(LEDGF)的下調(diào)(響應(yīng)Hsp70-2的缺失)關(guān)聯(lián)起來。本研究的方法和結(jié)果將在實施例部分進(jìn)行更詳細(xì)的闡述。在本發(fā)明中闡明了Hsp70通過與溶酶體BMP的相互作用增強(qiáng)溶酶體穩(wěn)定性的細(xì)胞保護(hù)作用的分子基礎(chǔ)，這些發(fā)現(xiàn)為治療性靶向溶酶體貯積病提供了基礎(chǔ)。本發(fā)明現(xiàn)在已經(jīng)證明，令人驚奇地，向細(xì)胞提供重組Hsp70有效逆轉(zhuǎn)溶酶體貯積病(如本發(fā)明證明的尼曼-皮克病(Niemann-Pickdisease)和法伯氏病(Farberdisease))的病理。此外，向細(xì)胞提供Hsp70誘導(dǎo)劑苯甲醇有效逆轉(zhuǎn)溶酶體貯積病(如本發(fā)明證明的尼曼-皮克病)的病理。因此，本發(fā)明提供了通過提供Hsp70或其功能片段或變體，或者通過提供Hsp70誘導(dǎo)物或輔誘導(dǎo)物(co-inducer)而直接或間接提高有此需要的個體中Hsp70的細(xì)胞內(nèi)濃度和/或活性來治療溶酶體貯積病的方法。一方面，本發(fā)明涉及能夠提高Hsp70的細(xì)胞內(nèi)濃度和/或活性的生物活性劑，其用作藥物或用于溶酶體貯積癥的治療。在一個實施方式中，所述生物活性劑為Hsp70或其功能片段或變體。在另一個實施方式中，所述生物活性劑為Hsp70誘導(dǎo)物或輔誘導(dǎo)物。另一方面，本發(fā)明提供了治療溶酶體貯積病的方法，其包括向有此需要的個體施用本發(fā)明的生物活性劑。在一個實施方式中，所述治療為預(yù)防、治愈或改善。在一個實施方式中，所述溶酶體貯積病選自尼曼-皮克病、法伯氏病、克拉伯病(Krabbedisease)、法布里病、戈謝病、唾液酸貯積病(Sialidosis)、異染性腦白質(zhì)營養(yǎng)不良和鞘脂激活蛋白(saposin)缺乏病。在另一個實施方式中，所述溶酶體貯積病的特征在于具有所述疾病病理涉及的缺陷酶的殘留酶促活性。本發(fā)明還涉及治療溶酶體貯積病的方法，其包括施用本發(fā)明的生物活性劑和至少一種其它治療形式(modality)的組合。本發(fā)明再一方面提供了調(diào)節(jié)酶的酶促活性的方法，其中，所述酶與BMP(二(單?；视?磷酸酯)相互作用，所述方法包括以下步驟：i)施用本發(fā)明的生物活性劑，ii)使BMP和Hsp70之間相互作用，和iii)調(diào)節(jié)與BMP相互作用的酶的酶促活性。另一方面，本發(fā)明涉及Hsp70或其功能片段或變體，其用作藥物。一方面，本發(fā)明涉及調(diào)節(jié)酶的酶促活性的方法，其中，所述酶與BMP相互作用，所述方法包括施用Hsp70或其功能片段或變體并由此調(diào)節(jié)與BMP相互作用的酶的酶促活性的步驟，其中所述Hsp70或其功能片段或變體是適合使BMP和Hsp70或所述功能片段或變體之間相互作用的形式。優(yōu)選地，Hsp70或所述其功能片段或變體與BMP形成共價或非共價復(fù)合物。優(yōu)選地，BMP與鞘脂激活蛋白相互作用。優(yōu)選地，所述鞘脂激活蛋白(Saposin)選自鞘脂激活蛋白A、鞘脂激活蛋白B、鞘脂激活蛋白C和鞘脂激活蛋白D。優(yōu)選地，所述酶選自鞘磷脂酶、酸性鞘磷脂酶、唾液酸酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷神經(jīng)酰胺酶、葡糖神經(jīng)酰胺酶和酸性神經(jīng)酰胺酶。優(yōu)選地，所述酶促活性的調(diào)節(jié)是上調(diào)所述酶的酶促活性。另一方面，本發(fā)明涉及Hsp70或其功能片段或變體，其用作藥物。優(yōu)選地，所述Hsp70或其功能片段或變體可用于治療、減緩或預(yù)防溶酶體貯積癥，例如尼曼-皮克病、戈謝病、法伯氏病、克拉伯病、法布里病和唾液酸貯積病。另一方面，本發(fā)明涉及提高化合物的攝取的方法，所述方法包括施用所述化合物和Hsp70或其功能片段或變體的步驟。在一個實施方式中，所述Hsp70或其功能片段或變體與所述化合物共價結(jié)合。在另一個實施方式中，所述Hsp70或其功能片段或變體與所述化合物非共價結(jié)合。本發(fā)明的實施方式涉及上調(diào)與溶酶體貯積癥(例如尼曼-皮克病、戈謝病、法伯氏病、克拉伯病、法布里病和唾液酸貯積病)相關(guān)的酶的酶促活性的方法。優(yōu)選地，所述溶酶體貯積癥為尼曼-皮克病。由于所述溶酶體貯積癥由酶促活性不足引起，因此本發(fā)明的目的是提高所述酶促活性，從而減輕或治愈所述病癥。已經(jīng)證明，Hsp70與BMP相互作用。由于BMP作為其它多種蛋白的輔因子，Hsp70和BMP之間的相互作用可以調(diào)節(jié)所述其它多種蛋白的功能。例如，BMP作為aSMase的輔因子。因此，Hsp70和BMP之間的相互作用可以提高aSMase的活性。由于尼曼-皮克病與aSMase活性的降低有關(guān)，因此Hsp70可以通過提高aSMase的活性來減輕或治愈尼曼-皮克病。類似地，BMP作為鞘脂激活蛋白A、鞘脂激活蛋白B、鞘脂激活蛋白C和鞘脂激活蛋白D的輔因子發(fā)揮作用。這些鞘脂激活蛋白在其它溶菌酶貯積癥中均有涉及，因此Hsp70可以通過提高鞘脂激活蛋白或與所述鞘脂激活蛋白相關(guān)的酶的活性來減輕或治愈其它溶酶體貯積癥。在本發(fā)明的一個實施方式中，在溶酶體貯積癥的治療中同時施用Hsp70和酶替代療法。在這種方式中，由于Hsp70的酶激活作用，因此可以顯著降低所必需的酶量。在另一個實施方式中，使用Hsp70促進(jìn)酶替代療法中酶的攝取，由此提高被相關(guān)細(xì)胞攝取的酶量。定義和簡稱aSMase/ASM酸性鞘磷脂酶ADD70:用于Hsp70的源自AIF的誘餌(AIF-deriveddecoyforHsp70)AIF:凋亡誘導(dǎo)因子AO:吖啶橙Apaf-1:凋亡蛋白酶激活因子-1Bag-1:Bcl-2相關(guān)抗凋亡蛋白-1(Bcl-2associatedathanogene-1)Bcl-2:B細(xì)胞淋巴瘤/白雪病2Bid:BH3相互作用結(jié)構(gòu)域凋亡激動蛋白BMP:二(單酰基甘油)磷脂CARD:Caspase招募域Caspase:半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶CHIP:Hsp70-結(jié)合蛋白的羧基末端CytC:細(xì)胞色素CDD:死亡結(jié)構(gòu)域DED:死亡效應(yīng)域dsRNA:雙鏈RNAeHsp70:細(xì)胞外Hsp70ER:內(nèi)質(zhì)網(wǎng)ERT酶替代療法FADD:包含F(xiàn)as相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域的蛋白HIP:Hsp70相互作用蛋白HRP:辣根過氧化物酶HS:熱休克/熱應(yīng)激HSE:熱休克元件HSF:熱休克因子Hsp:熱休克蛋白HspBP1:熱休克蛋白結(jié)合蛋白1IAP:凋亡蛋白抑制蛋白iMEF永生化的鼠胚胎成纖維細(xì)胞JNK:c-Jun氨基末端激酶LAMP-1/-2:溶酶體相關(guān)膜蛋白-1/-2LBPA:溶血二磷脂酸(lysobisphosphatidicacid)LEDGF:晶狀體上皮源性生長因子LMP:溶酶體膜通透化MIC-1:巨噬細(xì)胞抑制細(xì)胞因子1MOMP:線粒體外膜通透化MPR甘露糖6-磷酸受體MTT:3-(4,5-二甲基-2-噻唑基)-2,5-二苯基-2H-四唑溴化物NPD尼曼-皮克病NPDAA型尼曼-皮克病NPDBB型尼曼-皮克病NPDCC型尼曼-皮克病NPDDD型尼曼-皮克病PCD:程序性細(xì)胞死亡PKC:蛋白激酶CPOPC:棕櫚酰-油酰-磷脂酰膽堿POPS:棕櫚酰-油酰-磷脂酰絲氨酸RNAi:RNA干擾ROS:活性氧SD:標(biāo)準(zhǔn)偏差siRNA:小干擾RNASmac/Diablo:第二個線粒體來源的caspase激活因子tBid:截短BidTNF:腫瘤壞死因子TNFR:TNF-受體TRADD:TNFR相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白TRAF:TNFR相關(guān)因子溶酶體貯積癥(LSD)：所使用的術(shù)語“溶酶體貯積癥”和“溶酶體貯積病”同義。Hsp70的功能片段：術(shù)語“Hsp70的功能片段”解釋為表示Hsp70的具有預(yù)期功能的任何片段。與酶促活性的調(diào)節(jié)有關(guān)時，功能片段是能夠調(diào)節(jié)所述酶促活性的片段。與提高物質(zhì)的攝取有關(guān)時，Hsp70的功能片段是能夠提高所述物質(zhì)的攝取的片段。應(yīng)該理解，所述功能片段的精確量化作用可能與全長分子的作用不同。在一些情況下，所述功能片段可能確實比全長分子更有效。此外，從片段的較小尺寸考慮，使用片段代替全長分子可能是有利的。Hsp70的功能變體：術(shù)語“Hsp70的功能變體”解釋為表示Hsp70的具有預(yù)期功能的任何變體。與酶促活性的調(diào)節(jié)有關(guān)時，功能變體是能夠調(diào)節(jié)所述酶促活性的變體。與提高物質(zhì)的攝取有關(guān)時，Hsp70的功能變體是能夠提高所述物質(zhì)的攝取的片段。應(yīng)該理解，所述功能變體的精確量化作用可能與全長分子的作用不同。在一些情況下，所述功能變體可能確實比全長分子更有效。“生物活性劑”(即在生物學(xué)上具有活性的物質(zhì)/試劑)是提供可以通過體內(nèi)或體外證明的某些藥理學(xué)作用(通常為有益作用)的任何試劑、藥物、化合物、物質(zhì)組分或組合物。在本文中使用的該術(shù)語進(jìn)一步包括在個體中產(chǎn)生局部或全身作用的任何生理學(xué)或藥理學(xué)活性物質(zhì)。生物活性劑的另外實例包括，但不限于包含寡糖或由寡糖組成的試劑，包含多糖或由多糖組成的試劑，包含任選糖基化的肽或由任選糖基化的肽組成的試劑，包含任選糖基化的多肽或由任選糖基化的多肽組成的試劑，包含核酸或由核酸組成的試劑，包含寡核苷酸或由寡核苷酸組成的試劑，包含多核苷酸或由多核苷酸組成的試劑，包含脂質(zhì)或由脂質(zhì)組成的試劑，包含脂肪酸或由脂肪酸組成的試劑，包含脂肪酸酯或由脂肪酸酯組成的試劑，以及包含次級代謝物或由次級代謝物組成的試劑。在個體(例如人和其它任何動物)的治療中，生物活性劑可以用于預(yù)防疾病、治療疾病。本文使用的生物活性劑是能夠提高Hsp70的細(xì)胞內(nèi)濃度和/或活性的物質(zhì)。本文使用的術(shù)語“藥”或“藥物”包括作用于人或動物體局部或全身的在生物學(xué)上、生理學(xué)上或藥學(xué)上具有活性的物質(zhì)。本文使用的術(shù)語“治療”和“療法”等同地表示治愈性治療、預(yù)防性治療和改善性治療或減輕性治療。該術(shù)語包括用于獲得可以在臨床上建立的有益的或期望的生理學(xué)結(jié)果的方法。出于本發(fā)明的目的，有益的或預(yù)期的臨床效果包括，但不限于緩解癥狀，減小疾病的程度，穩(wěn)定(即不惡化)病況，延遲或減慢病況/癥狀的發(fā)展或惡化，改善或減輕病況或癥狀，以及不論可測與否的緩和(部分或完全)。本文使用的術(shù)語“減輕”及其變式表示，與不施用本發(fā)明組合物相比，生理病況或癥狀的程度和/或有害表現(xiàn)減少和/或發(fā)展時間減慢或延長。如果根據(jù)構(gòu)成術(shù)語“治療”和“療法”的定義的標(biāo)準(zhǔn)測定，所治療的病況有變化，則“治療效果”或“療效”是明顯的。如果有至少5％的改善，優(yōu)選10％的改善，更優(yōu)選至少25％，甚至更優(yōu)選至少50％，如至少75％，最優(yōu)選至少100％的改善，則所治療的病況有“變化”。所述變化可基于所治療個體病況的嚴(yán)重程度的改善，或者基于利用生物活性劑或生物活性劑和本發(fā)明的藥物組合物治療和不治療的個體群病況改善頻率的差異?！吧锘钚詣钡摹八幚韺W(xué)上的有效量”、“藥學(xué)上的有效量”或“生理學(xué)上的有效量”是在使用本發(fā)明所述藥物組合物時，為在所治療的個體血流中或作用部位(即肺、胃系統(tǒng)、結(jié)腸系統(tǒng)、前列腺等)提供預(yù)期水平的活性劑以產(chǎn)生預(yù)期的生理反應(yīng)所需要的此組合物中存在的活性劑的量。準(zhǔn)確的量將取決于多種因素，例如活性劑、組合物的活性、所采用的遞送裝置、組合物的物理特征、計劃的患者用法(即每天施用的劑量數(shù))和患者因素等，并且可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本文提供的信息而容易地確定?？梢栽谝淮谓o藥中，或者通過多次施用總和為有效量的量(優(yōu)選在24小時的時間內(nèi))而施用“有效量”的生物活性劑?？梢酝ㄟ^用于測定合適量和給藥時間的標(biāo)準(zhǔn)臨床方法確定有效量。應(yīng)該理解，“有效量”可以是由醫(yī)療專家和/或個人確定的經(jīng)驗性和/或個性化(根據(jù)個案)結(jié)果。本文使用的術(shù)語“增強(qiáng)”和“提高”有益效果及其變式是指，與安慰劑相比生物活性劑的治療效果，或者本發(fā)明的藥物治療的治療效果高于通常利用不含本發(fā)明生物活性劑的藥物組合物所獲得的治療效果的提高。作為施用生物活性劑的結(jié)果，當(dāng)治療效果的強(qiáng)度和/或程度得到促進(jìn)和/或提高時，“治療效果的提高”是明顯的?！爸委熜Ч奶岣摺边€包括治療益處的時間得到延長。它還可以表現(xiàn)為，與施用不含生物活性劑的較高量的藥物組合物相比，當(dāng)共同施用所述藥物組合物和本發(fā)明提供的生物活性劑時獲得相同益處和/或效果所需要的所述藥物組合物的量較低。優(yōu)選但不必需地，所述效果的增強(qiáng)引起對所述藥物組合物單獨不能有效治療或者治療效果較小的急性癥狀的治療。與單獨施用藥物組合物相比，當(dāng)本發(fā)明的生物活性劑與藥物組合物共同施用時治療效果具有至少5％的提高，例如治療效果具有至少10％的提高，則實現(xiàn)了增強(qiáng)(提高)。優(yōu)選地，所述提高為至少25％，更優(yōu)選至少50％，甚至更優(yōu)選至少75％，最優(yōu)選至少100％。本文使用的“共同施用”、“同時施用”或“一起施用”生物活性劑或者生物活性劑和現(xiàn)有藥物是指，在一定時間內(nèi)施用本發(fā)明的一種或多種生物活性劑，或者施用本發(fā)明的一種或多種生物活性劑和現(xiàn)有藥物組合物。所述時間優(yōu)選小于72小時，例如48小時，例如小于24小時，例如小于12小時，例如小于6小時，如小于3小時。然而，所述術(shù)語還表示可以同時施用所述生物活性劑和治療性組合物。術(shù)語“個體”指脊椎動物，尤其是哺乳動物中的一種，優(yōu)選包括人在內(nèi)的靈長類。在優(yōu)選的實施方式中，本文使用的個體為任意年齡的人，男性或女性?！坝写诵枰膫€體”是指可以從本發(fā)明受益的個體。在一個實施方式中，所述有此需要的個體為患病個體，其中所述疾病為溶酶體貯積病。術(shù)語“天然核苷酸”或“核苷酸”是指在自然界中發(fā)現(xiàn)的任意四種脫氧核苷酸dA、dG、dT和dC(DNA的組分)和四種核苷酸A、G、U和C(RNA的組分)。各種天然的核苷酸包括糖部分(核糖或脫氧核糖)、磷酸部分和天然/標(biāo)準(zhǔn)的堿基部分或基本由上述部分組成。天然核苷酸根據(jù)熟知的堿基配對原則(Watson和Crick)與互補核苷酸結(jié)合，其中腺嘌呤(A)與胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U)配對，鳥嘌呤(G)與胞嘧啶(C)配對，其中相應(yīng)的堿基對是互補且反向平行的核苷酸鏈的一部分。堿基配對引起預(yù)定的互補核苷酸之間的特異雜交。堿基配對是酶能夠催化合成與模板寡核苷酸互補的寡核苷酸的基礎(chǔ)。在這種合成中，結(jié)構(gòu)單元(通常為A、T、U、C或G的核糖衍生物或脫氧核糖衍生物的三磷酸酯)在模板寡核苷酸的指導(dǎo)下形成具有正確的互補序列的互補寡核苷酸?；パa序列對其寡核苷酸序列的識別由形成堿基對的相應(yīng)相互作用堿基介導(dǎo)。實質(zhì)上，導(dǎo)致堿基配對的具體相互作用由堿基的大小以及堿基的氫鍵供體和受體的模式控制。大的嘌呤堿基(A或G)與小的嘧啶堿基(T、U或C)配對。此外，堿基之間的堿基配對識別還受堿基之間形成的氫鍵的影響。在Watson-Crick堿基配對幾何中，利用連接兩個環(huán)原子的中間氫鍵和在任意一側(cè)結(jié)合附加于各所述環(huán)的官能基團(tuán)的氫鍵，利用與受體基團(tuán)配對的供體基團(tuán)，使六元環(huán)(天然寡核苷酸中的嘧啶)與由稠合六元環(huán)和五元環(huán)(天然寡核苷酸中的嘌呤)構(gòu)成的環(huán)系統(tǒng)并列。本文使用的“核酸”或“核酸分子”是指多核苷酸，例如脫氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)，寡核苷酸，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)產(chǎn)生的片段和通過連接、剪切、核酸內(nèi)切酶作用和核酸外切酶作用中任何一種產(chǎn)生的片段。核酸分子可以由天然存在的核苷酸(例如DNA和RNA)或天然存在的核苷酸的類似物(例如天然存在的核苷酸的α-對映體形式)或二者的組合的單體構(gòu)成。修飾核苷酸可以在糖部分和/或嘧啶或嘌呤堿基部分具有變化。糖修飾包括，例如利用鹵素、烷基基團(tuán)、胺和疊氮基團(tuán)取代一個或多個羥基基團(tuán)，或者可以使糖官能化作醚或酯。此外，還可以用空間上和電子上相似的結(jié)構(gòu)，例如氮雜-糖和碳環(huán)糖類似物取代完整的糖部分。堿基部分的修飾的實例包括烷基化嘌呤和嘧啶，?；堰驶蜞奏せ蛘咂渌熘碾s環(huán)取代物。核酸單體可以通過磷酸二酯鍵或這些連接的類似物進(jìn)行連接。磷酸二酯鍵連接的類似物包括硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯(phosphoroselenoate)、二硒代磷酸酯(phosphorodiselenoate)、phosphoroanilothioate、phosphoranilidate和氨基磷酸酯等。術(shù)語“核酸分子”也包括，例如包含連接至聚酰胺骨架上的天然存在的或修飾的核酸堿基的所謂的“肽核酸”。核酸可以為單鏈或雙鏈。術(shù)語“核酸分子的互補物”是指與參考核苷酸序列相比具有互補核苷酸序列并且為反方向的核酸分子。例如，序列5'ATGCACGGG3'與5'CCCGTGCAT3'互補?！胺蛛x的核酸分子”是指沒有整合在生物體的基因組DNA中的核酸分子。例如，已經(jīng)從細(xì)胞的基因組DNA分離的編碼生長因子的DNA分子即為分離的DNA分子。分離的核酸分子的另一個實例是沒有整合在生物體的基因組中的化學(xué)合成的核酸分子。已經(jīng)從特定物種分離的核酸分子小于該物種的染色體的完整DNA分子?！昂怂岱肿訕?gòu)建體”是已經(jīng)通過人為介入進(jìn)行修飾從而包含以天然不存在的排列結(jié)合或并列的核酸片段的單鏈或雙鏈核酸分子?！熬€性DNA”是指具有游離5’和3’末端的非環(huán)狀DNA分子?？梢酝ㄟ^酶促降解或物理斷裂由閉合的環(huán)狀DNA分子(例如質(zhì)粒)制備線性DNA。“互補DNA(cDNA)”是反轉(zhuǎn)錄酶由mRNA模板形成的單鏈DNA分子。通常，采用與部分mRNA互補的引物起始反轉(zhuǎn)錄。本領(lǐng)域技術(shù)人員還使用術(shù)語“cDNA”表示由此類單鏈DNA分子及其互補DNA鏈組成的雙鏈DNA分子。術(shù)語“cDNA”還表示由RNA模板合成的cDNA分子的克隆。“異源DNA”是指在給定宿主細(xì)胞中天然不存在的DNA分子或DNA分子群。異源于具體宿主細(xì)胞的DNA分子可以包含源自所述宿主細(xì)胞的物種的DNA(內(nèi)源DNA)，只要宿主DNA與非宿主DNA(即異源DNA)結(jié)合。例如，可以將包含非宿主DNA片段的DNA分子認(rèn)為是異源DNA分子，其中所述非宿主DNA片段編碼可操作地與包含轉(zhuǎn)錄啟動子的宿主DNA片段連接的多肽。相反，異源DNA分子可以包含可操作地與外源啟動子相連的內(nèi)源基因。作為另一個示例，如果DNA分子被引入到缺乏野生型基因的突變細(xì)胞內(nèi)，則也可以將包含源自野生型細(xì)胞的所述基因的該DNA分子認(rèn)為是異源DNA。“多肽”是天然產(chǎn)生的或合成的氨基酸殘基聚合物，優(yōu)選其僅通過肽鍵相連。通過非宿主DNA分子表達(dá)產(chǎn)生的多肽為“異源”肽或多肽。本文使用的術(shù)語“多肽”涵蓋了蛋白、肽和多肽，其中所述蛋白、肽或多肽可以已經(jīng)經(jīng)過翻譯后修飾或可以不經(jīng)過翻譯后修飾。翻譯后修飾可以為，例如磷酸化、甲基化和糖基化。術(shù)語“表達(dá)”是指基因或基因產(chǎn)物的生物合成?！半s交”表示不同來源的核酸鏈的退火；即，在初始時沒有配對的兩條DNA鏈的互補區(qū)之間形成堿基對。根據(jù)Sambrooketal.,MolecularCloning,ALaboratoryManual,ColdSpringHarbor,LaboratoryPress(1989),1.101-1.104，對術(shù)語“在嚴(yán)格條件下的雜交”進(jìn)行定義。優(yōu)選地，在嚴(yán)格條件下的雜交表示，利用1×SSC和0.1％SDS在50℃、優(yōu)選在55℃、更優(yōu)選在62℃且最優(yōu)選在68℃洗滌1小時后，尤其是在0.2×SSC和0.1％SDS中在50℃、優(yōu)選在55℃、更優(yōu)選在62℃且最優(yōu)選在68℃洗滌1小時后，觀察到陽性雜交信號。“完全同源”的延長(stretch)定義為配對核苷酸沿著相互作用的核苷酸的序列的匹配；在天然存在的RNA中，A與U配對，G與C配對?！皢幼印睘橹笇?dǎo)結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄的核苷酸序列。通常，啟動子位于基因的5’非編碼區(qū)，與結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄起始位點相鄰近。在轉(zhuǎn)錄起始中發(fā)揮作用的啟動子內(nèi)的序列元件通常以共有核苷酸序列為特征。如果啟動子為誘導(dǎo)型啟動子，則在對誘導(dǎo)劑的應(yīng)答中提高轉(zhuǎn)錄速率。相反，如果啟動子為組成型啟動子，則誘導(dǎo)劑不能調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄速率。還已知有阻遏型啟動子。“調(diào)控元件”是調(diào)節(jié)啟動子活性的核苷酸序列。例如，調(diào)控元件可以包含與能夠排他地或優(yōu)先地在特定細(xì)胞、組織或器官中進(jìn)行轉(zhuǎn)錄的細(xì)胞因子結(jié)合的核苷酸序列。這些類型的調(diào)控元件通常與以“細(xì)胞特異性”、“組織特異性”或“器官特異性”的方式表達(dá)的基因結(jié)合?！霸鰪?qiáng)子”是一種類型的調(diào)控元件，其能夠提高轉(zhuǎn)錄效率，而不論增強(qiáng)子相對于轉(zhuǎn)錄起始位點的距離或方向?！翱寺≥d體”為具有能夠在宿主細(xì)胞中自主復(fù)制的能力的核酸分子，例如質(zhì)粒、粘粒或細(xì)菌噬菌體?？寺≥d體通常包含一個或少數(shù)幾個限制性內(nèi)切酶識別位點，該位點允許以可確定的方式插入核酸分子，而不使載體喪失主要的生物功能；和編碼標(biāo)記基因的核苷酸序列，該序列適合用于轉(zhuǎn)化有所述克隆載體的細(xì)胞的鑒別和篩選。標(biāo)記基因通常包括提供四環(huán)素或氨芐青霉素抗性的基因。“表達(dá)載體”是編碼在宿主細(xì)胞中表達(dá)的基因的核酸分子。通常，表達(dá)載體包含轉(zhuǎn)錄啟動子、基因和轉(zhuǎn)錄終止子。基因表達(dá)常常處于啟動子的控制之下，將此類基因稱為“可操作地連接至”所述啟動子上。類似地，如果調(diào)控元件調(diào)節(jié)核心啟動子的活性，則調(diào)控元件和核心啟動子被可操作地連接。被稱作“轉(zhuǎn)錄載體”的較簡單載體僅能夠轉(zhuǎn)錄但不能翻譯：它們能夠在靶細(xì)胞中復(fù)制但不能表達(dá)，其與表達(dá)載體不同。轉(zhuǎn)錄載體用于擴(kuò)增其插入物?！爸亟M宿主”是包含異源核酸分子，例如克隆載體或表達(dá)載體的細(xì)胞。轉(zhuǎn)染描述的是將外來物質(zhì)引入真核細(xì)胞中。用于非病毒方法的術(shù)語“轉(zhuǎn)染”最常用于指哺乳動物細(xì)胞，而術(shù)語“轉(zhuǎn)化”優(yōu)選用于描述非病毒DNA轉(zhuǎn)移至細(xì)菌和非動物真核細(xì)胞，例如真菌、藻類和植物?；瘜W(xué)方法和物理方法均可以用于轉(zhuǎn)染細(xì)胞。“多肽”是天然產(chǎn)生的或合成的氨基酸殘基聚合物，其優(yōu)選僅通過肽鍵連接。通過非宿主DNA分子表達(dá)產(chǎn)生的多肽為“異源”肽或多肽。本文使用的術(shù)語“多肽”涵蓋了蛋白、肽和多肽，其中所述蛋白、肽或多肽可以已經(jīng)經(jīng)過翻譯后修飾或可以不經(jīng)過翻譯后修飾。翻譯后修飾可以為，例如磷酸化、甲基化和糖基化?！鞍被釟埢笨梢詾殡逆I或不同于肽鍵的鍵連接的天然或非天然氨基酸殘基。氨基酸殘基可以為D-構(gòu)型或L-構(gòu)型。氨基酸殘基包括被包含碳原子或碳原子鏈的中心部分分開的氨基末端部分(NH2)和羧基末端部分(COOH)，它們的至少之一包括至少一個側(cè)鏈或官能團(tuán)。NH2是指存在于氨基酸或肽的氨基末端的氨基基團(tuán)，COOH是指存在于氨基酸或肽的羧基末端的羧基基團(tuán)。常用術(shù)語氨基酸包括天然的或非天然的氨基酸。J.Biol.Chem.,243:3552-59(1969)andadoptedin37C.F.R.,section1.822(b)(2)中列出的標(biāo)準(zhǔn)命名法的天然氨基酸屬于下表1中列出的氨基酸組。非天然氨基酸是未列在表1中的氨基酸。非天然氨基酸的實例是，例如37C.F.R.section1.822(b)(4)中列出的氨基酸，其均通過引用并入本文。此外，非天然氨基酸殘基包括，但不限于經(jīng)修飾的氨基酸殘基、L-氨基酸殘基和D-氨基酸殘基的立體異構(gòu)體。表1：天然氨基酸及其各自的代號“等價氨基酸殘基”是指能夠取代多肽中的另一個氨基酸殘基而基本不改變該多肽的結(jié)構(gòu)和/或功能的氨基酸殘基。因此，等價氨基酸具有類似的性質(zhì)，例如側(cè)鏈的體積(bulkiness)、側(cè)鏈極性(極性或非極性)、疏水性(疏水或親水)、pH(酸性、中性或堿性)和(芳族/脂肪族)碳分子的側(cè)鏈構(gòu)造。因此，可以將“等價氨基酸殘基”認(rèn)為是“保守氨基酸取代”。在一個實施方式中，等價氨基酸的分類是指以下類：1)HRK，2)DENQ，3)C，4)STPAG，5)MILV和6)FYW。在一個實施方式中，在本文使用的術(shù)語“等價氨基酸取代”的含義內(nèi)，以下所指的氨基酸組中的一個氨基酸可以被另一個氨基酸取代。i)具有極性側(cè)鏈的氨基酸(Asp,Glu,Lys,Arg,His,Asn,Gln,Ser,Thr,Tyr和Cys)ii)具有非極性側(cè)鏈的氨基酸(Gly,Ala,Val,Leu,Ile,Phe,Trp,Pro,和Met)iii)具有脂肪族側(cè)鏈的氨基酸(Gly,AlaVal,Leu,Ile)iv)具有環(huán)形側(cè)鏈的氨基酸(Phe,Tyr,Trp,His,Pro)v)具有芳族側(cè)鏈的氨基酸(Phe,Tyr,Trp)vi)具有酸性側(cè)鏈的氨基酸(Asp,Glu)vii)具有堿性側(cè)鏈的氨基酸(Lys,Arg,His)viii)具有酰胺側(cè)鏈的氨基酸(Asn,Gln)ix)具有羥基側(cè)鏈的氨基酸(Ser,Thr)x)具有含硫側(cè)鏈的氨基酸(Cys,Met),xi)中性、弱疏水性氨基酸(Pro,Ala,Gly,Ser,Thr)xii)親水性、酸性氨基酸(Gln,Asn,Glu,Asp),和xiii)疏水性氨基酸(Leu,Ile,Val)本發(fā)明還涉及Hsp70的變體或其片段，其中已經(jīng)通過計算機(jī)分析設(shè)計了取代，該計算機(jī)分析利用序列同源性以預(yù)測取代是否影響蛋白功能(例如，PaulineC.NgandStevenHenikoff,GenomeResearch,Vol.11,Issue5,863-874,May2001)。由于標(biāo)準(zhǔn)分析方法的不精確性，聚合物的分子量和長度被理解為近似的數(shù)值。應(yīng)當(dāng)理解，當(dāng)此數(shù)值被表示為“約”X或“近似于”X時，所指的數(shù)值X精確至+/-20％，例如+/-10％，如+/-5％。附圖說明圖1Hsp70對aSMase與BMP的結(jié)合以及神經(jīng)酰胺水平的影響。(A)作為事先結(jié)合的Hsp70的作用，0.2μMaSMase與含BMP的脂質(zhì)體在pH4.5結(jié)合(類似于實施例1的實驗，詳細(xì)參見本文的材料和方法部分)。使Hsp70解離10分鐘，從而在添加aSMase之前達(dá)到較低的解離漸近線)。(B)野生型(WT)和Hsp70轉(zhuǎn)基因(Hsp70-TG)iMEF的共聚焦顯微照片以及其中神經(jīng)酰胺水平的定量。利用抗神經(jīng)酰胺的小鼠單克隆抗體(克隆15b4)進(jìn)行免疫檢測。在6個預(yù)定區(qū)域的激光掃描顯微照片的基礎(chǔ)上進(jìn)行定量，之后在LSMDuo軟件中進(jìn)行量化。圖2rHsp70對iMEF-WT(永生化鼠胚胎成纖維細(xì)胞，野生型)中的aSMase活性的影響。向細(xì)胞施予3nM、30nM和300nM的rHsp70，并測定aSMase的活性(A500是所產(chǎn)生的提高濁度的神經(jīng)酰胺的量度)。對照細(xì)胞用BSA(牛血清白蛋白)處理。圖3不同成纖維細(xì)胞中的aSMase活性。NPDA：A型尼曼-皮克病。圖4主要的鞘脂水解示意圖。具有短親水性頭部基團(tuán)的鞘脂類的外水解斷裂需要非酶促輔因子鞘脂激活因子蛋白(SAP或鞘脂激活蛋白)。各酶以及相應(yīng)激活蛋白的遺傳性缺乏都引起溶酶體脂質(zhì)貯積，并導(dǎo)致各種鞘脂貯積病的出現(xiàn)。Ferlintzetal.,Chem.Phys.Lipids,(102)35-43,1999。圖5溶酶體Hsp70穩(wěn)定了溶酶體膜。(a)利用300nMrHsp70-AF488(綠色)溫育，固定并用溶酶體膜整合蛋白-1(LIMP-1；紅色)染色的U-2-OS細(xì)胞的代表性共聚焦圖像。對于用其它細(xì)胞器標(biāo)記物的共定位，參見圖9。(b)在對通過反復(fù)凍融循環(huán)和離心輕膜部分(LMF)獲得的膜(memb.)中和上清液(sup.)中的rHsp70-AF488定量前，利用300nMrHsp70-AF488溫育U-2-OS細(xì)胞24小時。溶酶體相關(guān)膜蛋白2(LAMP-2)和組織蛋白酶B(CatB)的免疫印跡分析證明了分級方法的可行性。(c)暴露于光致氧化下的U-2-OS細(xì)胞的代表性靜止圖像(吖啶橙和藍(lán)光)。通過紅色染色降低和綠色染色增加使溶酶體完整性的丟失可視化。(d和e)用所示的重組蛋白(300nM)溫育U-2-OS細(xì)胞24小時，并在光致氧化后分析溶酶體的完整性。如所示，在加入重組蛋白之前用所示siRNA處理細(xì)胞48小時。數(shù)值表示的是3個(d)或5個(e)獨立試驗的平均值±SD。來自未處理的或用對照siRNA或Hsp70siRNA處理的U-2-OS細(xì)胞的所示蛋白的代表性免疫印跡結(jié)果示于右側(cè)。比例尺：20μm(a和c)。圖6Hsp70和BMP之間的pH依賴性相互作用穩(wěn)定了溶酶體膜。(a)在pH7.4(左)和pH6.0(右)向包含所示脂質(zhì)(χ＝0.2)的脂質(zhì)體中加入rHsp70(0.12nmol試樣量)時脂質(zhì)體90°光散射的相對變化。(b)U-2-OS細(xì)胞未處理(-)或用50μg/ml抗-BMPIgG或?qū)φ誌gG溫育7小時然后加入載體(-)或300nMrHsp70溫育24小時，并分析光致氧化時溶酶體的完整性。(c)U-2-OS細(xì)胞未處理(-)或用50μg/ml抗-BMPIgG或?qū)φ誌gG溫育7小時然后加入載體(-)或25nM順鉑溫育24小時，并分析Hoechst33342染色時凋亡細(xì)胞的形態(tài)。(d)通過相對峰熒光強(qiáng)度的變化測定的在pH6.0時rHsp70及其突變體與POPC/BMP(χBMP＝0.2)脂質(zhì)體的相互作用。蛋白濃度為0.36μM(rHsp70)、0.5μM(ΔATP)和0.35μM(ΔPBD)(左)或0.43μM(右)，并加入10μM試樣量的脂質(zhì)體。(e)野生型rHsp70(WT)及其缺失突變體(ΔATP和ΔPBD)和點突變體(W90F和W580F)在pH4.5下與固定化LUV(平均直徑：100nm；總脂質(zhì)濃度：0.1mM；組成：鞘磷脂(χ＝0.1)、磷脂酰膽堿(χ＝0.5)、膽固醇(χ＝0.2)和BMP(χ＝0.2))之間的相互作用的BIAcore分析。注射脂質(zhì)體直至平衡(100s)，并以20μl/分鐘的流速注射包含所示濃度(左)或300nM(右)重組蛋白的乙酸鈉緩沖液(50mM,pH4.5)共200s，然后為10分鐘的解離階段。ΔRU定義為脂質(zhì)體平衡后和蛋白-脂質(zhì)體平衡后測定的響應(yīng)信號之間的差異。(f和g)U-2-OS細(xì)胞未處理(對照)或者用所示的重組Hsp70蛋白(300nM)溫育24小時并在光致氧化后分析溶酶體的完整性(f)，或者用載體(白色柱)或25μM順鉑(黑色柱)處理24小時并分析凋亡樣形態(tài)(g)。(h)Hsp70的ATPase結(jié)構(gòu)域的帶結(jié)構(gòu)和分子表面模型。ATP(范德華-表面表示)可以被可視化地結(jié)合在ATP-結(jié)合口袋內(nèi)。綠色和紫色球體分別表示配位結(jié)合的鈣和鈉離子的范德華-表面。注意底部結(jié)構(gòu)域的帶正電荷的部分和W90的位置。數(shù)值表示的是最少5次獨立試驗的平均值±SD(b、c、f和g)。圖7Hsp70刺激ASM活性，進(jìn)而穩(wěn)定溶酶體。(a)作為預(yù)先結(jié)合的rHsp70的功能，200nMrASM與包含BMP的脂質(zhì)體在pH4.5時結(jié)合的Biacore測定。按照圖6e圖例的描述進(jìn)行試驗，在10分鐘的rHsp70-解離階段之后加入rASM共180秒，隨后為再一個10分鐘的解離階段。(b)如圖所示，野生型(WT)和Hsp70轉(zhuǎn)基因(Hsp70)MEF的裂解物中ASM的活性(左側(cè)圖)以及用300nMrHsp70溫育24小時或48小時的WTMEF中ASM的活性。(c和d)用所示濃度的地昔帕明(Desipramine)處理3小時的WT和Hsp70iMEF的存活率(MTT還原法；c)和胞質(zhì)組織蛋白酶的活性(zFRase；d)。(e)WT和Hsp70MEF以及用12.5μM和25μM地昔帕明(分別為左側(cè)圖和右側(cè)圖)溫育3小時的Hsp70MEF的溶酶體完整性丟失(光致氧化)的活單細(xì)胞成像。連續(xù)測定紅色熒光的降低(左側(cè)圖)和綠色熒光的增加(右側(cè)圖)，以獲得溶酶體完整性丟失的完整動態(tài)曲線。每次試驗在預(yù)定的區(qū)域測定25-60個細(xì)胞，Hsp70與WT之間以及Hsp70+地昔帕明與Hsp70之間p<0.001。所有數(shù)值表示的均為最少3次獨立試驗的平均值±SD。圖8rHsp70刺激ASM的活性，穩(wěn)定溶酶體并降低了NPDA成纖維細(xì)胞中溶酶體的體積。(a)按照圖3分析的NPDA患者的原代成纖維細(xì)胞溶酶體穩(wěn)定性的活單細(xì)胞成像，p<0.001。(b)未處理的，或者用300nMrHsp70處理48小時(左側(cè)圖)，或者單獨用150nMrASM或150nMrASM與300nMrHsp70的組合處理24小時(右側(cè)圖)的NPDA成纖維細(xì)胞的ASM活性。根據(jù)所獲得的酶促反應(yīng)速率(DA500/mg蛋白/分鐘)計算的p值。右圖證明了rASM(綠色)的細(xì)胞內(nèi)吞攝取，以及通過用溶酶體紅色熒光探針(LysotrackerRed)共染色可視化的溶酶體區(qū)室的定位。(c)按照圖3進(jìn)行的未處理的，或者用300nMrHsp70或用150nMaSMase或用rHsp70和aSMase的組合處理24小時的NPDA成纖維細(xì)胞的溶酶體穩(wěn)定性的分析，與未處理細(xì)胞相比所有處理組p<0.001。(d)未處理的，或者用300nMBSA、300nMrHsp70、150nMrASM(150nM)或rHsp70和rASM的組合處理24小時的NPDA成纖維細(xì)胞的細(xì)胞共聚焦橫截面的溶酶體面積的定量。右圖證明了rHsp70(綠色)對NPDA成纖維細(xì)胞內(nèi)溶酶體區(qū)室(紅色)體積的影響。白色箭頭表示具有細(xì)胞內(nèi)吞的rHsp70且溶酶體區(qū)室減小的細(xì)胞。數(shù)值表示為三個獨立試驗的平均值±SD。比例尺＝20μM。UT＝未處理。圖9細(xì)胞內(nèi)吞的rHsp70-AF488和溶酶體的共定位。利用300nMrHsp70-AF488(綠色)溫育，固定并用以下細(xì)胞器標(biāo)記物(紅色)染色的U-2-OS細(xì)胞的代表性聚焦圖像。溶酶體相關(guān)膜蛋白-1(LAMP-1；溶酶體)，LAMP-2(溶酶體)，LBPA/BMP(6C4；內(nèi)溶酶體區(qū)室)，Cytc(線粒體)，SERCA(ER)和golgin-97(高爾基體)。比例尺：20μm(LAMP-1、LAMP-2和BMP)或者10μm(Cytc、SERCA和Golgin-97)。圖10在rHsp70存在下rASM(重組aSMase)和BMP的相互作用。(a)rASM與固定的陰離子脂質(zhì)體(平均直徑為100nm，總脂質(zhì)濃度為0.1mM，組成為：10mol％鞘磷脂、50mol％磷脂酰膽堿、20mol％膽固醇和20mol％BMP)在pH4.5的相互作用。在脂質(zhì)體的結(jié)合(此時定義為0)之后測定的響應(yīng)信號。(b)預(yù)先結(jié)合的rHsp70對隨后的rASM的結(jié)合的影響。利用與(a)相同的固定化陰離子脂質(zhì)體溫育所示量的rHsp70。在10分鐘的rHsp70解離階段后，加入200nMrASM共180秒，然后解離10分鐘。圖11Hsp70小分子誘導(dǎo)劑苯甲醇對A型尼曼-皮克病(NPDA)患者成纖維細(xì)胞的影響。(A)苯甲醇以劑量依賴的形式對NPDA中Hsp70的誘導(dǎo)(蛋白表達(dá))(B)在用40mM苯甲醇處理NPDA細(xì)胞后，NPDA溶酶體的穩(wěn)定性增加。(C)在用40mM苯甲醇處理后，通過溶酶體橫截面面積測定的NPDA細(xì)胞的病理減少(方法將在實施例2中詳述)。圖12aSMase缺失對溶酶體穩(wěn)定性的影響根據(jù)廠商的方法利用Oligofectamine(Invitrogen)將靶向酸性鞘磷脂酶(aSMase)的小干擾RNA(siRNA)(si938、si1257、si1340)和對照siRNA(mm)轉(zhuǎn)染至U2OS細(xì)胞中。siRNA的濃度：50nM。72小時后，通過RT-PCR(未顯示)，以及通過吖啶橙介導(dǎo)的光致氧化的活單細(xì)胞成像的細(xì)胞溶酶體穩(wěn)定性分析證明了敲減。持續(xù)測定綠色熒光的增加，以獲得溶酶體完整性丟失的完整動態(tài)曲線。由圖片可以看出，用靶向aSMase的siRNA處理的細(xì)胞的溶酶體穩(wěn)定性顯著降低。所述方法將在實施例2中作進(jìn)一步解釋。圖13用rHsp70對所有NPDA/B細(xì)胞系的處理顯著逆轉(zhuǎn)了溶酶體的病理，即降低了溶酶體的橫截面面積。A型和B型尼曼-皮克病成纖維細(xì)胞(NPDA/NPDB)和未處理的正常成纖維細(xì)胞(BJ)用作為對照的300nMBSA或葡聚糖處理24小時，或者用300nMrHsp70、150nMrhaSMase或300nMrHsp70和150nMrhaSMase組合處理24小時的細(xì)胞共聚焦橫截面的溶酶體面積定量。用300nMrHsp70-W90F(W90F)(不與BMP相互作用的Hsp-70突變體)處理24小時的NPDA細(xì)胞具有與對照細(xì)胞相當(dāng)?shù)淖饔?。方法參見實施?。圖14在Hsp70轉(zhuǎn)基因成纖維細(xì)胞中和rHsp70處理的NPDA成纖維細(xì)胞中aSMase活性增加。野生型(WT)或Hsp70-轉(zhuǎn)基因(TG)永生化小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(iMEF)(A和B)中，以及A型尼曼-皮克病患者的未處理的或用rHsp70處理的成纖維細(xì)胞(NPDA83/24)(C)中的脂質(zhì)物質(zhì)(所示的鞘磷脂和神經(jīng)酰胺)的質(zhì)譜分析。鞘磷脂水平的降低和神經(jīng)酰胺水平的增高表明aSMase的活性提高。圖15法伯氏病患者成纖維細(xì)胞中病理的逆轉(zhuǎn)。法伯氏病患者細(xì)胞的共聚焦橫截面的溶酶體面積定量。法伯氏病患者成纖維細(xì)胞(法伯氏89/73和法伯氏89/78)未處理或者如所示用300nMBSA或300nMrHsp70處理24小時。由圖明顯看出，用rHsp70處理法伯氏病患者成纖維細(xì)胞顯著逆轉(zhuǎn)了溶酶體的病理，即減少了溶酶體的橫截面面積。關(guān)于方法的描述，參見實施例2。圖16Hsp70提高了對其它分子的內(nèi)吞攝取。A圖：野生型的(WT)或者Hsp70轉(zhuǎn)基因(TG)的永生化小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(iMEF，用20μg/mLAlexaFluor-488-標(biāo)記的BSA(BSA*)溫育24小時)。通過熒光顯微照片(未顯示)證明了內(nèi)吞攝取(參見實施例2)。然后收集細(xì)胞，并分析BSA*的攝取。由圖明顯看出，Hsp70-轉(zhuǎn)基因iMEF的BSA*攝取量顯著高于野生型iMEF。B圖：如所示，用含或不含3000nMrHsp70的20μg/mLBSA*溫育24小時的U2OS骨肉瘤細(xì)胞。通過熒光顯微照片(未顯示)證明了內(nèi)吞攝取(參見實施例2)。然后收集細(xì)胞，并分析BSA*的攝取量。由圖明顯看出，同時加入BSA*和rHsp70的U2OS細(xì)胞的BSA*攝取量顯著高于單獨用BSA*溫育的細(xì)胞。具體實施方式本發(fā)明人證明，Hsp70通過與內(nèi)溶酶體膜的直接相互作用(由特定的磷脂，即BMP(二(單?；视?磷脂)關(guān)聯(lián)起來的相互作用)發(fā)揮其細(xì)胞保護(hù)作用的主要部分。BMP僅存在于在晚期內(nèi)涵體和溶酶體中。本發(fā)明人證明Hsp70-BMP相互作用依賴于Hsp70的N端ATPase結(jié)構(gòu)域，尤其是色氨酸90，并且這種相互作用是pH依賴性的。Hsp70和BMP間的相互作用通過提供用于調(diào)節(jié)特定亞類溶酶體酶的穩(wěn)定性以及抑制溶酶體膜的去穩(wěn)定化并確保溶酶體酶的釋放的平臺，而對Hsp70的膜穩(wěn)定性作用至關(guān)重要。這些發(fā)現(xiàn)形成了本文所公開的用于溶酶體貯積癥的有前景的新治療形式的基礎(chǔ)。溶酶體自deDuve在1955年發(fā)現(xiàn)溶酶體以來，對該細(xì)胞器的認(rèn)識一直被“溶酶體是獨立的動物細(xì)胞內(nèi)吞途徑的終點——容納大量如果釋放至胞質(zhì)中將引起壞死和組織炎癥的水解酶的區(qū)室”的理論所統(tǒng)治。由于近來的發(fā)現(xiàn)為溶酶體及其內(nèi)容物的更多特異任務(wù)提供了證據(jù)，因此對溶酶體的這種認(rèn)識(最好的認(rèn)識是垃圾處理單元，最差的認(rèn)識是非特異的“自殺袋”)已經(jīng)發(fā)生巨大變化。溶酶體水解酶作為細(xì)胞內(nèi)降解和隨后的細(xì)胞組分回收的主要區(qū)室，溶酶體接受異源的和自噬的物質(zhì)，所述物質(zhì)在溶酶體細(xì)胞器的內(nèi)腔中找到其最終命運。降解由能夠消化所有主要細(xì)胞大分子的多種酸性水解酶(磷酸酶、核酶、糖苷酶、蛋白酶、肽酶、硫酸酯酶、脂酶等)實現(xiàn)。其中，研究的最透徹的溶酶體蛋白酶為組織蛋白酶家族。根據(jù)其活性位點的氨基酸可以將組織蛋白酶分成三個亞組，即半胱氨酸(B、C、H、F、K、L、O、S、V、W和X/Z)、天冬氨酸(D和E)和絲氨酸(G)組織蛋白酶。雖然組織蛋白酶在溶酶體外的中性pH仍能夠發(fā)揮作用(雖然穩(wěn)定性降低和/或特異性改變)，但優(yōu)選在溶酶體的酸性pH(pH4-5)發(fā)揮作用。直至最近仍認(rèn)為組織蛋白酶的功能限于溶酶體內(nèi)蛋白的轉(zhuǎn)換，以及在分泌后對細(xì)胞外基質(zhì)的降解。然而，在過去的幾年中，已經(jīng)公認(rèn)一些組織蛋白酶具有更特異的功能，包括在骨重建、抗原提呈、表皮穩(wěn)態(tài)、激素原加工、保護(hù)細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞在脫粒后不受自身的破壞、保持小鼠的中樞神經(jīng)系統(tǒng)、血管生成、癌細(xì)胞的侵襲以及程序性細(xì)胞死亡(PCD)中的作用。除了蛋白斷裂之外，溶酶體以及晚期內(nèi)涵體還通過一系列的內(nèi)吞溶酶體酶和輔酶(其正常功能依賴于溶酶體內(nèi)膜的脂質(zhì)組成)負(fù)責(zé)細(xì)胞脂質(zhì)(例如鞘糖脂)的代謝?？梢匀菀椎赝ㄟ^在鞘脂代謝的任何階段的功能失常的情況下臨床疾病明顯，產(chǎn)生諸如泰-薩氏病(Tay-Sachsdisease)、桑德霍夫病(Sandhoffdisease)、法伯氏病、法布里病(Fabrydisease)、戈謝病(Gaucherdisease)、克拉伯病和尼曼-皮克病的疾病的事實，理解功能性內(nèi)溶酶體脂質(zhì)代謝的重要性。向溶酶體的運輸和從溶酶體的運輸內(nèi)吞膜的運送作用通過向多種細(xì)胞內(nèi)區(qū)室遞送膜組分、各種溶質(zhì)分子和受體相關(guān)的配體而在哺乳動物細(xì)胞中發(fā)揮重要作用。然而多種內(nèi)吞途徑(主要途徑集中于溶酶體，在溶酶體中發(fā)生降解并可能回收至質(zhì)膜)直至目前似乎都很簡單，但最近的證據(jù)表明這些途徑比之前想象的更復(fù)雜。內(nèi)吞途徑對內(nèi)吞作用的最佳理解是通過形成披網(wǎng)格蛋白小窩的受體介導(dǎo)的分子內(nèi)吞作用，不過還鑒定出多種非網(wǎng)格蛋白(non-clathrin)介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)吞途徑(例如巨胞飲作用、吞噬作用、通過形成細(xì)胞小窩和形成披非網(wǎng)格蛋白小窩的攝取)。內(nèi)吞系統(tǒng)的命名還沒有完全標(biāo)準(zhǔn)化，通常使用的術(shù)語“早期內(nèi)涵體”實際上描述了兩種不同的內(nèi)涵體區(qū)室——分選內(nèi)涵體和內(nèi)吞再循環(huán)區(qū)室(ERC)。在常規(guī)的受體介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)吞途徑中，諸如轉(zhuǎn)鐵蛋白受體、低密度脂蛋白受體和甘露糖-6-磷酸受體(MPR)的受體通過披網(wǎng)格蛋白小窩的胞質(zhì)末端序列基序和網(wǎng)格蛋白層中元件(element)之間的相互作用而集中于質(zhì)膜表面的披網(wǎng)格蛋白小窩內(nèi)。在其網(wǎng)格蛋白層脫落后，新形成的內(nèi)涵體與其它內(nèi)涵體以及預(yù)存在的分選內(nèi)涵體融合，以成為分選內(nèi)涵體。如名稱所揭示的，分選內(nèi)涵體的主要任務(wù)是將新獲取的組分分選到其正確的位置。已知的三種目的地包括質(zhì)膜、晚期內(nèi)涵體和ERC。隨著分選內(nèi)涵體的成熟，其pH降低，從而促進(jìn)了受體結(jié)合的配體向內(nèi)涵體腔內(nèi)的釋放。然而，在分選內(nèi)涵體完全成熟為晚期內(nèi)涵體前，必須將去往再循環(huán)的分子分選出來。該過程被認(rèn)為是通過夾斷狹窄小管(有利于從溶質(zhì)分子分選出膜蛋白的過程)而發(fā)生，原因是小管的表面積-體積比大于由小泡組成的分選內(nèi)涵體。夾斷的小管可以使膜蛋白直接返回質(zhì)膜(直接歸還途徑)或至ERC。ERC主要是一類管狀細(xì)胞器，其位置隨細(xì)胞類型而不同。雖然ERC能夠?qū)⒎肿臃诌x至數(shù)種不同的目的地，但通過ERC運輸?shù)姆肿佣鄶?shù)返回質(zhì)膜。隨著分選內(nèi)涵體的成熟，主要由于空泡型質(zhì)子ATPase(V-ATPase)的作用而使腔內(nèi)pH穩(wěn)定下降，同時還發(fā)生膜脂質(zhì)和蛋白組成的轉(zhuǎn)移。從分選內(nèi)涵體至晚期內(nèi)涵體以及進(jìn)一步進(jìn)入溶酶體的膜運輸存在一些爭議。爭議在于通過小泡運輸或通過分選內(nèi)涵體的成熟能否對這種運輸作出最佳解釋。提出的分選內(nèi)涵體和晚期內(nèi)涵體之間的中間體的模型有兩種。雖然成熟模型派認(rèn)為到達(dá)晚期內(nèi)涵體的小泡是在從前分選內(nèi)涵體除去組分后所留下的，但預(yù)存在分隔模型派認(rèn)為分子向晚期內(nèi)涵體的分子運輸通過內(nèi)吞載體小泡(ECV，預(yù)存分選內(nèi)涵體區(qū)室和晚期內(nèi)涵體區(qū)室之間的特異運輸小泡)而發(fā)生。認(rèn)為分選內(nèi)涵體區(qū)室和晚期內(nèi)涵體區(qū)室兩者的結(jié)構(gòu)均比運輸小泡復(fù)雜且具有更特異的功能。然而，由于從早期內(nèi)涵體動態(tài)網(wǎng)產(chǎn)生的小泡可以經(jīng)歷釋放小的GTPaseRAB5并募集RAB7(晚期內(nèi)涵體標(biāo)記)的轉(zhuǎn)變，最近的活細(xì)胞成像研究對兩種模型的機(jī)械方面進(jìn)行了協(xié)調(diào)。雖然在功能上很好地定義了內(nèi)涵體途徑的機(jī)體組成，但其命名可能仍令人困擾。利用通過早期內(nèi)涵體/分選內(nèi)涵體(在此發(fā)生受體-配體解偶聯(lián))但不通過晚期內(nèi)涵體(在此可以發(fā)生蛋白水解)回收的管家受體(例如轉(zhuǎn)鐵蛋白受體)以及其它脂質(zhì)和蛋白在功能上對細(xì)胞內(nèi)吞途徑進(jìn)行了定義。然而在這些功能性定義之外，當(dāng)面對命名時所述描繪圖則變得較為模糊，當(dāng)在早期內(nèi)涵體中開始并且在向晚期內(nèi)涵體的成熟過程中變得越來越明顯的腔內(nèi)小泡的產(chǎn)生形成了所謂的“多泡體”(MVB)時尤其如此。術(shù)語多泡體一直與用于ECV和晚期內(nèi)涵體以及用于包含多泡區(qū)或元件的所有內(nèi)吞小泡的另一個名稱交換使用，其包括當(dāng)溶酶體與晚期內(nèi)涵體(包含多泡結(jié)構(gòu))融合時形成的雜細(xì)胞器。然而，晚期內(nèi)涵體包含的腔膜小泡多于早期內(nèi)涵體，并因此常常用術(shù)語“多泡體”描述該區(qū)室。最后，該領(lǐng)域的大量混淆來自晚期內(nèi)涵體相對于溶酶體的定義，或者甚至是缺乏此定義。兩個區(qū)室酸性相當(dāng)且多數(shù)(如非所有)存在于溶酶體的蛋白也可以在晚期內(nèi)涵體中發(fā)現(xiàn)。根據(jù)成熟模型，晚期內(nèi)涵體是溶酶體的前體，但考慮到逐步發(fā)育(如理論所提示)，很難獲得嚴(yán)格的分類。然而，最近的證據(jù)提出溶酶體和晚期內(nèi)涵體為獨立的區(qū)室，其在經(jīng)歷“接吻”事件(短暫融合)和完全融合事件之后，可由所述雜合細(xì)胞器重新形成溶酶體。生物合成途徑除細(xì)胞內(nèi)吞作用之外，晚期內(nèi)涵體還通過MPR途徑接受來自高爾基體外側(cè)網(wǎng)絡(luò)(TGN)的物質(zhì)(生物合成途徑)。陽離子依賴性MPR和非陽離子依賴性MPR/胰島素樣生長因子-II(IGF-II)受體共同完成向溶酶體遞送來自TGN的新合成的酸性水解酶的任務(wù)。MPR對酸性水解酶的識別需要向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中加入碳水化合物以及隨后碳水化合物殘基對高爾基體內(nèi)側(cè)甘露糖-6-磷酸部分的修飾和磷酸化。結(jié)合有MPR的水解酶首先被遞送至內(nèi)涵體中，在此其由于腔內(nèi)pH的下降而從受體解離，由此使受體重新被回收至TGN。雖然定位于高爾基體的含γ-耳ADP核糖基化因子結(jié)合蛋白(γ-ear-containingADPribosylationfactor-bindingproteins，GGA)也發(fā)揮作用，但披網(wǎng)格蛋白小窩中主要負(fù)責(zé)將MPR分選至TGN處的蛋白為銜接蛋白-1(AP-1)。AP-1和GGA是否為共同作用或者實際上將兩種MPR靶向不同的亞細(xì)胞定位，目前還不知道。AP-1是由四個成員(均為廣泛用在分泌和內(nèi)吞途徑中的雜四聚體蛋白)組成的接合蛋白家族的一部分。AP-1除了在TGN中形成的披網(wǎng)格蛋白小窩內(nèi)的上述作用外，質(zhì)膜的內(nèi)吞過程中在披網(wǎng)格蛋白小窩中也使用AP-1和AP-2，同時AP-3和AP-4在溶酶體相關(guān)的膜蛋白(LAMP)的運輸中發(fā)揮作用。自噬途徑自噬作用是大分子到達(dá)溶酶體的第三個被很好表征的途徑。自噬作用是進(jìn)化保守性途徑，其涉及長壽命蛋白和細(xì)胞器的轉(zhuǎn)換。其通常在低基礎(chǔ)水平上發(fā)揮作用，不過可以在例如營養(yǎng)饑餓的條件下誘導(dǎo)自噬作用。在這些條件下，巨自噬是負(fù)責(zé)向溶酶體遞送物質(zhì)的主要途徑。巨自噬的特征在于包裹胞質(zhì)細(xì)胞器的扁平膜池和/或由此形成閉合的雙膜結(jié)合空泡(自噬體)的胞質(zhì)部分。自噬體最終與溶酶體融合形成自噬溶酶體/自溶酶體，在此發(fā)生所吞噬的大分子的降解和回收。自噬體膜的來源仍未闡明。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體、被稱為吞噬核心的沒有被很好表征的膜區(qū)室以及從頭合成(denovosynthesis)都被認(rèn)為自噬體膜的來源。通過酵母基因組學(xué)的新進(jìn)展和后來的哺乳動物同源物的發(fā)現(xiàn)迅速增強(qiáng)了對自噬過程的理解，并且還有望在不久后闡明自噬體膜的來源。還有其它的溶酶體接受自噬物質(zhì)的途徑。被稱為巨自嗜作用的相當(dāng)難區(qū)分的過程的特征在于溶酶體通過溶酶體膜的內(nèi)陷吞沒胞質(zhì)。除了存在于所吞沒的胞質(zhì)中的大分子外，該過程還可能涉及細(xì)胞器(例如過氧化物酶體)的攝取。最后，分子伴侶介導(dǎo)的胞質(zhì)蛋白至溶酶體腔內(nèi)的運輸代表了自噬作用的更直接的選擇形式。該途徑依賴于溶酶體膜兩側(cè)存在的熱休克蛋白70家族的組成型表達(dá)成員Hsc70。該過程還依賴于LAMP-2a對目標(biāo)蛋白內(nèi)的KDEL序列基序的識別。溶酶體的重新形成和溶酶體分泌在溶酶體與晚期內(nèi)涵體或自噬體融合后，通過酶蛋白的扣押和腔內(nèi)容物的凝縮由所產(chǎn)生的雜合細(xì)胞器重新形成溶酶體。在需要從雜合細(xì)胞器除去或回收的膜蛋白中，最明顯的是MPR，原因是根據(jù)定義其是不存在于溶酶體中的。然而，不能將溶酶體看作是細(xì)胞內(nèi)吞途徑的終點，原因是溶酶體也能夠通過與分泌顆粒融合而形成分泌溶酶體，這是一個Ca2+-依賴性過程并首先在造血來源的分泌細(xì)胞中被認(rèn)可。然而，也存在Ca2+-調(diào)節(jié)的接近膜的溶酶體區(qū)室負(fù)責(zé)非分泌細(xì)胞的胞吐作用的證據(jù)。胞吐的過程依賴于蛋白Rab27a，其為具有大于60個成員的Rab蛋白家族的成員。Rab是在大多數(shù)膜轉(zhuǎn)運步驟(包括小泡形成、運動、停靠和融合)中具有重要調(diào)節(jié)作用的小GTPases。在細(xì)胞內(nèi)吞途徑中為了確定各種細(xì)胞內(nèi)吞分子及其小泡的命運，至少使用了13種Rab。程序性細(xì)胞死亡調(diào)節(jié)總細(xì)胞數(shù)以及構(gòu)成不同組織的細(xì)胞數(shù)并需要用于清除不需要的細(xì)胞的機(jī)制，這在多細(xì)胞生物體中都非常重要。程序性細(xì)胞死亡是實現(xiàn)這種目的的一種方式，其使多細(xì)胞生物體具有自身除去不需要的細(xì)胞而不泄漏細(xì)胞組分，并由此避免與壞死(與程序性細(xì)胞死亡在概念上相似)相關(guān)的炎癥的潛能。凋亡術(shù)語凋亡使用的是希臘語，用以描述花瓣從花上或者樹葉從樹上“脫落”或“掉落”，并且在1972年由Currie及其同事首次創(chuàng)造，用以描述作者在多種組織和細(xì)胞類型中觀察到的程序性細(xì)胞死亡的通用類型。作者注意到他們觀察到的事件具有明顯的形態(tài)相似性，其不同于表征細(xì)胞經(jīng)歷病理的壞死性死亡的形態(tài)特征，并提出這些共同的形態(tài)特征可能是由于經(jīng)歷了一個共同的過程。當(dāng)細(xì)胞通過凋亡死亡時，其經(jīng)歷一系列的轉(zhuǎn)變事件(transformingevent)。在這些事件中且對特征性凋亡表型至關(guān)重要的是caspase的激活，caspase是半胱氨酸肽鏈內(nèi)切酶家族，其在特異的天冬氨酸殘基處切割底物，由此得名。caspase的激活導(dǎo)致其它caspase的蛋白水解加工以及細(xì)胞內(nèi)總蛋白活性的其它一些變化，最終產(chǎn)生與caspase激活相關(guān)的典型的形態(tài)特征，并由此被定義為凋亡。典型的凋亡特征包括細(xì)胞收縮和胞質(zhì)膜起泡，核內(nèi)染色質(zhì)凝聚為清晰的幾何形狀，DNA片段化為～200bp的部分，所謂的核小體梯度，細(xì)胞從其相鄰細(xì)胞脫離和細(xì)胞被瓦解成所謂的凋亡體的小的封閉小泡。在多細(xì)胞環(huán)境中，這些凋亡體最終被巨噬細(xì)胞或相鄰細(xì)胞吞噬，由此實現(xiàn)不利細(xì)胞的清除。程序性細(xì)胞死亡程序性細(xì)胞死亡(PCD)與凋亡不同意，雖然由于大量文獻(xiàn)不加區(qū)別地使用這些術(shù)語而可能趨向于認(rèn)為兩者相同。術(shù)語PCD逐漸接替，但術(shù)語凋亡仍然被用于描述由caspase(尤其是caspase-3)的激活而產(chǎn)生的細(xì)胞死亡程序。然而，某些細(xì)胞在促凋亡caspase的激活下存活以及完全沒有caspase激活的PCD和caspase激活導(dǎo)致非凋亡PCD的能力揭示了細(xì)胞死亡程序的顯著可塑性，并由此PCD可能被更準(zhǔn)確地定義為依賴于死亡細(xì)胞內(nèi)的信號或活性的細(xì)胞死亡。雖然優(yōu)選根據(jù)在任何導(dǎo)致死亡的給定條件組下參與的信號途徑來區(qū)分PCD，但已經(jīng)提議可以根據(jù)死亡細(xì)胞的細(xì)胞核形態(tài)將PCD分成凋亡、凋亡樣PCD和壞死樣PCD，所杜撰的每種定義對應(yīng)于不同的形態(tài)特征，主要特征是染色質(zhì)凝聚的形狀或沒有染色質(zhì)凝聚。然而，由于仍在挑選導(dǎo)致不同種類的細(xì)胞死亡的線索，所以仍沒有可用于區(qū)分不同PCD模型的方法。壞死壞死是PCD的概念相似物，原因是除了除去產(chǎn)生壞死的刺激外不能通過任何其它方式抑制壞死。這種細(xì)胞死亡模式通常見于生物體的病理損害過程中。程序性細(xì)胞死亡的分子機(jī)器凋亡如在之前部分所提及的，通過被稱為caspase的半胱氨酸肽鏈內(nèi)切酶家族成員的激活以及與其激活相關(guān)的形態(tài)來定義凋亡。Caspase以未激活的酶原的形式存在于細(xì)胞中，蛋白水解加工可迅速激活該酶原。所述加工以級聯(lián)形式進(jìn)行，在該級聯(lián)中，凋亡刺激物激活起始caspase(例如caspase-8和caspase-9)，其進(jìn)一步激活級聯(lián)中的下一級——效應(yīng)caspase(例如caspase-3、caspase-6和caspase-7)。由于效應(yīng)caspase切割多種底物(該加工最終導(dǎo)致凋亡相關(guān)的表型)，其被認(rèn)為是凋亡的執(zhí)行者。凋亡程序可以由多種刺激物激活，可以將所述刺激物廣義地分為細(xì)胞外刺激物和細(xì)胞內(nèi)刺激物，細(xì)胞內(nèi)刺激物參見作為主要參與者的線粒體。所述細(xì)胞外刺激物和產(chǎn)生凋亡的以下反應(yīng)也可以被稱為外來信號途徑，其包括由多種死亡受體之一(例如Fas/Apo-1/CD95、TNFR或TRAIL)的激活起始的一系列事件。與其適當(dāng)?shù)呐潴w結(jié)合后，這些受體通過與受體中存在的死亡結(jié)構(gòu)域(DD)相互作用而募集包含死亡結(jié)構(gòu)域的銜接分子(adaptormolecule)，例如TRADD(TNFR1相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白)和FADD(具有死亡結(jié)構(gòu)域的Fas相關(guān)蛋白)。然后，這些銜接分子將caspase-8招募至受體復(fù)合物，在此可能通過接近誘導(dǎo)的自催化加工激活caspase。然后，在某些細(xì)胞(所謂的I型細(xì)胞)中，caspase-8直接切割并激活procaspase-3，然而在II型細(xì)胞中，caspase-8的下一級為胞質(zhì)蛋白Bid。Bid的切割產(chǎn)生片段(截短Bid(tBid))，其誘導(dǎo)兩個促凋亡Bcl-2家族成員Bax和Bak的低聚化、轉(zhuǎn)位并插入至線粒體外膜。這種插入介導(dǎo)了電子載體細(xì)胞色素c(CytC)以及其它一些蛋白從線粒體膜間間隙釋放，其中在所述其它一些蛋白中，最突出的包括凋亡誘導(dǎo)因子(AIF)、對抗已知的凋亡抑制(IAP)蛋白的作用的Smac/DIABLO和內(nèi)切核酶G(其為DNAse)。應(yīng)該注意到，雖然這是通過線粒體激活caspase的理論的關(guān)鍵點，但并沒有關(guān)于Bax和Bak的插入如何促進(jìn)細(xì)胞色素c的釋放的決定性證據(jù)。從線粒體釋放后，CytC在細(xì)胞質(zhì)中積聚，在此其與蛋白Apaf-1(凋亡蛋白酶激活因子-1)結(jié)合，引起構(gòu)象變化，從而促進(jìn)Apaf-1的低聚化。然后，該低聚物通過caspase募集結(jié)構(gòu)域(CARD)之間的同型相互作用而與procaspase-9結(jié)合，導(dǎo)致形成所謂凋亡體的復(fù)合物。該復(fù)合物的形成很大程度上增強(qiáng)了pro-caspase-9的酶促活性，從而導(dǎo)致caspase-3蛋白水解激活。凋亡還可以由引發(fā)線粒體外膜通通透化(MOMP，被稱為內(nèi)部途徑的過程)的細(xì)胞內(nèi)因素觸發(fā)。這些因素包括與細(xì)胞應(yīng)激相關(guān)的第二信使，例如Ca2+、NO和花生四烯酸以及膽紅素、膽汁鹽和能夠產(chǎn)生蛋白變性以及核DNA和線粒體DNA受損的刺激物(例如電離輻射、熱應(yīng)激、活性氧(ROS)和化療劑。在核DNA受損事件中，多種蛋白激酶都可感應(yīng)該事件，但其依賴于DNA損害的形式且由Noxa引發(fā)。這些激酶的活性誘導(dǎo)p53的集聚，然后p53可以作為轉(zhuǎn)錄因子導(dǎo)致促凋亡基因(例如Bax、Noxa和PUMA，均可誘導(dǎo)MOMP)的轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)。p53在線粒體水平上誘導(dǎo)局部產(chǎn)生ROS的線粒體酶和線粒體基質(zhì)蛋白(p53AIP1)的表達(dá)，而其過表達(dá)則觸發(fā)線粒體膜電位的丟失和凋亡。上述通過p53或內(nèi)在刺激物作用的MOMP的誘導(dǎo)是內(nèi)在途徑和外在途徑的交匯點，內(nèi)在途徑在已經(jīng)描述的外在途徑之后，具有細(xì)胞色素c的釋放、凋亡體的形成和caspase-3的激活，其構(gòu)成了使不利細(xì)胞死亡的最后幾個步驟。凋亡的選擇在過去十年，caspase作為PCD執(zhí)行者的排他性作用已經(jīng)遭到挑戰(zhàn)，越來越多的證據(jù)表明，對于細(xì)胞的生命并且尤其是死亡來說，起作用的不單是caspase。新開發(fā)的caspase特異性藥理學(xué)抑制劑以及諸如能量損耗、硝化/氧化應(yīng)激和凋亡蛋白抑制物(IAP)家族的因素對caspase途徑的滅活并不總是阻止步入死亡的進(jìn)程，其顯露出或者甚至增強(qiáng)一些基礎(chǔ)的非caspase依賴性死亡程序。這些程序包括死亡受體起始的途徑和由癌癥藥物、失去生長因子、星形孢菌素(staurosporine)、Bax相關(guān)蛋白和Hsp70缺乏引發(fā)的途徑。這些非caspase依賴性死亡程序的形態(tài)特征常常使人想起經(jīng)典凋亡所觀察到的形態(tài)特征，諸如組織蛋白酶、需鈣蛋白酶和絲氨酸蛋白酶的其它蛋白酶作為caspase上游或下游的主要輔因子的作用的實驗證據(jù)迅速增多。許多非-caspase蛋白酶能夠切割至少一些經(jīng)典caspase底物的發(fā)現(xiàn)更加強(qiáng)了該論點，該發(fā)現(xiàn)可能能夠解釋所觀察到的caspase依賴性死亡程序和非caspase依賴性死亡程序之間的一些相似性。盡管由于此類死亡程序被caspase的功效所掩蔽而可以爭論此類死亡程序的相關(guān)性，但證據(jù)集中于溶酶體組織蛋白酶在作為對多種刺激物(例如腫瘤壞死因子受體家族的死亡受體、缺氧、氧化應(yīng)激、滲透應(yīng)激、熱和抗癌藥)的反應(yīng)所起始的細(xì)胞死亡程序中的進(jìn)化保守性作用。溶酶體在程序性細(xì)胞死亡中的作用雖然充分確定了溶酶體及其水解酶在PCD清除期(即相鄰細(xì)胞或吞噬細(xì)胞對凋亡細(xì)胞或凋亡體的吞沒)的作用，但認(rèn)識到溶酶體及溶酶體水解酶在PCD的較立即事件中的重要性花費了很長時間。這種延遲的一個原因可能是通常用于評價caspase在PCD中的作用的甲基酮肽抑制劑(例如zVAD-fmk、Ac-DEVD-fmk、Boc-D-fmk等)還抑制包括幾個半胱氨酸組織蛋白酶在內(nèi)的其它半胱氨酸蛋白酶的事實。即使在認(rèn)識到這種交叉作用后九年，能夠抑制非-caspase蛋白酶的濃度的這些抑制劑的保護(hù)性作用仍然常常被理解為是caspase介導(dǎo)的死亡途徑的證據(jù)，因此其它半胱氨酸蛋白酶在PCD中的作用仍被低估。由于在電子顯微鏡分析的凋亡細(xì)胞中顯示完整的溶酶體超微結(jié)構(gòu)，溶酶體PCD的發(fā)現(xiàn)可能也一直被延遲。因此，直至最近一直認(rèn)為溶酶體破裂是不受控的壞死細(xì)胞死亡和組織自溶的晚期階段過程中的全或無開關(guān)。然而，可以更準(zhǔn)確的評價溶酶體膜完整性的新技術(shù)已經(jīng)揭示，具有正常超微結(jié)構(gòu)的溶酶體可能泄漏了其部分酶，并且部分溶酶體膜通透化(LMP)不僅發(fā)生在許多死亡模式的早期，事實上還可以觸發(fā)凋亡和凋亡樣PCD。溶酶體膜通透化(LMP)及其結(jié)果利用直接靶向溶酶體膜完整性的多種化合物(例如H2O2、L-亮氨酰-L-亮氨酸甲酯、滲透應(yīng)激、鞘氨醇、趨溶酶體抗生素諾氟沙星和環(huán)丙沙星和光致氧化溶酶體損害(光分解))的研究已經(jīng)令人信服地證明了中等溶酶體通透化能夠?qū)е翽CD。已經(jīng)提出用溶酶體破裂量和細(xì)胞死亡模式之間的定量關(guān)系解釋LMP之后的差異很大的形態(tài)結(jié)果。根據(jù)該模型，低應(yīng)激強(qiáng)度觸發(fā)溶酶體內(nèi)容物向細(xì)胞質(zhì)的有限釋放，之后是凋亡或凋亡樣細(xì)胞死亡，而高強(qiáng)度應(yīng)激導(dǎo)致廣義的溶酶體破裂和細(xì)胞的迅速壞死。因此，低濃度鞘氨醇(在低pH具有類似于去污劑的性質(zhì)的酸性神經(jīng)酰胺酶產(chǎn)生的神經(jīng)酰胺的代謝物)誘導(dǎo)部分LMP和caspase介導(dǎo)的凋亡，而高濃度則導(dǎo)致大量的LMP和非caspase依賴的壞死性細(xì)胞死亡。在該模型中，由部分LMP觸發(fā)的死亡可以被半胱氨酸和天冬氨酸組織蛋白酶的藥理學(xué)抑制劑所抑制，并且胞質(zhì)組織蛋白酶活性的提高先于caspase的激活和線粒體膜的潛在變化，這提示胞質(zhì)組織蛋白酶在死亡過程中的直接作用。重要的是，LMP和組織蛋白酶在細(xì)胞死亡中的作用并不局限于采用直接溶酶體破裂物的實驗?zāi)Ｐ?。LMP還參與完成應(yīng)對多種典型的凋亡刺激物(例如腫瘤壞死因子(INF)受體家族的死亡受體的激活、白介素-1、p53激活、生長因子饑餓、微管穩(wěn)定劑、依托泊苷、σ-2受體激活、合成的類視色素CD437、B細(xì)胞受體激活、星形孢菌素、滲透應(yīng)激以及在誘導(dǎo)不依賴于p53的凋亡的新型抗癌藥的篩選中鑒定的小分子)的細(xì)胞死亡。作為線粒體凋亡途徑觸發(fā)器的LMPLMP的細(xì)胞毒性作用常常依賴于(至少部分依賴于)線粒體死亡途徑的激活。線蟲微注射研究已經(jīng)證明，當(dāng)位于胞質(zhì)中時，與細(xì)胞總組織蛋白酶D活性的一半對應(yīng)的細(xì)胞劑量的單個溶酶體水解酶(組織蛋白酶D)足以在人成纖維細(xì)胞中觸發(fā)線粒體外膜通透化和凋亡。然而，組織蛋白酶D不足以觸發(fā)涉及LMP的所有細(xì)胞死亡模型中的PCD。其它被文獻(xiàn)充分證明的由LMP觸發(fā)的PCD的介質(zhì)(mediator)包括半胱氨酸組織蛋白酶B和L以及活性氧。然而，應(yīng)該強(qiáng)調(diào)的是，并沒有恰當(dāng)?shù)嘏懦渌苊阁w水解酶、溶酶體來源的第二信使和LMP-誘導(dǎo)的胞質(zhì)的酸化的作用。組織蛋白酶和線粒體膜通透化之間的一個連接可能是Bid，其是Bcl-2家族的唯BH3促凋亡蛋白，其在胞質(zhì)pH下能夠被數(shù)種半胱氨酸組織蛋白酶加工并激活，但不被組織蛋白酶D加工和激活。然而，已經(jīng)提出組織蛋白酶D在TNF受體-1(TNF-R1)內(nèi)在化后在溶酶體區(qū)室內(nèi)的酸性環(huán)境中切割并激活Bid。根據(jù)該模型，配體激活的TNF-R1的內(nèi)吞引起酸性鞘磷脂酶介導(dǎo)的神經(jīng)酰胺的產(chǎn)生，然后神經(jīng)酰胺與未活化的組織蛋白酶D結(jié)合并通過自催化加工激活組織蛋白酶D。如在星形孢菌素處理的T細(xì)胞中所證明的，組織蛋白酶D還可以以不依賴于Bid的方式激活Bax。此外，在用環(huán)丙沙星處理的成纖維細(xì)胞中，LMP通過Bax和Bak的Bid非依賴性激活而觸發(fā)線粒體膜通透化。在該模型系統(tǒng)中，Bax的激活不依賴于組織蛋白酶D，而依賴于活性氧。應(yīng)該注意到，在缺乏Bax和Bak的細(xì)胞中沒有完全抑制環(huán)丙沙星誘導(dǎo)的線粒體膜通透化。將LMP與線粒體膜通透化聯(lián)系起來的另一個機(jī)制可能包括活性氧和/或可以以依賴于組織蛋白酶B的方式產(chǎn)生的脂質(zhì)介質(zhì)(例如花生四烯酸)的直接作用。利用來自單個組織蛋白酶缺陷的小鼠的永生化鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEF)的研究已經(jīng)清楚的表明，細(xì)胞死亡執(zhí)行根據(jù)觸發(fā)LMP的刺激物而由不同的組織蛋白酶參與。來自組織蛋白酶B和L缺陷小鼠而非組織蛋白酶D缺陷小鼠的永生化MEF對TNF高度耐受，而當(dāng)用星形孢菌素對所述細(xì)胞進(jìn)行處理后則出現(xiàn)相反的結(jié)果。對TNF誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡途徑的深入研究進(jìn)一步揭示了單個組織蛋白酶在PCD中的作用取決于所研究的細(xì)胞類型。如上所述，TNF誘導(dǎo)的永生化MEF的死亡與半胱氨酸組織蛋白酶有關(guān)，而與組織蛋白酶D無關(guān)。然而，組織蛋白酶D的缺失可有效保護(hù)HeLa宮頸癌細(xì)胞不受TNF-誘導(dǎo)的和順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性。這種區(qū)別似乎不是由于人和鼠細(xì)胞的一般差別，原因是組織蛋白酶B單獨或者與其它半胱氨酸組織蛋白酶一起還對在人宮頸癌細(xì)胞系((ME-180))和乳腺癌細(xì)胞系(MCF-7)中TNF誘導(dǎo)的有效殺傷至關(guān)重要。對這種差別的解釋仍不為人所知，但不同細(xì)胞系中單個組織蛋白酶及其抑制劑的不同表達(dá)水平可能起作用。因此，不同死亡刺激物調(diào)節(jié)單個組織蛋白酶或其抑制劑的表達(dá)水平的能力可能解釋了對不同刺激物的應(yīng)答的區(qū)別。例如，已知阿霉素和依托泊苷通過p53的激活增強(qiáng)組織蛋白酶D的表達(dá)?；蛘撸喾N刺激物誘導(dǎo)的其它信號途徑可以與特定的組織蛋白酶協(xié)作。LMP誘導(dǎo)的線粒體非依賴性死亡途徑重要的是，LMP和胞質(zhì)組織蛋白酶的致死作用不限于內(nèi)在凋亡途徑的激活。在用微管穩(wěn)定藥物(紫杉醇、埃博霉素B和盤皮海綿內(nèi)酯(discodermolide)處理的小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中，LMP在死亡過程的早期發(fā)生，并且半胱氨酸組織蛋白酶以不依賴于caspase的方式介導(dǎo)微核化和細(xì)胞死亡。在TNF處理的人癌細(xì)胞系中，在線粒體外膜通透化的下游發(fā)生LMP。然而，對半胱氨酸組織蛋白酶活性或表達(dá)的抑制可顯著保護(hù)細(xì)胞免受TNF誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡，且沒有明顯抑制效應(yīng)子caspase的激活。此外，在TNF處理的鼠WEHI-S纖維肉瘤細(xì)胞中，在缺乏caspase活性下，組織蛋白酶B引起凋亡樣變化，例如染色質(zhì)凝聚、磷脂酰絲氨酸外露和質(zhì)膜起泡。另外，多種人癌細(xì)胞中熱休克蛋白70(Hsp70)的缺失和T細(xì)胞的超最適度激活觸發(fā)了LMP和組織蛋白酶介導(dǎo)的凋亡樣PCD，而沒有激活內(nèi)在凋亡途徑。與這些數(shù)據(jù)相符的是，組織蛋白酶B可以在分離的核中誘導(dǎo)核凋亡。因此，取決于刺激物和細(xì)胞情況，組織蛋白酶似乎具有作為程序性細(xì)胞死亡的起始物和效應(yīng)蛋白酶兩種能力。特別地，組織蛋白酶在癌細(xì)胞(其中，由于例如Bcl-2的過表達(dá)使線粒體死亡途徑被阻斷)中介導(dǎo)PCD的能力使得有望證明誘導(dǎo)LMP的治療可有效治療對常規(guī)凋亡誘導(dǎo)物耐受的癌癥。永生化和轉(zhuǎn)化能使細(xì)胞對溶酶體細(xì)胞死亡敏感的數(shù)據(jù)進(jìn)一步支持了該觀點。向LMP的信號傳導(dǎo)如以上所述，LMP之后向胞質(zhì)中釋放溶酶體內(nèi)容物(尤其是組織蛋白酶)被認(rèn)為是溶酶體死亡途徑的主要激活步驟。然而，導(dǎo)致LMP的信號途徑仍然僅僅開始顯現(xiàn)。雖然不同靶細(xì)胞中廣泛不同的應(yīng)答已經(jīng)使向LMP的信號傳導(dǎo)途徑的解釋在很大程度上復(fù)雜化，但研究的最透徹的機(jī)制之一是來自腫瘤壞死因子受體1的信號。總之，TNF可以根據(jù)細(xì)胞情況誘導(dǎo)caspase依賴性LMP或caspase非依賴性LMP。此外，TNF相關(guān)配體FasL、TRAIL和TWEAK也都與具有凋亡或壞死形態(tài)的caspase非依賴性PCD有關(guān)。藥理學(xué)和遺傳研究表明，caspase介導(dǎo)的由TNF導(dǎo)向LMP的途徑依賴于caspase-8和caspase-9，不過人和鼠細(xì)胞中caspase-9的激活相差較大。Caspase和LMP之間的關(guān)聯(lián)仍不知曉，并且雖然已經(jīng)提出由TNF誘導(dǎo)的caspase-8介導(dǎo)的Bid切割導(dǎo)致LMP，但在Bid缺乏的iMEF中TNF誘導(dǎo)的LMP不能證實這些發(fā)現(xiàn)。進(jìn)一步提出Bid是組織蛋白酶在溶酶體死亡途徑中的靶標(biāo)，從而提示Bid在LMP下游而非上游。TNF還通過激活質(zhì)膜上的中性鞘磷脂酶(SMase)以及溶酶體區(qū)室內(nèi)酸的或酸性的SMase(aSMase)而刺激鞘磷脂降解為磷酸膽堿和神經(jīng)酰胺。這兩個事件都在TNF誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡途徑中有牽連，但目前僅中性SMase通過與中性SMase(FAN)相關(guān)的因子與LMP相連。基于FAN缺陷性iMEF和表達(dá)負(fù)顯性形式的FAN的人成纖維細(xì)胞的研究表明，F(xiàn)AN不僅介導(dǎo)TNF誘導(dǎo)的神經(jīng)酰胺產(chǎn)生，還參與caspase-8加工和細(xì)胞死亡。由于鼠肝細(xì)胞中TNF誘導(dǎo)的LMP依賴于caspase-8，其加工減少可以解釋表達(dá)負(fù)顯性FAN的經(jīng)TNF處理的肝細(xì)胞中LMP的減少。然而，不能排除神經(jīng)酰胺及其代謝物的作用。aSMase缺陷性(其在caspase-8下游被激活)小鼠體內(nèi)TNF的降低和Fas誘導(dǎo)的肝毒性支持了神經(jīng)酰胺及其代謝物在TNF-誘導(dǎo)的死亡信號傳導(dǎo)中的作用。特別地，在由溶酶體酶酸性神經(jīng)酰胺酶催化的反應(yīng)中由神經(jīng)酰胺生產(chǎn)的鞘氨醇是誘人的候選物，原因是與神經(jīng)酰胺相反，鞘氨醇可以作為去污劑，直接使溶酶體膜不穩(wěn)定。除了通過激活SMases提高產(chǎn)生的鞘氨醇前體神經(jīng)酰胺外，TNF還通過組織蛋白酶B介導(dǎo)的鞘氨醇激酶-1(將促凋亡的鞘氨醇轉(zhuǎn)化為抗凋亡的鞘氨醇-1-磷酸的酶)的下調(diào)而調(diào)節(jié)鞘氨醇的水平。組織蛋白酶B的這種活性可能導(dǎo)致鞘氨醇在溶酶體中的集聚，并由此可以(至少部分地)解釋在經(jīng)TNF處理的肝細(xì)胞中，高效的LMP需要組織蛋白酶B。TNF還可以在存在caspase抑制劑的條件下觸發(fā)LMP和細(xì)胞死亡。該途徑不依賴于caspase-8，但需要含死亡結(jié)構(gòu)域的受體相互作用蛋白-1(RIP-1)，并涉及活性氧的產(chǎn)生。氧化應(yīng)激可以通過Fenton型化學(xué)與溶酶體內(nèi)離子共同產(chǎn)生氧自由基，并由此可以引起溶酶體膜脂質(zhì)的氧化，導(dǎo)致溶酶體膜不穩(wěn)定和溶酶體內(nèi)容物的釋放。然而，RIP-1、氧化應(yīng)激和LMP之間的分子聯(lián)系仍然未知。幾種典型的凋亡誘導(dǎo)物(例如p53、依托泊苷和星形孢菌素)對細(xì)胞死亡的誘導(dǎo)還涉及LMP，之后為組織蛋白酶依賴性線粒體膜通透化。然而，從這些刺激物至LMP的信號途徑仍待揭示?？筁MP的細(xì)胞防御機(jī)制考慮到LMP的潛在致死結(jié)果，細(xì)胞已經(jīng)發(fā)展出多種策略，或者通過抑制LMP本身，或者通過保護(hù)細(xì)胞不向胞質(zhì)泄漏酸性水解酶(LMP的后果)進(jìn)行應(yīng)對并不奇怪。在其多種其它功能中，已經(jīng)報道磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)保護(hù)溶酶體不被去穩(wěn)定(destabilization)。在人血管內(nèi)皮細(xì)胞中抑制PI3K誘導(dǎo)組織蛋白酶B向胞質(zhì)中的釋放，這證明了PI3K在保持溶酶體膜的完整性中的相當(dāng)直接的作用。此外，PI3K抑制劑使細(xì)胞對TNF誘導(dǎo)的和白介素-1誘導(dǎo)的溶酶體死亡途徑敏感。癌細(xì)胞中溶酶體功能的改變和組織蛋白酶表達(dá)水平的增加可能以降低溶酶體穩(wěn)定性的方式造成威脅。因此，通常在人癌細(xì)胞中被激活的PI3K還可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞中溶酶體的穩(wěn)定，并由此提高其細(xì)胞死亡抗性。盡管PI3K在腫瘤細(xì)胞溶酶體穩(wěn)定性中的作用只是推測性的，但最新的數(shù)據(jù)支持Hsp70在保護(hù)溶酶體免受細(xì)胞膜破壞性刺激物中的作用。這項工作主要在腫瘤細(xì)胞中進(jìn)行，這也常常證明了Hsp70在質(zhì)膜以及溶酶體內(nèi)區(qū)室中的定位。在LMP時向胞質(zhì)中釋放溶酶體蛋白酶的事件中，胞質(zhì)蛋白酶抑制劑提供了對抗其有害結(jié)果的屏障。盡管沒有已知的組織蛋白酶D的內(nèi)源性抑制劑，但至少三種胞質(zhì)蛋白酶抑制劑，即胱抑素A和B以及絲氨酸蛋白酶抑制劑2A(Spi2A，最近發(fā)現(xiàn)其還具有針對幾種半胱氨酸組織蛋白酶(B、H、K、L和V)和組織蛋白酶G的高效抑制劑活性)可以有效抑制半胱氨酸組織蛋白酶。胱抑素B缺陷性小鼠(顯示其小腦顆粒細(xì)胞的凋亡增加)證明了這些抑制劑在防止生理和病理條件下的PCD中的重要性。此外，Spi2A的表達(dá)在TNF處理時通過NF-κB途徑被誘導(dǎo)，并有效抑制了TNF誘導(dǎo)的MEF中胞質(zhì)組織蛋白酶B的活性和細(xì)胞死亡。有趣的是，已經(jīng)報道在秀麗線蟲(C.Elegans)中，胞質(zhì)絲氨酸蛋白酶抑制劑(serpin)-6可保護(hù)對抗來自由高滲應(yīng)激和多種其它溶酶體應(yīng)激引起的溶酶體損傷的誘導(dǎo)和致死效應(yīng)，這證明對抗LMP的保護(hù)作用是進(jìn)化保守性機(jī)制。溶酶體貯積病溶酶體貯積病(LSD)是由溶酶體功能缺陷引起的包括大約40種罕見的遺傳代謝病癥的一類疾病。LSD由通常作為脂質(zhì)、糖蛋白或粘多糖代謝所需的單個酶的缺陷的結(jié)果的溶酶體功能失常所引起。雖然各個病癥是由被翻譯成酶活性缺陷的不同基因突變引起的，但其具有一個共同的生化特征——所有溶酶體病癥源自物質(zhì)在溶酶體內(nèi)的異常集聚。單個地，LSD的發(fā)生率小于1:100,000，但作為組，其發(fā)生率為約1:5000-1:10,000。這些病癥中的大多數(shù)是常染色體隱性遺傳，然而也有一些是X-連鎖的隱性遺傳，例如法布里病。通常根據(jù)所涉及的主要貯積物質(zhì)的性質(zhì)對所述溶酶體貯積病進(jìn)行分類，可以將其大致分成以下組：-脂質(zhì)貯積癥(或脂沉積病(lipidose))，主要是鞘脂貯積癥(包括戈謝病和尼曼-皮克病)o神經(jīng)節(jié)苷脂貯積病(包括泰-薩氏病)o腦白質(zhì)營養(yǎng)不良-粘多糖貯積病(包括Hunter綜合征和Hurler病)-糖蛋白貯積病(糖蛋白貯積病)-粘脂貯積病根據(jù)疾病的嚴(yán)重程度，患者或者在年輕時或在不可預(yù)測的年齡死亡，許多患者在出生后數(shù)月或數(shù)年死亡，然而，其他存活進(jìn)入成人早期的，最終死于其特定病癥的多種病理。LSD的癥狀根據(jù)特定病癥而不同，并且可以為輕微的至嚴(yán)重的癥狀。所述癥狀可以包括發(fā)育延遲、運動障礙、癲癇發(fā)作、癡呆、耳聾和/或失明。一些患有LSD的人的肝臟增大(肝腫大)，脾增大(脾腫大)，具有肺和心臟問題以及骨骼生長異常。通過酶測定初步篩出多數(shù)患者，酶測定是實現(xiàn)確診的最有效方法。在一些家族(其中引起疾病的突變是已知的)中和某些遺傳隔離群體中，可以進(jìn)行突變分析。由于可能具有多種不同的突變，有時對編碼受影響的特定酶的基因進(jìn)行測序是確診必須的。當(dāng)具有已知的遺傳風(fēng)險因子時，產(chǎn)前診斷可能是有用的。在一個實施方式中，本發(fā)明涉及用于治療溶酶體貯積癥的方法。溶酶體的鞘脂水解許多酶都參與溶酶體對鞘脂(或糖鞘脂)的代謝(參見圖4)。這些酶(或者更具體地為水解酶)均參與特定鞘脂的降解。溶酶體鞘脂水解酶與鞘脂激活因子蛋白(SAP或鞘脂激活蛋白)相互作用以刺激所述水解酶的活性。認(rèn)為SAP有利于水溶性酶和膜結(jié)合底物之間的酶/底物相互作用。此外，晚期內(nèi)涵體和溶酶體區(qū)室的脂質(zhì)組成的特征在于存在帶負(fù)電荷的磷脂，例如BMP和PI(磷脂酰肌醇)，其也刺激一些水解酶的活性。BMP-依賴性溶酶體水解酶包括唾液酸酶、α-半乳糖苷酶A、葡糖神經(jīng)酰胺酶、β-半乳糖苷神經(jīng)酰胺酶、芳基硫酸酯酶A、酸性神經(jīng)酰胺酶和鞘磷脂酶。輔因子鞘脂激活蛋白鞘脂激活蛋白是作為多種溶酶體脂質(zhì)降解酶的激活劑的小的溶酶體蛋白，其可能通過從膜環(huán)境分離脂質(zhì)底物，由此使其更易接近可溶的降解酶而發(fā)揮作用。所有哺乳動物鞘脂激活蛋白均以單個前體分子(鞘脂激活蛋白原)合成，所述前體分子包含在蛋白水解切割后產(chǎn)生活性鞘脂激活蛋白的四個鞘脂激活蛋白-B結(jié)構(gòu)域和在激活反應(yīng)中被除去的兩個鞘脂激活蛋白-A結(jié)構(gòu)域。所述鞘脂激活蛋白-B結(jié)構(gòu)域還存在于其它蛋白中，其中一些在膜裂解中具有活性。鞘脂激活蛋白原(PSAP)是在人中由PSAP基因編碼的蛋白。該基因編碼高度保守的糖蛋白，其是4個裂解產(chǎn)物鞘脂激活蛋白A、B、C和D的前體。鞘脂激活蛋白是鞘脂激活因子蛋白或SAP的縮寫。所述前體蛋白的各結(jié)構(gòu)域的長度均為大約80個氨基酸殘基，并且半胱氨酸殘基以及糖基化位點的位置幾乎相同。鞘脂激活蛋白A-D主要位于溶酶體區(qū)室，在此其促進(jìn)具有短的寡糖基團(tuán)的糖鞘脂的代謝。所述前體蛋白同時作為分泌蛋白和膜內(nèi)在蛋白(integralmembraneprotein)而存在，并且具有親神經(jīng)活性。特定溶酶體水解酶對某些鞘脂的水解需要鞘脂激活蛋白A-D。鞘脂激活蛋白是唾液酸酶(SAP-B)、α-半乳糖苷酶A(SAP-B)、葡糖神經(jīng)酰胺酶(SAP-C、β-半乳糖苷神經(jīng)酰胺酶(SAP-C)、芳基硫酸酯酶A(SAP-B)和酸性神經(jīng)酰胺酶(SAP-D)的重要輔激活物。酸性鞘磷脂酶(aSMase)并不決定性地依賴于任何已知的激活蛋白，然而鞘脂激活蛋白的存在提高了該酶的活性。第五個鞘脂激活蛋白GM2-激活蛋白也已經(jīng)被表征。BMP二(單?；视?磷酸酯(BMP)還被稱為溶血二磷脂酸，是晚期內(nèi)涵體和溶酶體區(qū)室的脂質(zhì)成分的主要部分，其是帶負(fù)電荷的磷脂，更具體地是甘油-磷脂。BMP首次分離自兔肺部，但現(xiàn)在已知是所有動物組織的常見但卻很少的組分。BMP的立體化學(xué)構(gòu)型與其它動物甘油-磷脂的區(qū)別在于磷酸二酯部分與甘油的sn-1和sn-1’而非sn-3位置相連。甘油部分中的sn-3和3’或sn-2和sn-2’位置是否被脂肪酸酯化仍不清楚。不論脂肪酸在甘油分子上的位置如何，其組成都可以以18:1(n-9)和18:2(n-6)、20:4和22:6(n-3)的豐度而不同，不過這高度取決于具體的組織、細(xì)胞類型或細(xì)胞器。這種不同的組成提示十分特異的功能，這些中的一些仍未被揭示。BMP通常為動物組織的相當(dāng)少的組分。然而，在肝臟和其它組織的溶酶體中高度富含BMP，在這些組織中其可占膜磷脂的15％或更高，并且目前被認(rèn)作是該細(xì)胞器的標(biāo)記物。含有特有的脂質(zhì)BMP的是晚期內(nèi)涵體和溶酶體。確實，包含70％之多的BMP磷脂的似乎是晚期內(nèi)涵體的內(nèi)膜。如果所報道的BMP存在于桿菌種的一些嗜堿株中能被證實，則這將是BMP脂質(zhì)嚴(yán)格地為哺乳動物來源且不存在于原核生物、酵母和高等植物中這一規(guī)則的唯一已知的例外。有利的證據(jù)是BMP主要在內(nèi)涵體系統(tǒng)中由磷脂酰甘油合成。在所認(rèn)為的主要途徑中，在第一步，磷脂酶A2從磷脂酰甘油的sn-2位置除去脂肪酸。在第二步，通過與溶血磷脂酰甘油(作為酰基供體和?；荏w)的?；D(zhuǎn)移酶反應(yīng)使溶血磷脂酰甘油在頭部基團(tuán)甘油部分的sn-2’位置被?；瑥亩a(chǎn)生sn-3:sn-1’溶血二磷脂酸。第三步仍沒有被適當(dāng)?shù)孛枋?，但肯定包括從主要甘油單元的sn-1位置除去脂肪酸，以及磷酰基酯從sn-3到sn-1位置的重排。最終，可能通過與作為供體的另一個磷脂的?；D(zhuǎn)移反應(yīng)使主要甘油單元的sn-2位置被酯化(由此產(chǎn)生獨特的脂肪酸組成)。也可能是其它生物合成途徑。BMP在溶酶體中的功能仍處于積極研究中，其可能通過傾向不形成雙層的幫助在復(fù)雜的腔內(nèi)膜系統(tǒng)的形成中發(fā)揮結(jié)構(gòu)性作用。BMP是錐形分子，并且促進(jìn)在內(nèi)涵體中的pH下的膜融合。此外，BMP的獨特立體化學(xué)性質(zhì)意味著其對磷脂酶具有抗性，因此將阻止或防止溶酶體膜的自降解。脂肪酸組分可以通過?；D(zhuǎn)移反應(yīng)而迅速轉(zhuǎn)換(turnover)，但甘油磷脂骨架是穩(wěn)定的。另一種可能性是該脂質(zhì)可以與膜區(qū)域中功能類似于筏(raft)的特定蛋白結(jié)合。已經(jīng)提出，在多泡晚期內(nèi)涵體內(nèi)包含的富含BMP的膜的特征性網(wǎng)絡(luò)通過作為收集和重分配點而調(diào)節(jié)膽固醇運輸。例如，當(dāng)用抗BMP抗體溫育溶酶體膜時，膽固醇易于集聚。該過程受Alix/AlP1的控制，Alix/AlP1是特異性地與BMP相互作用的蛋白且參與向多泡內(nèi)涵體中的分選。已知BMP極大地刺激參與糖基神經(jīng)酰胺降解的酶，例如鞘脂激活因子蛋白，如鞘脂激活蛋白。在這種情況下，BMP可以簡單地發(fā)揮功能以提供適合鞘糖脂水解酶與其激活物相互作用的環(huán)境。此外，BMP還在為在肺泡巨噬細(xì)胞中產(chǎn)生二十烷酸提供花生四烯酸酯中發(fā)揮極大作用。當(dāng)膜中存在BMP時，BMP依賴性酶的水解速度極大提高，對于aSMase，甚至在沒有諸如鞘脂激活蛋白的激活蛋白存在的情況下也如此。在圖4中，點劃圈標(biāo)記的是具有BMP依賴性的酶或所述酶的缺陷性疾病。BMP與溶酶體貯積病，例如尼曼-皮克C病(膽固醇集聚)和某些藥物誘導(dǎo)的脂沉積癥的病理有關(guān)。在這些情況下，其組成易于改變從而有利于包含較少多不飽和組分的分子。BMP是被患有所謂抗磷脂綜合征的罕見且尚不清楚的疾病的患者的自免疫血清識別的抗原，因此，其可能是該疾病的病理基礎(chǔ)中的因子。在一個實施方式中，本發(fā)明涉及通過利用Hsp70和BMP之間的相互作用而治療溶酶體貯積癥的方法。脂質(zhì)貯積癥脂質(zhì)貯積癥(或脂沉積病)是溶酶體貯積癥的一個亞群，在該組疾病中由于脂質(zhì)代謝所需的酶的表達(dá)或功能的降低使有害量的脂質(zhì)積聚在細(xì)胞內(nèi)。這種過量貯積的脂質(zhì)可隨時間引起永久的細(xì)胞和組織損傷，尤其在腦、外周神經(jīng)系統(tǒng)、肝、脾和骨髓中。脂質(zhì)是一大組天然存在的分子，其包括脂肪、蠟、固醇、脂溶性維生素(例如維生素A、D、E和K)、單甘油酯、二甘油酯、磷脂及其它。脂質(zhì)的主要生物功能包括能量儲存、作為細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)組成和作為重要的信號傳導(dǎo)分子。脂質(zhì)可以被寬泛地定義為疏水性或兩性小分子，一些脂質(zhì)的兩性性質(zhì)可使其在水環(huán)境中形成諸如小泡、脂質(zhì)體或膜的結(jié)構(gòu)。生物脂質(zhì)完全或部分源自兩種不同類型的生化亞基：酮?；鶊F(tuán)和異戊二烯基團(tuán)。利用該方法可以將脂質(zhì)分成8類：脂肪?；?、甘油脂、甘油磷脂、鞘脂、糖脂和聚酮(源自酮?；鶃喕目s合)；以及固醇脂和孕烯醇酮脂(prenollipids，源自異戊二烯亞基的縮合)。雖然有時將術(shù)語脂質(zhì)用作脂肪的同義詞，但脂肪是被稱為三甘油酯的脂質(zhì)的亞組。脂質(zhì)還包括諸如脂肪酸及其衍生物(包括三甘油酯、二甘油酯和單甘油酯和磷脂)以及含固醇的其它代謝物(例如膽固醇)。已經(jīng)對以脂質(zhì)集聚為特征的一些溶酶體貯積癥(即脂質(zhì)貯積癥)進(jìn)行了表征；這些溶酶體貯積癥概述于下文。在一個實施方式中，本發(fā)明涉及用于治療脂質(zhì)貯積癥的方法。尼曼-皮克病尼曼-皮克病(NPD)由酸性鞘磷脂酶(aSMase，其系統(tǒng)命名為鞘磷脂磷酸二酯酶)的缺陷引起。溶酶體酶aSMase水解大量膜鞘磷脂，以產(chǎn)生神經(jīng)酰胺(和膽堿磷酸)。鞘磷脂由與短的親水性磷酸膽堿部分相連的神經(jīng)酰胺膜錨定組成。鞘磷脂酶并不決定性的依賴于任何已知的激活蛋白，這使aSMase的假定分子內(nèi)激活結(jié)構(gòu)域和溶酶體中存在的帶負(fù)電荷脂質(zhì)足以用于鞘磷脂轉(zhuǎn)換。因此，aSMase不需要作為輔因子的鞘脂激活蛋白的存在，然而存在的鞘脂激活蛋白總是進(jìn)一步刺激該酶的活性。(Ferlinzetal.,1999)。BMP刺激aSMase的活性。當(dāng)鞘磷脂不能被完全代謝時，其積聚在細(xì)胞內(nèi)，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡和主要器官系統(tǒng)功能不全。癥狀可能包括肌肉協(xié)調(diào)缺乏，腦退化，學(xué)習(xí)問題，肌肉張力喪失，對碰觸的敏感性增加，痙攣、喂食和吞咽困難，言語含糊(slurredspeech)以及肝和脾增大?？赡芫哂薪悄せ鞚岵⑶以谝暰W(wǎng)膜中心周圍形成典型的櫻桃紅的暈。尼曼-皮克病(NPD)具有4個相關(guān)類型，類型A、B、C和D。所有類型的NPD都以常染色體隱性模式遺傳，且可以影響男性和女性。在A型和B型中，aSMase酶活性的不足引起毒性量的鞘磷脂的增加。當(dāng)人的兩份aSMase基因(兩個等位基因)都發(fā)生突變時，產(chǎn)生這種疾病。A型尼曼-皮克病(NPDA)是最常見的類型，其發(fā)生在嬰兒期。NPDA的特征是黃疸、肝增大和深度腦損傷。目前還沒有針對A型患者的有效治療，A型患者在嬰兒期死亡，通常在18個月齡之前死亡。B型尼曼-皮克病(NPDB)包括肝和脾增大，其通常發(fā)生在前十年，并且常見呼吸問題。器官的增大和呼吸問題可引起心血管應(yīng)激，并可在生命晚期導(dǎo)致心臟病。NPDB患者通常不涉及或幾乎不涉及神經(jīng)系統(tǒng)損害。已經(jīng)試圖對一些B型患者進(jìn)行骨髓移植，并且報道的結(jié)果混雜。酶替代和基因治療的進(jìn)一步開發(fā)也可能對B型患者有幫助。B型兒童可以存活相對長的時間，但由于肺損傷而可能需要補充氧。NPDA和NPDB均由同一酶促缺陷引起，并且越來越多的證據(jù)表明這兩種形式代表連續(xù)體的相反端。NPDA患者通常產(chǎn)生的aSMase極少或者沒有(小于正常的1％)，而NPDB患者的aSMase為正常水平的約10％。全世界大約有1,200例NPA和NPB，且主要為B型或中間形式。通過測定血液樣本中白細(xì)胞內(nèi)的aSMase活性水平對NPDA和NPDB進(jìn)行診斷。雖然這種檢測將鑒別出A型和B型患者，但對于攜帶者(其僅具有一個沒有功能的ASM基因拷貝)的檢測則非常不可信。此外，該檢測顯示aSMase的活性降低，但其始終不能預(yù)測該個體為A型或B型或該疾病的中間變體，而這需要對個體進(jìn)行臨床評估。在某些人群中，特定突變在aSMase缺陷病例中占高百分比。在德裔猶太人(AshkenaziJewish)人群中，對于NPDA，R496L、fsP330和L302P突變占引起疾病的遺傳變化的比例大于95％。將該人群個體中這三個變化的直接檢測用于鑒定攜帶者。在其它人群中，在能夠?qū)易宄蓡T進(jìn)行DNA攜帶者檢測前，必須首先在累的個體中檢測所述突變。對于NPDB，H421Y和K576NaSMase突變占沙特阿拉伯NPDB人群的85％；L137P、fsP189和L549P突變占土耳其NPDB人群的75％；S379P、R441X和R474W突變占葡萄牙NPDB人群的55％；A196P突變占英格蘭/蘇格蘭NPDB人群的42％，并且在NPDB患者中還已經(jīng)將F480L和DeltaR608突變確定為引起疾病的原因。C型尼曼-皮克病(NPDC)非常不同于A型或B型。NPDC患者不能在細(xì)胞中完全代謝膽固醇和其它脂質(zhì)，并且其特征是具有中斷膽固醇在腦細(xì)胞之間的運輸?shù)娜毕?。因此，過量膽固醇和其它脂質(zhì)積聚在肝、脾和腦中。NPDC引起aSMase活性的間接降低，從而導(dǎo)致被認(rèn)為是同一疾病形式的3種類型。當(dāng)C型癥狀首次出現(xiàn)時和在所述疾病進(jìn)展中具有相當(dāng)大的變化。癥狀可以在早至數(shù)月齡或晚至成人期出現(xiàn)。垂直性動眼麻痹(Verticalgazepalsy，眼睛不能上下運動)、肝增大、脾增大或者兒童黃疸是可以確定為NPC的強(qiáng)指證。通常在該疾病的早期階段僅出現(xiàn)一個或兩個癥狀。在多數(shù)情況下，神經(jīng)學(xué)上的癥狀在4-10歲時開始出現(xiàn)。通常，神經(jīng)學(xué)上的癥狀開始的越晚，該疾病的發(fā)展越慢。全世界診斷出約500例C型尼曼-皮克病。然而，認(rèn)為受NPDC影響的人數(shù)較多，但診斷困難使得不能準(zhǔn)確評估其發(fā)生率。NPDC最初被診斷為無學(xué)習(xí)能力、輕度遲鈍、笨拙和精細(xì)運動技能發(fā)育延遲。D型尼曼-皮克病目前被認(rèn)為是C型的變體。D型通常發(fā)生在新斯科舍省具有遺傳背景的人中。患有C型和D型的個體常常需要低膽固醇膳食，但其臨床效果并不令人信服。患有C型和D型的患者的預(yù)期壽命不同，然而該疾病通常為致命的。絕大多數(shù)兒童在20歲之前死亡。NPDC是罕見且變化極大的疾病，因此可能不被一些醫(yī)護(hù)人員識別。對于懷疑患者中該診斷的專家，可以通過組織活檢、培養(yǎng)成纖維細(xì)胞并研究其運輸和儲存膽固醇的能力而進(jìn)行確定。通過測定膽固醇從一種形式至另一種形式(酯交換)的轉(zhuǎn)變研究細(xì)胞中膽固醇的運輸。通過用在紫外光下發(fā)光的化學(xué)劑(filipin)對細(xì)胞進(jìn)行染色對膽固醇的儲存進(jìn)行評價。NPC1基因在1997年被鑒定出來。該基因中的突變或引起疾病的變化導(dǎo)致約95％的NPDC病例。自此，已經(jīng)在該基因中和被稱為NPC2的第二NPDC基因中鑒定出大于250種與NPDC相關(guān)的不同遺傳突變?？偟膩碚f，在大約95％的病例中，如果首先通過上述檢測確定了NPC的診斷，則可能鑒定出引起所述疾病的遺傳變化。然而，由于這些基因的特定突變非常多，并且具有突變沒有鑒定出來的典型NPC患者，因此將遺傳檢測用作NPDC的常規(guī)診斷工具并不是最理想的。尼曼-皮克病影響北美、南美、歐洲、非洲、亞洲和澳洲報道的所有部分的病例群。然而，發(fā)現(xiàn)在某些人群中的發(fā)生率更高：·德裔猶太人人群(NPDA和NPDB)·新斯科舍省的法裔加拿大人(D型-現(xiàn)在認(rèn)為是NPDC的變體)·北非的馬格里布區(qū)(突尼斯、摩洛哥和阿爾及利亞)(NPDB)·南部新墨西哥和科羅拉多的西班牙裔美國人群(NPDC)在一個實施方式中，本發(fā)明涉及通過調(diào)節(jié)酸性鞘磷脂酶(aSMase)的活性治療尼曼-皮克病的方法。法伯氏病法伯氏病由酸性神經(jīng)酰胺酶缺陷引起。酸性神經(jīng)酰胺酶負(fù)責(zé)將神經(jīng)酰胺轉(zhuǎn)化為鞘氨醇(和脂肪酸)；因此所述缺陷導(dǎo)致神經(jīng)酰胺的集聚。酸性神經(jīng)酰胺酶的活性由BMP刺激并依賴于鞘脂激活蛋白。酸性神經(jīng)酰胺酶還被稱為N-酰基鞘氨醇酰胺水解酶，并且由ASAH1基因編碼。它是由未糖基化的α亞基和糖基化β亞基組成的雜二聚體蛋白，其中所述糖基化β亞基在翻譯后被切割成成熟的酶。法伯氏病還被稱為法伯氏脂肉芽腫病、神經(jīng)酰胺酶缺乏病、纖維細(xì)胞粘多糖障礙病(Fibrocyticdysmucopolysaccharidosis)和脂肉芽腫病。它是非常罕見的常染色體隱性疾病，特征是關(guān)節(jié)、肝、喉、組織和中樞神經(jīng)系統(tǒng)異常。肝、心臟和腎也可被影響。癥狀通常在出生的前幾周出現(xiàn)，并且包括運動和智力能力消弱以及吞咽困難。其它癥狀可包括關(guān)節(jié)炎、淋巴結(jié)和關(guān)節(jié)腫脹、嘶啞、皮下節(jié)結(jié)(并且有時在肺內(nèi)和身體的其它部位)、關(guān)節(jié)周圍的肌肉或肌腱慢性變短和嘔吐。受影響的人可能需要插入呼吸管。在嚴(yán)重情況下，肝和脾擴(kuò)大。目前沒有針對法伯氏病的特異治療。皮質(zhì)類固醇激素可有助于緩解疼痛?？梢杂霉撬枰浦仓委煿?jié)結(jié)，在某些情況下，或者可以通過手術(shù)減小或除去?；加械湫托问降姆ú喜〉亩鄶?shù)兒童在2歲死亡，通常死于肺病。患有較輕微形式的所述疾病的個體可以活到十幾歲。在一個實施方式中，本發(fā)明涉及通過調(diào)節(jié)酸性神經(jīng)酰胺酶的酶活性治療法伯氏病的方法。克拉伯病克拉伯病由β-半乳糖苷神經(jīng)酰胺酶缺陷引起。β–半乳糖苷神經(jīng)酰胺酶負(fù)責(zé)將半乳糖基神經(jīng)酰胺轉(zhuǎn)化為神經(jīng)酰胺；因此該缺陷導(dǎo)致半乳糖基神經(jīng)酰胺的集聚。β–半乳糖苷神經(jīng)酰胺酶的活性由BMP刺激并依賴于鞘脂激活蛋白?？死∵€被稱為球形細(xì)胞腦白質(zhì)營養(yǎng)不良或半乳糖基神經(jīng)酰胺脂沉積病。它是一種罕見且常常致命的退行性常染色體隱性病癥，影響神經(jīng)系統(tǒng)的髓鞘。它在100,000新生兒中出現(xiàn)約1例。作為較高的流行性，已經(jīng)報道在以色列的一些阿拉伯區(qū)域約為1/6,000?？死∮梢鸢肴樘擒丈窠?jīng)酰胺酶缺乏的GALC基因的突變引起。脂質(zhì)累積影響神經(jīng)保護(hù)性髓鞘(隔離許多神經(jīng)的表層)的生長，并引起運動技能的嚴(yán)重退化?；加锌死〉膵雰涸诔錾鷷r是正常的。癥狀開始于3-6月齡，表現(xiàn)為易怒、發(fā)燒、四肢僵硬、癲癇發(fā)作、喂食困難、嘔吐和智力和運動開發(fā)緩慢。在疾病初期，醫(yī)生常常會將所述癥狀誤認(rèn)為是大腦性麻痹的癥狀。其它癥狀包括肌無力、痙攣、耳聾、視神經(jīng)萎縮和失明、癱瘓和吞咽時困難。還可能發(fā)生長期減重。也有青少年和成年發(fā)作的克拉伯病例，其具有相似的癥狀但發(fā)展較慢。在嬰兒中，該疾病通常在2歲前致死。晚發(fā)性克拉伯病的患者疾病發(fā)展較慢，且存活時間顯著較長。雖然還沒有治愈克拉伯病的方法，但已經(jīng)顯示在疾病早期進(jìn)行骨髓移植是有益的。通常，對于該病癥的治療是對癥和支持性治療。物理治療可能有助于維持或提高肌肉張力和循環(huán)。根據(jù)最近的研究報道，只要在明顯癥狀出現(xiàn)之前給予臍帶血移植就可成功地終止該疾病。在一個實施方式中，本發(fā)明涉及通過調(diào)節(jié)β-半乳糖苷神經(jīng)酰胺酶的酶活性治療克拉伯病的方法。法布里病法布里病是由α-半乳糖苷酶A缺陷引起的。α-半乳糖苷酶A負(fù)責(zé)將紅細(xì)胞三糖基神經(jīng)酰胺轉(zhuǎn)化成乳糖基神經(jīng)酰胺；因此該缺陷導(dǎo)致紅細(xì)胞三糖基神經(jīng)酰胺(也簡稱為Gb3、GL-3或神經(jīng)酰胺三已糖苷)的集聚。α-半乳糖苷酶A的活性由BMP刺激并依賴于鞘脂激活蛋白。法布里病也被稱為Anderson-Fabry病、彌漫性軀體血管角皮瘤、Ruiter-Pompen-Wyers綜合征、神經(jīng)酰胺三已糖苷沉積病和Sweeley-Klionsky病。它是X-連鎖隱性(遺傳性)病，影響半合子男性以及雜合和純合女性；男性具有經(jīng)歷最嚴(yán)重的臨床癥狀的趨勢，而女性則不同，其可以從臨床上沒有癥狀至與男性一樣嚴(yán)重。這種變化被認(rèn)為是由于在女性胚胎發(fā)育過程中的X-失活模式。癥狀包括缺汗癥(缺汗)、疲勞、血管角質(zhì)瘤(毛細(xì)管的良性皮膚損傷)、燒傷極度疼痛和眼睛病變。血管角質(zhì)瘤是出現(xiàn)于身體任何區(qū)域但主要位于大腿、臀部、下腹部和腹股溝的小的無痛丘疹。表面的眼睛病變可能存在，表明角膜渦狀營養(yǎng)不良(也被稱為渦狀角膜病)。角膜病可能是無癥狀攜帶者出現(xiàn)的特征，且一定與渦狀角膜病的其它原因(例如角膜內(nèi)的藥物沉積)不同。其它可見的眼睛表現(xiàn)包括結(jié)膜動脈瘤、較晚期的車輻狀白內(nèi)障、視神經(jīng)乳頭水腫、黃斑水腫、視神經(jīng)萎縮和視網(wǎng)膜血管膨脹。腎并發(fā)癥是該疾病的常見嚴(yán)重結(jié)果；腎功能不全和腎功能衰竭可能在生命過程中加重。蛋白尿常常是腎臟病變的第一個癥狀。還可能發(fā)生心臟并發(fā)癥；與心臟血管的影響隨年齡惡化，且可能導(dǎo)致心臟病風(fēng)險的增加。對腦血管的影響導(dǎo)致中風(fēng)風(fēng)險的增加。其它癥狀包括耳鳴、眩暈、反胃和腹瀉。癥狀通常首次出現(xiàn)于兒童期早期，并且可能非常難以理解；法布里病對許多臨床醫(yī)生的罕見性有時可導(dǎo)致誤診或被忽視。該疾病的表現(xiàn)的數(shù)量和嚴(yán)重程度常常隨個體年齡而增加。直至最近，對法布里病的治療是對癥治療。然而，目前利用α半乳糖苷酶(Agalsidasealpha)(利甫蓋素(Replagal))和β半乳糖苷酶(Agalsidasebeta)(法布瑞酶(Fabrazyme))通過酶替代療法(ERT)在細(xì)胞水平上治療該疾病。這些藥物的費用是個難題(每年每位患者大約250,000美元)，從而對許多國家的許多患者造成了障礙。酶替代療法(通常每兩周進(jìn)行輸注)可以在患者家中由患者自身實施。酶替代療法不是治愈，并且其必須經(jīng)常輸注以獲得最大效果。在一個實施方式中，本發(fā)明涉及通過調(diào)節(jié)α-半乳糖苷酶A的酶活性治療法布里病的方法。戈謝病戈謝病由葡糖神經(jīng)酰胺酶(也被稱為葡糖腦苷脂酶和酸性β-葡糖苷酶)缺陷引起，葡糖神經(jīng)酰胺酶是55.6KD、497個氨基酸長度的蛋白。葡糖神經(jīng)酰胺酶負(fù)責(zé)糖基神經(jīng)酰胺(或葡糖腦苷脂)轉(zhuǎn)化為神經(jīng)酰胺；因此該缺陷導(dǎo)致糖基神經(jīng)酰胺的集聚。葡糖神經(jīng)酰胺酶的活性由BMP刺激并依賴于鞘脂激活蛋白。戈謝病是最常見的溶酶體貯積病。脂肪物質(zhì)可集中于脾、肝、腎、肺、腦和骨髓中。癥狀可包括脾和肝增大、肝功能不全、骨骼病癥和可能疼痛的骨損傷、嚴(yán)重的神經(jīng)學(xué)并發(fā)癥、淋巴結(jié)和(偶而的)臨近關(guān)節(jié)的腫脹、腹部膨脹、皮膚成褐色、貧血、血小板低和鞏膜上堆積黃色脂肪。所受影響最嚴(yán)重的人還可能更易于感染。該疾病顯示常染色體隱性遺傳性，因此同時影響男性和女性。葡糖神經(jīng)酰胺酶的不同突變決定剩余的酶活性并且很大程度上決定表型。研究表明，特定葡糖神經(jīng)酰胺酶突變的雜合體患帕金森病和某些惡性病(非霍奇金淋巴瘤、黑色素瘤和胰腺癌)的風(fēng)險提高。糖基神經(jīng)酰胺是紅細(xì)胞和白細(xì)胞的細(xì)胞膜組分。清理這些細(xì)胞的巨噬細(xì)胞不能夠除去廢產(chǎn)物，這些廢產(chǎn)物集聚在原纖維內(nèi)，并進(jìn)入戈謝細(xì)胞，其在光學(xué)顯微鏡下看起來像起皺的紙。戈謝病有三種常見的臨床亞型。每種類型都與特定的突變相關(guān)聯(lián)。整體上有約80種已知突變。·I型(或非神經(jīng)類型)是該疾病的最常見形式，在50,000新生兒中發(fā)生大約1例。I型最常發(fā)生在德裔猶太人家系的人中，其發(fā)生率是普通人群的100倍。癥狀可開始于生命早期或者成人期，并且包括肝增大和脾增大很多(同時肝脾增大)；脾可能破裂并引起額外的并發(fā)癥?？赡軓V泛出現(xiàn)骨骼無力和骨病。脾增大和骨髓替代引起貧血、血小板減少和白細(xì)胞減少。腦不受影響，但可能具有肺損傷和罕見的腎損傷。該組患者通常容易擦傷(由于血小板水平低)并且由于紅細(xì)胞數(shù)量少而感到疲勞。根據(jù)疾病發(fā)作和嚴(yán)重程度，I型患者可以很好地活到成人期。一些患者具有輕度形式的所述疾病，或者可能不顯示任何癥狀?！I型(或者急性嬰兒神經(jīng)病性戈謝病)通常開始于出生6個月內(nèi)，且發(fā)生率為每100,000新生兒中約有1例。癥狀包括肝和脾增大、廣泛且發(fā)展的腦損傷、眼動病癥、痙攣、癲癇發(fā)作、四肢僵硬、吮吸和吞咽能力差。受影響的兒童通常在2歲死亡?！II型(慢性神經(jīng)病形式)可開始于兒童期的任何時間或者甚至在成人期，并且在100,000新生兒中約發(fā)生1例。它的特征是發(fā)展緩慢但與急性類型或II型相比神經(jīng)學(xué)癥狀較輕。主要癥狀包括脾和/或肝增大、癲癇發(fā)作、協(xié)調(diào)性差、骨骼不規(guī)則、眼動病癥、包括貧血在內(nèi)的血液病癥和呼吸問題。患者通?；畹绞畮讱q的早期和成人期。國家戈謝病基金會稱在普通美國人群中每100人中約有1人是I型戈謝病(流行度為1/40,000)攜帶者；在德裔猶太人中，攜帶者的比例相當(dāng)高，約為1/15。顯示II型戈謝病對任何種族都沒有特定偏好。III型戈謝病在瑞典北部北博滕人群中尤其常見，其在該地區(qū)的發(fā)病率為1/50,000。對于I型患者和多數(shù)III型患者，用靜脈內(nèi)重組葡糖神經(jīng)酰胺酶的酶替代治療可降低肝和脾的大小，減少骨骼異常并逆轉(zhuǎn)其它表現(xiàn)。該疾病的罕見性意味著一直難以進(jìn)行用于決定劑量的研究，因此對于最佳劑量和給藥頻率一直存在爭議。由于發(fā)病率低，重組葡糖神經(jīng)酰胺酶在許多國家已經(jīng)變成唯一的藥物。單個患者用于目前存在的戈謝病的治療劑(注射用伊米苷酶(imiglucerase))的花費高達(dá)550,000美元，且這種治療需要持續(xù)終生。美格魯特(Miglustat)是在2003年批準(zhǔn)用于該疾病的另一種藥物。成功的骨髓移植治愈了該疾病的非神經(jīng)學(xué)表現(xiàn)，原因是其引入了具有活性葡糖神經(jīng)酰胺酶的單核細(xì)胞群。然而，該過程具有巨大的風(fēng)險，且在戈謝患者中進(jìn)行的極少。在罕見情況下，如果患者貧血或者當(dāng)器官增大影響到患者的舒適度，則可能需要除去脾的手術(shù)(脾切除術(shù))。輸血可能對一些貧血患者有益。其它患者可能需要關(guān)節(jié)置換術(shù)，以改善活動性和生活質(zhì)量。其它治療選擇包括用于感染的抗生素，用于癲癇的抗癲癇藥，用于骨損傷的二磷脂和肝臟移植?？梢宰C明底物減少療法(substratereductiontherapy)可有效阻止II型，原因是其可以穿過血腦屏障進(jìn)入腦中。目前還沒有用于可能發(fā)生在II型和III型戈謝病患者中的嚴(yán)重腦損傷的有效治療。在一個實施方式中，本發(fā)明涉及通過調(diào)節(jié)葡糖神經(jīng)酰胺酶的酶活性治療戈謝病的方法。唾液酸貯積病唾液酸貯積病或I型粘脂貯積病(MLI)由唾液酸酶(或α-神經(jīng)氨酸酶)的缺陷引起。唾液酸酶負(fù)責(zé)將GM3轉(zhuǎn)化為乳糖基神經(jīng)酰胺；因此該缺陷導(dǎo)致GM3的集聚。唾液酸酶的活性由BMP刺激并依賴于鞘脂激活蛋白。唾液酸貯積病以常染色體隱性方式遺傳。癥狀或者在出生時出現(xiàn)或者在生命的第一年內(nèi)形成。在許多累的嬰兒中，注意到在出生時全身過度腫脹。這些嬰兒通常天生具有粗糙的面部特征，如平鼻梁、眼瞼腫脹、齒齦增大且舌頭尺寸過大(巨舌)。一些嬰兒還天生具有骨骼畸形，例如胯關(guān)節(jié)脫位。嬰兒通常顯示出突然不自覺的肌肉收縮(所謂的肌陣攣)，并且眼睛中具有紅點(櫻桃紅的斑點)。所述嬰兒常常不能調(diào)整主動動作(所謂的共濟(jì)失調(diào))，還發(fā)生顫動、視力削弱和癲癇發(fā)作。檢查發(fā)現(xiàn)肝(肝腫大)和脾異常增大(脾腫大)且腹部極端腫脹。所述嬰兒通常缺乏肌張力(張力減退)且智力延遲(或者在最初或者日益嚴(yán)重)。一些患者不能茁壯成長且患有周期性呼吸道感染?；加蠱LI的多數(shù)嬰兒在1歲前死亡?？梢愿鶕?jù)癥狀開始的年齡和癥狀出現(xiàn)的類型將唾液酸貯積病分成亞類。該疾病的影響可以從輕微到嚴(yán)重。唾液酸貯積病是沒有種族偏好的罕見病癥?？色@得的人群數(shù)據(jù)非常少，但據(jù)荷蘭的研究報道，發(fā)生率為在2,175,000新生兒中約有1例。然而，這種比例可能并不適用于所有人群，一些人群可能具有更高的發(fā)病率；此外，當(dāng)沒有新生兒篩查的選項時，錯誤的臨床識別是一個重要因素。針對唾液酸貯積病的治療選擇有限，且主要涉及支持性護(hù)理和癥狀緩解。在一個實施方式中，本發(fā)明涉及通過調(diào)節(jié)唾液酸酶的活性治療唾液酸貯積病的方法。異染性腦白質(zhì)營養(yǎng)不良異染性腦白質(zhì)營養(yǎng)不良(MLD)或芳基硫酸酯酶A缺陷癥由芳基硫酸酯酶A(或腦苷脂硫酸酶)的缺陷引起。芳基硫酸酯酶A負(fù)責(zé)將硫腦苷脂(或者腦苷脂3-硫酸)轉(zhuǎn)化為半乳糖基神經(jīng)酰胺；因此該缺陷導(dǎo)致硫腦苷脂的集聚。芳基硫酸酯酶A的活性由BMP刺激并依賴于鞘脂激活蛋白。異染性腦白質(zhì)營養(yǎng)不良是溶酶體貯積病，常列在腦白質(zhì)營養(yǎng)不良家族中。腦白質(zhì)營養(yǎng)不良影響髓鞘質(zhì)(作為整個中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)纖維周圍的隔離物的脂肪表層)脂肪生長和/或發(fā)育。與影響脂質(zhì)代謝的其它一些遺傳病癥相同，MLD有晚嬰兒期、青少年期和成年期幾種形式，·在晚嬰兒期形式(最常見形式的MLD)中，受影響的嬰兒在1歲后開始行走困難。癥狀包括肌肉消瘦和無力，肌肉僵硬，發(fā)育延遲，逐漸喪失視力導(dǎo)致失明，抽搐、吞咽受損，麻痹和癡呆。兒童可能變得昏睡。未治療時，患有這種形式的MLD的多數(shù)兒童在5歲死亡，且常常死亡早的多。·患有青少年期形式的MLD(在3-10歲發(fā)作)的兒童通常開始于學(xué)校表現(xiàn)削弱、智力退化和癡呆，然后出現(xiàn)類似于晚嬰兒期形式但發(fā)作較慢的癥狀。死亡年齡不同，但通常在癥狀發(fā)作的10-15年內(nèi)。·成年期形式通常在16歲后開始精神病或逐步的癡呆。成人期發(fā)作的MLD的發(fā)展比晚嬰兒期和青少年期形式慢的多，拖延時間為10年或更長。在罕見的情況下，機(jī)體能夠彌補所述缺陷，人將不出現(xiàn)癥狀。對于MLD沒有治愈也沒有標(biāo)準(zhǔn)的治療，MLD是終期疾病。對具有晚期青少年發(fā)作或成年發(fā)作的兒童和顯示癥狀的晚嬰兒期患者的治療限于處理疼痛和癥狀。前驅(qū)癥狀性晚嬰兒期MLD患者和患有青少年期或成年期MLD(或者為前驅(qū)癥狀或者顯示溫和至中等癥狀)的患者可選擇正在研究中的骨髓移植(包括干細(xì)胞移植)。在一個實施方式中，本發(fā)明涉及通過調(diào)節(jié)芳基硫酸酯酶A的酶活性治療異染性腦白質(zhì)營養(yǎng)不良的方法。鞘脂激活蛋白缺乏癥在人和小鼠中，鞘脂激活蛋白原/鞘脂激活蛋白缺乏癥導(dǎo)致嚴(yán)重的神經(jīng)學(xué)缺陷。在鞘脂激活蛋白A、B和C中具有點突變的人患者顯示克拉伯病、異染性腦白質(zhì)營養(yǎng)不良和戈謝病的表型，這表明其在體內(nèi)的主要底物分別是半乳糖基神經(jīng)酰胺、硫腦苷脂和葡糖神經(jīng)酰胺。由于鞘脂激活蛋白A缺乏的非典型克拉伯?。阂环N遺傳性生化病癥，在出生數(shù)月導(dǎo)致神經(jīng)衰退。死亡通常發(fā)生在生命的最初幾年。該病癥與克拉伯病類似，但區(qū)別在于生化缺陷的遺傳起源不同?？死∨c半乳糖腦苷脂酶基因的缺陷有關(guān)，而非典型克拉伯病與引起鞘脂激活蛋白A缺乏的鞘脂激活蛋白原基因的缺陷有關(guān)。鞘脂激活蛋白B(之前被稱為SAP-1和硫腦苷脂激活蛋白)分別刺激芳基硫酸酯酶A、酸性β-半乳糖苷酶和α-半乳糖苷酶對包括硫酸腦苷脂、GM1神經(jīng)節(jié)苷脂和紅細(xì)胞三糖基神經(jīng)酰胺在內(nèi)的多種底物的水解。人鞘脂激活蛋白B缺乏癥(作為常染色體隱性性質(zhì)遺傳)導(dǎo)致硫酸腦苷脂在組織中集聚和類似于異染性腦白質(zhì)病變的臨床圖像(缺乏激活蛋白的異染性腦白質(zhì)營養(yǎng)不良)，不過具有正常的芳基硫酸酯酶活性。鞘脂激活蛋白B缺乏癥是與異染性腦白質(zhì)營養(yǎng)不良中的譜(spectrum)類似的異質(zhì)性疾病(heterogeneousdisease)。葡糖神經(jīng)酰胺的降解需要鞘脂激活蛋白(SAP-)C，并且鞘脂激活蛋白(SAP-)C的缺乏導(dǎo)致戈謝病的一種變式：由于缺乏SAP-C的無神經(jīng)病變的戈謝病。在患者中觀察到非常高水平的殼三糖苷酶活性和趨化因子CCL18，以及血漿中葡糖神經(jīng)酰胺的濃度增高，而皮膚成纖維細(xì)胞中β-葡糖苷酶活性正常。已經(jīng)鑒定出位于SAP-C結(jié)構(gòu)域的錯義突變p.L349P和位于鞘脂激活蛋白原前體蛋白的起始編碼中的另一個突變p.M1L。在一些無神經(jīng)病變的戈謝患者中，已經(jīng)鑒定出了在鞘脂激活蛋白C和鞘脂激活蛋白D兩者中的突變。小鼠中鞘脂激活蛋白C和D的聯(lián)合缺陷導(dǎo)致神經(jīng)病變的表型以及葡糖神經(jīng)酰胺和α-羥基神經(jīng)酰胺的集聚。在小鼠中，鞘脂激活蛋白D與神經(jīng)酰胺集聚、浦肯野細(xì)胞(Purkinjecell)的部分喪失和泌尿系統(tǒng)功能受損相關(guān)聯(lián)。這種表型沒有模仿完全缺失酸性神經(jīng)酰胺酶(鞘脂激活蛋白D的同源酶(cognateenzyme))的小鼠所表現(xiàn)的胚胎致死性。在人中已知兩種引起所有四種鞘脂激活蛋白和鞘脂激活蛋白原完全失活的突變?？偳手せ畹鞍兹狈κ嵌鄠€器官和多個鞘脂病變的破壞性疾病。已經(jīng)在出現(xiàn)引起新生兒死亡的嚴(yán)重性腦脊髓交感神經(jīng)系統(tǒng)營養(yǎng)不良(neurovisceraldystrophy)病例中報道了鞘脂激活蛋白聯(lián)合缺乏(或鞘脂激活蛋白原缺乏)。尿中的多種鞘脂均提高，紅細(xì)胞三糖基神經(jīng)酰胺顯示最大增加。在PSAP基因中鑒定出了新突變，是純合性外顯子10上游的2個堿基的剪接受體位點突變。這種突變導(dǎo)致早熟終止密碼并產(chǎn)生低水平轉(zhuǎn)錄。在一個實施方式中，本發(fā)明涉及治療鞘脂激活蛋白缺乏癥的方法。所述鞘脂激活蛋白缺乏癥可選自鞘脂激活蛋白A缺乏癥、鞘脂激活蛋白B缺乏癥、鞘脂激活蛋白C缺乏癥、鞘脂激活蛋白C缺乏癥和鞘脂激活蛋白聯(lián)合缺乏癥(或者鞘脂激活蛋白原缺乏癥)。殘留酶促活性如上文所列出的，溶酶體貯積病由缺陷性酶引起。所述缺陷性酶可以沒有殘留活性，或者可以具有一些殘留活性。本文使用的殘留酶促活性表示，雖然所述酶是缺陷性的，例如由突變引起，但該酶的活性并沒有完全失去，但是被降低至病理水平。在一個方面，本發(fā)明涉及用于治療溶酶體貯積病的生物活性劑，和用于治療患溶酶體貯積病的個體的方法。在本發(fā)明的實施方式中，根據(jù)本發(fā)明治療的溶酶體貯積病的特征在于所述疾病病理涉及的缺陷性酶具有殘留酶促活性。在一個實施方式中，所述殘留酶促活性為0.1％-50％，如0.1-1％，例如1-2％，如2-3％，例如3-4％，如4-5％，例如5-6％，如6-7％，例如7-8％，如8-9％，例如9-10％，如10-11％，例如11-12％，如12-13％，例如13-14％，如14-15％，例如15-20％，如20-25％，例如25-30％，如30-35％，例如35-40％，如40-45％，例如45-50％的殘留酶促活性。LSD的當(dāng)前治療形式針對溶酶體貯積病沒有治愈，治療多為癥狀性的，不過已經(jīng)嘗試了骨髓移植和酶替代療法(ERT)并且取得一些成功。此外，在?？浦行恼谶M(jìn)行母系臍帶血移植用于這些疾病中的一些。然而，移植療法伴隨有多種副作用，且常常使患者產(chǎn)生并發(fā)癥。此外，底物減少療法(用于減少貯積物質(zhì)的集聚的方法)目前正在用于評價這些疾病中的一些。對于多數(shù)溶酶體貯積病，未滿足的主要需求仍然是提供有效的治療形式。已經(jīng)針對一些溶酶體貯積病開發(fā)出了酶替代療法，用于治療戈謝病的已經(jīng)上市多年。通過重組技術(shù)制備缺陷性酶葡糖腦苷脂酶，并通過靜脈輸注數(shù)小時施予。治療不是治愈性的，且患者需要終生治療以阻止疾病的發(fā)展。通過ERT可改善一些癥狀。然而，對于多數(shù)LSD，還沒有開發(fā)出有效地ERT。這可能是因為缺陷性酶的復(fù)雜亞基結(jié)構(gòu)使活性酶的生產(chǎn)被證明是一個難題。確實，酶在生成后可能錯誤折疊。對于可利用ERT的那些LSD，存在使該治療形式較不理想的缺點。首先且最重要地，ERT是非常昂貴的治療形式，其對社會造成經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)且使許多患者難以接近。此外，ERT僅特異地針對一種疾病。已經(jīng)報道了的一些副作用，包括免疫反應(yīng)的形成、惡心、嘔吐、腹痛、腹瀉、皮疹、疲勞、頭疼、發(fā)燒、頭暈眼花、寒戰(zhàn)、背疼和心率快速以及過敏性反應(yīng)的提示性癥狀。因此，本發(fā)明公開的內(nèi)容提供了用于治療溶酶體貯積病的創(chuàng)新性新方法。這尤其與還沒有開發(fā)出有效療法的這些疾病、可能受益于較低廉的治療的那些疾病以及可能受益于包含本發(fā)明的生物活性劑的組合療法的那些疾病有關(guān)。如本文所公開的，本發(fā)明的方法提供了顯著比ERT廉價且針對多于一種具體溶酶體貯積癥的治療形式。下文對分子伴侶或熱休克蛋白進(jìn)行介紹，原因是根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)本文所介紹的熱休克蛋白70和溶酶體BMP之間的相互作用形成調(diào)節(jié)溶酶體酶促活性和治療溶酶體貯積病的基礎(chǔ)。分子伴侶細(xì)胞在開始轉(zhuǎn)錄以及之后翻譯DNA遺傳密碼時消耗大量能量，最終產(chǎn)生具有細(xì)胞生命的這個點所需要的功能的多肽。然而，為了獲得完整功能的蛋白，必須克服最后的許多障礙，其中之一是該新生多肽鏈的正確折疊。獲得正確折疊的進(jìn)化意義是明顯的，合成沒有正確構(gòu)象并由此沒有功能的肽不僅是一種可怕的能量浪費，而且此類蛋白在細(xì)胞腔室中的聚合可能證明對細(xì)胞是有害的?？紤]到高蛋白濃度的細(xì)胞內(nèi)環(huán)境，這種聚合事實上是一種完全可能的結(jié)果，由此蛋白產(chǎn)生了復(fù)雜且完善的機(jī)器幫助蛋白折疊以使蛋白在此條件下維持功能狀態(tài)并不意外。這些蛋白被統(tǒng)稱為分子伴侶，因為象其人類對應(yīng)物一樣，它們防止其不成熟客戶之間的不利相互作用。分子伴侶發(fā)現(xiàn)于蛋白發(fā)生構(gòu)象重排的所有細(xì)胞區(qū)室中，雖然蛋白合成是細(xì)胞內(nèi)未折疊肽的主要來源，但當(dāng)細(xì)胞面臨高溫或可能使蛋白結(jié)構(gòu)變化由此易于未折疊和聚合的其它刺激物時，利用包括產(chǎn)生保護(hù)性蛋白的特定細(xì)胞應(yīng)答應(yīng)對。這種應(yīng)答是在從原核細(xì)胞至真核細(xì)胞的各種細(xì)胞類型中觀察到的現(xiàn)象，被稱為熱休克反應(yīng)或應(yīng)激反應(yīng)。由這種應(yīng)答誘導(dǎo)的蛋白被稱為熱休克蛋白(HSP)，其具有幾個家族。這些家族由在序列上、結(jié)構(gòu)上和功能上相關(guān)的蛋白組成，然而不同家族的伴侶分子可在結(jié)構(gòu)和細(xì)胞功能上明顯不同。伴侶分子家族的主要實例是Hsp70蛋白，其構(gòu)成了真核細(xì)胞的多數(shù)區(qū)室中、真細(xì)菌中和許多古細(xì)菌(archae)中存在的普遍性伴侶系統(tǒng)的核心部分。除了作為伴侶分子外，最近發(fā)現(xiàn)該家族參與細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的其它方面，最明顯地通過其抗凋亡性質(zhì)、其免疫性功能和癌細(xì)胞對Hsp70上調(diào)的明顯依賴性。熱休克蛋白70家族Hsp70蛋白參與包括蛋白折疊和不穩(wěn)定細(xì)胞蛋白的降解在內(nèi)的多種細(xì)胞過程，并且還發(fā)揮其它細(xì)胞保護(hù)性作用。Hsp70在這些過程中的共同作用似乎是與部分折疊的多肽的短疏水部分結(jié)合，由此促進(jìn)準(zhǔn)確折疊并防止聚合。在真核細(xì)胞中，Hsp70伴侶分子在體內(nèi)與調(diào)節(jié)其功能循環(huán)的主要步驟的不同類蛋白相互作用；在這些蛋白中有J-結(jié)構(gòu)域家族蛋白Hsp40。此外，已經(jīng)鑒定出了額外的結(jié)伴蛋白，其中一些將Hsp70連接至諸如Hsp90系統(tǒng)的其它伴侶分子系統(tǒng)。人Hsp70家族的成員分子伴侶的一些重要功能包括蛋白至細(xì)胞區(qū)室的輸送、在胞質(zhì)溶膠、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體中的蛋白折疊、防止蛋白聚合以及錯誤折疊蛋白的重折疊。目前，人Hsp70家族包括由不同基因編碼的10個成員，該部分旨在提供這些家族成員在功能、表達(dá)譜和同源性方面的概述。雖然Tavariaetal.已經(jīng)制定了一套通用的規(guī)則，該規(guī)則提供了基因座名稱、基因和蛋白之間的邏輯聯(lián)系，但關(guān)于不同人Hsp70家族成員的命名仍存在許多混淆。然而，由于種類間仍然存在一些混淆，在本文中提供其基因座的名稱表示Hsp70基因和蛋白。名稱Hsp70可以表示基因座名稱為HSPA1A和HSPA1B的兩種誘導(dǎo)型Hsp70家族成員，或者如本文本的通用性所顯示的整體表示整個Hsp70家族。然而，如本發(fā)明全文所使用的，Hsp70意在表示基因座名稱為HSPA1A和HSPA1B的兩種誘導(dǎo)型Hsp70家族成員的任一個。HspA1A和HspA1B由基因座HSPA1A和HSPA1B轉(zhuǎn)錄的基因是兩個熱/應(yīng)激誘導(dǎo)Hsp70基因，涉及人Hsp70的多數(shù)文獻(xiàn)都指的是由這兩個基因編碼的蛋白。所述基因產(chǎn)生由641個氨基酸構(gòu)成，彼此具有99％的同源性且是首個被克隆和表征的人Hsp70家族成員的蛋白。這些基因在6p21.3被聯(lián)鎖在MHCIII類復(fù)合體中、無內(nèi)含子且啟動子區(qū)域包含HSE，使其能夠與HSF結(jié)合，并在多種細(xì)胞攻擊的應(yīng)答中誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄。人熱休克70kDa蛋白1A(HSPA1A)的蛋白質(zhì)序列是(SEQIDNO:1)(登錄號：NM_005345.5):MAKAAAIGIDLGTTYSCVGVFQHGKVEIIANDQGNRTTPSYVAFTDTERLIGDAAKNQVALNPQNTVFDAKRLIGRKFGDPVVQSDMKHWPFQVINDGDKPKVQVSYKGETKAFYPEEISSMVLTKMKEIAEAYLGYPVTNAVITVPAYFNDSQRQATKDAGVIAGLNVLRIINEPTAAAIAYGLDRTGKGERNVLIFDLGGGTFDVSILTIDDGIFEVKATAGDTHLGGEDFDNRLVNHFVEEFKRKHKKDISQNKRAVRRLRTACERAKRTLSSSTQASLEIDSLFEGIDFYTSITRARFEELCSDLFRSTLEPVEKALRDAKLDKAQIHDLVLVGGSTRIPKVQKLLQDFFNGRDLNKSINPDEAVAYGAAVQAAILMGDKSENVQDLLLLDVAPLSLGLETAGGVMTALIKRNSTIPTKQTQIFTTYSDNQPGVLIQVYEGERAMTKDNNLLGRFELSGIPPAPRGVPQIEVTFDIDANGILNVTATDKSTGKANKITITNDKGRLSKEEIERMVQEAEKYKAEDEVQRERVSAKNALESYAFNMKSAVEDEGLKGKISEADKKKVLDKCQEVISWLDANTLAEKDEFEHKRKELEQVCNPIISGLYQGAGGPGPGGFGAQGPKGGSGSGPTIEEVD人熱休克70kDa蛋白1A(HSPA1A)的核酸(DNA)序列是(SEQIDNO:2)(登錄號：NM_005345.5):人熱休克蛋白70kDa蛋白1B(HSPA1B)的蛋白序列是(SEQIDNO:3)(登錄號：NM_005346):MAKAAAIGIDLGTTYSCVGVFQHGKVEIIANDQGNRTTPSYVAFTDTERLIGDAAKNQVALNPQNTVFDAKRLIGRKFGDPVVQSDMKHWPFQVINDGDKPKVQVSYKGETKAFYPEEISSMVLTKMKEIAEAYLGYPVTNAVITVPAYFNDSQRQATKDAGVIAGLNVLRIINEPTAAAIAYGLDRTGKGERNVLIFDLGGGTFDVSILTIDDGIFEVKATAGDTHLGGEDFDNRLVNHFVEEFKRKHKKDISQNKRAVRRLRTACERAKRTLSSSTQASLEIDSLFEGIDFYTSITRARFEELCSDLFRSTLEPVEKALRDAKLDKAQIHDLVLVGGSTRIPKVQKLLQDFFNGRDLNKSINPDEAVAYGAAVQAAILMGDKSENVQDLLLLDVAPLSLGLETAGGVMTALIKRNSTIPTKQTQIFTTYSDNQPGVLIQVYEGERAMTKDNNLLGRFELSGIPPAPRGVPQIEVTFDIDANGILNVTATDKSTGKANKITITNDKGRLSKEEIERMVQEAEKYKAEDEVQRERVSAKNALESYAFNMKSAVEDEGLKGKISEADKKKVLDKCQEVISWLDANTLAEKDEFEHKRKELEQVCNPIISGLYQGAGGPGPGGFGAQGPKGGSGSGPTIEEVD人熱休克蛋白70kDa蛋白1B(HSPA1B)的核酸(DNA)序列是(SEQIDNO:4)(登錄號：NM_005346):HspA1L和HspA2由于雄性生殖細(xì)胞的強(qiáng)表達(dá)偏好而將這兩種Hsp70家族成員稱為“沙文基因(chauvinistgene)”。hspA1L基因是組成型表達(dá)的無內(nèi)含子的Hsp70家族成員，位于第6號染色體上相同的MHCIII類復(fù)合體中的HSPA1A基因座端粒端(telomeric)4kb。該基因在熱休克前后均以少量表達(dá)，但具有有利于在小鼠、大鼠和人中的睪丸的表達(dá)圖譜，其是與HspA1A具有90％同源性的641個氨基酸(aa)的蛋白質(zhì)。hspA2基因首次分離自小鼠基因文庫，后來顯示在包括骨骼肌、卵巢、小腸、結(jié)腸、腦、胎盤和腎的多種人體組織中以低水平組成型表達(dá)，但在睪丸中高表達(dá)。該基因的表達(dá)(或者缺乏表達(dá))與人的異常精子發(fā)生有關(guān)，hspA2(-/-)雄性小鼠是不育的。該基因位于第14號染色體上，產(chǎn)生與HspA1A具有84％同源性的639aa的蛋白，雖然由于兩篇文獻(xiàn)已經(jīng)提出了不同的基因座位置14q24.1和14q22使得其準(zhǔn)確位置仍在討論中。HspA6和HspA7hspA6和hspA7基因是Hsp70家族的熱誘導(dǎo)型成員，在小鼠中沒有明顯的對應(yīng)物。這兩個基因在啟動子位置包含HSE，且無內(nèi)含子。所述基因共同位于第1號染色體上，其核苷酸序列彼此具有94％的同源性。然而，由于hspA7基因具有單個核苷酸插入，從而在+1324產(chǎn)生早熟的終止密碼，僅HspA6具有功能。HspA6蛋白的長度為643aa，且顯示與HspA1A和HspA1B具有77％的同源性。HspA5和HspA9hspA5和hspA9基因是Hsp70家族的兩個區(qū)室特異性成員。655aa的HspA5蛋白位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)中，并促進(jìn)該區(qū)室內(nèi)新合成蛋白的折疊和運輸。該蛋白與HspA1A具有64％的同源性，其基因位于9q34。679aa的HspA9蛋白位于線粒體中，其在此幫助蛋白質(zhì)在運輸穿過線粒體膜后的折疊。HspA9位于5q31.1，蛋白與HspA1A具有52％的同源性。HspA8同源Hsp70成員(被稱為Hsc70)由位于11q24的hspA8基因編碼，產(chǎn)生與HspA1A具有86％同源性的646aa的蛋白，并且其在所有組織和細(xì)胞系中均組成型地表達(dá)。該蛋白在細(xì)胞內(nèi)的功能與Hsp70類似，提供在正常條件下所需的伴侶，但還在披網(wǎng)格蛋白小泡的去包被中以及伴侶分子介導(dǎo)的自吞噬中發(fā)揮作用。HspA3和HspA4由于對HSPA3是否根本不存在還存在懷疑并且HSPA4最可能是Hsp110家族的成員但關(guān)于其目前還沒有了解(除了其位于5q31.1-2的染色體位置外)，因此在本文中將不對這兩者進(jìn)行討論。表1：人Hsp70基因家族的列表。列出了這些基因的基因組座名稱、本文使用的名稱、染色體的定位(位置)、與HspA1A的氨基酸同源性以及文獻(xiàn)中參見的可選名稱。Hsp70的轉(zhuǎn)錄調(diào)控人Hsp70啟動子的基因組印跡顯示，熱休克/應(yīng)激誘導(dǎo)熱休克轉(zhuǎn)錄因子(HSF)與被稱為熱休克元件(HSE)的包含nGAAn序列的區(qū)域迅速結(jié)合。正常情況下，Hsp70與殘留在胞質(zhì)中的HSF結(jié)合，但在應(yīng)激過程中HSF從Hsp70分離并在被PKC或其它絲氨酸/蘇氨酸激酶磷酸化后采取均三聚體構(gòu)象(homotrimericconformation)。HSF三聚體進(jìn)入細(xì)胞核，在此其與位于Hsp70基因的啟動子區(qū)域的HSE結(jié)合并進(jìn)一步被HSF激酶磷酸化。目前已經(jīng)在人中表征了三種HSF(HSF1、HSF2和HSF4)。HSF1是在多數(shù)應(yīng)激條件下均被激活的主要轉(zhuǎn)錄因子，并且對可被分類成生理(例如細(xì)胞分裂、激素刺激)、病理(例如感染、發(fā)燒、炎癥、惡性病)和環(huán)境條件(例如熱休克、重金屬、乙醇)的多種刺激物產(chǎn)生應(yīng)答。HSF2僅對氯高鐵血紅素產(chǎn)生應(yīng)答，而HSF4優(yōu)先在人心臟、胰腺、腦和骨骼肌中表達(dá)，缺乏在所有脊椎動物HSF中均有且似乎抑制HSP表達(dá)的C-末端疏水性重復(fù)。不清楚負(fù)責(zé)合成組成型表達(dá)的Hsp70(Hsc70)的Hsp70基因調(diào)控，但似乎HSF不并參與其中。雖然HSF是調(diào)節(jié)HSP表達(dá)的最著名因子，但已知其它轉(zhuǎn)錄因子也具有同一功能。已經(jīng)證明特異性CCAAT-盒結(jié)合因子(CBF)誘導(dǎo)Hsp70轉(zhuǎn)錄，腫瘤抑制因子p53可以通過與Hsp70的啟動子區(qū)結(jié)合和通過中和CBF而抑制轉(zhuǎn)錄，并且HSF能夠被熱休克因子結(jié)合蛋白1(HSBP1)拮抗，其通過這種方式削弱Hsp70的轉(zhuǎn)錄。Hsp70的結(jié)構(gòu)和功能性質(zhì)通過真細(xì)菌Hsp70(DnaK)、其Hsp40輔伴侶(DnaJ)和核苷酸置換因子GrpE，最大程度了解Hsp系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能。然而，雖然有證據(jù)提示GrpE的解偶聯(lián)，但通常認(rèn)為所述機(jī)制在真核生物中是類似的。本部分將集中于真核生物Hsp70系統(tǒng)，但在恰當(dāng)時也將包括對真細(xì)菌系統(tǒng)的討論。Hsp70包括兩個功能實體——N末端ATPase結(jié)構(gòu)域和較小的C-末端肽結(jié)合結(jié)構(gòu)域。ATPase結(jié)構(gòu)域包含被裂隙(cleft)分開的兩個亞結(jié)構(gòu)域，其中，所述裂隙含有決定C-末端結(jié)構(gòu)域的肽結(jié)合性質(zhì)的核苷酸結(jié)合位點。當(dāng)結(jié)合ATP時，肽底物迅速結(jié)合和解離(雖然親合力低)，而在沒有核苷酸或ADP結(jié)合至N-末端結(jié)構(gòu)域的情況下，肽結(jié)合和解離的速率下降而親合力提高。因此，ATP水解作為Hsp70的兩種狀態(tài)之間的分子開關(guān)，其在真核細(xì)胞中的循環(huán)受到J-結(jié)構(gòu)域家族蛋白Hsp40的控制而在真細(xì)菌中則受DnaJ和GrpE的控制。Hsp40的N-末端J-結(jié)構(gòu)域與Hsp70結(jié)合，加速ATP-水解，由此促進(jìn)肽捕獲，而Hsp40的C-末端部分通過識別疏水肽而作為伴侶分子發(fā)揮作用，由此將Hsp70募集至新生肽鏈。重要的是注意到，分子伴侶不提供用于結(jié)合蛋白的折疊的特定立體構(gòu)象，但抑制非生產(chǎn)性的相互作用，由此使所述蛋白更高效地折疊成其新生結(jié)構(gòu)。在真細(xì)菌中，GrpE誘導(dǎo)從DnaK(細(xì)菌Hsp70)釋放ADP，而對于真核細(xì)胞的Hsp70蛋白，這種因子似乎可有可無，原因是該ATPase循環(huán)中的限速步驟不是結(jié)合ADP的解離而是ATP水解本身。然而，在真核細(xì)胞中由額外的蛋白調(diào)節(jié)Hsp70的功能；均低聚蛋白Hip(Hsp70相互作用蛋白)通過穩(wěn)定Hsp70的ADP結(jié)合態(tài)而作為正調(diào)節(jié)子，而Hsp-70結(jié)合蛋白(CHIP)和Bcl-2-相關(guān)抗凋亡蛋白-1(Bag-1)的蛋白羧基末端均具有抑制作用：CHIP通過抑制Hsp70的ATPase活性，Bag-1通過拮抗Hsp70的重折疊活性。進(jìn)一步的相互作用由兩種人Hsp40蛋白Hdj1和Hdj2提供，除了其Hsp40功能(如上所述)外，這兩種蛋白還顯示通過Hop(Hsp-組織蛋白)促進(jìn)Hsp70和Hsp90的偶聯(lián)，所述Hop是通過其分別與Hsp70和Hsp90的延長C-末端序列結(jié)合的兩個三十四肽重復(fù)(TPR)結(jié)構(gòu)域與伴侶分子物理連接的銜接蛋白。最近表明，上述一些蛋白調(diào)控非天然或不可逆錯誤折疊蛋白從伴侶分子至泛素-蛋白酶體機(jī)器的運輸。除了其對Hsp70的負(fù)調(diào)節(jié)作用外，CHIP蛋白還能夠通過N-末端TPR結(jié)構(gòu)域與Hsp90結(jié)合并通過C-末端泛素激酶結(jié)構(gòu)域靶向Hsp90底物降解，而且還能夠在功能上與結(jié)合了Hsp70和蛋白酶體的BAG-1配合。這些發(fā)現(xiàn)提供了使伴侶分子幫助的折疊和蛋白水解降解(胞質(zhì)中蛋白組質(zhì)量控制的兩個主要成分)一體化的機(jī)制間的可能關(guān)聯(lián)。通過Hsp70的細(xì)胞保護(hù)除了其作為分子伴侶的結(jié)果的抗凋亡能力(即在使蛋白變性的條件下促進(jìn)蛋白折疊)外，Hsp70還能夠以多種其它方式影響細(xì)胞存活，包括保護(hù)在缺血再灌注損傷后線粒體的功能，阻斷在用TNF刺激原代成纖維細(xì)胞后應(yīng)激激酶c-junN-末端激酶(JNK)的激活，并且已經(jīng)提出Hsp70/Bag-1復(fù)合物在細(xì)胞應(yīng)激條件過程中調(diào)節(jié)細(xì)胞生長和有絲分裂。Hsp70保護(hù)細(xì)胞免受由一些諸如TNF、TRAIL、氧化應(yīng)激、UV-輻射和抗癌藥多柔比星、依托泊苷和紫杉醇的刺激物誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡的能力進(jìn)一步凸顯了其抗凋亡性質(zhì)。最后，由于已經(jīng)證明Hsp70拮抗凋亡誘導(dǎo)因子(AIF)，并在caspase-3下游發(fā)揮抗凋亡功能，報道還提供了Hsp70和凋亡機(jī)器之間的更直接的相互作用的證據(jù)。最近的證據(jù)還證明，Hsp70的有效細(xì)胞保護(hù)作用部分是由于溶酶體膜的穩(wěn)定化。作為對此的印證，Hsp70的缺失觸發(fā)癌細(xì)胞中溶酶體膜的早通透化和組織蛋白酶介導(dǎo)的細(xì)胞死亡，外源Hsp70有效抑制由多種應(yīng)激誘導(dǎo)的溶酶體去穩(wěn)定。此外，Hsp70缺陷型小鼠患有由溶酶體蛋白酶至胞質(zhì)中的泄漏引起的胰腺炎。所有這些事件強(qiáng)調(diào)了Hsp70作為PCD的重要調(diào)節(jié)物并由此作為細(xì)胞存活因子的作用。癌癥中的Hsp70Hsp70通常在人惡性腫瘤在過量表達(dá)，并且其表達(dá)與乳腺癌和子宮內(nèi)膜癌的預(yù)后差有關(guān)。因此，Hsp70增加了向免疫受損的動物或同基因動物灌輸?shù)膰X動物細(xì)胞產(chǎn)生腫瘤的潛能。Hsp70作為癌細(xì)胞存活的重要因子的作用進(jìn)一步被Weietal.(其首次在癌細(xì)胞中進(jìn)行了Hsp70的缺失研究)的報道所證實。該結(jié)果表明，當(dāng)通過使用反義低聚物抑制多種癌細(xì)胞系中Hsp70的表達(dá)時，誘導(dǎo)了對細(xì)胞增殖的抑制和隨后的凋亡。該工作已經(jīng)在多種試驗中得到證實，在所述試驗中，反義腺病毒介導(dǎo)的Hsp70缺失觸發(fā)了腫瘤細(xì)胞特異性溶酶體死亡程序。利用在免疫缺陷小鼠中的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤和乳腺癌原位異種移植以及結(jié)腸癌皮下異種移植的體內(nèi)研究進(jìn)一步證明了Hsp70缺失的抗癌潛能，因為接受上述腺病毒構(gòu)建體的局部區(qū)域性施用的小鼠的腫瘤顯示大量凋亡樣細(xì)胞死亡和巨噬細(xì)胞的募集。這些研究清楚地證明了一些腫瘤對Hsp70的存在的依賴性，雖然其它研究辯稱在腺病毒介導(dǎo)的Hsp70缺失后在細(xì)胞培養(yǎng)物中觀察到的細(xì)胞毒性是由于病毒介導(dǎo)的細(xì)胞應(yīng)激和Hsp70下調(diào)。盡管存在這種矛盾，但由于Bcl-2過表達(dá)和caspase的藥物抑制均不能拯救細(xì)胞，所以由Hsp70缺失誘導(dǎo)的細(xì)胞培養(yǎng)物中的細(xì)胞毒性不依賴于caspase。相反，由于抑制半胱氨酸組織蛋白酶具有顯著的細(xì)胞保護(hù)作用，因此LMP的觸發(fā)和組織蛋白酶向胞質(zhì)中的釋放可能是死亡誘導(dǎo)事件。此外，Hsp70在之前提及的小鼠腫瘤異體移植物中的缺失導(dǎo)致組織蛋白酶釋放和腫瘤細(xì)胞死亡。如之前所述，許多癌細(xì)胞似乎都采用的Hsp70的細(xì)胞保護(hù)機(jī)制之一是Hsp70轉(zhuǎn)位至內(nèi)溶酶體區(qū)室，在此其發(fā)揮膜保護(hù)作用。由于研究已經(jīng)證明大于50％的腫瘤顯示Hsp70在質(zhì)膜表面(通過前述的內(nèi)吞作用和分泌事件與內(nèi)溶酶體區(qū)室直接相連的區(qū)域)的定位，驅(qū)動這種轉(zhuǎn)移的可能不僅僅是保護(hù)溶酶體膜的需要。表面暴露的Hsp70作為能夠用作自然殺傷(NK)細(xì)胞的識別結(jié)構(gòu)，刺激NK細(xì)胞增殖和溶細(xì)胞活性的獨特表位。已經(jīng)證明，由該Hsp70肽序列激活的NK細(xì)胞在患有嚴(yán)重的合并免疫缺陷癥(SCID))的小鼠中抑制腫瘤生長，其可能機(jī)制可能是細(xì)胞表面結(jié)合的Hsp70通過不依賴于穿孔素(perforin)的顆粒溶解酶B(granzymeB)的特異結(jié)合和攝取介導(dǎo)凋亡。如上文，內(nèi)溶酶體膜和質(zhì)膜經(jīng)常相互交換。因此，癌細(xì)胞表面存在的Hsp70可能是促進(jìn)腫瘤發(fā)展的兩個事件的“不幸”結(jié)果；組織蛋白酶的分泌，其促進(jìn)侵襲和血管生成，以及Hsp70在溶酶體膜上的定位，其防止半胱氨酸組織蛋白酶向細(xì)胞膠質(zhì)的意外釋放并保證細(xì)胞死亡。細(xì)胞外的Hsp70由前面的段落可以看出，Hsp70的細(xì)胞內(nèi)功能對正確的細(xì)胞穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要，尤其是在面對毒性應(yīng)激時。然而，細(xì)胞外Hsp70(eHsp70)的有益作用(尤其當(dāng)提及免疫和炎癥應(yīng)答時)也在顯示，其可能還在癌細(xì)胞的清除中發(fā)揮重要作用。此外，對于eHsp70，還顯示參與對應(yīng)激的一般生理適應(yīng)和保護(hù)對抗細(xì)胞損傷的作用。細(xì)胞外Hsp70和神經(jīng)保護(hù)關(guān)于eHsp70存在的首個證據(jù)來自對烏賊巨大神經(jīng)索的研究，其中證明溫度的提高誘導(dǎo)圍繞軸索的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞鞘中并被轉(zhuǎn)移至所述軸索的一些熱休克蛋白。這些發(fā)現(xiàn)不久即在培養(yǎng)的大鼠胚胎細(xì)胞中重現(xiàn)，并且重要的是，關(guān)于這點，已經(jīng)提供了負(fù)責(zé)Hsp70釋放的非典型胞吐途徑的證據(jù)，因為典型分泌途徑的兩個抑制劑莫能菌素或秋水仙堿均不能阻擋Hsp70的分泌。自這些出版物公開以來，其它報道也提供了在多種動物模型系統(tǒng)(例如青蛙、小龍蝦和大鼠)中神經(jīng)膠質(zhì)釋放Hsps和神經(jīng)元攝取的實例。培養(yǎng)的人成膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞的研究提供了在膠質(zhì)細(xì)胞作為人體中eHsp70來源的作用的證據(jù)。該研究表明，在對照條件下，每一百萬細(xì)胞在24小時的時間內(nèi)向培養(yǎng)基釋放～10pgHsp70。當(dāng)時間開始時采用20分鐘熱休克時，這種釋放提高2.5-5倍。重要的是，該研究還證明，eHsp70的釋放量大于細(xì)胞死亡可能占的量。這些數(shù)據(jù)都支持由Tytelletal.闡明的最先建議的假設(shè)，即Hsps的神經(jīng)膠質(zhì)釋放可能是在代謝應(yīng)激過程中維持神經(jīng)元功能的一種途徑。eHsp70在急性應(yīng)激過程中具有神經(jīng)保護(hù)作用的體內(nèi)證據(jù)來自于多個研究。Tidwelletal.的研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)在軸索斷裂后通過凝膠海綿應(yīng)用eHsp70時，eHsp70能夠減少軸索斷裂后運動神經(jīng)細(xì)胞的數(shù)量。在同一研究中，在施用Hsp70后還觀察到背根神經(jīng)節(jié)感覺神經(jīng)元(dorsalrootganglionsensoryneuron)細(xì)胞存活增加，雖然這依賴于比運動神經(jīng)元稍高的Hsp70劑量。此外，還證明eHsp70保護(hù)運動神經(jīng)元(否則在小雞胚胎發(fā)育觀察中注定死亡)，并且還保護(hù)在營養(yǎng)因子缺乏后從小雞脊髓分離的運動神經(jīng)元。當(dāng)涉及視網(wǎng)膜的光損害時，也描述了eHsp70在體內(nèi)的保護(hù)作用。在該研究中，Yuetal.在暴露于之前已經(jīng)描述的劑量的誘導(dǎo)損傷的光以引起嚴(yán)重的光感受器變性后，玻璃體內(nèi)注射重組Hsp70和Hsc70溶液。有趣的是，右眼的玻璃體室中存在的eHsp70混合物在視網(wǎng)膜中引起明顯更多的光感受器。此外，對熒光標(biāo)記的Hsc/Hsp70的攝取的評價證明，在施用后6小時，其仍然存在于視網(wǎng)膜中。通過鼻內(nèi)治療施用的細(xì)胞外Hsp70也顯示防止大鼠內(nèi)不可避免的應(yīng)激的后果，并且最近指出，在肌萎縮性側(cè)索硬化癥小鼠模型中，腹膜內(nèi)注射的重組人Hsp70可有效提高壽命、延遲癥狀發(fā)生、保持運動功能并延長運動神經(jīng)元的存活。在神經(jīng)元系統(tǒng)中利用Hsp70或Hsc/Hsp70混合物的其他體外工作進(jìn)一步證明，eHsp70能夠增強(qiáng)神經(jīng)細(xì)胞應(yīng)激耐受，并降低多聚谷氨酰胺(polyglutamine)的毒性和聚合。細(xì)胞外Hsp70和免疫性除了在細(xì)胞保護(hù)中的作用外，文獻(xiàn)已經(jīng)證明與質(zhì)膜結(jié)合的eHsp70和游離的全身性eHsp70在免疫性中發(fā)揮作用?？紤]到Hsp70的主要功能之一是作為細(xì)胞內(nèi)蛋白的伴侶，Hsp70能夠參與免疫原性肽的結(jié)合并通過主要組織相容性復(fù)合體(MHC)1類分子幫助這些肽的提呈可能并不驚奇。此外，還證明腫瘤來源的eHsp70作為免疫原性肽的伴侶并選擇性地與抗原提呈細(xì)胞(APC)結(jié)合。在受體介導(dǎo)的內(nèi)吞后，這些Hsp70-肽復(fù)合體被呈遞至MHC1類分子上，導(dǎo)致細(xì)胞毒性t細(xì)胞應(yīng)答。除了作為自身抗原(self-antigen)的伴侶外，Hsp70還能夠結(jié)合細(xì)菌DNA中的微生物肽和未甲基化的CpG基序。除了其作為抗原提呈伴侶分子的作用外，eHsp70還參與先天免疫的刺激。在證明許多細(xì)胞類型釋放Hsp70的同時，還證明eHsp70與包括天然自殺(NK)細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞和樹突細(xì)胞在內(nèi)的不同白細(xì)胞亞群上的多種受體結(jié)合。參與eHsp70識別的受體主要包括模式識別受體(PRR)并且由來自不同受體家族(例如toll樣受體(TLR)、清道夫受體和C型凝聚素)的多種受體構(gòu)成。受體結(jié)合后，eHsp70能夠引起多種細(xì)胞因子應(yīng)答，包括釋放諸如TNF-a、IL-1b、IL-12、IL-6和GM-CSF的促炎癥性細(xì)胞因子(由NF-kB向細(xì)胞核的轉(zhuǎn)位觸發(fā)的過程)，這提示eHsp70的細(xì)胞因子作用，其還形成使新創(chuàng)造的術(shù)語伴侶細(xì)胞因子(chaperokine)表示eHsp70，以更好地描述eHsp70同時作為伴侶和細(xì)胞因子的獨特功能的提議。eHsp70在免疫中的作用的體內(nèi)研究的大部分已經(jīng)在嚙齒動物模型中進(jìn)行。例如，在應(yīng)答尾休克(tail-shock)中eHsp70濃度的提高與皮下大腸桿菌注射后炎癥的降低和恢復(fù)時間的加快有關(guān)。此外，向小鼠體內(nèi)遞送Hsp70加快了傷口的愈合，這一特點可能是由于巨噬細(xì)胞對傷口死細(xì)胞的吞噬作用增強(qiáng)。缺乏Hsp70在人體內(nèi)的免疫調(diào)節(jié)作用的證據(jù)，但研究已經(jīng)證明了eHsp70的增加和腦損傷的預(yù)后/結(jié)果的改善之間的關(guān)系(雖然也已經(jīng)證明了相反的結(jié)論)。然而，還顯示eHsp70的濃度隨年齡而下降，這可能提示與年齡相關(guān)的進(jìn)行全面應(yīng)激反應(yīng)減少的能力，這又可能解釋了隨著年齡增長發(fā)病率和死亡率增加，不過這還是純的推測。Hsp70的釋放除了證明eHsp70在鄰近細(xì)胞之間(例如在神經(jīng)膠質(zhì)/軸索模型中)的轉(zhuǎn)移的數(shù)據(jù)外，一些報道證明了循環(huán)中存在游離的eHsp70。對該區(qū)室中存在的Hsp70，必須從器官/細(xì)胞中釋放出來。實現(xiàn)這種釋放通?？紤]兩種主要方法。一個是主動方法，其中在外周循環(huán)中觀察到的eHsp70是由于細(xì)胞裂解或死亡而使細(xì)胞中Hsp70庫釋放的結(jié)果。可選地，或可能另外地，Hsp70通過非典型胞吐途徑被主動釋放。已經(jīng)提出，Hsp70和其它熱休克蛋白僅在引起壞死性死亡的病理條件下釋放而不在程序性細(xì)胞死亡過程中釋放。毫無疑問，引起壞死的嚴(yán)重性損傷和病理條件可導(dǎo)致Hsp70向血液中釋放。這已經(jīng)被文獻(xiàn)充分證明并且也可從邏輯上推導(dǎo)。然而，最近的研究已經(jīng)證明，可以通過主動機(jī)制從完整細(xì)胞釋放Hsp70，并且刺激物的程度決定釋放模式。Hsp70的非壞死性釋放的有力證據(jù)還來自對鍛煉誘導(dǎo)(exercise-induced)的eHsp70至外周血的釋放的研究。取決于鍛煉的模式(身體應(yīng)變度(physicalstrain)越高，釋放的越多)，在外周血中能夠檢測到較多的eHsp70釋放，并且重要地，還沒有已知研究報道過eHsp70和肌肉損傷標(biāo)記物之間的直接相關(guān)性。eHsp70能夠被釋放而與細(xì)胞或組織損傷無關(guān)這一結(jié)論還被Fleshner及其同事極好地證明，他們證明諸如掠食性恐懼和電擊的心里應(yīng)激能夠引發(fā)應(yīng)激誘導(dǎo)的eHsp70釋放，這被認(rèn)為是一個依賴于兒茶酚胺信號傳導(dǎo)的過程。不過，Hsp70離開細(xì)胞的方式仍不清楚，尤其是因為Hsp70不含可能使其分泌的任何典型的肽引導(dǎo)序列。此外，由于典型分泌早就已經(jīng)遭到質(zhì)疑，這提示必定存在釋放eHsp70的其它機(jī)制。已經(jīng)證明eHsp70能夠被釋放至特征為外來體的小泡中，但還提出了在細(xì)胞體系和體內(nèi)eHsp70可以作為游離eHsp70被釋放的證據(jù)。已經(jīng)提出eHsp70的釋放需要脂質(zhì)筏，不過這還處于爭論中。此外，已經(jīng)表明，功能溶酶體區(qū)室對于eHsp70的釋放是必須的，并且該釋放伴隨有溶酶體標(biāo)記物蛋白在細(xì)胞表面的出現(xiàn)，提示這是一個依賴于質(zhì)膜和溶酶體膜融合的分泌。與所述釋放是否通過外來體或者通過溶酶體的直接釋放無關(guān)，有趣的是注意到一些類型的分泌性MVB/晚期內(nèi)涵體/溶酶體區(qū)室明顯與所有類型的釋放有關(guān)。由于兒茶酚胺通過α1-腎上腺素受體可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣流動，并且由于已經(jīng)提出相同的鈣流動引起外來體、多泡體和溶酶體的胞吐，目前的假設(shè)是在應(yīng)激情況下，作用于α1-腎上腺素受體的去甲腎上腺素的增加導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的鈣流動和隨后Hsp70在外來體中的釋放。本發(fā)明的生物活性劑在一個實施方式中，本發(fā)明涉及通過使用能夠提高Hsp70的細(xì)胞內(nèi)濃度和/或活性的生物活性劑的酶促活性調(diào)節(jié)，其中，所述酶與BMP相互作用。本發(fā)明的酶促活性調(diào)節(jié)可以通過提供提高Hsp70的細(xì)胞內(nèi)濃度和/或活性的以下類型的化合物和療法之一而實現(xiàn)：-Hsp70或其功能片段或變體-Hsp70誘導(dǎo)物和輔誘導(dǎo)物■小分子藥物，例如氯吡哌醇(Bimoclomol)和Arimoclomol■膜流化劑，例如苯甲醇■亞致死熱療(sublethalheattherapy)(≤42℃)或過高熱■來自消炎藥和抗腫瘤藥類的某些藥物■細(xì)胞應(yīng)激■活性氧(ROS)■腎上腺素，去甲腎上腺素■UV光線■放射治療因此，本發(fā)明的生物活性劑可以為提高Hsp70的細(xì)胞內(nèi)濃度和/或活性的任何試劑、化學(xué)品或化合物；并且包括Hsp70本身、或其功能片段或變體，以及本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何Hsp70誘導(dǎo)物或輔誘導(dǎo)物，由此，所述生物活性劑能夠調(diào)節(jié)與BMP相互作用的酶的活性。認(rèn)為生物活性劑可以直接或間接提高Hsp70的細(xì)胞內(nèi)濃度和/或活性。在一個實施方式中，本發(fā)明的生物活性劑是Hsp70或其功能片段或變體。在另一個實施方式中，本發(fā)明的生物活性劑是Hsp70誘導(dǎo)物或輔誘導(dǎo)物。在一個實施方式中，本發(fā)明的生物活性劑包含Hsp70或其功能片段或變體與Hsp70誘導(dǎo)物或輔誘導(dǎo)物的組合。本發(fā)明一方面提供了能夠提高Hsp70的細(xì)胞內(nèi)濃度和/或活性的生物活性劑，其用作藥物。本發(fā)明另一方面提供了能夠提高Hsp70的細(xì)胞內(nèi)濃度和/或活性的生物活性劑，其用于溶酶體貯積癥的治療。本發(fā)明另一方面提供了能夠提高Hsp70的細(xì)胞內(nèi)濃度和/或活性的生物活性劑，其用作藥物或用于溶酶體貯積癥的治療。在一個實施方式中，所述治療為預(yù)防、治愈或改善。在一個具體的實施方式中，所述治療為預(yù)防。在另一個實施方式中，所述治療是治愈。在再一個實施方式中，所述治療為改善。在一個實施方式中，所述溶酶體貯積癥選自尼曼-皮克病、法伯氏病、克拉伯病、法布里病、戈謝病、異染性腦白質(zhì)營養(yǎng)不良、唾液酸貯積病和鞘脂激活蛋白缺乏癥。在一個具體的實施方式中，所述溶酶體貯積癥是A型或B型尼曼-皮克病。在另一個具體的實施方式中，所述溶酶體貯積癥為法伯氏病。在另一個具體的實施方式中，所述溶酶體貯積癥為克拉伯病。在另一個具體的實施方式中，所述溶酶體貯積癥為異染性腦白質(zhì)營養(yǎng)不良。在另一個具體的實施方式中，所述溶酶體貯積癥為唾液酸貯積病。在另一個具體的實施方式中，所述溶酶體貯積癥為法布里病。在再一個具體的實施方式中，所述溶酶體貯積癥為戈謝病。在再一個具體的實施方式中，所述溶酶體貯積癥為鞘脂激活蛋白缺乏癥。本發(fā)明的再一個方面提供了能夠提高Hsp70的細(xì)胞內(nèi)濃度和/或活性的生物活性劑，其用于溶酶體貯積癥的治療，其中，所述溶酶體貯積癥為選自尼曼-皮克病、法伯氏病、克拉伯病、法布里病、戈謝病、異染性腦白質(zhì)營養(yǎng)不良、唾液酸貯積病和鞘脂激活蛋白缺乏癥中的一種，如兩種，例如三種，如四種，例如五種，如六種，例如七種病癥。認(rèn)為本發(fā)明的生物活性劑可用于治療選自尼曼-皮克病、法伯氏病、克拉伯病、法布里病、戈謝病、異染性腦白質(zhì)營養(yǎng)不良、唾液酸貯積病和鞘脂激活蛋白缺乏癥的溶酶體貯積癥的亞組。在一個具體的實施方式中，本發(fā)明的生物活性劑可用于治療A型和B型尼曼-皮克病和法伯氏病。在一個實施方式中，本發(fā)明的生物活性劑包含Hsp70或其功能片段或變體與提高Hsp70和BMP之間相互作用的物質(zhì)的組合。本發(fā)明再一方面提供了能夠提高Hsp70的細(xì)胞內(nèi)濃度和/或活性的生物活性劑在制備用于治療溶酶體貯積癥的藥物中的應(yīng)用。生物活性劑-Hsp70或其功能片段或變體本發(fā)明在一個實施方式中涉及通過使用Hsp70或其功能片段或變體的酶促活性調(diào)節(jié)，其中，所述酶與BMP相互作用。本發(fā)明一方面提供了Hsp70或其功能片段或變體，其用作藥物。本發(fā)明的再一方面提供了Hsp70或其功能片段或變體，其用于溶酶體貯積癥的治療。本發(fā)明的再一方面提供了Hsp70或其功能片段或變體在制備用于治療溶酶體貯積癥的藥物中的應(yīng)用。在一個實施方式中，所述溶酶體貯積癥選自尼曼-皮克病、法伯氏病、克拉伯病、法布里病、戈謝病、異染性腦白質(zhì)營養(yǎng)不良、唾液酸貯積病和鞘脂激活蛋白缺乏癥。應(yīng)該理解，本發(fā)明的Hsp70或其功能片段或變體可以為任何天然的或合成的產(chǎn)物，并且可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何常規(guī)技術(shù)生產(chǎn)。在一個實施方式中，Hsp70或其功能片段或變體從天然來源中純化。所述天然來源可以為任何植物、動物或細(xì)菌，所述植物、動物或細(xì)菌表達(dá)或者可誘導(dǎo)表達(dá)適合向有此需要的個體施用的形式的Hsp70。然而，在優(yōu)選的實施方式中，Hsp70或其功能片段或變體通過合成制備。在一個優(yōu)選的實施方式中，認(rèn)為Hsp70或其功能片段或變體可以為通過常規(guī)技術(shù)制備的重組蛋白，并由此被稱為rHsp70。本發(fā)明的合成或天然Hsp70可以具有源自任何合適的植物、動物或細(xì)菌物種的序列。在一個實施方式中，所述rHsp70源自哺乳動物。所述哺乳動物可以選自人(homosapiens)、小鼠(musmusculus)、牛、狗、大鼠、鼬(ferret)、豬、綿羊和猴。在另一個實施方式中，所述rHsp70源自細(xì)菌。Hsp70的部分特征在于種間序列保守程度非常高，由此可能使源自一個物種的Hsp70可用于另一個物種而不引發(fā)有害的免疫應(yīng)答。在一個具體的實施方式中，所述rHsp70具有源自人Hsp70的序列。在一個具體的實施方式中，所述rHsp70具有源自多于一個物種的序列。因此，在一個實施方式中，所述Hsp70或其功能片段或變體可以為嵌合體。重組蛋白是源自重組DNA的蛋白。重組DNA是通過將天然不共同存在的DNA序列結(jié)合而形成的天然不存在的DNA形式。對于遺傳修飾，通過向加入相關(guān)DNA而將重組DNA引入到已有生物體DNA(例如細(xì)菌質(zhì)粒)中，從而編碼針對特定目的的不同性狀。遺傳修飾不同于遺傳重組，遺傳修飾不通過細(xì)胞內(nèi)過程發(fā)生，而是人為工程化。在一個實施方式中，本發(fā)明的Hsp70與野生型Hsp70蛋白具有100％的同源性。在另一個實施方式中，本發(fā)明的Hsp70與野生型Hsp70蛋白具有小于100％的同源性，例如與野生型蛋白具有99.9-95％的同源性，例如95-90％的同源性，如90-85％的同源性，例如85-80％的同源性，如80-75％的同源性，例如75-60％同源性。與同源性的程度無關(guān)，保留了調(diào)節(jié)與BMP結(jié)合的酶的酶促活性的能力的Hsp70的任何變體均涵蓋于本發(fā)明內(nèi)。在一個實施方式中，所述生物活性劑是Hsp70。在一個實施方式中，所述Hsp70是全長Hsp70。一個實施方式還提供了Hsp70的功能片段或變體。如本文所定義的，Hsp70的功能片段或變體具有期望的功能，所述期望的功能就本發(fā)明而言是調(diào)節(jié)與BMP相互作用的酶的酶促活性的能力。在一個實施方式中，所述生物活性劑是Hsp70的功能片段或變體。在一個實施方式中，所述生物活性劑是Hsp70的功能片段或變體，其中通過野生型Hsp70的缺失、添加或取代對Hsp70進(jìn)行修飾。野生型Hsp70蛋白的全長為641個氨基酸。在一個實施方式中，Hsp70的片段意在表示包括全長小于641個氨基酸的野生型蛋白，如小于625個氨基酸，例如小于600個氨基酸，如小于575個氨基酸，例如小于550個氨基酸，如小于525個氨基酸，例如小于500個氨基酸，如小于475個氨基酸，例如小于450個氨基酸，如小于425個氨基酸，例如小于400個氨基酸，如小于375個氨基酸，例如小于350個氨基酸，如小于325個氨基酸，例如小于300個氨基酸，如小于275個氨基酸，例如小于250個氨基酸，如小于225個氨基酸，例如小于200個氨基酸，如小于175個氨基酸，例如小于150個氨基酸，如小于125個氨基酸，例如小于100個氨基酸，如小于75個氨基酸，例如小于50個氨基酸，如小于25個氨基酸的任何片段。野生型Hsp70蛋白的全長為641個氨基酸。在一個實施方式中，Hsp70的片段意在表示包括全長大于10個氨基酸，如大于25個氨基酸，例如大于50個氨基酸，如大于75個氨基酸，例如大于100個氨基酸，如大于125個氨基酸，例如大于150個氨基酸，如大于175個氨基酸，例如大于200個氨基酸，如大于225個氨基酸，例如大于250個氨基酸，如大于275個氨基酸，例如大于300個氨基酸，如大于325個氨基酸，例如大于350個氨基酸，如大于375個氨基酸，例如大于400個氨基酸，如大于425個氨基酸，例如大于450個氨基酸，如大于475個氨基酸，例如大于500個氨基酸，如大于525個氨基酸，例如大于550個氨基酸，如大于575個氨基酸，例如大于600個氨基酸，如大于625個氨基酸的任何片段。在一個實施方式中，認(rèn)為本發(fā)明的Hsp70的片段的全長為5-25個氨基酸，如25-50個氨基酸，例如50-75個氨基酸，如75-100個氨基酸，例如100-125個氨基酸，如125-150個氨基酸，例如150-175個氨基酸，如175-200個氨基酸，例如200-225個氨基酸，如225-250個氨基酸，例如250-275個氨基酸，如275-300個氨基酸，例如300-325個氨基酸，如325-350個氨基酸，例如350-375個氨基酸，如375-400個氨基酸，例如400-425個氨基酸，如425-450個氨基酸，例如450-475個氨基酸，如475-500個氨基酸，例如500-525個氨基酸，如525-550個氨基酸，例如550-575個氨基酸，如575-600個氨基酸，例如600-625個氨基酸，如625-640個氨基酸。在一個具體的實施方式中，Hsp70的片段或變體包含Hsp70的全部或部分ATPase結(jié)構(gòu)域。在一個實施方式中，認(rèn)為本發(fā)明的Hsp70的片段或變體包含第30至第382的所有或部分氨基酸。在另一個具體的實施方式中，Hsp70的片段或變體包含Hsp70ATPase結(jié)構(gòu)域的第90位氨基酸色氨酸。Hsp70的片段可以為野生型蛋白的截短形式，即其是較短的形式?？梢酝ㄟ^從所述蛋白的氨基末端或羧基末端縮短該蛋白而使片段截短，或者也可以通過缺失所述蛋白的任何大小的一個或多個內(nèi)部區(qū)域而使其截短。在一個實施方式中，Hsp70的片段或變體可以與野生型蛋白具有100％的同源性。在另一個實施方式中，所述Hsp70的片段或變體還可以為與野生型蛋白具有小于100％的同源性，例如與野生型蛋白具有99.9-95％的同源性，例如95-90％的同源性，如90-85％的同源性，例如85-80％的同源性，如80-75％的同源性，例如75-60％同源性的Hsp70變體。應(yīng)該理解，保留了調(diào)節(jié)溶酶體酶活性的能力的Hsp70的任何片段或變體都被涵蓋于本發(fā)明中。應(yīng)該理解，保留了與BMP相互作用的能力的Hsp70的任何片段或變體都被涵蓋于本發(fā)明中。應(yīng)該理解，所述功能片段或變體的準(zhǔn)確量化作用可能不同于全長分子的作用。在一些情況下，所述功能片段或變體可能確實比全長分子更有效。此外，考慮到片段的尺寸較小，利用片段代替全長分子可能是有利的。在一個實施方式中，Hsp70的功能片段或變體可以為其中的一個或多個氨基酸已經(jīng)被取代的Hsp70變體。所述取代可以為等同或保守性取代，或者非等同或非保守取代。在一個實施方式中，野生型Hsp70的0.1-1％的氨基酸被取代，例如1-2％氨基酸殘基，例如2-3％氨基酸殘基，如3-4％氨基酸殘基，例如4-5％氨基酸殘基，如5-10％氨基酸殘基，例如10-15％氨基酸殘基，如15-20％氨基酸殘基，例如20-30％氨基酸殘基，如30-40％氨基酸殘基，例如40-50％氨基酸殘基，如50-60％氨基酸殘基，例如60-70％氨基酸殘基，如70-80％氨基酸殘基，例如80-90％氨基酸殘基，如90-100％的氨基酸殘基被取代。在一個實施方式中，野生型Hsp70的1-5個氨基酸殘基被取代，如5-10個氨基酸殘基，例如10-15個氨基酸殘基，如15-20個氨基酸殘基，例如20-30個氨基酸殘基，如30-40個氨基酸殘基，例如40-50個氨基酸殘基，如50-75個氨基酸殘基，例如75-100個氨基酸殘基，如100-150個氨基酸殘基，例如150-200個氨基酸殘基，如200-300個氨基酸殘基，例如300-400個氨基酸殘基，如400-500氨基酸殘基被取代。在一個實施方式中，所述Hsp70的功能片段或變體是融合蛋白。在一個實施方式中，所述Hsp70的功能片段或變體與標(biāo)簽融合。利用Hsp70或其功能片段或變體的優(yōu)勢如上文所討論的，除了針對戈謝病和法布里病開發(fā)的酶替代療法(ERT)外，還沒有治愈溶酶體貯積病的方法并且治療多是對癥治療。如所述，ERT是僅對一種具體疾病有效的非常昂貴的治療形式。據(jù)本發(fā)明人所知，目前還沒有為其它與脂質(zhì)集聚相關(guān)的溶酶體貯積病提供ERT的成功嘗試，因此當(dāng)前未滿足的主要需求是針對這些LSD的有效且特異的治療。與溶酶體貯積病的常規(guī)治療形式相比，向有此需要的個體施用Hsp70或其功能片段或變體具有多種優(yōu)勢。首先，利用現(xiàn)代技術(shù)生產(chǎn)重組蛋白(例如rHsp70或其功能片段或變體)是以簡單且直接的方式生產(chǎn)足夠量的rHsp70或其功能片段或變體。生產(chǎn)重組酶的常規(guī)技術(shù)為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。此外，生產(chǎn)重組蛋白，例如rHsp70、其功能片段或變體是用于生產(chǎn)足夠量的rHsp70或其功能片段或變體的廉價方法。與用于ERT的酶的生產(chǎn)相比，其費用大幅減少。此外，使用Hsp70或其功能片段或變體可用于治療多于一種特異的溶酶體貯積癥。這還適用于本發(fā)明的Hsp70誘導(dǎo)物和輔誘導(dǎo)物。確實，能夠提高Hsp70的細(xì)胞內(nèi)濃度和/或活性的生物活性劑可用于治療可通過調(diào)節(jié)所涉及的與BMP相互作用的缺陷性酶的酶促活性而逆轉(zhuǎn)的任何溶酶體貯積病。最后，由于Hsp70是內(nèi)源產(chǎn)生的分子，即源自生物體、組織或細(xì)胞內(nèi)的分子，因此預(yù)期施用Hsp70或其功能片段或變體不觸發(fā)免疫應(yīng)答或觸發(fā)的免疫應(yīng)答非常有限。由于當(dāng)施用于個體時其促進(jìn)治療且減少了潛在的副作用，因此這是主要優(yōu)勢。Hsp70的異位表達(dá)在一個實施方式中，Hsp70或其功能片段或變體可以由載體表達(dá)。因此，在一個實施方式中，本發(fā)明涉及編碼Hsp70或其功能片段或變體的載體。在本發(fā)明的一個實施方式中，Hsp70或其功能片段或變體可以以載體的形式施用于有此需要的個體。用于表達(dá)Hsp70或其功能片段或變體的載體可以選自以下：病毒載體(逆轉(zhuǎn)錄病毒和腺病毒)或非病毒載體(質(zhì)粒、粘粒、噬菌體)。在一個實施方式中，所述載體包含一個或多個復(fù)制起點、篩選標(biāo)記和一個或多個限制性內(nèi)切酶識別位點。在另一個實施方式中，所述載體可操作地與在合適的宿主細(xì)胞中控制所述Hsp70或其功能片段或變體轉(zhuǎn)錄的調(diào)控序列相連。如本文所述，在一個實施方式中，本發(fā)明涉及生產(chǎn)Hsp70或其功能片段或變體的方法；所述方法包括提供編碼所述Hsp70或其功能片段或變體的載體，并在體外或在合適的宿主生物內(nèi)以體內(nèi)方式表達(dá)所述載體，由此產(chǎn)生所述Hsp70或其功能片段或變體的步驟。本發(fā)明還涉及所分離的包含編碼本發(fā)明的Hsp70或其功能片段或變體的載體的重組或轉(zhuǎn)基因宿主細(xì)胞。本發(fā)明還涉及產(chǎn)生重組或轉(zhuǎn)基因宿主細(xì)胞的方法，所述方法包括以下步驟：提供編碼Hsp70或其功能片段或變體的載體，將所述載體引入所述重組或轉(zhuǎn)基因宿主細(xì)胞并任選地在所述重組或轉(zhuǎn)基因宿主細(xì)胞中表達(dá)所述載體，由此產(chǎn)生生產(chǎn)所述Hsp70或其功能片段或變體的重組或轉(zhuǎn)基因宿主細(xì)胞。在另一個實施方式中，本發(fā)明涉及包含上述宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因哺乳動物生物體。在再一個實施方式中，包含本發(fā)明的重組或轉(zhuǎn)基因宿主細(xì)胞的所述轉(zhuǎn)基因哺乳動物生物體不是人。所述轉(zhuǎn)基因宿主細(xì)胞可選自哺乳動物、植物、細(xì)菌、酵母或真菌宿主細(xì)胞。為了提高DNA至細(xì)胞的遞送，必須保護(hù)所述DNA免受損傷，且必須有利于其進(jìn)入細(xì)胞。已經(jīng)產(chǎn)生了具有保護(hù)DNA在轉(zhuǎn)染過程中免受不利降解的能力的Lipoplex和polyplex。質(zhì)粒DNA可以被脂質(zhì)以類似于膠束或脂質(zhì)體的組織性結(jié)構(gòu)所包被。當(dāng)所述組織性結(jié)構(gòu)與DNA結(jié)合時，其被稱為lipoplex。有三種類型的脂質(zhì)可用于形成脂質(zhì)體：陰離子性(帶負(fù)電荷)、中性或陽離子性(帶正電荷)。聚合物與DNA的復(fù)合體被稱為polyplex。多數(shù)polyplex由陽離子性聚合物構(gòu)成，且其產(chǎn)生有離子的相互作用調(diào)節(jié)。在一個實施方式中，包含Hsp70或其功能片段或變體的載體可用于基因治療?；蛑委熓窍騻€體的細(xì)胞或組織中插入基因以治療諸如遺傳病的疾病，在基因治療中利用功能基因替代有害的突變等位基因。在另一個實施方式中，可以將Hsp70或其功能片段或變體作為裸DNA而施用。這是非病毒轉(zhuǎn)染的最簡單形式?？梢酝ㄟ^使用電轉(zhuǎn)化、聲致孔(sonoporation)或者使用“基因槍”(利用高壓氣體將DNA包被的金顆粒射入細(xì)胞中)，進(jìn)行裸DNA的遞送。生物活性劑——Hsp70誘導(dǎo)物和輔誘導(dǎo)物在一個實施方式中，本發(fā)明涉及通過使用Hsp70誘導(dǎo)物或輔誘導(dǎo)物的酶促活性調(diào)節(jié)，其中，所述酶與BMP相互作用。Hsp70誘導(dǎo)物是在沒有伴隨應(yīng)激(concomitantstress)的情況下本身能夠提高Hsp70基因表達(dá)和蛋白表達(dá)的化合物。Hsp70輔誘導(dǎo)物是在沒有伴隨(輕度)應(yīng)激的情況下不能提高Hsp70基因表達(dá)和蛋白表達(dá)，但應(yīng)激誘導(dǎo)的Hsp70水平的提高可被存在的Hsp70輔誘導(dǎo)物進(jìn)一步提高或增強(qiáng)的化合物。本發(fā)明一方面提供了Hsp70誘導(dǎo)物或輔誘導(dǎo)物，其用作藥物。本發(fā)明再一方面提供了Hsp70誘導(dǎo)物或輔誘導(dǎo)物，其用在溶酶體貯積癥的治療中。本發(fā)明再一方面提供了Hsp70或其功能片段或變體在制造用于治療溶酶體貯積癥的藥物中的應(yīng)用。在一個實施方式中，所述溶酶體貯積癥選自尼曼-皮克病、法伯氏病、克拉伯病、法布里病、戈謝病、異染性腦白質(zhì)營養(yǎng)不良、唾液酸貯積病和鞘脂激活蛋白缺乏癥。在一個具體的實施方式中，所述溶酶體貯積癥是A型或B型尼曼-皮克病。在另一個具體的實施方式中，所述溶酶體貯積癥為法伯氏病。在另一個具體的實施方式中，所述溶酶體貯積癥為克拉伯病。在另一個具體的實施方式中，所述溶酶體貯積癥為異染性腦白質(zhì)營養(yǎng)不良。在另一個具體的實施方式中，所述溶酶體貯積癥為唾液酸貯積病。在另一個具體的實施方式中，所述溶酶體貯積癥為法布里病。在再一個具體的實施方式中，所述溶酶體貯積癥為戈謝病。在再一個具體的實施方式中，所述溶酶體貯積癥為鞘脂激活蛋白缺乏癥。在一個實施方式中，本發(fā)明的生物活性劑是Hsp70誘導(dǎo)物或輔誘導(dǎo)物。在一個具體的實施方式中，本發(fā)明的生物活性劑是Hsp70誘導(dǎo)物。在另一個具體的實施方式中，本發(fā)明的生物活性劑是Hsp70輔誘導(dǎo)物。小分子藥物——羥胺衍生物在一個實施方式中，本發(fā)明的生物活性劑是Hsp70輔誘導(dǎo)物。在再一個實施方式中，所述Hsp70輔誘導(dǎo)物是小分子藥物。在一個具體的實施方式中，本發(fā)明的Hsp70輔誘導(dǎo)物是羥胺衍生物。在再一個實施方式中，所述羥胺衍生物可選自氯吡哌醇(BRLP-42)、Arimoclomol(BRX-220)、BRX-345和BGP-15。在一個具體的實施方式中，所述氫胺衍生物是Arimoclomol(BRX-220)。氯吡哌醇([2-羥基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-吡啶-carboximidoyl-氯馬來酸鹽)([2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)propoxy]-3-pyridine-carboximidoyl-chloridemaleate)是最初開發(fā)用于治療糖尿病并發(fā)癥(例如神經(jīng)病)的無毒性化合物。已經(jīng)證明氯吡哌醇部分地通過HSF-1的激活提高細(xì)胞內(nèi)包括Hsp70在內(nèi)的熱休克蛋白(HSP)，從而提高在試驗應(yīng)激條件下的細(xì)胞存活。已經(jīng)證明氯吡哌醇在沒有未折疊蛋白時具有Hsp70輔誘導(dǎo)的能力，并且氯吡哌醇與帶負(fù)電荷的膜脂質(zhì)相互作用并提高其流動性。BRX-345是氯吡哌醇的結(jié)構(gòu)類似物，并且誘導(dǎo)HSP的能力略小。Arimoclomol(BRX-220)是氯吡哌醇的類似物，其與熱休克蛋白相互作用并放大熱休克反應(yīng)。Arimoclomol目前正處于ALS(肌萎縮性側(cè)索硬化，一種進(jìn)行性神經(jīng)退化病癥)治療的臨床試驗中。Arimoclomol為CytRx公司所有。因此，本發(fā)明一方面提供了在溶酶體貯積癥治療中使用的羥胺衍生物Hsp70輔誘導(dǎo)物。本發(fā)明再一方面提供了羥胺衍生物Hsp70輔誘導(dǎo)物在制造用于治療溶酶體貯積癥的藥物中的應(yīng)用。在一個實施方式中，所述溶酶體貯積癥選自尼曼-皮克病、法伯氏病、克拉伯病、法布里病、戈謝病、異染性腦白質(zhì)營養(yǎng)不良、唾液酸貯積病和鞘脂激活蛋白缺乏癥。膜流化劑在一個實施方式中，本發(fā)明的生物活性劑是Hsp70誘導(dǎo)物。在再一個實施方式中，所述Hsp70誘導(dǎo)物是膜流化劑。利用膜流化劑的治療還可以被稱為脂質(zhì)療法。在一個具體的實施方式中，本發(fā)明的Hsp70誘導(dǎo)物是選自以下的膜流化劑：苯甲醇、庚醇、AL721、二十二碳六烯酸、脂肪醇、油醇、二甲基氨基乙醇、A2C、法尼醇和諸如利多卡因、羅哌卡因、布比卡因和馬比佛卡因的麻醉劑以及本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它膜流化劑。除了一部分細(xì)胞蛋白在受熱過程中變性(蛋白毒性)外，還認(rèn)為膜流動性的改變是啟動熱休克反應(yīng)并誘導(dǎo)HSP的細(xì)胞熱感器(thermosensor)。確實，化學(xué)誘導(dǎo)的膜擾亂(類似于熱誘導(dǎo)的質(zhì)膜流動化)能夠激活HSP，而不引起蛋白變性。膜流動性是指細(xì)胞膜脂雙層的粘性。膜磷脂加入了不同長度和飽和度的脂肪酸。膜流化劑的作用是通過插入到膜脂質(zhì)之間由此通過消弱脂?；滈g的范德華相互作用而誘導(dǎo)擾亂作用。因此，本發(fā)明一方面提供了選自以下的膜流化劑：苯甲醇、庚醇、AL721、二十二碳六烯酸、脂肪醇、油醇、二甲基氨基乙醇、A2C、法尼醇和諸如利多卡因、羅哌卡因、布比卡因和馬比佛卡因的麻醉劑以及本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它膜流化劑，其用在溶酶體貯積癥的治療中。本發(fā)明再一方面提供了選自以下的膜流化劑在制造用于治療溶酶體貯積癥的藥物中的應(yīng)用：苯甲醇、庚醇、AL721、二十二碳六烯酸、脂肪醇、油醇、二甲基氨基乙醇、A2C、法尼醇和諸如利多卡因、羅哌卡因、布比卡因和馬比佛卡因的麻醉劑以及本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它膜流化劑。在一個實施方式中，所述溶酶體貯積癥選自尼曼-皮克病、法伯氏病、克拉伯病、法布里病、戈謝病、異染性腦白質(zhì)營養(yǎng)不良、唾液酸貯積病和鞘脂激活蛋白缺乏癥。用于誘導(dǎo)Hsp70的其它方式用于誘導(dǎo)Hsp70表達(dá)的任何方式都被視為涵蓋于本發(fā)明中，其中一些列于下文。提高個體溫度是包括Hsp70在內(nèi)的HSP的有效誘因，并且因此亞致死熱療是本發(fā)明的一個方面。在一個實施方式中，亞致死熱療包括提高個體的溫度至約38℃，如約39℃，例如約40℃，如約41℃，例如約42℃，如約43℃的核心溫度。因此，本發(fā)明一方面提供了亞致死熱療，用于治療溶酶體貯積癥。諸如掠食性恐懼和電擊的心里應(yīng)激能夠引發(fā)應(yīng)激誘導(dǎo)的eHsp70釋放，這被認(rèn)為是一個依賴于兒茶酚胺信號傳導(dǎo)的過程。此外，腎上腺素和去甲腎上腺素也可以引發(fā)Hsp70釋放。已經(jīng)證明以下化合物誘導(dǎo)(或輔誘導(dǎo))包括Hsp70在內(nèi)的HSP：膜相互作用化合物：烷基溶血磷脂依地福新(Edelfosine)(ET-18-OCH3或1-十八烷基-2-甲基-rac-甘油-3-磷酸膽堿)；消炎藥，包括環(huán)氧合酶1/2抑制劑，例如塞來昔布(celecoxib)和羅非昔布(rofecoxib)，以及NSAID，例如乙酰水楊酸、水楊酸鈉和吲哚美辛；前列腺素PGA1、PGj2和2-環(huán)戊烯-1-酮；過氧化物酶增殖物激活型受體γ-激動劑，微管蛋白相互作用抗癌劑，包括長春新堿和紫杉醇；胰島素增敏劑吡格列酮；抗腫瘤劑，例如卡鉑、多柔比星、氟達(dá)拉濱、異環(huán)磷酰胺和阿糖胞苷；Hsp90抑制劑格爾德霉素(geldanamycin)、17-AAG、17-DMAG、根赤殼菌素(radicicol)、除莠霉素-A(herbimycin-A)和花生四烯酸；蛋白酶體抑制劑MG132和乳胞素(lactacystin)；絲氨酸蛋白酶抑制劑DCIC、TLCK和TPCK；抗?jié)兯幪嫫杖鹜?geranylgeranylacetone)(GGA)、瑞巴匹特(rebamipide)、甘珀酸(carbenoxolone)和聚普瑞鋅(polaprezinc)(L-肌肽鋅)；重金屬(鋅和錫)；消炎藥地塞米松；可卡因；煙堿；醇(alcohol)；α-腎上腺素激動劑；環(huán)戊烯酮前列腺素(cyclopentenoneprostanoids)；以及草本藥芍藥苷(paeoniflorin)、甘草甜素(glycyrrhizin)、雷公藤紅素(celastrol)、二氫雷公藤紅素(dihydrocelastrol)、二氫雷公藤紅素二乙酸酯(dihydrocelastroldiacetate)和姜黃色素。因此，本發(fā)明一方面提供了選自以下的化合物：依地福新(ET-18-OCH3或1-十八烷基-2-甲基-rac-甘油-3-磷酸膽堿)、塞來昔布和羅非昔布、乙酰水楊酸、水楊酸鈉、吲哚美辛、PGA1、PGj2、2-環(huán)戊烯-1-酮、過氧化物酶增殖物激活型受體γ-激動劑、長春新堿、紫杉醇、吡格列酮、卡鉑、多柔比星、氟達(dá)拉濱、異環(huán)磷酰胺、阿糖胞苷、格爾德霉素、17-AAG、17-DMAG、根赤殼菌素、除莠霉素-A、花生四烯酸、MG132、乳胞素、DCIC、TLCK和TPCK、替普瑞酮(GGA)、瑞巴匹特、甘珀酸、聚普瑞鋅(L-肌肽鋅)、地塞米松、可卡因、煙堿、醇、α-腎上腺素激動劑、環(huán)戊烯酮前列腺素、芍藥苷、甘草甜素、雷公藤紅素、二氫雷公藤紅素、二氫雷公藤紅素二乙酸酯和姜黃素以及本領(lǐng)域已知的其他HSP誘導(dǎo)物，其用于治療溶酶體貯積病。本發(fā)明的藥物組合物本發(fā)明涉及通過使用能夠提高Hsp70的濃度和/或活性的生物活性劑進(jìn)行酶促活性的調(diào)節(jié)，從而使溶酶體貯積病患者受益，所述酶與BMP相互作用。雖然本發(fā)明的生物活性劑可能以原料化學(xué)物施用，但優(yōu)選以藥物制劑的形式提供。因此，本發(fā)明還提供了用于醫(yī)藥應(yīng)用的藥物組合物，其包含本發(fā)明的生物活性劑或本文所定義的其藥學(xué)上可接受的鹽和其藥學(xué)上可接受的載體。本發(fā)明一方面提供了可以向有此需要的個體施用的包含本文定義的生物活性劑的組合物，例如藥物組合物。在一個實施方式中，本發(fā)明涉及包含本發(fā)明的生物活性劑的組合物。在一個實施方式中，本文公開的組合物可以與生理學(xué)上可接受的載體組合配制。在一個實施方式中，本文公開的組合物可以與藥學(xué)上可接受的載體組合配制?？梢酝ㄟ^常規(guī)技術(shù)，例如在Remington:TheScienceandPracticeofPharmacy1995,editedbyE.W.Martin,MackPublishingCompany,19thedition,Easton,Pa.中描述的技術(shù)，制備包含本發(fā)明的生物活性劑的藥物組合物。本發(fā)明的生物活性劑可經(jīng)配制用于腸胃外施用，并且可以以安瓿、預(yù)填充針劑、小體積輸注的單位劑量形式或添加了防腐劑的多劑量容器的形式提供。所述組合物可以采取諸如包含于油性或水性介質(zhì)、載體、稀釋劑或溶劑中的懸浮液、溶液或乳液的形式，其中所述溶劑包括礦物鹽或其它水溶分子的水溶液、丙二醇、乙二醇、植物油、動物油、合成油、可注射有機(jī)酯，并且所述組合物可以包含諸如防腐劑、潤濕劑、乳化劑或助懸劑、穩(wěn)定劑和/或分散劑、色素、緩沖劑、稠化劑和增溶劑等的制劑用試劑?；蛘?，所述活性成分可以為通過無菌固體的無菌分離或通過凍干獲得的粉末形式，以在使用前利用合適的介質(zhì)(例如無菌且無熱原質(zhì)的水)形成。預(yù)期本發(fā)明還包括可制備的所述生物活性劑的藥學(xué)上可接受的鹽，作為鹽的特定水合物形式。這些鹽是其在藥學(xué)應(yīng)用上可接受的形式，即所述鹽將保留母體化合物的生物活性并且所述鹽將在其應(yīng)用中不具有不恰當(dāng)?shù)幕蛴泻Φ淖饔?，并用在疾病治療中。藥學(xué)上可接受的鹽以標(biāo)準(zhǔn)方式制備。如果所述母體化合物是堿，利用過量有機(jī)酸或無機(jī)酸在合適溶劑中對其進(jìn)行處理。如果所述母體化合物是酸，利用過量有機(jī)堿或無機(jī)堿在合適溶劑中對其進(jìn)行處理?？梢圆捎帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知的本發(fā)明的生物活性劑的任何合適的制劑。在一個實施方式中，Hsp70或其功能片段或變體被配制在生物可降解的微球(例如脂質(zhì)體)中。施用(給藥)可以采用任何合適的給藥途徑以向哺乳動物(優(yōu)選人)提供有效量的本發(fā)明生物活性劑，其中所述生物活性劑可以為Hsp70或其功能片段或變體。可以通過三種主要遞送途徑向有此需要的個體施用生物活性劑或藥物組合物：1)外用(涂敷于身體表面，例如皮膚或粘膜)，2)經(jīng)腸(通過胃腸或消化道)，和3)腸胃外(除胃腸或消化道外的途徑)外用包括表皮給藥(epicutaneous)(涂敷于皮膚上)、吸入劑、灌腸劑、滴眼劑(滴至結(jié)膜)、滴耳劑、鼻內(nèi)途徑和陰道給藥。經(jīng)腸給藥除經(jīng)胃或十二指腸營養(yǎng)管外，還可以為胃腸道的任何部分參與的任何給藥形式，并且包括口服給藥(通過口，例如片劑、膠囊或滴劑)、直腸(例如栓劑或灌腸劑)給藥。腸胃外遞送(例如注射或輸注)可有效地將生物活性劑遞送至靶位點或者將藥物引入至血液，并且包括靜脈內(nèi)(進(jìn)入至靜脈內(nèi))、動脈內(nèi)(進(jìn)入至動脈)、肌肉內(nèi)(進(jìn)入至肌肉)、心臟內(nèi)(進(jìn)入至心臟)、皮下(在皮膚下面)、骨質(zhì)內(nèi)(進(jìn)入至骨髓)、皮內(nèi)(進(jìn)入至皮膚本身)、鞘內(nèi)或脊柱內(nèi)(進(jìn)入至椎管內(nèi))、腹膜內(nèi)(進(jìn)入腹膜內(nèi))、透皮(通過完整的皮膚擴(kuò)散)、經(jīng)粘膜(通過粘膜擴(kuò)散，例如吹入(insufflation)(嗅吸入)、舌下、口含(buccal)和陰道栓劑)、吸入、硬膜(進(jìn)入硬膜區(qū))和玻璃體內(nèi)(進(jìn)入眼睛)。舌下給藥(在舌下)也是一種腸胃外給藥方式，由此生物活性劑通過舌下的粘膜組織擴(kuò)散至血液中。本發(fā)明的生物活性劑可以通過任何腸胃外遞送途徑而施用，并優(yōu)選通過上述任意方式施用。腸胃外遞送具有避免與腸遞送相關(guān)的在胃腸道中降解的優(yōu)勢。由于腸胃外遞送可以使化合物直接被吸收至體循環(huán)內(nèi)，所以腸胃外遞送還具有消除與腸遞送相關(guān)的首過代謝的優(yōu)勢。首過代謝是藥物代謝的一種現(xiàn)象，該現(xiàn)象使藥物濃度在到達(dá)體循環(huán)前大幅降低。通常與肝和腸壁相關(guān)的是在吸收過程中損失的藥物部分。服用藥物后，其被消化系統(tǒng)吸收并進(jìn)入到肝門脈系統(tǒng)。該藥物在到達(dá)身體其它部分之前通過門靜脈進(jìn)入肝。肝臟代謝多種藥物，有時將藥物代謝至僅少量活性藥物從肝臟排出進(jìn)入體循環(huán)其它部分的程度。因此，經(jīng)過肝的這種首過(firstpass)大幅降低了所述藥物的生物利用度。影響藥物的首過效應(yīng)的四個主要系統(tǒng)是胃腸腔的酶、腸壁酶、細(xì)菌酶和肝酶。可以通過常規(guī)技術(shù)制備此種給藥的適當(dāng)劑型?？梢酝ㄟ^常規(guī)技術(shù)制備適合通過吸入給藥的劑型，例如噴霧制劑或定量吸入劑(ametereddoseinhaler)。在一個實施方式中，本發(fā)明的生物活性劑的具體給藥方式是通過腸胃外給藥。在一個實施方式中，本發(fā)明的生物活性劑的腸胃外給藥的具體方式是通過靜脈、皮下、肌內(nèi)、動脈、皮下或腹膜內(nèi)注射。在一個實施方式中，本發(fā)明的生物活性劑的腸胃外給藥的具體方式是通過吸入。在一個實施方式中，本發(fā)明的生物活性劑的腸胃外給藥的具體方式是通過靜脈內(nèi)輸注。在一個實施方式中，本發(fā)明的靜脈內(nèi)輸注進(jìn)行的時間可以為10分鐘-20分鐘，如20-30分鐘，例如30-40分鐘，如40-50分鐘，例如50-60分鐘，如60-90分鐘，例如90-120分鐘，如2小時-3小時，例如3-4小時，如4-5小時，例如5-6小時，如6-7小時，例如7-8小時。在一個具體的實施方式中，本發(fā)明的生物活性劑的腸胃外給藥的方式是通過經(jīng)粘膜遞送。在一個實施方式中，所述經(jīng)粘膜遞送為舌下遞送，在另一個實施方式中，所述經(jīng)粘膜遞送為口含(buccal)遞送，在再一個實施方式中，所述經(jīng)粘膜遞送為吹入或鼻內(nèi)遞送。劑型包括片劑、錠劑、分散體、混懸劑、溶液、膠囊、乳膏、軟膏、乳劑、凝膠、洗劑、糊劑、氣霧劑或本領(lǐng)域已知的其它形式。所采用的活性成分的有效劑量可以隨所采用的具體組合物、給藥形式、所治療的病況和所治療病況的嚴(yán)重程度而不同。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地確定此劑量。在一個實施方式中，本發(fā)明的生物活性劑以單次日劑量或分次劑量或者以緩釋形式以約1微克/kg動物體重-約100毫克/kg動物體重的日劑量施用?？梢栽谠摲秶鷥?nèi)或甚至該范圍外對給藥方案進(jìn)行調(diào)整，以提供最佳的治療結(jié)果。在一個實施方式中，所施用的本發(fā)明生物活性劑的劑量為約1μg/kg體重-約10μg/kg體重，如約10μg/kg體重-約50μg/kg體重，例如約50μg/kg體重-約100μg/kg體重，如約100μg/kg體重-約250μg/kg體重，例如約250μg/kg體重-約500μg/kg體重，如約500μg/kg體重-約750μg/kg體重，例如約750μg/kg體重-約1000μg/kg體重，如約1mg/kg體重-約10mg/kg體重，例如約10mg/kg體重-約50mg/kg體重，如約50mg/kg體重-約100mg/kg體重?？梢砸阅撤N時間間隔施用所述劑量，并且所述劑量可以以mg/kg體重/時間單位表示。在一個實施方式中，所述時間單位可以為每分鐘，如每小時，例如每天，如每周。聯(lián)合治療一方面，本發(fā)明提供了能夠提高Hsp70的細(xì)胞內(nèi)濃度和/或活性的生物活性劑和其它治療形式的組合，用于溶酶體貯積癥的治療。一個方面，本發(fā)明涉及治療溶酶體貯積病的方法，其包括施用本發(fā)明的任一生物活性劑和至少一種其它治療形式的組合。因此，在一個實施方式中，本發(fā)明的生物活性劑與至少一種其它治療形式(例如用于LSD的常規(guī)或已知治療形式)組合施用于有此需要的個體。應(yīng)該理解，本發(fā)明的生物活性劑包含Hsp70或其功能片段或變體，或者Hsp70誘導(dǎo)物或輔誘導(dǎo)物。組合多于一種治療形式的施用可以同時發(fā)生或依次發(fā)生。同時施用可以為包含在同一組合物或包含在獨立的組合物中的兩種化合物，或者可以為基本在同一時間進(jìn)行的一種組合物和另一種治療形式。依次施用表示在不同時間點施用多于一種治療形式，例如首先施用一種治療形式，然后施用第二種治療形式。依次施用多于一種治療形式的時間框架可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員確定，以獲得最佳結(jié)果，并且在一個實施方式中可以為30分鐘-72小時?；瘜W(xué)化合物的治療形式可以一起施用或分開施用，每種均為最有效的劑量。施用多于一種化合物可以具有協(xié)同作用，從而有效降低各藥物的所需劑量。在一個實施方式中，將本發(fā)明的生物活性劑與酶替代療法(ERT)共同施用于有此需要的個體。在一個實施方式中，所述ERT可以選自(注射用伊米苷酶)、美格魯特、(β-半乳糖苷酶)和利甫蓋素(α-半乳糖苷酶)。在一個實施方式中，將本發(fā)明的生物活性劑與(注射用伊米苷酶)或美格魯特共同施用于患戈謝病的個體。在另一個實施方式中，將本發(fā)明的生物活性劑與(β-半乳糖苷酶)或利甫蓋素(α-半乳糖苷酶)或美格魯特共同施用于患法布里病的個體。在另一個實施方式中，將本發(fā)明的生物活性劑與止痛物品(painreliever)共同施用于有此需要的個體。在再一個實施方式中，將本發(fā)明的生物活性劑與皮質(zhì)類固醇共同施用于有此需要的個體。在一個實施方式中，可以將本發(fā)明的生物活性劑與移植(例如骨髓移植、臍帶血移植或干細(xì)胞移植)共同施用于有此需要的個體。在另一個實施方式中，將本發(fā)明的生物活性劑與底物減少療法共同施用于有此需要的個體。在另一個實施方式中，將本發(fā)明的生物活性劑與對癥和支持治療(例如物理治療)共同施用于有此需要的個體。Hsp70提高了化合物的攝取本發(fā)明人進(jìn)一步證明Hsp70提高了其它分子的胞吞攝取(圖16)。由于在Hsp70存在下使化合物更易于被細(xì)胞攝取的被動機(jī)制，該提高的攝取可能是不依賴于Hsp70發(fā)生的，或者由于與Hsp70的直接結(jié)合，其可能是依賴于Hsp70發(fā)生的。Hsp70提高化合物的細(xì)胞攝取的能力有利于施用于細(xì)胞的Hsp70或其功能片段或變體易于被細(xì)胞所攝取。此外，由于Hsp70的存在可提高Hsp70和與Hsp70組合施用的化合物的攝取，Hsp70提高化合物的細(xì)胞攝取的能力有利于組合治療方案。對于其中的一個化合物是ERT用酶而另一個是Hsp70或其功能片段或變體的組合治療，這可能有助于有效降低為達(dá)到有效細(xì)胞內(nèi)劑量而所需的ERT用酶量。由于ERT非常昂貴，這種降低具有重大意義。因此，在本發(fā)明的生物活性劑包含Hsp70或其功能片段或變體和Hsp誘導(dǎo)物或輔誘導(dǎo)物的情況下，Hsp70的存在可提高所述Hsp70誘導(dǎo)物或輔誘導(dǎo)物的攝取。調(diào)節(jié)酶的酶促活性的方法本發(fā)明一個方面涉及酶促活性的調(diào)節(jié)。所述酶可以為溶酶體物質(zhì)分解代謝所涉及的酶。并且所述調(diào)節(jié)可來自Hsp70和BMP之間的相互作用。因此，本發(fā)明人描述了Hsp70和BMP之間的相互作用，其中，Hsp70與BMP相互作用或以特定親合力與BMP結(jié)合。在本文中，與分子X具有“親合力”的分子表示與分子X具有親合力的分子將在某種條件下以某種可檢測的量與分子X結(jié)合，但在同一條件下并不與其它不同的分子(與其沒有親合力的分子)以相同的程度結(jié)合(優(yōu)選可檢測的結(jié)合)。描述一種分子與其它分子的親合力的一個方式是解離常數(shù)Kd。Kd越小，親合力越強(qiáng)?？梢岳帽绢I(lǐng)域熟知的方法，例如表面等離子共振分析測定解離常數(shù)。在本文中，與另一個分子X具有“親合力”的分子與所述分子X的Kd小于100mM，如小于10mM，例如小于5mM，如小于1mM，例如小于0.1mM，如小于0.01mM，例如小于1μM，如小于100nM,，例如小于10nM，如小于1nM，例如小于100pM，如小于10pM，例如小于1pM。此外，本文優(yōu)選與分子X“沒有親合力”的分子的與分子X結(jié)合的解離常數(shù)Kd比與分子X具有親合力的分子(與分子X)的結(jié)合的Kd高至少10倍，如高至少20倍，例如高至少30倍，如高至少40倍，例如高至少50倍，如高至少60倍，例如高至少70倍，如高至少80倍，例如高至少90倍，如高至少100倍。最優(yōu)選地，認(rèn)為與分子X具有親合力的分子和確定與分子X沒有親合力的分子之間Kd的差異至少為10倍。本發(fā)明一方面提供了調(diào)節(jié)與BMP(二(單酰基甘油)磷酸酯)相互作用的酶的酶促活性的方法，其中所述方法包括以下步驟：i)施用能夠提高Hsp70的細(xì)胞內(nèi)濃度和/或活性的生物活性劑，和ii)使BMP和Hsp70之間相互作用，和iii)調(diào)節(jié)與BMP相互作用的酶的酶促活性。在一個實施方式中，所述相互作用可以是直接的，或者在另一個實施方式中，所述相互作用可以是間接的。在一個實施方式中，本發(fā)明一方面涉及調(diào)節(jié)與BMP(二(單?；视?磷酸酯)相互作用的酶的酶促活性的方法，其中所述方法包括以下步驟：i)施用本發(fā)明的生物活性劑，ii)使BMP和Hsp70之間相互作用，和iii)調(diào)節(jié)與BMP相互作用的酶的酶促活性。在一個實施方式中，所述Hsp70與BMP形成共價或非共價復(fù)合物。在一個實施方式中，所述BMP與鞘脂激活蛋白相互作用。在再一個實施方式中，所述鞘脂激活蛋白可選自鞘脂激活蛋白A、鞘脂激活蛋白B、鞘脂激活蛋白C和鞘脂激活蛋白D。在再一個實施方式中，所述酶選自鞘磷脂酶、酸性鞘磷脂酶(aSMase)、酸性神經(jīng)酰胺酶、β-半乳糖苷神經(jīng)酰胺酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖神經(jīng)酰胺酶、唾液酸酶和芳基硫酸酯酶。在一個具體的實施方式中，所述酶促活性的調(diào)節(jié)是酶促活性的提高。在一個實施方式中，所述酶促活性的提高是提高1-5％，如5-10％，例如10-15％，如15-20％，例如20-25％，如25-30％，例如30-35％，如35-40％，例如40-45％，如45-50％，例如50-60％，如60-70％，例如70-80％，如80-90％，例如90-100％，如100-120％，例如120-140％，如140-160％，例如160-180％，如180-200％，例如200-250％，如250-300％，例如300-400％，如400-500％，例如500-750％，如750-1000％，例如1000-1500％，如1500-2000％，例如2000-5000％。本發(fā)明另一方面涉及鑒定Hsp70-BMP復(fù)合物的結(jié)合伴侶的方法，所述方法包括提取所述Hsp70-BMP復(fù)合物并分離所述結(jié)合伴侶的步驟。在一個實施方式中，所述結(jié)合伴侶為激動劑。在另一個實施方式中，所述結(jié)合伴侶為拮抗劑。本發(fā)明另一方面涉及Hsp70-BMP復(fù)合物及其作為藥物的應(yīng)用，如用于治療溶酶體貯積病。在一個實施方式中，本發(fā)明涉及特異性識別Hsp70-BMP復(fù)合物的抗體。治療方法本發(fā)明一方面涉及治療有此需要的個體的方法。因此，本發(fā)明一方面提供了治療溶酶體貯積病的方法，所述方法包括向有此需要的個體施用本發(fā)明的生物活性劑。在一個實施方式中，認(rèn)為所述治療為預(yù)防、治愈或改善。在一個具體的實施方式中，所述治療為預(yù)防。在另一個實施方式中，所述治療是治愈。在再一個實施方式中，所述治療為改善。在一個實施方式中，本發(fā)明使用的生物活性劑可以被配制為藥物組合物。在一個實施方式中，所述溶酶體貯積癥選自尼曼-皮克病、法伯氏病、克拉伯病、法布里病、戈謝病、異染性腦白質(zhì)營養(yǎng)不良、唾液酸貯積病和鞘脂激活蛋白缺乏癥。在一個具體的實施方式中，所述溶酶體貯積癥是A型或B型尼曼-皮克病。在另一個具體的實施方式中，所述溶酶體貯積癥為法伯氏病。在另一個具體的實施方式中，所述溶酶體貯積癥為克拉伯病。在另一個具體的實施方式中，所述溶酶體貯積癥為異染性腦白質(zhì)營養(yǎng)不良。在另一個具體的實施方式中，所述溶酶體貯積癥為唾液酸貯積病。在另一個具體的實施方式中，所述溶酶體貯積癥為法布里病。在再一個具體的實施方式中，所述溶酶體貯積癥為戈謝病。在再一個具體的實施方式中，所述溶酶體貯積癥為鞘脂激活蛋白缺乏癥。在一個實施方式中，所述溶酶體病的特征是細(xì)胞內(nèi)集聚的鞘脂增加。在一個實施方式中，所述治療減少了有此需要的個體細(xì)胞內(nèi)集聚的物質(zhì)。所述物質(zhì)可以為通常在溶酶體中降解的物質(zhì)。在一個實施方式中，所述物質(zhì)為鞘脂。在一個實施方式中，本發(fā)明的治療將溶酶體可降解物質(zhì)(例如鞘脂)的細(xì)胞內(nèi)集聚量減少至小于100％的集聚量，如小于90％的集聚量，例如小于80％的集聚量，如小于70％的集聚量，例如小于60％的集聚量，如小于50％的集聚量，例如小于40％的集聚量，如小于30％的集聚量，例如小于20％的集聚量，如小于10％的集聚量，例如小于5％的集聚量。在一個實施方式中，本發(fā)明的治療將鞘脂的細(xì)胞內(nèi)集聚量減少了至少5％，如小于10％，例如小于15％，如小于20％，例如小于25％，如小于30％，例如小于35％，如小于40％，例如小于45％，如小于50％，例如小于55％，如小于60％，例如小于65％，如小于70％，例如小于75％，如小于80％，例如小于85％，如小于90％，例如小于95％，如小于100％。在一個實施方式中，所述集聚的鞘脂選自鞘磷脂、神經(jīng)酰胺、半乳糖苷神經(jīng)酰胺、球形三酰神經(jīng)酰胺(globotriaosylceramide)、糖基神經(jīng)酰胺、GM3和硫腦苷脂。溶酶體可降解物質(zhì)(例如鞘脂)的細(xì)胞內(nèi)濃度的降低速度可取決于諸如施用形式和劑量方案等因素。在一個實施方式中，所述治療延長了有此需要的個體的預(yù)期壽命。在一個實施方式中，認(rèn)為所述預(yù)期壽命可提高6月-1年，如1年-2年，例如2-3年，如3-4年，例如4-5年，如5-6年，例如6-7年，如7-8年，例如8-9年，如9-10年，例如10-12年，如12-14年，例如14-16年，如16-18年，例如18-20年，如20-25年，例如25-30年，如30-40年，例如40-50年，如50-60年，例如60-70年，如70-80年，例如80-90年，如90-100年。在一個實施方式中，預(yù)期壽命提高了至少6個月，如至少1年，如至少2年，例如3年，如至少4年，例如5年，如至少6年，例如7年，如至少8年，例如9年，如至少10年，例如12年，如至少14年，例如16年，如至少18年，例如20年，如至少25年，例如30年，如至少40年，例如50年，如至少60年，例如70年，如至少80年，例如90年，如至少100年。因此，本發(fā)明一方面還提供了延長溶酶體貯積病患者預(yù)期壽命的方法，其中，所述方法包括向有此需要的個體施用本發(fā)明的生物活性劑。在一個實施方式中，本發(fā)明涉及延長溶酶體貯積病患者預(yù)期壽命的方法，其中所述方法包括向有此需要的個體施用本發(fā)明的生物活性劑，其中所述預(yù)期壽命被提高6月-1年，如1年-2年，例如2-3年，如3-4年，例如4-5年，如5-6年，例如6-7年，如7-8年，例如8-9年，如9-10年，例如10-12年，如12-14年，例如14-16年，如16-18年，例如18-20年，如20-25年，例如25-30年，如30-40年，例如40-50年，如50-60年，例如60-70年，如70-80年，例如80-90年，如90-100年。在一個實施方式中，本發(fā)明涉及延長溶酶體貯積病患者預(yù)期壽命的方法，其中所述方法包括向有此需要的個體施用本發(fā)明的生物活性。在一個實施方式中，其中所述預(yù)期壽命被提高至少6個月，如至少1年，如至少2年，例如3年，如至少4年，例如5年，如至少6年，例如7年，如至少8年，例如9年，如至少10年，例如12年，如至少14年，例如16年，如至少18年，例如20年，如至少25年，例如30年，如至少40年，例如50年，如至少60年，例如70年，如至少80年，例如90年，如至少100年。實施例實施例1:Hsp70和二(單?；视?磷酸酯之間的相互作用穩(wěn)定了溶酶體并促進(jìn)了細(xì)胞存活簡述溶酶體膜通透化是應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡的進(jìn)化保守性特點。本發(fā)明人在此證明了，主要的應(yīng)激誘導(dǎo)熱休克蛋白70(Hsp70)通過pH依賴性親合結(jié)合至內(nèi)溶酶體的陰離子磷脂二(單酰基甘油)磷酸酯(BMP；還被稱為溶血二磷脂酸)穩(wěn)定溶酶體，從而增強(qiáng)細(xì)胞存活。Hsp70的帶正電荷的ATPase結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)結(jié)合，但為了溶酶體的有效穩(wěn)定還需要底物結(jié)合結(jié)構(gòu)域。重要的是，細(xì)胞保護(hù)作用可以通過重組Hsp70的內(nèi)吞遞送獲得，并特別通過BMP抗體或Hsp70抑制劑的額外細(xì)胞給藥逆轉(zhuǎn)。因此，這種蛋白-脂質(zhì)相互作用提供了分別用于治療退行性疾病和癌癥的細(xì)胞保護(hù)療法和細(xì)胞毒性溶酶體特異性療法的令人興奮的可能性。介紹溶酶體是處于高動態(tài)的胞質(zhì)細(xì)胞器，其接受來自生物合成(高爾基體反面網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu))、內(nèi)吞、吞噬和自我吞噬途徑的膜運輸輸入物。溶酶體包含大于50種酸性水解酶，其能夠加工細(xì)胞的所有主要大分子以降解可用于代謝回收利用的產(chǎn)物。除了其分解代謝的看家功能外，最近證明溶酶體酶(組織蛋白酶)是由例如腫瘤壞死因子受體家族的死亡受體、組織缺氧、氧化應(yīng)激、滲透應(yīng)激、熱和抗癌藥誘導(dǎo)的進(jìn)化保守性細(xì)胞死亡程序中的重要效應(yīng)子。組織蛋白酶依賴性細(xì)胞死亡的特征是早期溶酶體膜通透化和隨后組織蛋白酶向胞質(zhì)中的轉(zhuǎn)移，在此組織蛋白酶可以啟動caspase-依賴性和caspase-非依賴性細(xì)胞死亡途徑。因此，溶酶體膜完整性是多種應(yīng)激條件下細(xì)胞存活的重要調(diào)節(jié)因素。雖然已經(jīng)報道了胞質(zhì)半胱氨酸蛋白酶抑制劑在哺乳動物細(xì)胞和線蟲類秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditiselegans)中提供不受組織蛋白酶誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷的保護(hù)作用，但細(xì)胞調(diào)節(jié)溶酶體膜穩(wěn)定性的機(jī)制還很不清楚。然而，最近的間接證據(jù)表明，主要應(yīng)激誘導(dǎo)Hsp70的有效細(xì)胞保護(hù)作用是由于溶酶體膜的穩(wěn)定化。癌細(xì)胞中Hsp70的缺失觸發(fā)了溶酶體膜的早期通透化和組織蛋白酶介導(dǎo)的細(xì)胞死亡，并且外源性Hsp70有效抑制了由多種應(yīng)激誘導(dǎo)的溶酶體去穩(wěn)定化。此外，Hsp70缺陷小鼠患有由溶酶體蛋白酶泄漏至胞質(zhì)引起的胰腺炎。Hsp70的溶酶體保護(hù)潛能的分子機(jī)制仍不清楚，但其作用機(jī)制的線索可能在于少部分Hsp70向內(nèi)溶酶體區(qū)室的與應(yīng)激和癌相關(guān)的轉(zhuǎn)移。本研究的主要目的是確定溶酶體定位是否確實對Hsp70的細(xì)胞保護(hù)作用至關(guān)重要。引人注意地，本文提供的數(shù)據(jù)證明Hsp70以高親合力與溶酶體特異性脂質(zhì)BMP結(jié)合，并且這種蛋白-脂質(zhì)相互作用穩(wěn)定了溶酶體。重要的是，能夠通過細(xì)胞外施用細(xì)胞保護(hù)性Hsp70本身或干擾Hsp70-BMP結(jié)合或Hsp70功能(特別是溶酶體區(qū)室內(nèi))的化合物，利用這種新型細(xì)胞保護(hù)機(jī)制。結(jié)果和討論為了檢測溶酶體定位是否對Hsp70的細(xì)胞保護(hù)至關(guān)重要，本發(fā)明人制備了重組Hsp70(rHsp70)并利用細(xì)胞的內(nèi)吞機(jī)器使rHsp70進(jìn)入溶酶體腔內(nèi)。用標(biāo)記有AlexaFluor488的rHsp70溫育的U-2-OS骨肉瘤細(xì)胞的免疫細(xì)胞化學(xué)分析證明了內(nèi)吞的rHsp70與晚期內(nèi)涵體和溶酶體標(biāo)記蛋白(溶酶體相關(guān)膜蛋白1和2以及溶酶體膜內(nèi)在蛋白-1(LIMP-1))以及內(nèi)溶酶體特異性脂質(zhì)(BMP)的明顯共定位，然而利用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)標(biāo)記物(內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+-ATPase(SERCA))、高爾基體(golgin-97)或線粒體標(biāo)記物(細(xì)胞色素c(cytc))沒有觀察到共定位。還在活細(xì)胞中觀察到所述溶酶體定位，其中內(nèi)吞rHsp70與溶酶體紅色熒光探針(Red)共定位，但不與線粒體紅色熒光探針(Red)共定位。為了測定內(nèi)吞Hsp70的量，對荷載rHsp70*的細(xì)胞的熒光信號進(jìn)行定量，結(jié)果表明每1*105細(xì)胞平均攝取70ngrHsp70*。為了測定內(nèi)吞的rHsp70*是否僅位于腔內(nèi)或者其是否直接結(jié)合至內(nèi)溶酶體膜上，將荷載rHsp70*的U-2-OS進(jìn)行亞分級，并測定輕膜部分(LMF)中存在的rHsp70*量(包括早期內(nèi)涵體和晚期內(nèi)涵體以及溶酶體的細(xì)胞器)。通過在液氮中反復(fù)凍融的循環(huán)使LMF中的細(xì)胞器冷凍破裂，引起組織蛋白酶B完全釋放至上清液中，然而溶酶體膜蛋白LAMP-2停留在沉淀的破裂膜部分中。內(nèi)吞rHsp70*的定量表明，大約1/3的總rHsp70*保留在沉淀中，強(qiáng)有力地證明其被結(jié)合在內(nèi)溶酶體膜上。為了評價內(nèi)吞的rHsp70是否能夠穩(wěn)定溶酶體膜，使細(xì)胞荷載吖啶橙(集聚在細(xì)胞的酸性區(qū)室中，是晚期內(nèi)涵體和溶酶體中的因光異色的弱堿)，并在暴露于藍(lán)光后使其對光致氧化敏感(Brunketal.,1997；Nylandstedetal.,2004)。光致氧化引起溶酶體pH-梯度的喪失，并使吖啶橙泄漏至胞質(zhì)中。當(dāng)吖啶橙集中在細(xì)胞的酸性區(qū)室內(nèi)時顯示紅色熒光，而當(dāng)以較低濃度存在于胞質(zhì)中時則顯示綠色熒光，因此很容易可視化和定量。顯著地，內(nèi)吞的rHsp70保護(hù)溶酶體免受藍(lán)光誘導(dǎo)的光致氧化，而在荷載重組Hsc70和Hsp70-2(與Hsp70分別具有86％和84％的氨基酸序列同源性)的細(xì)胞中沒有觀察到保護(hù)作用。此外，Hsp70特異性小干擾RNA(siRNA)使U-2-OS細(xì)胞的溶酶體對光致氧化敏感，并且這種作用可適當(dāng)?shù)乇粌?nèi)吞的rHsp70完全逆轉(zhuǎn)，由此證明內(nèi)吞Hsp70的保護(hù)作用是由位于溶酶體腔內(nèi)的小部分蛋白所介導(dǎo)而非殘留在胞質(zhì)中的大的蛋白池所介導(dǎo)。以上證明的Hsp70的有效內(nèi)吞攝取和溶酶體穩(wěn)定化可以解釋最近報道的在多種已知觸發(fā)溶酶體細(xì)胞死亡途徑的處理(即視網(wǎng)膜光損害和坐骨神經(jīng)軸索切斷)后向受損位點施用細(xì)胞外Hsp70的意外神經(jīng)保護(hù)作用。為了檢測Hsp70的所述保護(hù)作用是否可能是Hsp70與溶酶體膜的直接結(jié)合的結(jié)果，本發(fā)明人研究了其與包含多種膜相關(guān)陰離子脂質(zhì)(即棕櫚?；?油?；?磷脂酰絲氨酸(POPS；主要存在于質(zhì)膜的內(nèi)小葉中)、心磷脂(主要存在于線粒體中)和BMP(主要存在于晚期內(nèi)涵體和溶酶體中))的棕櫚?；?油?；?磷脂酰膽堿(POPC)大單層囊泡(LUV)的相互作用?？紤]到內(nèi)溶酶體區(qū)室在成熟為溶酶體后環(huán)境酸性的提高，對中性(pH7.4)和酸性(pH6.0)條件下的蛋白-脂質(zhì)相互作用進(jìn)行了比較。在pH7.4時，rHsp70引起POPC溶酶體中90°光散射的小的相對變化，表明其非常弱地結(jié)合至POPC雙層上。根據(jù)針對POPS的早期報道，所有帶負(fù)電荷的脂質(zhì)都增強(qiáng)了中性pH下rHsp70與脂質(zhì)體的結(jié)合。這種增強(qiáng)約為4倍，且與負(fù)電荷脂質(zhì)或脂質(zhì)體表面的電荷密度(POPS的凈電荷為-1，心磷脂和BMP的凈電荷為-2)無關(guān)。顯著地，將pH由7.4降低至6.0顯著改變了rHsp70的脂質(zhì)結(jié)合譜(lipidassociationprofile)。然而，酸化后與POPS的結(jié)合僅略有提高，與中性pH相比，在酸性pH中與BMP的結(jié)合強(qiáng)度提高了幾乎20倍。Hsp70與BMP的pH依賴性高親合力結(jié)合在一組獨立的BIAcore實驗中得到驗證。如之前所證明的(Kobayashietal.,1998)，為了測定活細(xì)胞中Hsp70介導(dǎo)的溶酶體穩(wěn)定化是否需要在體外觀察到的Hsp70和BMP之間的pH依賴性高親合力相互作用，本發(fā)明人通過使U-2-OS細(xì)胞的內(nèi)溶酶體區(qū)室荷載BMP抗體以靶向細(xì)胞BMP。顯著地，BMP抗體有效抑制了rHsp70提供的保護(hù)免受光致氧化誘導(dǎo)的溶酶體泄漏的能力。更重要地，BMP抗體使U-2-OS骨肉瘤細(xì)胞對順鉑顯著敏感，而順鉑在U-2-OS細(xì)胞中和本研究中使用的其它順鉑敏感性細(xì)胞系下誘導(dǎo)早期溶酶體膜通透化。因此，在用抗BMP抗體處理后，PC-3和DU-145前列腺癌細(xì)胞對順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡顯著敏感。證明了溶酶體Hsp70-BMP相互作用對Hsp70的細(xì)胞保護(hù)作用至關(guān)重要后，本發(fā)明人接著研究了Hsp70的哪部分負(fù)責(zé)脂質(zhì)結(jié)合。為了實現(xiàn)該目的，在pH6.0下使rHsp70?？吭诎珺MP的脂質(zhì)體中后對酪氨酸的熒光轉(zhuǎn)移(W90和W580)進(jìn)行測定。本發(fā)明人生產(chǎn)了在rHsp70的兩個主要功能結(jié)構(gòu)域即氨基末端ATPase結(jié)構(gòu)域(rHsp70-ΔATP；缺失第119-426氨基酸)和羧基末端肽結(jié)合結(jié)構(gòu)域(rHsp70-ΔPBD；缺失第437-617氨基酸)具有缺失的rHsp70突變蛋白。Hsp70-ΔATP相對峰熒光強(qiáng)度信號的喪失表明，Hsp70與POPC/BMP雙層的高親合力結(jié)合需要ATPase結(jié)構(gòu)域。接著，為了研究哪個酪氨酸負(fù)責(zé)脂質(zhì)結(jié)合和熒光轉(zhuǎn)移，利用苯丙氨酸取代Hsp70中的兩個酪氨酸(W90F和W580F)。在ATPase結(jié)構(gòu)域缺乏酪氨酸(rHsp70-W90F)的rHsp70-W90F的信號減少，在肽結(jié)合結(jié)構(gòu)域中缺乏酪氨酸的rHsp70-W580F的信號不變，這表明第90位的酪氨酸被?？吭谥|(zhì)層中。以上使用的方法僅測定了酪氨酸包埋在親脂環(huán)境中后熒光的相對轉(zhuǎn)移，本發(fā)明人還采用BIAcore2000系統(tǒng)利用固定在L1傳感芯片表面的含BMP的LUV以更加量化的方式分析了pH4.5時rHsp70及其突變體的脂質(zhì)結(jié)合。rHsp70和rHsp70-ΔPBD均與BMP具有強(qiáng)的相互作用，然而rHsp70-ΔATP的結(jié)合顯著降低，這證明Hsp70主要通過其ATPase結(jié)構(gòu)域與BMP相互作用。驚人的是，酪氨酸突變體的與BMP的相互作用的能力具有顯著差異。然而，rHsp70-W580F突變體具有與rHsp70基本相同的相互作用譜，rHsp70-W90F突變體的結(jié)合顯著降低。由于根據(jù)遠(yuǎn)UV圓二色性和近UV圓二色性分析rHsp70-W90F被準(zhǔn)確折疊并且能夠折疊熒光素酶和水解ATP，W90F突變特異性地消除了Hsp70和BMP之間的相互作用并同時保持了Hsp70伴侶分子的結(jié)構(gòu)和功能方面。因此，rHsp70-W90F突變體意外地為本發(fā)明人提供了用于進(jìn)一步測定Hsp70和BMP之間的直接相互作用是否使Hsp70具有溶酶體保護(hù)性質(zhì)的無價工具。確實，rHsp70-W90F突變體完全喪失了其保護(hù)溶酶體膜免受光致氧化和保護(hù)細(xì)胞免受順鉑誘導(dǎo)的溶酶體細(xì)胞死亡的能力，而rHsp70-W580F突變體顯示與野生型蛋白相同的功效。此外，顯示與富含BMP的膜的結(jié)合能力不變的rHsp70-ΔPBD突變體喪失了其保護(hù)免受光致氧化和順鉑的能力。這些發(fā)現(xiàn)證明，為賦予溶酶體膜保護(hù)作用需要Hsp70與BMP的結(jié)合但這并不是充分條件。此外，完整的羧基末端肽結(jié)合結(jié)構(gòu)域?qū)τ诨罴?xì)胞中溶酶體膜的穩(wěn)定化也是必須的。Hsp70抑制劑長期被認(rèn)作是重要的抗癌藥。然而，由于注意力集中于胞質(zhì)Hsp70的抑制，并且由于藥物遞送問題和對Hsp70家族成員間特異性的不了解使合適Hsp70拮抗劑的開發(fā)面臨不可逾越的障礙。已經(jīng)確定了Hsp70的細(xì)胞保護(hù)作用需要與BMP的結(jié)合以及完整的肽結(jié)合結(jié)構(gòu)域，并且已經(jīng)證明了靶向Hsp70-BMP相互作用的可能，本發(fā)明人接著檢測了內(nèi)溶酶體Hsp70的保護(hù)作用是否也可能被Hsp70伴侶分子活性的抑制劑所削弱。通過用凋亡誘導(dǎo)因子衍生肽(ADD70，其通過與Hsp70的肽結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合而抑制Hsp70的伴侶功能)溫育細(xì)胞，實現(xiàn)此目的。應(yīng)該注意到，該大的衍生肽(388個氨基酸)不跨過質(zhì)膜，并由此為我們提供了特異性地靶向內(nèi)溶酶體Hsp70的另一個工具。特別地，用ADD70肽溫育細(xì)胞完全阻斷了內(nèi)吞的rHsp70在U-2-OS細(xì)胞中的溶酶體保護(hù)作用。為了檢測ADD70是否也可能削弱細(xì)胞自身的Hsp70的細(xì)胞保護(hù)作用，本發(fā)明人研究了ADD70對Hsp70轉(zhuǎn)基因的永生化鼠胚胎成纖維細(xì)胞(iMEFs)中順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性的影響，其中，在Hsp70轉(zhuǎn)基因的永生化鼠胚胎成纖維細(xì)胞中轉(zhuǎn)基因Hsp70幾乎提供了完整的對順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡的抗性。顯著地，Hsp70轉(zhuǎn)基因iMEFs的ADD70-治療有效消除了Hsp70介導(dǎo)的細(xì)胞保護(hù)作用，并使其具有與野生型iMEFs相同的對順鉑的敏感性。野生型iMEFs表達(dá)非常低水平的Hsp70，因此ADD70不能進(jìn)一步使野生型iMEFs對順鉑敏感，這支持了ADD70介導(dǎo)的敏化確實是由于Hsp70的抑制的觀點。類似于抗-BMP治療，ADD70治療也使PC-3和DU-145前列腺癌細(xì)胞對順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性敏感。本文提供的數(shù)據(jù)顯示，Hsp70與內(nèi)溶酶體陰離子磷脂BMP直接相互作用并且這種相互作用穩(wěn)定了內(nèi)溶酶體膜。由于內(nèi)吞小泡中BMP濃度隨內(nèi)涵體成熟形成多泡體、晚期內(nèi)涵體和溶酶體而增加，pH調(diào)節(jié)可能是使Hsp70靶向BMP和溶酶體的方式。Hsp70的亞結(jié)構(gòu)域的pI值明顯不同，ATPase結(jié)構(gòu)域的pI高于肽結(jié)合結(jié)構(gòu)域1.72個單位。這種特征表明，在酸性pH時，優(yōu)選ATPase結(jié)構(gòu)域帶正電荷，這可促進(jìn)其與陰性脂質(zhì)的相互作用。由于內(nèi)吞成熟過程中pH降低，將增加正電荷并且任何陰離子相互作用也將被進(jìn)一步增強(qiáng)。本文提供的證明Hsp70–BMP相互作用依賴于酸性pH和ATPase結(jié)構(gòu)域的數(shù)據(jù)支持了該理論。此外，Hsp70的ATPase結(jié)構(gòu)域的靜電表面的分子模建表明，Hsp70的ATPase結(jié)構(gòu)域形成接近楔樣的結(jié)構(gòu)，并且甚至在pH7.0時在楔的底部都具有大量正電荷。有趣的是，W90位于該帶正電荷的結(jié)構(gòu)域內(nèi)部，其可能給出Hsp70-W90F突變體為何對Hsp70的與BMP相互作用并穩(wěn)定溶酶體的能力產(chǎn)生此種深刻影響的線索。BMP全部位于內(nèi)溶酶體區(qū)室的內(nèi)膜中，在此，其支持酸性鞘磷脂酶和鞘脂激活因子蛋白對脂質(zhì)小泡的分裂和從脂質(zhì)小泡提取脂質(zhì)，產(chǎn)生參與膜去穩(wěn)定和細(xì)胞死亡的諸如神經(jīng)酰胺和鞘氨醇-1-磷脂的代謝物。應(yīng)該注意，可以通過早期內(nèi)涵體和晚期內(nèi)涵體水平上的周界膜的內(nèi)陷形成溶酶體內(nèi)膜，并且因此各小泡可能也含有Hsp70。因此，Hsp70可以干擾BMP作為鞘脂水解的輔因子的作用，并由此改變?nèi)苊阁w的脂質(zhì)組成。為了檢測這種假設(shè)，本發(fā)明人當(dāng)前開發(fā)了基于質(zhì)譜的技術(shù)，用于量化溶酶體鞘脂代謝。大量數(shù)據(jù)證明，溶酶體蛋白酶表達(dá)的提高和運輸?shù)母淖兛梢酝ㄟ^使腫瘤細(xì)胞對溶酶體膜通透化敏感而形成“致命點”。因此，內(nèi)溶酶體膜上BMP-Hsp70相互作用所產(chǎn)生的內(nèi)溶酶體區(qū)室穩(wěn)定化為癌細(xì)胞提供了免受這種死亡直接途徑的保護(hù)作用。作為這種細(xì)胞保護(hù)作用基礎(chǔ)的分子機(jī)制開啟了用于使癌細(xì)胞對通過特異抑制Hsp70的溶酶體穩(wěn)定功能而誘導(dǎo)溶酶體細(xì)胞死亡途徑的試劑敏感的新的令人興奮的可能。反之亦然，Hsp70和BMP之間的相互作用可能提供了依賴于外源施用的Hsp70的溶酶體穩(wěn)定功能產(chǎn)生的細(xì)胞保護(hù)作用的新治療策略，用于胰腺炎、運動神經(jīng)病變和感官神經(jīng)病變和光誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜損傷的多種損傷。材料和方法細(xì)胞培養(yǎng)和試劑在補充有6％的熱滅活小牛血清和青霉素-鏈霉素的RPMI1640(Invitrogen)中培養(yǎng)人U-2-OS骨肉瘤細(xì)胞系。按照現(xiàn)有技術(shù)的描述(Nylandstedetal.,2004)，產(chǎn)生Hsp70轉(zhuǎn)基因iMEF和適宜的對照iMEF并維持生長。所有細(xì)胞都在含有5％CO2的37℃加濕空氣氣氛下培養(yǎng)，反復(fù)測定并確定支原體陰性。除非另有說明，所有化學(xué)物質(zhì)都購自Sigma-Aldrich(Sigma-AldrichDenmarkA/S)。重組蛋白利用pET-16b載體系統(tǒng)(Novagen)產(chǎn)生重組Hsp70及其突變體，并根據(jù)廠商的方法進(jìn)行蛋白表達(dá)的誘導(dǎo)和隨后的Ni2+-親合-純化的優(yōu)化。根據(jù)廠商的方法(MolecularProbes)利用AlexaFluor488標(biāo)記rHsp70。重組蛋白和抗體的細(xì)胞攝取在補充有6％的熱滅活小牛血清和青霉素-鏈霉素的RPMI1640(Invitrogen)中培養(yǎng)亞匯合的細(xì)胞。將重組蛋白或網(wǎng)狀細(xì)胞裂解物直接加入到培養(yǎng)基中，達(dá)到最終濃度。然后在所述蛋白裂解物存在下使細(xì)胞再生長20小時。根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)，利用抗BMP抗體(LBPA)(6C4)荷載細(xì)胞。通過在rHsp70*存在下培養(yǎng)細(xì)胞20小時，然后收集細(xì)胞，在PBS中洗滌3次并計數(shù)，對內(nèi)吞的rHsp70*進(jìn)行量化。對于整個細(xì)胞攝取，使用了1*105個細(xì)胞。通過在100μL毛地黃皂苷-PBS(200μg/mL)中于冰上溫育30分鐘裂解細(xì)胞。在SpectramaxGemini酶標(biāo)儀(MolecularDevices)上測定熒光。對于輕膜部分(LMF)，總共收集了10*106個細(xì)胞，在PBS中洗滌3次并進(jìn)行Dounce-勻漿化，直到通過臺盼藍(lán)染色測定的膜裂解達(dá)到90％。然后，通過首先清除質(zhì)膜、細(xì)胞核和重膜部分使細(xì)胞進(jìn)行膜分級，之后通過在17000*g離心20分鐘收集LMF。然后將LMF分成兩份，保持第一份為“完整”LMF(“full”LMF)。為了從腔內(nèi)容物(luminalcontent)中分離膜，第二部分在液氮中凍融5個循環(huán)以裂解膜，然后在20000*g離心20分鐘。收集后，所有細(xì)胞操作都在最高4℃下進(jìn)行。溶酶體完整性和細(xì)胞存活率試驗在補充有3％FCS的Hanks平衡鹽溶液中洗滌、照射并分析利用2μg/ml吖啶橙在37℃溫育15分鐘的亞匯合U-2-OS細(xì)胞。以透射光模式從各個孔的8個預(yù)定區(qū)域選擇用于單細(xì)胞成像的細(xì)胞，之后立即可視化并暴露在來自安裝在U-ULS100HGhousing(Olympus)中的USH102100W汞弧燈(Ushioelectric)的藍(lán)光下20秒。在具有LCPlanF1×20物鏡(NA＝0,40)的OlympusIX-70倒置顯微鏡上進(jìn)行熒光顯微檢測。在倒置的OlympusIX-70熒光顯微鏡(FilterU-MWU330-385nm)下，通過用0.05μg/mlHoechst33342(MolecularProbes公司)對細(xì)胞染色來評價凋亡樣細(xì)胞死亡，并利用縮聚的細(xì)胞核對細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)。對于每次試驗，最少對八個隨機(jī)選擇的區(qū)域進(jìn)行計數(shù)。按照現(xiàn)有技術(shù)的描述67，通過3-(4,5-二甲基噻唑基-2-基)-2,5-二苯基四唑溴化物(MTT)還原試驗分析細(xì)胞存活率。利用2.5μMSYTOXGreen(MolecularProbes)在37℃對細(xì)胞染色10分鐘的流式細(xì)胞術(shù)對壞死細(xì)胞進(jìn)行定量，然后通過在流式細(xì)胞儀(FACSCaliburTM；BectonDickinson)的FL1通道中的熒光強(qiáng)度測定正染色的細(xì)胞。如所述的，用順鉑處理細(xì)胞，并通過洋地黃皂苷處理獲得胞質(zhì)部分，并測定胞質(zhì)半胱氨酸組織蛋白酶(zFRase)和類caspase-3(DEVDase)的活性。RNA干擾所使用的siRNA包括靶向編碼Hsp70的兩個基因(HSPA1A和HSPA1B)的一個siRNA：5'-GCCAUGACGAAAGACAACAAUCUGU-3'(Invitrogen)，以及之前描述的對照Hsp70siRNA。使用Oligofectamine(Invitrogen)作為轉(zhuǎn)染試劑。免疫檢測所使用的一抗包括針對Hsp70的小鼠單克隆抗體(2H9；由BorisMargulis,RussianAcademyofSciences,St.Petersburg,Russia惠贈)，針對3-磷酸甘油醛脫氫酶的小鼠單克隆抗體(GAPDH；Biogenesis)，針對BMP的小鼠單克隆抗體(6C4；(Kobayashietal.,1998))，針對LIMP-1的小鼠單克隆抗體(H5C6；由J.ThomasAugust和JamesE.K.Hildreth開發(fā)，并獲自在NICHD資助下開發(fā)的并由美國愛荷華市的愛荷華大學(xué)生物科學(xué)系維護(hù)的發(fā)育研究用雜交瘤庫)，針對cytc的小鼠單克隆抗體(克隆6H2.B4,BDPharMingen)，針對SERCA的小鼠單克隆抗體(IID8,Calbiochem)和針對golgin-97的小鼠單克隆抗體(CDF4,MolecularProbes)。利用所示的一抗、結(jié)合有過氧化物酶的適當(dāng)二抗和LuminescentImageReader(LAS-1000Plus,Fujifilm)對通過10％SDS-PAGE分離并轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上的蛋白進(jìn)行檢測。色氨酸熒光譜和脂質(zhì)體90°光散射利用由基本如之前所述的脂質(zhì)組成的LUV在HEPES緩沖液(20mMHEPES,0.1mMEDTA,所示pH為7.4或6.0)中分析色氨酸熒光譜(RFI)和脂質(zhì)體90°光散射(RSI)。對于RFI，將LUV加入到10μM試樣量中，并在20分鐘的穩(wěn)定期后記錄光譜。對于RSI，將重組蛋白加入到0.12nmol試樣量中。表面等離子共振(BIAcore)為了制備LUV，將由溶解在有機(jī)溶劑中的10mol％鞘磷脂、50mol％磷脂酰膽堿、20mol％膽固醇和20mol％BMP構(gòu)成的脂質(zhì)混合物在氬氣流下干燥，并在Tris/HCl緩沖液(pH7.4)中再水化(Kolzeretal.,2004)。將所述混合物在液氮中然后在37℃的孵箱中凍融9次。在超聲浴中持續(xù)15分鐘后，使混合物通過孔徑為100nm的聚碳酸酯膜21次。利用BIAcore2000系統(tǒng)在25℃進(jìn)行表面等離子共振測定。將包含于PBS(上樣緩沖液)中的LUV(總脂質(zhì)濃度為0.1mM)固定在L1傳感芯片(BIAcore)的表面。所使用的運行緩沖液為醋酸鈉緩沖液(50mM,pH4.5)。作為對照，向脂質(zhì)體表面直接注射aSMase(0.2μM，包含在60μl運行緩沖液中)。獲得4100RU–5250RU的響應(yīng)單位。以20μl/分鐘的流速將所示濃度的感興趣蛋白注射在運行緩沖液中。注射后，附加10分鐘的解離階段。分子模建利用從瑞士生物信息研究所的ExpertProteinAnalysisSystem(EXPaSy)蛋白組學(xué)服務(wù)器(http://expasy.org/)獲得的軟件進(jìn)行初級結(jié)構(gòu)分析和分子模建。利用DeepView-SwissPDBViewer在人Hsp70-ATPase結(jié)構(gòu)域(pdb碼：1S3X)和人Hsc70底物結(jié)合結(jié)構(gòu)域(pdb碼：7HSC)的晶體結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，進(jìn)行分子模建。使用介電常數(shù)為80(H2O)，使表面模型基于pH7.0的庫倫相互作用。統(tǒng)計學(xué)分析為了評價零假設(shè)，利用雙側(cè)成對Student'sT-檢驗進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。統(tǒng)計學(xué)顯著性的截斷水平設(shè)定為5％，并且利用F-檢驗對所有組數(shù)據(jù)的方差可比性進(jìn)行檢驗。所有統(tǒng)計都基于最小n＝3的獨立試驗。討論文獻(xiàn)已經(jīng)提供了Hsp70可能存在于腫瘤細(xì)胞的質(zhì)膜上和內(nèi)溶酶體系統(tǒng)中的證據(jù)。此外，還已知在不同的應(yīng)激誘導(dǎo)事件(最典型的是發(fā)燒、外傷和大量鍛煉，最吸引人的可能來自心理應(yīng)激)過程中，Hsp70可能被釋放于血液中，雖然該工作主要在免疫學(xué)領(lǐng)域中進(jìn)行。內(nèi)溶酶體區(qū)室內(nèi)存在的Hsp70-物質(zhì)(Hsp70-species)還描述了Hsp70家族的另一個成員——組成型表達(dá)的Hsc70。確實，Hsc70在該位置的功能是被稱為所謂伴侶分子介導(dǎo)的自噬的過程。然而，根據(jù)文獻(xiàn)，關(guān)于Hsp70與質(zhì)膜和內(nèi)溶酶體膜之間的結(jié)合的分子基礎(chǔ)一無所知，從而促使使本發(fā)明人形成了本方案。實施例1中提供的數(shù)據(jù)表明，Hsp70能夠在中性pH下與帶負(fù)電荷的膜脂質(zhì)，例如磷脂酰絲氨酸(PS)、心磷脂和二(單?；视?磷酸酯(BMP)相互作用。然而，在模擬了能夠預(yù)期的早期內(nèi)溶酶體系統(tǒng)(pH6.0)中的酸性后，相互作用譜發(fā)生巨變，并且Hsp70與BMP的親合力變?yōu)楸戎行詐H時高20倍，且?guī)缀醣萈S高9倍。這種Hsp70-BMP相互作用在較成熟的BIAcore系統(tǒng)中得到證實，在所述BIAcore系統(tǒng)中，pH目前被設(shè)定為作為多數(shù)細(xì)胞BMP的主要位點的晚期內(nèi)涵體和溶酶體(pH4.5)中的預(yù)期值。有趣的是，與Hsp70與BMP的親合力相比，已知的BMP相互作用蛋白——酸性鞘磷脂酶(aSMase，其作為依賴于BMP的輔因子)與BMP的親合力僅顯示為一半，這證明了Hsp70對BMP的相對高的親合力。其它人也報道了Hsp70與PS的相互作用，即小鼠Hsp70和酸性糖基神經(jīng)酰胺之間具有相互作用，其中，該相互作用依賴于N-末端ATPase結(jié)構(gòu)域，并且在某些情況下還依賴于肽結(jié)合結(jié)構(gòu)域(PBD)。然而，與本文采用的系統(tǒng)相反，這些研究結(jié)果是在基本上僅由一種脂質(zhì)(分別為90-100％和100％的純脂質(zhì))組成的系統(tǒng)中進(jìn)行的，而不可能類似于預(yù)期的真核細(xì)胞中的任何最低限度復(fù)雜的脂質(zhì)環(huán)境。然而，Haradaetal.所證明的Hsp70的N-末端區(qū)域?qū)λ嵝灾|(zhì)結(jié)合的重要性與本發(fā)明人的Hsp70與BMP的相互作用依賴于其N-末端ATPase結(jié)構(gòu)域的發(fā)現(xiàn)一致。本發(fā)明人進(jìn)一步證明，Hsp70的色氨酸90(W90)是至關(guān)重要的氨基酸，原因是該氨基酸的突變顯著降低了Hsp70-BMP相互作用。假想模型認(rèn)為，Hsp70在ATPase和肽結(jié)合結(jié)構(gòu)域(PBD)中均包含針對酸性糖脂的親水部分和疏水部分的特異結(jié)合位點。雖然該模型可能應(yīng)用于Hsp70與酸性糖脂的結(jié)合，但本發(fā)明人仍提出了Hsp70-BMP相互作用的另一個模型?；诒疚奶峁┑臄?shù)據(jù)：I)PBD僅能與BMP具有弱得多的相互作用；II)W90的重要性；III)ATPase結(jié)構(gòu)域的結(jié)合性質(zhì)；和IV)Hsp70的表面靜電勢的分子模建，本發(fā)明人提出Hsp70通過在ATPase裂隙底部帶正靜電荷的楔樣亞結(jié)構(gòu)域與BMP相互作用。然而，由于W90至苯丙氨酸的保守性突變顯著降低了Hsp70-BMP相互作用，而不影響Hsp70的折疊或ATPase活性，并且由于該單個氨基酸突變不改變靜電譜，所述兩個模型的中間體更適合解釋Hsp70和較常見的陰離子脂質(zhì)基序的相互作用是可能的。在此模型中，表面正電荷可能促進(jìn)靜電相互作用，并且尤其是諸如W90的殘基可能參與決定這種情況下的陰離子結(jié)合伴侶BMP的結(jié)合特異性。有趣的是，該研究潛在暗示Hsp70可作為細(xì)胞中較常見的脂質(zhì)靜電荷調(diào)節(jié)物。支持該論點的是證明細(xì)胞的脂質(zhì)膜可能作為諸如發(fā)燒和氧化應(yīng)激的應(yīng)激的初級感應(yīng)器(primarysensor)并由此作為應(yīng)激應(yīng)答的起始誘導(dǎo)物的數(shù)據(jù)。在面對應(yīng)激時，有人可能爭辯，細(xì)胞的脂質(zhì)膜是為保持穩(wěn)態(tài)或者為了觸發(fā)作為對細(xì)胞沖擊的應(yīng)答的特異信號事件而確實進(jìn)行修飾的至關(guān)重要的分隔。因此，Hsp70與諸如BMP的脂質(zhì)的結(jié)合和隨后溶酶體膜穩(wěn)定性的提高以及可能的其它細(xì)胞脂質(zhì)事件可能代表了一部分常規(guī)細(xì)胞應(yīng)激應(yīng)答。在癌的情況下，此種應(yīng)答可能被綁架以服務(wù)于癌癥本身，而且從更寬泛的進(jìn)化角度出發(fā)，在面臨細(xì)胞應(yīng)激時協(xié)作的蛋白-脂質(zhì)應(yīng)答可能是很好的解釋。本文提供的證明僅Hsp70而非Hsc70和Hsp70-2能夠直接保護(hù)溶酶體膜的數(shù)據(jù)認(rèn)為，潛在的脂質(zhì)應(yīng)激應(yīng)答可能特異地由主要的應(yīng)激誘導(dǎo)的Hsp70本身且非其它Hsp70-物質(zhì)調(diào)節(jié)。然而，如還證明的，Hsp70-2缺失也導(dǎo)致溶酶體膜通透化和細(xì)胞死亡，不過在Hsp70-2缺失的情況下通路是間接的，因為其依賴于LEDGF。然而，LEDGF如何影響溶酶體膜的機(jī)制并未解決。為了驗證體內(nèi)Hsp70-BMP相互作用的相關(guān)性，本發(fā)明人通過內(nèi)吞抗體和溶酶體Hsp70靶向BMP，其中所述溶酶體Hsp70是由另外的不能滲透細(xì)胞的源自AIF的多肽ADD70的內(nèi)吞作用實現(xiàn)的。這證明了Hsp70和BMP之間的相互作用用于穩(wěn)定溶酶體膜，原因是細(xì)胞隨后對直接溶酶體膜破裂性刺激物和LMP誘導(dǎo)的化療劑順鉑的作用明顯敏感(程序性細(xì)胞死亡作為該方案的一部分的特征)。之前已經(jīng)證明，ADD70的表達(dá)使癌細(xì)胞對多種死亡刺激物敏感，并在同系動物中降低大鼠結(jié)腸癌和小鼠黑色素瘤細(xì)胞的成瘤性。該方法與本文提供的方法間的主要區(qū)別在于本發(fā)明人通過ADD70的內(nèi)吞作用而特異性地靶向溶酶體Hsp70，而之前的研究為了靶向更多的胞質(zhì)Hsp70使用了ADD70的胞質(zhì)表達(dá)。靶向內(nèi)溶酶體Hsp70-BMP相互作用的成功還為通過內(nèi)吞作用靶向溶酶體組分以用于治療手段的思路提供了某種觀念的證據(jù)(proof-of-concept)，所述觀念可具有寬的治療性應(yīng)用，原因是能夠設(shè)想使例如癌細(xì)胞對通過特異性抑制Hsp70的溶酶體穩(wěn)定功能來誘導(dǎo)細(xì)胞死亡途徑的試劑敏感。反之亦然，Hsp70和BMP之間的相互作用可能提供了依賴于外源施用于諸如胰腺炎、運動神經(jīng)損傷和感官神經(jīng)損傷和光誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜損傷的身體損傷的Hsp70的溶酶體穩(wěn)定功能提供的細(xì)胞保護(hù)作用的新治療策略。確實，由于顯示基于促凋亡BH3相互作用結(jié)構(gòu)域死亡激動劑Bid的烴釘BH3螺旋的內(nèi)吞遞送可誘導(dǎo)白血病細(xì)胞死亡，已經(jīng)產(chǎn)生了利用內(nèi)吞機(jī)器引入特定細(xì)胞毒性化合物的觀念。該過程依賴于使內(nèi)吞區(qū)室完整并激活Bax和Bak的BH3螺旋，以誘導(dǎo)細(xì)胞色素c釋放并激活凋亡的線粒體程序，。然而，令人遺憾的是，在該論文中并沒有解決逃脫內(nèi)吞系統(tǒng)的機(jī)制。如本文所示，Hsp70與BMP相互作用依賴于Hsp70的ATPase。有趣的是，最近關(guān)于Hsp70輔伴侶分子——hsp70結(jié)合蛋白1(HspBP1)的報道可能強(qiáng)調(diào)了Hsp70的這個帶正電荷區(qū)域的重要性。與Hsp70的部分ATPase結(jié)構(gòu)域結(jié)合的HspBP1的晶體結(jié)構(gòu)的研究表明，這兩者之間的相互作用由包含四個犰狳樣重復(fù)(armadillo-likerepeat)的HspBP1中的彎曲的全部α-螺旋折疊介導(dǎo)。該彎曲折疊的凹面環(huán)繞ATPase結(jié)構(gòu)域的圓形凸出部II(lobeII)，所述圓形凸出部II是形成Hsp70的ATPase結(jié)構(gòu)域的大部分正靜電荷量的同一圓形凸出部，并且本發(fā)明人認(rèn)為其介導(dǎo)Hsp70和BMP之間的相互作用。另一項研究提供了對此的進(jìn)一步看法，其中，在所述研究中利用14種癌細(xì)胞系的相對Hsp70/HspBP1水平對這14種癌細(xì)胞系進(jìn)行了表征。該研究發(fā)現(xiàn)，HspBP1/Hsp70摩爾比高的細(xì)胞系比比例低的細(xì)胞系更易于受抗癌藥的影響，并且HspBP1的過量表達(dá)促進(jìn)了溶酶體膜的通透化?；谶@些報道以及該實施例中提供的數(shù)據(jù)，能夠認(rèn)為在模型中HspBP1通過結(jié)合至Hsp70的ATPase結(jié)構(gòu)域的帶正電荷區(qū)域擾亂了其與BMP的相互作用以及由此擾亂了其對內(nèi)溶酶體膜的穩(wěn)定作用，從而導(dǎo)致對LMP-誘導(dǎo)刺激物的敏感性提高。因此，HspBP1的犰狳重復(fù)結(jié)構(gòu)域可潛在形成智能藥物設(shè)計的基礎(chǔ)，ADD70即是如此。這種源自HspBP1的分子的功效在本文描述的系統(tǒng)中易于檢測，并提供了本文描述的分子機(jī)制的進(jìn)一步應(yīng)用的有意義的途徑。如本發(fā)明人在本文所證明的，Hsp70在pH4.5下以高親合力與BMP結(jié)合，甚至親合力幾乎比“經(jīng)典”BMP結(jié)合伴侶酸性鞘磷脂酶(aSMase)高2倍。有趣的是，由于BMP還具有鞘脂激活蛋白(SAPs/鞘脂激活蛋白)A-D輔因子的功能，因此BMP不僅作提供aSMase的鞘脂的酶促水解的刺激性輔因子，還作為多數(shù)膜結(jié)合鞘脂的酶促水解的刺激性輔因子。由此產(chǎn)生的明顯問題可能是，Hsp70是否通過其與BMP的結(jié)合設(shè)法改變aSMase和鞘脂激活蛋的結(jié)合性質(zhì)，由此改變膜鞘脂和糖鞘脂的代謝和下游效應(yīng)分子(例如神經(jīng)酰胺及其代謝物、神經(jīng)酰胺-1-磷酸酯、鞘氨醇和鞘氨醇-1-磷酸酯，所有均參與細(xì)胞存活和死亡)的產(chǎn)生。確實，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，Hsp70能夠調(diào)節(jié)aSMase與含BMP的脂質(zhì)體在pH4.5的結(jié)合，這取決于Hsp70的濃度?？梢钥闯觯蜐舛鹊腍sp70(3-150nM)有利于aSMase和BMP-Hsp70的相互作用，而高濃度的Hsp70(300-1500nM)的作用相反。雖然在加入用于內(nèi)吞的Hsp70時本發(fā)明在培養(yǎng)基中的工作濃度為300nM，但難以在該基礎(chǔ)上估測溶酶體內(nèi)濃度，并且關(guān)于Hsp70在體內(nèi)對aSMase活性的影響的任何結(jié)論都可能是純理論的。然而，用抗神經(jīng)酰胺的單克隆抗體對Hsp70-轉(zhuǎn)基因(Hsp70-TG)和野生型(WT)iMEF染色證明，Hsp70-轉(zhuǎn)基因小鼠顯示明顯的神經(jīng)酰胺上調(diào)，這種上調(diào)顯示于細(xì)胞輪廓和接近細(xì)胞核的輪廓的特征性的序列微珠譜圖(beads-on-a-stringpattern)。由于神經(jīng)酰胺的累積水平由iMEF-WT的平均10.2ng神經(jīng)酰胺/mg蛋白至Hsp70轉(zhuǎn)基因iMEF的14.9ng/mg，通過脂質(zhì)提取和隨后的脂質(zhì)質(zhì)譜對iMEF的神經(jīng)酰胺譜的進(jìn)一步分析印證了這些發(fā)現(xiàn)。由于本發(fā)明人還表征了荷載rHsp70的U-2-OS細(xì)胞的譜(即300nMrHsp70的完全培養(yǎng)基24小時，類似于本文提供的所有其它Hsp70內(nèi)吞試驗)，本發(fā)明人進(jìn)一步證明，這種作用可歸功于Hsp70的作用。荷載Hsp70的U-2-OS細(xì)胞中神經(jīng)酰胺的定量表明了神經(jīng)酰胺的累積水平由對照細(xì)胞的2.99ng神經(jīng)酰胺/mg蛋白提高至荷載Hsp70細(xì)胞的5.10ng/mg(該實驗在寫作時僅作一次)。然而，雖然還需要進(jìn)一步的驗證，但總體來說這些都支持Hsp70在調(diào)節(jié)細(xì)胞中神經(jīng)酰胺水平的作用。然而，如果這些數(shù)據(jù)得到證明，則產(chǎn)生了一系列的問題，例如神經(jīng)酰胺物質(zhì)的區(qū)分、特定神經(jīng)酰胺物質(zhì)的定量(至少有50種不同的分子種類)、面臨各種應(yīng)激時的神經(jīng)酰胺水平譜圖和細(xì)胞的轉(zhuǎn)化態(tài)等。有趣的是，之前的研究已經(jīng)解決了這些問題中的一個，其證明熱休克(42.5℃持續(xù)2小時)引起神經(jīng)酰胺在Molt-4急性白血病淋巴細(xì)胞中的集聚。這種集聚可被藥物抑制劑伏馬毒素B1(FumonisinB1)和多球殼菌素(myriocin)阻斷，伏馬毒素B1被認(rèn)為是神經(jīng)酰胺體內(nèi)合成途徑的特定抑制劑并且其阻斷了絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶的作用，而絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶啟動體內(nèi)由絲氨酸和棕櫚酰-CoA合成新鞘脂。已經(jīng)在酵母中闡明了神經(jīng)酰胺體內(nèi)合成的這種提高的部分機(jī)制，其中，在酵母中熱應(yīng)激誘導(dǎo)絲氨酸向ER的急速流入，由此促進(jìn)體內(nèi)合成。這些藥物抑制劑是否可以調(diào)節(jié)在rHsp70內(nèi)吞后觀察到的神經(jīng)酰胺水平的提高或者觀察到的提高是否源于鞘脂降解的代謝途徑和Hsp70與BMP結(jié)合對其的刺激，這種驗證是有趣的。當(dāng)然，還可能假設(shè)化合物模型。在該模型中，初始熱應(yīng)激可能導(dǎo)致膜流化，絲氨酸流動和體內(nèi)鞘脂合成的快速啟動。因此，作為熱應(yīng)激的后果，Hsp70的誘導(dǎo)可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Hsp70水平的提高、Hsp70與BMP的相互作用、aSMase活性和可能的SAP活性的提高，而SAP活性的提高可通過代謝途徑產(chǎn)生神經(jīng)酰胺。這種二級應(yīng)答可能補充初始從頭誘導(dǎo)或者可能接過初始從頭誘導(dǎo)，因為連續(xù)的從頭應(yīng)答將依賴于絲氨酸和棕櫚酰-CoA的連續(xù)供應(yīng)。然而，還需要測定細(xì)胞保護(hù)是否是神經(jīng)酰胺本身增加的結(jié)果，或者可能是由于其上游和下游代謝物水平的改變造成的。從這點看，許多主要問題仍需解答：Hsp70如何在細(xì)胞外環(huán)境和內(nèi)溶酶體區(qū)室內(nèi)終結(jié)？Hsp70是被分泌并然后通過內(nèi)吞攝?。窟€是Hsp70存在于溶酶體內(nèi)或者更專門的分泌溶酶體內(nèi)，等待應(yīng)激形式的釋放信號？并且，可能更重要的是，細(xì)胞外環(huán)境中存在的Hsp70的生物意義是什么？雖然本發(fā)明的工作不能解答這些復(fù)雜的問題，但能夠作出一些推理。首先，Hsp70可能在本課題中所檢測的所有細(xì)胞系中被內(nèi)吞，認(rèn)為這是識別細(xì)胞外Hsp70(eHsp70)的一般途徑。這與證明eHsp70能夠與不同白細(xì)胞亞群上的多種受體結(jié)合的數(shù)據(jù)一致。參與細(xì)胞外Hsp70(eHsp70)識別的受體主要包括模式識別受體(PPP)并由來自不同受體家族(例如toll樣受體(TLR)、清道夫受體和C型凝聚素)的多種受體構(gòu)成。由于本課題的工作并沒有解決Hsp70被內(nèi)吞的初始機(jī)制(受體介導(dǎo)、依賴于筏、依賴于網(wǎng)格蛋白)，在本發(fā)明的系統(tǒng)中不能確定PPP是否負(fù)責(zé)eHsp70的內(nèi)吞。然而，10倍過量的無標(biāo)記Hsp70不能與U-2-OS細(xì)胞或iMEF攝取的標(biāo)記有AF488的Hsp70競爭，相反，在過量無標(biāo)記Hsp70存在下內(nèi)吞被顯著增強(qiáng)，這在一定程度反駁了攝取的可飽和機(jī)制。免疫學(xué)領(lǐng)域主要焦點在于由eHsp70與PRRs的結(jié)合引發(fā)的細(xì)胞因子應(yīng)答和先天免疫防御的激活，并且因此對受體結(jié)合和信號傳導(dǎo)開始后eHsp70的作用沒有太多關(guān)心。雖然關(guān)于仍然缺乏這些驚人機(jī)制的令人滿意的分子解釋，但本文一定程度上解決了Hsp70向細(xì)胞外環(huán)境釋放和Hsp70的作用的機(jī)制。不過，存在大量關(guān)于Hsp70在應(yīng)激后存在于循環(huán)系統(tǒng)中的證據(jù)，并且大量數(shù)據(jù)支持了eHsp70(無論是應(yīng)激誘導(dǎo)的還是外源遞送的)在神經(jīng)保護(hù)和準(zhǔn)備初級免疫防御系統(tǒng)中的作用。關(guān)于Hsp70的釋放，第一個關(guān)于Hsp70從一個細(xì)胞轉(zhuǎn)移至另一個細(xì)胞的證據(jù)來自烏賊巨大神經(jīng)索中的研究，并且在所培養(yǎng)的大鼠胚胎細(xì)胞中重現(xiàn)這些結(jié)果時，出現(xiàn)了胞吐的非典型途徑可能負(fù)責(zé)Hsp70的釋放的證據(jù)。已經(jīng)提出，Hsp70和其它熱休克蛋白僅在病理條件下釋放，引起壞死性死亡，而不在程序性細(xì)胞死亡過程中釋放。然而，最近的研究表明，Hsp70可以由主動機(jī)制從完整細(xì)胞釋放，并且刺激程度決定釋放的模式。重要的是，雖然在身體鍛煉時可在外周血中檢測到eHsp70的大量增加，但已知研究沒有eHsp70和肌肉損傷標(biāo)記物之間的直接相互關(guān)系的報道。最令人信服的并且可能也是最誘人的是，發(fā)現(xiàn)諸如掠食性恐懼和電擊的心里應(yīng)激能夠引發(fā)應(yīng)激誘導(dǎo)的eHsp70釋放(這被認(rèn)為是一個依賴于兒茶酚胺信號過程)。由于兒茶酚胺α1-腎上腺素受體可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣流通，并且鈣流通可引起外來體、多泡體和溶酶體的胞吐，因此這尤其有趣。因此，在應(yīng)激時間內(nèi)，作用于α1-腎上腺素受體的去甲腎上腺素的增加可能導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的鈣流通，隨后為Hsp70向外來體內(nèi)的釋放。該假說的證據(jù)來自eHsp70可由外來體特征的小泡釋放的實證，但還存在在細(xì)胞系統(tǒng)和體內(nèi)eHsp70可作為游離eHsp70釋放的證據(jù)。雖然這還存在爭議，但還證明了eHsp70的釋放需要脂質(zhì)筏。此外，已經(jīng)證明功能溶酶體區(qū)室是eHsp70釋放必須的，并且這種釋放伴隨著溶酶體標(biāo)記物蛋白在細(xì)胞表面的存在，提示這是依賴于質(zhì)膜和溶酶體膜融合的分泌。不管所釋放的Hsp70是否存在于外來體中或作為游離eHsp70，有趣的是，注意到一些類型的分泌MVB/晚期內(nèi)涵體/溶酶體區(qū)室明顯地參與到所有釋放方式中。在這些數(shù)據(jù)和本文獲得的結(jié)果的基礎(chǔ)上，可以形成Hsp70如何從胞質(zhì)逃至細(xì)胞外環(huán)境的更復(fù)雜的假說。Hsp70的釋放仍依賴于細(xì)胞內(nèi)鈣的增加，原因是這可作為內(nèi)溶酶體胞吐的信號。然而，如本文所述，由于Hsp70將大量集聚在晚期內(nèi)涵體/MVB/溶酶體的含有BMP的內(nèi)膜中，Hsp70在該區(qū)室內(nèi)的存在將依賴于Hsp70和BMP相互作用。由于如本文所述，或者通過早期和晚期內(nèi)涵體和溶酶體的周界膜的內(nèi)陷，從細(xì)胞外攝取(例如內(nèi)吞)的Hsp70可到達(dá)晚期內(nèi)涵體和溶酶體中，從而使細(xì)胞內(nèi)的Hsp70和BMP接近。所述區(qū)室的酸性將維持使Hsp70定位至含BMP膜的強(qiáng)的偏好。胞吐后，一些Hsp70仍與含BMP的外來體結(jié)合，但在細(xì)胞外環(huán)境中遇到的中性pH將使此時的Hsp70-BMP平衡明顯地向更多的未結(jié)合Hsp70的方向偏移，產(chǎn)生游離和與外來體結(jié)合的Hsp70，然后這些Hsp70可發(fā)揮細(xì)胞外功能?？傊?，本文提供的數(shù)據(jù)表明，Hsp70與內(nèi)溶酶體陰離子磷脂BMP直接且pH依賴性地相互作用。本發(fā)明人證明，Hsp70與BMP的結(jié)合由包含色氨酸90的Hsp70ATPase結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)，并且這種相互作用可能通過影響其它BMP結(jié)合蛋白的活性而引起內(nèi)溶酶體膜的穩(wěn)定。本發(fā)明人還證明，該分子機(jī)制的闡明開啟了用于使癌細(xì)胞對通過特異抑制Hsp70的溶酶體穩(wěn)定功能而誘導(dǎo)溶酶體細(xì)胞死亡途徑的試劑敏感的驚人的新可能。反之亦然，Hsp70和BMP之間的相互作用可能提供了依賴于外源施用的Hsp70的溶酶體穩(wěn)定功能產(chǎn)生的細(xì)胞保護(hù)作用的新治療策略。實施例2：Hsp70和二(單?；视?磷酸酯之間的相互作用激活了酸性鞘磷脂酶，穩(wěn)定了溶酶體膜并促進(jìn)了細(xì)胞存活熱休克蛋白70(Hsp70)是在進(jìn)化上高度保守的分子伴侶，其通過抑制溶酶體膜通透化(應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡的特點)而促進(jìn)受應(yīng)激的細(xì)胞的存活。該作用的分子機(jī)制的線索可能在于最近報道的應(yīng)激相關(guān)和癌癥相關(guān)的少部分Hsp70至溶酶體區(qū)室的轉(zhuǎn)移。在此，本發(fā)明人證明Hsp70通過增強(qiáng)酸性鞘磷脂酶(ASM，將鞘磷脂水解成神經(jīng)酰胺和磷酸膽堿的溶酶體酯酶)而穩(wěn)定溶酶體。在酸性環(huán)境中，Hsp70以高親合性和高特異性與內(nèi)溶酶體陰離子磷脂二(單?；视?磷酸酯(BMP，ASM的主要輔因子)結(jié)合，由此促進(jìn)ASM與BMP的結(jié)合并刺激ASM活性。BMP抗體或Hsp70中的點突變(W90A)對Hsp70-BMP相互作用的抑制以及地昔帕明對ASM活性的抑制有效地逆轉(zhuǎn)了Hsp70介導(dǎo)的溶酶體穩(wěn)定作用。顯著地，A型尼曼-皮克病(NPDA，由ASM基因的突變引起的嚴(yán)重的溶酶體貯積癥)患者細(xì)胞中ASM活性的降低還與溶酶體穩(wěn)定性的大幅降低有關(guān)，并且可通過用重組Hsp70或ASM處理來恢復(fù)溶酶體ASM活性而有效地糾正這種表型?？傊@些數(shù)據(jù)開啟了利用通過內(nèi)吞遞送途徑進(jìn)入溶酶體腔的非細(xì)胞滲透性化合物治療溶酶體貯積癥和癌癥的驚人可能。溶酶體蛋白酶，即組織蛋白酶，是由多種應(yīng)激誘導(dǎo)的進(jìn)化保守性細(xì)胞死亡程序中的重要因子。組織蛋白酶依賴性細(xì)胞死亡的特征在于早期溶酶體膜通透化和隨后組織蛋白酶向胞質(zhì)的轉(zhuǎn)移，組織蛋白酶在此能夠啟動caspase依賴性和caspase非依賴性細(xì)胞死亡途徑。為了測定溶酶體定位是否對所報道的Hsp70穩(wěn)定溶酶體膜并保護(hù)細(xì)胞免受細(xì)胞應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡的能力至關(guān)重要，本發(fā)明人利用細(xì)胞內(nèi)吞機(jī)器以使重組Hsp70(rHsp70)靶向至溶酶體內(nèi)。用標(biāo)記有熒光團(tuán)的rHsp70溫育的U-2-OS骨肉瘤細(xì)胞的免疫細(xì)胞化學(xué)和生物化學(xué)分析表明了rHsp70的有效攝取，其與晚期內(nèi)涵體標(biāo)記物和溶酶體標(biāo)記物的共定位以及與溶酶體膜的結(jié)合(圖5a、b和圖9)。通過利用實時成像監(jiān)測溶酶體膜的完整性(圖5c)，本發(fā)明人證明內(nèi)吞的rHsp70保護(hù)溶酶體免受光致氧化(圖5d)。此外，特異于Hsp70的小干擾RNA(siRNA)使溶酶體對光致氧化敏感，并且通過內(nèi)吞rHsp70完全逆轉(zhuǎn)了這種作用，這證明內(nèi)源性Hsp70的保護(hù)作用是由溶酶體腔內(nèi)的小部分蛋白介導(dǎo)的(圖5e)。盡管攝取類似(數(shù)據(jù)未顯示)，但是重組Hsc70和Hsp70-2(其與Hsp70分別具有86％和84％的氨基酸序列同源性)沒有觀察到溶酶體定位。Hsp70在溶酶體膜中的存在以及其在產(chǎn)生水解作用的溶酶體環(huán)境中存活，這提示其與溶酶體膜脂質(zhì)結(jié)合。因此，本發(fā)明人研究了Hsp70與包含多種膜相關(guān)陰離子脂質(zhì)，即棕櫚?；?油?；?磷脂酰絲氨酸(POPS；主要存在于質(zhì)膜中)、心磷脂(主要存在于線粒體中)和BMP(主要存在于晚期內(nèi)涵體和溶酶體中))的棕櫚?；?油酰基-磷脂酰膽堿(POPC)大單層囊泡(LUV)的相互作用。考慮到內(nèi)溶酶體區(qū)室在成熟為溶酶體后環(huán)境酸性的提高，本發(fā)明人對中性(pH7.4)和酸性(pH6.0)條件下的蛋白-脂質(zhì)相互作用進(jìn)行了比較。在pH7.4時，rHsp70引起POPC溶酶體中90°光散射的小的相對變化，表明非常弱地結(jié)合。如之前關(guān)于POPS的報道，不論脂質(zhì)體表面的電荷密度(從-1至-2)，所有帶負(fù)電荷的脂質(zhì)都使rHsp70與溶酶體在中性pH下的結(jié)合增強(qiáng)了約4倍，(圖6a)。顯著地，與中性pH相比，在酸性pH下與BMP的結(jié)合增強(qiáng)幾乎20倍，而與POPS的結(jié)合在酸化后僅略有提高(圖6a)。Hsp70與BMP在酸性pH下的高親合性在一組獨立的BIAcore實驗中得到驗證(圖6e和圖7a)。重要的是，通過內(nèi)吞作用遞送至內(nèi)溶酶體區(qū)室的BMP抗體有效抑制了rHsp70在活細(xì)胞中穩(wěn)定溶酶體的能力(圖6b)，并使細(xì)胞對誘導(dǎo)溶酶體泄漏的抗癌藥順鉑敏感(圖6c)。為了研究Hsp70的哪部分負(fù)責(zé)結(jié)合BMP，本發(fā)明人測定了rHsp70色氨酸及其突變體在?？吭诤珺MP的脂質(zhì)體中后色氨酸的熒光轉(zhuǎn)移。缺乏氨基末端ATPase結(jié)構(gòu)域(rHsp70-ΔATP)內(nèi)的第119-426氨基酸的Hsp70突變體喪失相對峰熒光強(qiáng)度信號，而缺乏羧基末肽結(jié)合結(jié)構(gòu)域(rHsp70-ΔPBD)中的第437-617氨基酸的突變體則沒有喪失相對峰熒光強(qiáng)度信號，這表明Hsp70與BMP的高親合力結(jié)合需要ATPase結(jié)構(gòu)域(圖6d)。接著，本發(fā)明人用苯丙氨酸取代Hsp70中的兩個色氨酸(W90F和W580F)并研究了哪個色氨酸負(fù)責(zé)脂質(zhì)結(jié)合誘導(dǎo)的熒光轉(zhuǎn)移。僅rHsp70-W90F的信號具有減少表明，所述蛋白的NH2-末端?？吭谥|(zhì)層中(圖6d)。對BMP-rHsp70相互作用的更量化的BIAcore分析證明，Hsp70主要通過其ATPase結(jié)構(gòu)域與BMP相互作用(圖6e)。令人吃驚的是，W90F突變特異性地消除了rHsp70與BMP之間的相互作用，同時保留了Hsp70分子伴侶的結(jié)構(gòu)(通過遠(yuǎn)UV圓二色性和近UV圓二色性分析的折疊)和功能(熒光酶折疊和ATP水解)方面(圖6e以及未顯示的數(shù)據(jù))。因此，rHsp70-W90F突變體意外地為本發(fā)明人提供了用于進(jìn)一步測定Hsp70和BMP之間的直接相互作用是否使Hsp70具有溶酶體保護(hù)性質(zhì)的無價工具。確實，rHsp70-W90F突變體完全喪失了其保護(hù)溶酶體膜免受光致氧化和保護(hù)細(xì)胞免受順鉑誘導(dǎo)的溶酶體細(xì)胞死亡的能力，而rHsp70-W580F突變體顯示與野生型蛋白相同的功效。重要的是，突變Hsp70蛋白的內(nèi)吞效果與野生型Hsp70基本相同(數(shù)據(jù)未顯示)。因此，本發(fā)明人得出結(jié)論，Hsp70與BMP的結(jié)合對于Hsp70的溶酶體穩(wěn)定作用至關(guān)重要。由于內(nèi)吞小泡中BMP的濃度隨內(nèi)涵體成熟以形成溶酶體而提高，所以pH調(diào)節(jié)可能是使Hsp70靶向至溶酶體的方式。計算(PROTPARAM，EXPaSy蛋白質(zhì)組學(xué)服務(wù)器，瑞士生物信息研究所)表明，Hsp70的ATPase結(jié)構(gòu)域的理論pI比肽結(jié)合結(jié)構(gòu)域高1.72個單位(6.62與4.9)。該特征表明，在酸性pH時，ATPase結(jié)構(gòu)域優(yōu)選帶正電荷，這可能有利于其與陰離子脂質(zhì)的相互作用。本發(fā)明人的證明Hsp70-BMP相互作用對酸性pH和ATPase結(jié)構(gòu)域的依賴性的數(shù)據(jù)支持了該理論。此外，Hsp70的ATPase結(jié)構(gòu)域的靜電表面的分子模建表明，Hsp70的ATPase結(jié)構(gòu)域形成接近楔樣的結(jié)構(gòu)，并且在包含W90的楔的底部具有大量正電荷，這可能解釋了W90F突變對Hsp70的與BMP相互作用并穩(wěn)定溶酶體的能力產(chǎn)生的深刻影響。BMP以高親合力與ASM結(jié)合，并刺激其將鞘磷脂水解成神經(jīng)酰胺飽和磷酸膽堿的能力。BIAcore分析表明，用亞-等摩爾(sub-equimolar)濃度的rHsp70預(yù)處理含BMP的LUV有利于ASM的隨后結(jié)合，而較高的rHsp70濃度則顯示抑制作用(圖7a和10)。顯著的是，具有免受應(yīng)激誘導(dǎo)的溶酶體損傷的保護(hù)的Hsp70轉(zhuǎn)基因鼠胚胎成纖維細(xì)胞(Hsp70-MEF)(圖7e)顯示了比野生型MEF(WT-MEF)顯著高的ASM活性，并且用細(xì)胞保護(hù)濃度(300nM)的rHsp70處理WT-MEF將ASM的活性提高至與Hsp70-MEF相當(dāng)?shù)乃?圖7b)。為了測定ASM是否負(fù)責(zé)溶酶體穩(wěn)定作用，本發(fā)明人用被完全表征的藥理學(xué)ASM抑制劑地昔帕明處理細(xì)胞。地昔帕明以劑量依賴方式降低了MEF的存活性，并且細(xì)胞死亡與由溶酶體組織蛋白酶向胞質(zhì)中的泄漏證明的大量溶酶體通透化有關(guān)(圖7c和d)。顯著的是，與WT-MEF相比，在Hsp70-MEF中地昔帕明-誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡和溶酶體泄漏被顯著降低。此外，如在光致氧化后加速了溶酶體膜完整性的喪失所證明的，用亞毒性濃度的地昔帕明抑制ASM將Hsp70-MEF的溶酶體應(yīng)激抗性逆轉(zhuǎn)至WT-MEF的水平。證明NPDA(由ASM基因突變引起的致命的溶酶體貯積癥)患者成纖維細(xì)胞中的溶酶體顯示對光致氧化誘導(dǎo)的損傷的敏感性的數(shù)據(jù)進(jìn)一步支持了ASM的溶酶體保護(hù)作用(圖8a)。顯著地，rHsp70還能夠增強(qiáng)患者細(xì)胞中內(nèi)源性突變ASM和同時荷載的rASM的酶促活性。通過使溶酶體荷載rHsp70、rASM或前述兩者的組合獲得的ASM活性的提高與其在NPDA細(xì)胞中穩(wěn)定溶酶體和使大幅擴(kuò)大的溶酶體區(qū)室的體積規(guī)格化的能力有關(guān)(圖8b-d)。應(yīng)該注意，類似于rHsp70，rASM也位于溶酶體中(圖8b)。本發(fā)明的全部數(shù)據(jù)表明，Hsp70-BMP相互作用通過包括鞘磷脂代謝的調(diào)節(jié)而非膜的直接物理穩(wěn)定化的機(jī)制穩(wěn)定溶酶體。BMP全部位于內(nèi)溶酶體區(qū)室的內(nèi)膜中(在此，其主要功能是支持ASM和鞘脂激活因子蛋白對脂質(zhì)小泡的分裂和從脂質(zhì)小泡提取脂質(zhì))的事實支持了此種間接作用。有趣的是，ASM介導(dǎo)的溶酶體神經(jīng)酰胺濃度的增加修飾了溶酶體膜的立體構(gòu)象并由此促進(jìn)了其與其它細(xì)胞內(nèi)小泡和質(zhì)膜的融合。因此，溶酶體膜組成和體積的改變(作為神經(jīng)酰胺誘導(dǎo)的增強(qiáng)的融合能力的結(jié)果)可有助于Hsp70介導(dǎo)的溶酶體穩(wěn)定性的提高。另一方面，多種凋亡刺激物誘導(dǎo)ASM向質(zhì)膜外小葉轉(zhuǎn)位，在此，神經(jīng)酰胺可以形成功能是作為凋亡信號傳導(dǎo)中涉及的膜相關(guān)信號分子的激活位點的脂質(zhì)微結(jié)構(gòu)域。因此，神經(jīng)酰胺可以對細(xì)胞存活產(chǎn)生相反作用，這取決于神經(jīng)酰胺產(chǎn)生于溶酶體內(nèi)部或者質(zhì)膜上。上述潛藏在Hsp70的細(xì)胞保護(hù)作用之下的分子機(jī)制開啟了用于使癌細(xì)胞對通過特異抑制Hsp70的溶酶體穩(wěn)定功能而誘導(dǎo)溶酶體細(xì)胞死亡途徑的試劑敏感的令人興奮的新可能。反之亦然，外源單獨施用rHsp70或與rASM組合施用都可直接作為NPD患者的新療法，其中，目前用于所述NPD患者的治療選擇限于基因治療和干細(xì)胞治療。方法概述根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)的描述產(chǎn)生了WT-MEF和Hsp70-MEF，對其進(jìn)行永生化并保持。人NPDA成纖維細(xì)胞(83/24)起源自患有肝脾大的5月齡患者的皮膚活檢。利用pET-16b載體系統(tǒng)和Ni2+-親合-純化(Novagen)產(chǎn)生重組蛋白，并根據(jù)廠商的說明用AlexaFluor488(MolecularProbes)標(biāo)記。為了分析溶酶體的完整性，本發(fā)明人形成了用吖啶橙(在細(xì)胞的酸性區(qū)室中集聚的因光異色的弱堿)染色的細(xì)胞實時成像方法，將所述細(xì)胞染成紅色并使其對光致氧化敏感。通過ZeissLSMDUO軟件，成纖維細(xì)胞中光致氧化誘導(dǎo)的溶酶體pH梯度的喪失和吖啶橙自單個溶酶體向胞質(zhì)中的泄漏被可視地量化為U2-O-S細(xì)胞中“紅點的消失”和紅色的減少以及綠色熒光的增加。按照現(xiàn)有技術(shù)的描述，利用zFR-AFC(EnzymeSystemProducts)探針在地高辛處理的樣本中測定總的組織蛋白酶活性和胞質(zhì)的(地高辛提取的)組織蛋白酶活性?；景凑宅F(xiàn)有技術(shù)的描述，在HEPES緩沖液(20mMHEPES,0.1mMEDTA,所示pH)中分析色氨酸熒光譜(RFI)和脂質(zhì)體90°光散射(RSI)。按照現(xiàn)有技術(shù)的描述，通過BIAcore2000利用固定化的LUV進(jìn)行表面等離子共振。利用Oligofectamine(Invitrogen)轉(zhuǎn)染Hsp70siRNA(5'-GCCAUGACGAAAGACAACAAUCUGU-3')和對照Hsp70siRNA。利用標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行免疫檢測。基本按照現(xiàn)有技術(shù)分析凋亡樣細(xì)胞死亡和溶酶體膜通透化。通過經(jīng)現(xiàn)有技術(shù)描述修飾的MolecularProbes的AmplexRedSphingomyelinaseAssayKit(A12220)分析ASM活性。利用雙側(cè)成對學(xué)生T檢驗進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，并且利用F-檢驗檢驗所有數(shù)據(jù)組的所有方差的可比性。方法細(xì)胞培養(yǎng)和試劑在補充有6％的熱滅活小牛血清和青霉素-鏈霉素的RPMI1640(Invitrogen)中培養(yǎng)人U-2-OS骨肉瘤細(xì)胞系。按照現(xiàn)有技術(shù)的描述，產(chǎn)生Hsp70轉(zhuǎn)基因iMEF和適當(dāng)?shù)膶φ読MEF，并維持。人原代NPDA成纖維細(xì)胞生長在進(jìn)一步補充有1％丙酮酸鈉、1％HEPES、1％L-谷氨酰胺的MEF培養(yǎng)基中。所有細(xì)胞都在含有5％CO2的37℃加濕空氣氣氛下培養(yǎng)，反復(fù)測定并確定支原體陰性。除非另有說明，所有化學(xué)物質(zhì)都購自Sigma-Aldrich(Sigma-AldrichDenmarkA/S)。溶酶體完整性的測定在補充有3％胎牛血清的Hanks平衡鹽溶液中洗滌、照射并分析利用2μg/ml吖啶橙在37℃溫育15分鐘的亞匯合細(xì)胞。以透射光模式從各個孔的8個預(yù)定區(qū)域選擇用于單細(xì)胞成像的細(xì)胞，之后立即可視化并暴露在來自安裝在U-ULS100HGhousing(Olympus)中的USH102100W汞弧燈(Ushioelectric)的藍(lán)光下20秒。在具有LCPlanF1x20物鏡(NA＝0,40)的OlympusIX-70倒置顯微鏡上進(jìn)行熒光顯微檢測。通過計數(shù)強(qiáng)的紅色染色的損失而對溶酶體pH梯度的損失進(jìn)行定量。研發(fā)了用于檢測溶酶體完整性的更成熟的方法以處理該研究使用的各種成纖維細(xì)胞的較大的溶酶體區(qū)室。以透射光模式從各個孔的8個預(yù)定區(qū)域選擇用于單細(xì)胞成像的細(xì)胞，之后使同樣的細(xì)胞立即并持續(xù)暴露在來自100mW二極管激光的489nm光下，同時在ZeissLSMLIVEDUO共聚焦系統(tǒng)上每隔330ms在由用于495-555nm(綠色)和LP650nm(紅色)光的帶通濾波器限定的兩個通道中捕獲激光掃描顯微照片。隨后通過完整的ZeissLSMDUO軟件分析所產(chǎn)生的延時電影(timelapsemovie)。按照現(xiàn)有技術(shù)的描述，利用zFR-AFC(EnzymeSystemProducts)探針在地高辛處理的樣本中測定總的組織蛋白酶活性和胞質(zhì)的(地高辛提取的)組織蛋白酶活性。細(xì)胞存活率試驗通過基本按照現(xiàn)有技術(shù)的描述，通過3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑溴化物(MTT)還原試驗分析細(xì)胞密度。通過利用0.05μg/mlHoechst33342(MolecularProbes)對細(xì)胞染色并在倒置的OlympusIX-70熒光顯微鏡(FilterU-MWU330-385nm)下對具有縮聚細(xì)胞核的細(xì)胞計數(shù)來評價凋亡樣細(xì)胞死亡。對于各個試驗，對最小八個隨機(jī)選取的區(qū)域進(jìn)行計數(shù)。免疫檢測和顯微鏡方法所使用的一抗包括針對Hsp70的小鼠單克隆抗體(2H9；由BorisMargulis,RussianAcademyofSciences,St.Petersburg,Russia惠贈)，針對3-磷酸甘油醛脫氫酶的小鼠單克隆抗體(GAPDH；Biogenesis)，針對BMP的小鼠單克隆抗體(6C4)，針對溶酶體膜內(nèi)在蛋白-1的小鼠單克隆抗體(H5C6；由J.ThomasAugust和JamesE.K.Hildreth開發(fā)，并獲自在NICHD資助下開發(fā)的并由美國愛荷華市的愛荷華大學(xué)生物科學(xué)系維護(hù)的發(fā)育研究雜交瘤庫)。利用所示的一抗、來自Dako,ECLWesternblottingreagents(Amersham)的結(jié)合有過氧化物酶的適當(dāng)二抗和LuminescentImageReader(LAS-1000Plus,Fujifilm)對通過10％SDS-PAGE分離并轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上的蛋白進(jìn)行檢測。使用了結(jié)合有Alexa-576的二抗或結(jié)合有Alexa488的二抗用于免疫細(xì)胞化學(xué)。使用(Lysotracker)用于溶酶體區(qū)室的生動可視化。利用ZeissAxiovert100M激光掃描顯微鏡拍攝熒光圖片。在ZeissLSMLIVEDUO系統(tǒng)上進(jìn)行溶酶體完整性的溶酶體熒光探針(Lysotracker)定量和延時攝影。色氨酸熒光譜和脂質(zhì)體90°光散射利用由基本如之前所述的脂質(zhì)組成的LUV在HEPES緩沖液(20mMHEPES,0.1mMEDTA,所示的pH7.4或6.0)中分析色氨酸熒光譜(RFI)和脂質(zhì)體90°光散射(RSI)。對于RFI，將LUV加入到10μM試樣量中，并在20分鐘的穩(wěn)定期后記錄光譜。對于RSI，將重組蛋白加入到0.12nmol試樣量中。表面等離子共振(BIAcore)為了制備LUV，將由溶解在有機(jī)溶劑中的10mol％鞘磷脂、50mol％卵磷脂、20mol％膽固醇和20mol％BMP構(gòu)成的脂質(zhì)混合物在氬氣流下干燥，并在Tris/HCl緩沖液(pH7.4)中再水化。將所述混合物在液氮中然后在37℃的孵箱中凍融9次。在超聲浴中持續(xù)15分鐘后，使混合物通過孔徑為100nm的聚碳酸酯膜21次。利用BIAcore2000系統(tǒng)在25℃進(jìn)行表面等離子共振測定。將包含PBS(上樣緩沖液)中的LUV(總脂質(zhì)濃度為0.1mM)固定在L1傳感芯片(BIAcore)的表面。所使用的運行緩沖液為醋酸鈉緩沖液(50mM,pH4.5)。作為對照，向脂質(zhì)體表面直接注射酸性磷脂酶(0.2μM，包含在60μl運行緩沖液中)。獲得4100RU–5250RU的響應(yīng)單位。以20μl/分鐘的流速將所示濃度的感興趣蛋白注射在運行緩沖液中。注射后，附加10分鐘的解離階段。在rASM跟隨rHsp70的情況下，在10分鐘的rHsp70-解離階段后，加入rASM180秒鐘，之后仍為10分鐘的解離階段。分子模建利用從瑞士生物信息研究所的ExpertProteinAnalysisSystem(EXPaSy)蛋白組學(xué)服務(wù)器(http://expasy.org/)獲得的軟件進(jìn)行初級結(jié)構(gòu)分析和分子模建。利用DeepView-SwissPDBViewer在人Hsp70-ATPase結(jié)構(gòu)域(pdb碼：1S3X)和人Hsc70底物結(jié)合結(jié)構(gòu)域(pdb碼：7HSC)的晶體結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，進(jìn)行分子模建。使用介電常數(shù)為80(H2O)，使表面模型基于pH7.0的庫倫相互作用。統(tǒng)計學(xué)分析為了評價零假設(shè)，利用雙側(cè)成對學(xué)生T檢驗進(jìn)行統(tǒng)計分析。統(tǒng)計學(xué)顯著性的截斷水平設(shè)定為5％，并利用F-檢驗對所有組數(shù)據(jù)的方差可比性進(jìn)行檢驗。所有統(tǒng)計都基于最小n＝3的獨立試驗。實施例3：苯甲醇對溶酶體貯存病的影響在實施例2和3中證明了，Hsp70通過與BMP的相互作用而具有溶酶體穩(wěn)定作用。為了評價當(dāng)使細(xì)胞暴露在Hsp70化學(xué)誘導(dǎo)物時是否也可以觀察到這種作用，利用Hsp70的小分子誘導(dǎo)物苯甲醇(BA)處理A型尼曼-皮克病(NPDA)患者的成纖維細(xì)胞。結(jié)果示于圖11。首先，利用劑量逐增的BA(0、20mM、30mM、35mM、40mM、45mM)處理NPDA細(xì)胞，裂解細(xì)胞并通過蛋白印跡進(jìn)行分析。將同樣量的蛋白上樣至各個孔中。針對各個情況評價Hsp70蛋白表達(dá)，顯示BA以劑量依賴的形式誘導(dǎo)Hsp70表達(dá)(一抗：Hsp70特異性的StressgenSPA-810)。接著，利用如實施例2中所述的同一方法評價用40mMBA處理后NPDA溶酶體的穩(wěn)定性。在對BA的應(yīng)答中觀察到了溶酶體穩(wěn)定性的提高。最后，利用如實施例2中所述的同一方法評價用40mMBA處理后NPDA細(xì)胞的溶酶體橫截面積。觀察到病理減輕。項1.調(diào)節(jié)酶的酶促活性的方法，其中，所述酶與BMP相互作用，所述方法包括施用Hsp70或其所述功能片段并從而調(diào)節(jié)與BMP相互作用的酶的酶促活性的步驟，其中所述Hsp70或其所述功能片段為適合使BMP和Hsp70或其功能片段之間相互作用的形式。2.如第1項所述的方法，其中，Hsp70或其所述功能片段與BMP形成共價復(fù)合物或非共價復(fù)合物。3.如前述任一項所述的方法，其中，BMP與鞘脂激活蛋白相互作用。4.如第3項所述的方法，其中，所述鞘脂激活蛋白選自鞘脂激活蛋白A、鞘脂激活蛋白B、鞘脂激活蛋白C和鞘脂激活蛋白D。5.如前述任一項所述的方法，其中，所述酶選自鞘磷脂酶、酸性鞘磷脂酶、唾液酸酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷神經(jīng)酰胺酶、葡糖神經(jīng)酰胺酶和酸性神經(jīng)酰胺酶。6.Hsp70或其功能片段，其用作藥物。7.Hsp70或其功能片段，其用于治療、減輕或預(yù)防溶酶體貯積癥。8.如第7項所述的應(yīng)用，其中，所述溶酶體貯積癥選自尼曼-皮克病、戈謝病、法伯氏病、克拉伯病、法布里病和唾液酸貯積病。9.提高化合物的攝取的方法，所述方法包括將所述化合物和Hsp70或其功能片段一起施用的步驟。10.如第9項所述的方法，其中，所述Hsp70或其功能片段與所述化合物共價結(jié)合。