本發(fā)明涉及一種弱毒疫苗及其制備方法和用途，特別涉及一種山羊痘、羊口瘡二聯(lián)細胞弱毒疫苗及其制備方法和用途，本發(fā)明屬于獸醫(yī)生物制品領(lǐng)域。

背景技術(shù)：
羊痘病毒(Capripoxvirus,CPV)為痘病毒科脊椎動物痘病毒亞科羊痘病毒屬成員。該屬成員有山羊痘病毒(Goatpoxvirus,GTPV)、綿羊痘病毒(Sheeppoxvirus,SPV)和牛結(jié)節(jié)性疹塊病病毒(Lumpyskindiseasevirus,LSDV)。羊痘是由羊痘病毒引起的一種急性、接觸性傳染病，被世界動物衛(wèi)生組織(FAO/OIE)列為93種必須報告的動物疫病之一，我國將其列為一類傳染病。其發(fā)病率可達75％以上，死亡率可達50％以上，羔羊死亡率可達100％，同時還可導(dǎo)致母羊流產(chǎn)。羊痘是古老的疾病之一，1879年Hansen首次報道了挪威的山羊痘。后來，陸續(xù)在世界其他地區(qū)報道了該病。廣泛分布于非洲、中東、印度次大陸、北歐、地中海各國及德國、澳大利亞、美國等,特別是非洲北部、中東和亞洲的部分國家流行較為嚴(yán)重。與我國接壤的周邊國家，如印度、孟加拉、尼伯爾、巴基斯坦、俄羅斯、蒙古等不少國家均有本病的流行。近幾年我國的江蘇、廣東、貴州、山東、浙江、廣西、甘肅、黑龍江等地均有本病流行。該病的爆發(fā)和流行使家畜的生產(chǎn)力下降，活畜及畜產(chǎn)品貿(mào)易停滯，給養(yǎng)羊業(yè)的發(fā)展造成極大的經(jīng)濟損失。羊傳染性膿皰病(Contagiousecthyma,CE)又名羊傳染性膿皰性皮炎(Contagiouspustulardermatitis)，俗稱“羊口瘡(Orf)”，是由副痘病毒成員羊傳染性膿皰病毒(Orfvirus,ORFV)感染引起山羊、綿羊和人的一種急性、接觸性和嗜上皮性的人獸共患傳染病,以在患羊的口唇、蹄、乳房、外陰等處皮膚和黏膜形成紅斑、丘疹、膿瘡、潰瘍和疣狀厚痂為特征。世界動物衛(wèi)生組織(OIE)將該病列為需申報類動物疾病，我國將其列為一類動物疫病。該病最早發(fā)現(xiàn)于歐洲，目前，幾乎在所有養(yǎng)羊國家和地區(qū)均存在。自然情況下主要侵害綿羊和山羊，山羊較為多發(fā)。此外，駱駝、牛、鹿、麝牛、貓、幼犬、猴和人均有易感性。本病常呈群發(fā)性流行的趨勢，3～6月齡羔羊最易感染，常引起群體發(fā)病，尤其是飼養(yǎng)密集的羊群。范春玲等報道了我國2006年在北京市亞福動物養(yǎng)殖中心暴發(fā)該病，該病傳播速度快，發(fā)病率高達95.4％。近年來隨著肉羊產(chǎn)業(yè)的發(fā)展和羊頻繁流動，該病時有發(fā)生，甚至在一些大型種羊場都有該病的流行，給養(yǎng)羊業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟損失，嚴(yán)重危害肉羊產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。更為嚴(yán)重的是，此病可以通過傷口感染飼養(yǎng)人員，感染者表現(xiàn)為手背、指間和前臂部皰疹和破潰。例如2005年8月福建省永安市有8名羊場養(yǎng)殖工人因感染羊傳染性膿皰病毒而發(fā)病?？梢?，羊傳染性膿皰不但嚴(yán)重危害肉羊產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展，而且威脅人類的身體健康，是一種危害較為嚴(yán)重的人畜共患傳染病。近年來，國內(nèi)外羊痘、羊口瘡頻繁爆發(fā)，而羊痘、羊口瘡尚無有效的治療方法，免疫接種是預(yù)防羊口瘡唯一行之有效的措施。目前尚無一種能夠一針防兩病的山羊痘、羊口瘡二聯(lián)細胞弱毒疫苗。目前羊痘、羊口瘡疫苗的研發(fā)和應(yīng)用主要集中在常規(guī)疫苗，如滅活疫苗和細胞弱毒疫苗，以及新型疫苗，如囊膜亞單位疫苗、核酸疫苗和重組疫苗上。但是目前，羊痘、羊口瘡新型疫苗的研制還處于試驗階段，且新型疫苗往往制備過程繁瑣、技術(shù)要求高，應(yīng)用于臨床還有很長一段路要走。羊痘、羊口瘡滅活疫苗雖然國內(nèi)外學(xué)者均有研究，但其免疫效果有限，從未真正應(yīng)用于臨床。目前，在臨床上應(yīng)用較為廣泛的仍然是羊痘、羊口瘡弱毒疫苗，因為它具有用量少，能誘導(dǎo)機體產(chǎn)生較強的細胞免疫和體液免疫能力，且產(chǎn)生免疫保護力的時間持久的特點。在國內(nèi)，雖然羊口瘡弱毒疫苗在青海省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院獸醫(yī)研究所和甘肅省畜牧獸醫(yī)研究所均有研制，但其生產(chǎn)工藝復(fù)雜、落后，凍干保護劑不耐熱等諸多生產(chǎn)工藝瓶頸問題，是該疫苗無法量產(chǎn)，目前該疫苗處于有品無苗的局面。另外，該弱毒都是上世紀(jì)80年代前后的毒株，目前國內(nèi)流行毒可能發(fā)生變異，很難保證其免疫的有效性。山羊痘弱毒疫苗在國內(nèi)幾家疫苗廠家均有生產(chǎn)，但該疫苗生產(chǎn)過程需要羊睪丸原代細胞，凍干保護劑不耐熱等工藝問題，使該疫苗生產(chǎn)、運輸及保存成本過高。山羊痘、羊口瘡病毒二聯(lián)細胞弱毒疫苗研究，尚屬空白。國內(nèi)外學(xué)者現(xiàn)已證實，羊痘弱毒疫苗對處于同科的羊口瘡病毒具有部分交叉免疫保護。因此，研制一種抗原譜廣、免疫原性好、制苗工藝簡單的山羊痘、羊口瘡病毒二聯(lián)細胞弱毒疫苗，對預(yù)防國內(nèi)羊痘、羊口瘡爆發(fā)和流行具有一加一大于二的現(xiàn)實意義。本發(fā)明選用自行分離獲得的ORFV湖北通山縣分離毒株(OrfvirusHB09株)和GTPV河南信陽市分離毒株(GoatpoxvirusHN2010株)作為疫苗研制的候選毒株，利用牛/羊睪丸支持細胞系和雞胚成纖維原代細胞傳代致弱，培育出符合“獸用新生物制品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)”的ORFV和GTPV弱毒疫苗株，配比一定比例的耐熱凍干保護劑制備凍干弱毒疫苗。攻毒保護試驗結(jié)果顯示所制備的山羊痘、羊口瘡二聯(lián)細胞弱毒疫苗能夠產(chǎn)生有效的免疫保護力。因此，本發(fā)明利用ORFV、GTPV流行毒株研制安全、高效的弱毒疫苗對于羊痘、羊口瘡的防治具有重要的現(xiàn)實意義。

技術(shù)實現(xiàn)要素：
針對現(xiàn)有羊痘、羊口瘡弱毒疫苗的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種山羊痘、羊口瘡二聯(lián)細胞弱毒疫苗及其制備方法，以實現(xiàn)用簡單實用的制備方法生產(chǎn)出產(chǎn)量高、抗原譜廣、穩(wěn)定性好、成本低、安全可靠的疫苗。本發(fā)明的目的是通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)的：用MDBK細胞系對湖北株羊口瘡病陽性料進行適應(yīng)分離的OrfVirusHB-TS09株病毒傳代至17代，再將該細胞毒接種新生牛睪丸原代細胞進行傳代致弱，傳代至55代時進行本動物安全試驗發(fā)現(xiàn)，該細胞毒已致弱。然后繼續(xù)傳代至85代，每隔五代取病毒(滴度TCID50不低于10-6.0/0.1mL)的細胞毒進行本動物安全試驗，證實該毒株傳代至55代后對綿羊羔羊、成年綿羊以及山羊羔羊以及成年山羊均安全。其中，選擇OrfVirusHB-TS09第65代細胞傳代致弱毒作為羊傳染性膿皰病毒弱毒疫苗株，命名為羊傳染性膿皰病毒細胞傳代致弱毒OrfVirusHB-TS09F65株，分類命名為羊傳染性膿皰病毒細胞傳代致弱毒，并于2014年3月19日送交中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏號CCTCCNO：V201406，保藏地址在武漢大學(xué)。用羊睪丸原代細胞對河南株山羊痘病料進行適應(yīng)分離的GoatpoxvirusHN2010株病毒傳代至16代，GTPV毒價lgTCID50≥3.5時，將該細胞毒接種雞胚成纖維原代細胞進行傳代致弱，傳代至36代時進行本動物安全試驗發(fā)現(xiàn)，該細胞毒在傳代至28代時已致弱。然后繼續(xù)在羊睪丸原代細胞傳代至56代，分別取傳代致弱毒21代、25代、30代、35代、40代、45代、50代7代次細胞毒(各代次細胞病毒TCID50不小于103.5/0.1mL)進行本動物安全試驗，證實接種各代次GoatpoxvirusHN-XY2010株致弱毒株的羊只組在觀察期內(nèi)，各試驗組羊只，在口腔粘膜均出現(xiàn)紅點，在接種后3天自行消失。對照羊正常。證明致弱毒株GoatpoxvirusHN-XY2010株對綿羊、山羊均安全、無致病性，是一株安全的疫苗弱毒株。選擇GoatpoxvirusHN-XY2010株第43代致弱毒株作為羊痘病毒弱毒疫苗株，命名為山羊痘病毒細胞傳代致弱疫苗株GoatpoxVirusHN-XY2010F43株，分類命名為山羊痘病毒細胞傳代致弱疫苗株GoatpoxVirusHN-XY2010F43株，并于2015年1月14日送交中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏號CCTCCNO：V201503，保藏地址在武漢大學(xué)。本發(fā)明的一種山羊痘、羊口瘡病毒二聯(lián)細胞弱毒疫苗，其特征在于其有效成分包括山羊痘病毒細胞傳代致弱毒以及羊傳染性膿皰病毒細胞傳代致弱，其中，所述的山羊痘病毒細胞傳代致弱毒為山羊痘毒細胞傳代致弱毒GoatpoxVirusHN-XY2010F43株，保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏時間為2015年1月14日，保藏編號為CCTCCNO：V201503，所述的羊傳染性膿皰病毒細胞傳代致弱毒為羊傳染性膿皰病毒細胞傳代致弱毒OrfVirusHB-TS09F65株，保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏時間為2014年3月19日，保藏編號為CCTCCNO：V201406。此外，本發(fā)明還提供了一種制備山羊痘、羊口瘡病毒二聯(lián)細胞弱毒疫苗的方法，其特征在于包括以下步驟：(1)病毒抗原的制備選生長良好布滿單層的新生牛睪丸原代細胞和新生羊睪丸原代細胞，傾去營養(yǎng)液，按原營養(yǎng)液體積的1-10％分別接種所述的羊傳染性膿皰病毒細胞傳代致弱毒OrfVirusHB-TS09F65株以及山羊痘病毒細胞傳代致弱毒GoatpoxVirusHN-XY2010F43株的病毒液，吸附5-15分鐘后加DMEM維持液，調(diào)PH至7.0～7.2，加青霉素、鏈霉素各100單位/ml，于37℃、5％CO2濃度培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)；培養(yǎng)40～72h，細胞病變達到75％以上時收獲病毒，置-20℃冰箱反復(fù)凍融兩次，然后進行無菌檢驗、安全檢驗、支原體檢驗、外源病毒檢驗，達到《中華人民共和國獸醫(yī)生物制品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》中規(guī)定的各項指標(biāo)，且病毒滴度不低于10-3.5TCID50/0.1ml時，作為山羊痘、羊傳染性膿皰病毒細胞傳代致弱毒抗原，備用；(2)疫苗的配制和凍干將步驟(1)制備的各項指標(biāo)都合格的山羊痘、羊傳染性膿皰病毒細胞傳代致弱毒抗原以體積比1︰1混合，再與耐熱凍干保護劑以體積比1︰1的比例混勻后，以2mL/瓶無菌條件下封裝于鏈瓶內(nèi)，在低溫冷凍干燥機內(nèi)進行凍干，即為山羊痘、羊口瘡病毒二聯(lián)細胞弱毒疫苗，將其在2℃-8℃下保存。在本發(fā)明所述的方法中，優(yōu)選的，按原營養(yǎng)液體積的5％分別接種所述的羊傳染性膿皰病毒細胞傳代致弱毒以及山羊痘病毒細胞傳代致弱毒的病毒液，吸附10分鐘后加DMEM維持液，調(diào)PH至7.0～7.2，加青霉素、鏈霉素各100單位/ml，于37℃、5％CO2濃度培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。在本發(fā)明所述的方法中，優(yōu)選的，所述耐熱凍干保護劑中含有海藻糖30～70g/L，脫脂奶粉10～30g/L，聚乙烯吡咯烷酮10～30g/L，明膠5～15g/L，精氨酸0.5～4g/L，維生素C1～5g/L，剩余成分為超純水。更優(yōu)選的，所述耐熱凍干保護劑中含有海藻糖50g/L，脫脂奶20g/L，聚乙烯吡咯烷酮20g/L，明膠10g/L，精氨酸1.5g/L，維生素C2.5g/L，剩余成分為超純水。所述的耐熱凍干保護劑的制備方法包括：(1)對可高壓滅菌的物質(zhì)：海藻糖、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、脫脂奶粉、明膠按各自比例溶于超純水中，加熱至50～60℃溶解后，116℃滅菌30分鐘；(2)將不耐高溫的物質(zhì)精氨酸、維生素C也按各自比例溶于超純水中，用孔徑為0.22μm濾膜過濾除菌：各組分別將(1)、(2)兩組份混合，得到所述的耐熱凍干保護劑。相較于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的優(yōu)點在于：1、選用流行毒株的細胞傳代致弱毒來制備疫苗，保證了疫苗的免疫保護力；2、利用本實驗室研制的針對GTPV和ORFV病毒的耐熱凍干保護劑，解決了痘病毒活疫苗僅能在-15℃條件下保存和運輸?shù)钠款i技術(shù)，使該疫苗儲存、運輸更方便。本發(fā)明將為臨床上針對羊痘、羊口瘡病的防控以及羊痘、羊口瘡病毒在羊群中的清除提供了重要的物質(zhì)基礎(chǔ)和技術(shù)支撐，具有廣闊的應(yīng)用前景。具體實施方式下面結(jié)合具體實施例來進一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點和特點將會隨具體實施例的描述更為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不多本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明精神和范圍下可以對本發(fā)明的技術(shù)方案和細節(jié)形式和形式進行修改...