本發(fā)明屬生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及腫瘤靶向治療的藥物組合物，具體涉及一種Hedgehog通路抑制劑和納米藥物遞送系統(tǒng)的藥物組合物及其用途，該藥物組合物以Hedgehog通路為靶點(diǎn)調(diào)控腫瘤基質(zhì)增加納米藥物瘤內(nèi)遞送用于治療胰腺癌。

背景技術(shù)：

納米遞藥系統(tǒng)是當(dāng)今腫瘤治療領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一。其治療基礎(chǔ)是腫瘤的增強(qiáng)滲透與滯留(EPR)效應(yīng)，即實(shí)體瘤組織中的血管壁間隙較寬、結(jié)構(gòu)完整性差、淋巴系統(tǒng)回流障礙，從而促進(jìn)大分子類(lèi)物質(zhì)或微粒系統(tǒng)在腫瘤組織選擇性分布。利用腫瘤的EPR效應(yīng)，納米遞藥系統(tǒng)比小分子藥物具有更好的治療效果(參見(jiàn)文獻(xiàn)J Control Release.2012；164:138-44.Adv Drug Deliv Rev.2010；63:170-83)。然而對(duì)于某些纖維化嚴(yán)重的腫瘤，如胰腺癌等，納米遞藥系統(tǒng)的療效甚微(Gut.2012；62:112-20.ACS Nano.2013；7:2078-89)，其主要原因在于：①胰腺癌血管稀少，腫瘤基質(zhì)纖維化嚴(yán)重，豐富的基質(zhì)擠壓血管，使本已稀少的血管血流灌注量進(jìn)一步下降，直接影響藥物的遞送；②豐富的基質(zhì)還使納米遞藥系統(tǒng)難以有效穿過(guò)腫瘤基質(zhì)到達(dá)腫瘤細(xì)胞，降低了藥物治療的效果。因此，采用新的策略有效地治療這一類(lèi)型的腫瘤，是納米遞藥研究領(lǐng)域急需攻克的難題。

目前認(rèn)為，腫瘤的細(xì)胞外基質(zhì)纖維化是一系列腫瘤內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的異常激活所導(dǎo)致的，包括Hedgehog通路，TGF-β通路，PDGF通路等。其中，Hedgehog通路在胚胎發(fā)育及創(chuàng)傷修復(fù)中發(fā)揮重要作用，其介導(dǎo)的腫瘤信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑異常激活是許多腫瘤共有的特征，以基質(zhì)中纖維豐富的胰腺癌尤其明顯。經(jīng)典的Hedgehog信號(hào)通路由腫瘤細(xì)胞釋放的Hedgehog配體與相應(yīng)的腫瘤內(nèi)成纖維細(xì)胞表面的patch-1或patch-2受體結(jié)合，激活跨膜蛋白Smoothened，促發(fā)一系列的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)最終引起激活的轉(zhuǎn)錄因子GLI-1進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)調(diào)控靶基因的表達(dá)。 Hedgehog途徑激活后，成纖維細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生大量的基質(zhì)，擠壓血管并使胰腺癌細(xì)胞被環(huán)繞在腫瘤基質(zhì)內(nèi)，構(gòu)成一道小分子和普通納米藥物幾乎無(wú)法逾越的屏障。因此，Hedgehog通路抑制劑的使用可以抑制胰腺癌腫瘤細(xì)胞外基質(zhì)的纖維化，解除細(xì)胞外基質(zhì)對(duì)血管的擠壓，增加腫瘤內(nèi)的血流灌注，從而增加腫瘤內(nèi)的藥物遞送。此外，腫瘤基質(zhì)減少還可以減少納米遞藥系統(tǒng)穿過(guò)胰腺癌腫瘤基質(zhì)時(shí)所遇到的阻力，增加藥物到達(dá)腫瘤細(xì)胞的機(jī)會(huì)。

目前，已有一些研究采用藥物抑制TGF-β通路或PDGF通路調(diào)控腫瘤內(nèi)基質(zhì)成份改善藥物瘤內(nèi)遞送的研究。如采用氯沙坦通過(guò)抑制血管緊張素受體Ⅱ-1下游的基質(zhì)纖維化相關(guān)因子如TGF-β-1,CCN2and ET-1,抑制透明質(zhì)酸和膠原蛋白的形成，從而擴(kuò)張腫瘤血管，增加游離藥物的遞送，抑制原位胰腺癌的生長(zhǎng)延長(zhǎng)動(dòng)物的生存時(shí)間(參見(jiàn)文獻(xiàn)Nature Communications.2013；4:2516.)。如采用TGF-beta抑制劑減少周細(xì)胞的對(duì)內(nèi)皮的覆蓋，增加瘤內(nèi)的血流灌注，從而在一定程度上改善載吉西他濱納米藥物對(duì)胰腺癌的治療(參見(jiàn)文獻(xiàn)ACS Nano.2013Nov 26；7(11):10048-65.)。但是目前暫無(wú)應(yīng)用Hedgehog通路抑制劑增加胰腺癌內(nèi)的血流灌注和納米遞藥系統(tǒng)的瘤內(nèi)穿透，實(shí)現(xiàn)更為有效的腫瘤細(xì)胞遞藥的相關(guān)研究。亦無(wú)調(diào)節(jié)胰腺癌細(xì)胞外基質(zhì)聯(lián)合納米藥物用于胰腺癌治療的相關(guān)專(zhuān)利申請(qǐng)。

根據(jù)以上背景，考慮到Hedgehog通路在胰腺癌基質(zhì)纖維化過(guò)程中的重要作用，本發(fā)明采用Hedgehog通路抑制劑調(diào)控胰腺癌腫瘤微環(huán)境的基質(zhì)成分，通過(guò)增加瘤內(nèi)血流灌注和納米粒的瘤內(nèi)穿透，增加納米藥物瘤內(nèi)遞送，提高胰腺癌的治療效果。該策略不僅可用于胰腺癌的治療，而且也可用于Hedgehog通路異常激活的其他腫瘤，如膽管癌等。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供腫瘤靶向治療的藥物組合物，涉及一種Hedgehog通路抑制劑和納米藥物遞送系統(tǒng)的藥物組合物及其用途，該藥物組合物以Hedgehog通路為靶點(diǎn)調(diào)控腫瘤基質(zhì)增加納米藥物瘤內(nèi)遞送用于治療胰腺癌。

本發(fā)明為臨床實(shí)踐提供了一種針對(duì)胰腺癌的干預(yù)策略，具體涉及該策略通過(guò)抑制Hedgehog通路調(diào)控胰腺癌的基質(zhì)形成并增加腫瘤內(nèi)的血流灌注，增加納米 藥物穿透達(dá)到腫瘤局部，并減弱納米藥物在瘤內(nèi)均一分布所遇到的阻力，從而提高納米藥物對(duì)胰腺癌的治療效果。

具體的，本發(fā)明提供了一種Hedgehog通路抑制劑和納米藥物遞送系統(tǒng)的藥物組合物及其用途；所述的藥物組合物由Hedgehog通路抑制劑和納米藥物遞送系統(tǒng)組成。

本發(fā)明中，Hedgehog通路抑制劑為Smoothened蛋白的小分子抑制劑；Hedgehog配體所對(duì)應(yīng)的蛋白抗體；針對(duì)GLI-1基因的干擾RNA或反義DNA序列以及可以抑制GLI-1基因轉(zhuǎn)錄的小分子藥物；

本發(fā)明中，納米藥物為載抗腫瘤藥物的納米遞藥系統(tǒng)；該遞藥系統(tǒng)中抗腫瘤藥物為小分子抗腫瘤藥物，納米載體為表面聚乙二醇修飾的脂質(zhì)體、納米粒、聚合物泡囊、聚合物膠束、固體脂質(zhì)納米粒，藥物以包裹或共價(jià)連接的方式包載在納米載體內(nèi)，所述的納米遞藥系統(tǒng)粒徑為10-300nm。

優(yōu)選的，本發(fā)明中所述的Hedgehog通路抑制劑，包括環(huán)巴胺及其衍生物，IPI-269609，維生素D3，SANT1-4和Cur61414；Hedgehog配體所對(duì)應(yīng)的蛋白抗體；針對(duì)GLI-1基因的干擾RNA或反義DNA序列以及可以抑制GLI-1基因轉(zhuǎn)錄的小分子藥物，如GANT61和GANT58；Hedgehog通路抑制劑的給藥形式可以是注射，也可是口服；

所述環(huán)巴胺是從藜蘆屬植物內(nèi)分離得到的一種異甾體類(lèi)生物堿，能與Hedgehog信號(hào)通路中的Smoothened蛋白結(jié)合，從而抑制該蛋白的活性，是經(jīng)典的Hedgehog通路抑制劑，可以特異性地抑制胰腺癌內(nèi)過(guò)度激活的Hedgehog通路，有效地抑制胰腺癌腫瘤細(xì)胞外基質(zhì)的纖維化(參見(jiàn)文獻(xiàn)Science.2009；324:1400-1.Nature.2003；425:846-51.)，本發(fā)明的實(shí)施例中，更優(yōu)選的Hedgehog通路抑制劑為Smoothened蛋白的小分子抑制劑是環(huán)巴胺及其衍生物；

優(yōu)選的，本發(fā)明中納米藥物為載抗腫瘤藥物的納米遞藥系統(tǒng)，其中，藥物以包裹或共價(jià)連接的方式包載在納米載體內(nèi)，所述的納米遞藥系統(tǒng)粒徑為10-300nm；納米遞藥系統(tǒng)表面可以連接靶向功能分子以增加納米藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的選擇性，提高腫瘤細(xì)胞對(duì)納米藥物的攝取。

本發(fā)明中，抗腫瘤藥物為小分子抗腫瘤藥物，選自阿霉素、表阿霉素、紫杉醇、多烯紫杉醇、吉西他濱、喜樹(shù)堿、羥基喜樹(shù)堿、長(zhǎng)春堿、長(zhǎng)春新堿、長(zhǎng)春地 辛、長(zhǎng)春瑞濱、博來(lái)霉素、柔紅霉素、正定霉素、絲裂霉素、阿克拉霉素、甲氨蝶呤、舒尼替尼、伊馬替尼、吉非替尼、厄羅替尼、索拉非尼和拉帕替尼等；本發(fā)明中優(yōu)選的藥物為阿霉素、表阿霉素、紫杉醇、多烯紫杉醇、羥基喜樹(shù)堿、長(zhǎng)春新堿、吉西他濱、拉帕替尼。

本發(fā)明中，納米載體為表面聚乙二醇修飾的脂質(zhì)體、納米粒、聚合物泡囊、聚合物膠束、固體脂質(zhì)納米粒；其中優(yōu)選的納米載體為表面聚乙二醇修飾的脂質(zhì)體、納米粒和聚合物膠束。

本發(fā)明中，制備納米載體的材料為白蛋白、聚乳酸(PLA)、聚乳酸-羥基乙酸(PLGA)、聚己內(nèi)酯(PCL)、磷脂、聚乙二醇聚乳酸共聚物(PEG-PLA)、聚乙二醇聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PEG-PLGA)、聚乙二醇聚己內(nèi)酯共聚物(PEG-PCL)、聚乙二醇二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(PEG-DSPE)中的一種和幾種。

本發(fā)明中，聚乙二醇分子量為1000-20000Da，優(yōu)選2000-5000Da。

進(jìn)一步，本發(fā)明通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)針對(duì)胰腺癌的納米藥物遞藥干預(yù)策略研究：

(1)建立皮下荷Capan-2胰腺癌動(dòng)物模型，Hedgehog通路抑制劑使用后，通過(guò)western blot和PCR技術(shù)評(píng)價(jià)Hedgehog通路抑制劑對(duì)Hedgehog通路的抑制作用；

(2)采用免疫熒光和超聲成像法評(píng)價(jià)Hedgehog通路抑制劑給藥后，腫瘤內(nèi)部基質(zhì)及灌流的變化情況；

(3)制備納米藥物并對(duì)其理化性質(zhì)進(jìn)行表征，如采用Zeta/激光粒度儀測(cè)定納米粒的平均粒徑和電位，透射電鏡觀察其形態(tài)；

(4)采用紅外染料DiR標(biāo)記納米藥物后，通過(guò)小動(dòng)物活體成像儀評(píng)價(jià)Hedgehog通路抑制劑給藥后，納米藥物在實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的腫瘤內(nèi)富集差異；

(5)采用綠色熒光探針香豆素-6標(biāo)記納米藥物后，通過(guò)冰凍切片觀察Hedgehog通路抑制劑使用后，納米藥物在實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的腫瘤內(nèi)分布差異；

(6)通過(guò)腫瘤生長(zhǎng)抑制實(shí)驗(yàn)，評(píng)價(jià)Hedgehog通路抑制后聯(lián)合納米藥物對(duì)胰腺癌的遞藥研究。

本發(fā)明提供了一種Hedgehog通路抑制劑和納米藥物遞送系統(tǒng)的藥物組合物及其用途，該藥物組合物以Hedgehog通路為靶點(diǎn)調(diào)控腫瘤基質(zhì)增加納米藥物瘤 內(nèi)遞送用于治療胰腺癌；進(jìn)一步，本發(fā)明為臨床實(shí)踐提供了一種針對(duì)胰腺癌的干預(yù)策略，該策略包括通過(guò)抑制Hedgehog通路調(diào)控胰腺癌的基質(zhì)形成并增加腫瘤內(nèi)的血流灌注，增加納米藥物穿透達(dá)到腫瘤局部，并減弱納米藥物在瘤內(nèi)均一分布所遇到的阻力，從而提高納米藥物對(duì)胰腺癌的治療效果。

為了便于理解，以下將通過(guò)具體的附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的進(jìn)行詳細(xì)地描述。需要特別指出的是，具體實(shí)例和附圖僅是為了說(shuō)明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以根據(jù)本文說(shuō)明，在本發(fā)明的范圍內(nèi)對(duì)本發(fā)明做出各種各樣的修正和改變，這些修正和改變也納入本發(fā)明的范圍內(nèi)。

附圖說(shuō)明

圖1，以Hedgehog通路為靶點(diǎn)調(diào)控腫瘤基質(zhì)增加納米藥物瘤內(nèi)遞送干預(yù)胰腺癌的示意圖：其中，(A)，瘤內(nèi)基質(zhì)豐富表達(dá)，擠壓腫瘤血管，降低瘤內(nèi)血流灌注和納米藥物的穿透，(B)，采用Hedgehog通路抑制劑抑制Hedgehog通路后，瘤內(nèi)基質(zhì)減少，腫瘤血管擠壓解除，瘤內(nèi)血流灌注增加和納米藥物的穿透與分布增加，(C)，Hedgehog通路激活后，瘤內(nèi)基質(zhì)豐富表達(dá)，(D)，采用抑制劑抑制Hedgehog通路，瘤內(nèi)基質(zhì)表達(dá)關(guān)閉。

圖2，建立Capan-2荷胰腺癌細(xì)胞的皮下腫瘤模型，環(huán)巴胺給藥后對(duì)Capan-2腫瘤生長(zhǎng)和動(dòng)物體重的影響，其中，(A)，動(dòng)物體重變化曲線(xiàn)，(B)，腫瘤體積變化曲線(xiàn)，(C)，環(huán)巴胺組和(D)對(duì)照組瘤內(nèi)腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞的表達(dá)情況(紅色為成纖維細(xì)胞活化蛋白fibroblast-activated protein-α，藍(lán)色為細(xì)胞核)，(E)，單顯微鏡視野下相關(guān)成纖維細(xì)胞的數(shù)目。

圖3，環(huán)巴胺處理后對(duì)胰腺癌hedgehog通路關(guān)鍵基因和蛋白表達(dá)的抑制作用，其中A為western blot分析GIL-1蛋白的表達(dá)(左：western bolt圖譜，右：半定量分析結(jié)果)，B為定量PCR分析GIL-1mRNA的表達(dá)，*P<0.05與vehicle組相比。

圖4，環(huán)巴胺抑制腫瘤基質(zhì)的形成，其中上行為對(duì)照組(vehicle處理組)，下行為環(huán)巴胺組，藍(lán)色標(biāo)記為細(xì)胞核，紅色為熒光標(biāo)記的FNs。

圖5，環(huán)巴胺對(duì)腫瘤內(nèi)血流灌注的影響，其中，上行為對(duì)照組(vehicle處 理組)，下行為環(huán)巴胺組，藍(lán)色標(biāo)記為細(xì)胞核，綠色為lectin標(biāo)記的功能化血管，表征存在血流灌注，紅色為CD31標(biāo)記的血管。

圖6，超聲成像法觀察環(huán)巴胺處理后增加腫瘤內(nèi)的血流灌注，瘤內(nèi)超聲成像圖：(A)環(huán)巴胺處理組，(B)vehicle處理組。

圖7，納米藥物的表征結(jié)果，圖A為電鏡結(jié)果，圖B為粒徑儀測(cè)試結(jié)果。

圖8，環(huán)巴胺處理后對(duì)納米藥物瘤內(nèi)分布的影響，其中，(A)環(huán)巴胺處理結(jié)束后靜脈注射紅外染料DiR標(biāo)記的納米粒(NP-DiR)，24h活體成像圖；(B)NP-DiR注射24h后離體腫瘤的熒光成像圖和對(duì)應(yīng)的半定量結(jié)果(C)，(D)DiR-NP注射24h后離體器官的熒光成像圖和對(duì)應(yīng)的定量結(jié)果(E)；**P<0.01與vehicle組相比。

圖9，環(huán)巴胺處理后對(duì)納米藥物瘤內(nèi)穿透的影響，其中，顯示了環(huán)巴胺處理結(jié)束后靜脈注射香豆素-6標(biāo)記的納米粒(NP-Cou-6)，4h取瘤冰凍切片，觀察納米粒在腫瘤內(nèi)的分布，藍(lán)色標(biāo)記為細(xì)胞核，綠色為納米粒，紅色為CD31標(biāo)記的血管。

圖10顯示了環(huán)巴胺提高紫杉醇納米粒對(duì)胰腺癌的治療效果，其中，A為腫瘤的體積變化，B為動(dòng)物體重變化，C為處死動(dòng)物后剝離的腫瘤圖片，D為剝離腫瘤的重量，E為上述剝離的腫瘤行石蠟包埋切片后的TUNEI凋亡染色(放大倍數(shù)分別為100倍)，*P<0.05,#P<0.01，與對(duì)照組或環(huán)巴胺組比較；**P<0.01，與NP-PTX組比較。

圖11顯示了環(huán)巴胺提高紫杉醇膠束對(duì)胰腺癌的治療效果，其中，A為腫瘤的體積變化，B為剝離腫瘤的重量，*P<0.05,#P<0.01，與對(duì)照組或環(huán)巴胺組比較；**P<0.01，與NP-PTX組比較。

具體實(shí)施方式：

本實(shí)驗(yàn)例選擇環(huán)巴胺作為Hedgehog通路抑制劑的代表，探討Hedgehog通路抑制劑使用后對(duì)Hedgehog通路、腫瘤基質(zhì)形成、瘤內(nèi)血液灌注和納米藥物遞送的影響(如圖1所示)；

本實(shí)驗(yàn)例采用實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)方法：多組比較采用一步ANOVA法，兩組比較采用雙側(cè)t檢驗(yàn)法。

實(shí)施例1：Hedgehog通路抑制劑使用后對(duì)Hedgehog通路的抑制作用

將人源的胰腺癌capan-2細(xì)胞系按5×10⁶個(gè)細(xì)胞/動(dòng)物皮下注射建立皮下荷胰腺癌裸鼠模型，待皮下腫瘤直徑達(dá)到4-5mm，荷瘤模型小鼠經(jīng)過(guò)環(huán)巴胺連續(xù)三周灌胃或腹腔注(劑量為50mg/kg/d)處理，對(duì)照組同法給予不含環(huán)巴胺的空白制劑(采用vehicle表示)，同時(shí)每隔3d記錄一次荷瘤小鼠的體重及腫瘤的大小，以初步評(píng)價(jià)環(huán)巴胺的毒副作用及對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的作用；

免疫熒光染色法分析腫瘤成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)：環(huán)巴胺給藥結(jié)束后，二氧化碳窒息法處死模型小鼠，迅速用PBS及4％多聚甲醛溶液灌流，剝離腫瘤組織，并制備冰凍切片，采用免疫熒光法標(biāo)記腫瘤成纖維細(xì)胞，觀察環(huán)巴胺處理后對(duì)成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)的影響；

熒光定量PCR分析分析GIL-1基因mRNA的表達(dá)：環(huán)巴胺給藥結(jié)束后，二氧化碳窒息法處死模型小鼠，迅速剝離腫瘤組織，切取一小塊采用TRIzol法提取總RNA(備用的腫瘤組織迅速置于-80℃保存)，采用核酸測(cè)定儀檢測(cè)樣品的RNA濃度，選取OD₂₆₀/OD₂₈₀在1.7-2.1之間的樣品進(jìn)行下述實(shí)驗(yàn)。按照 RT reagent Kit說(shuō)明書(shū)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄制備cDNA(反應(yīng)體積為20μl，反應(yīng)條件為：42℃ 30min；85℃ 10min),然后采用SYBR法進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)(反應(yīng)體系為20μl，反應(yīng)條件為：預(yù)變性95℃ 30s,95℃ 12s和60℃ 40s共40個(gè)循環(huán))。記錄對(duì)照組和環(huán)巴胺處理組GIL-1和GAPDH^▲▲CT值，計(jì)算^▲▲CT值并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；

western blot法檢測(cè)GIL-1蛋白的變化：環(huán)巴胺給藥結(jié)束后，二氧化碳窒息法處死模型小鼠，迅速剝離腫瘤組織，切取小塊腫瘤組織，加入300μl組織細(xì)胞裂解液(備用的腫瘤組織迅速置于-80℃保存)，研磨均勻，4℃ 12000rpm離心5min后取上清，采用BCA法檢測(cè)各組總蛋白濃度；樣品使用10％SDS-PAGE分離，上樣量為20μl蛋白/孔；電泳結(jié)束后，使用Semi-Dry Cell進(jìn)行半干電泳轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)移條件為30mA 100min，使用Blocking Buffer封閉轉(zhuǎn)印膜,4℃過(guò)夜，第二天用1×TBST洗滌3次，每次15min。加入稀釋好的一抗(1:500)，37℃溫育2h。用1×TBST洗滌4次，每次10min。加入稀釋好的二抗(1:2000)，37℃溫育2h，用1×TBST洗滌4次，每次10min。用Super-GL ECL超敏發(fā)光液進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測(cè)，并對(duì)X光片曝光。經(jīng)顯影定影處理后，晾干的膠片最后 用凝膠成像分析系統(tǒng)拍照，并采用Gel-Pro Analyzer軟件進(jìn)行分析；

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，環(huán)巴胺的處理不影響動(dòng)物的體重(如圖2A所示)，不影響腫瘤的生長(zhǎng)(如圖1B所示，對(duì)瘤內(nèi)腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞的表達(dá)沒(méi)有影響(如圖2C,D所示)；

Western blot及熒光定量PCR結(jié)果顯示：環(huán)巴胺處理后，GIL-1相關(guān)蛋白表達(dá)顯著降低，半定量結(jié)果顯示僅為對(duì)照組的40.3％左右(如圖3A所示)，GIL-1基因mRNA下調(diào)了44.4±0.9％(如圖3B所示)，GIL-1基因和相關(guān)蛋白是Hedgehog通路的主要標(biāo)志物，說(shuō)明環(huán)巴胺的處理有效抑制了Hedgehog通路。

實(shí)施例2：Hedgehog通路抑制劑使用后對(duì)腫瘤基質(zhì)形成的影響

環(huán)巴胺給藥結(jié)束后，取瘤制備冰凍切片，采用免疫熒光法標(biāo)記纖維連接蛋白(FNs)，以纖維連接蛋白(FNs)作為細(xì)胞外基質(zhì)的標(biāo)記物，觀察腫瘤基質(zhì)的形成情況，結(jié)果顯示，空白制劑處理組中FNs分布廣泛，呈束帶狀，包繞隔離腫瘤實(shí)質(zhì)細(xì)胞(如圖4第一行所示)，而環(huán)巴胺處理組的腫瘤組織中，F(xiàn)Ns呈斷裂，散在分布于腫瘤基質(zhì)中(如圖4第二行所示)，表明Hedgehog通路抑制劑的處理可以有效減少腫瘤細(xì)胞外基質(zhì)的形成。

實(shí)施例3：Hedgehog通路抑制劑使用后對(duì)瘤內(nèi)血流灌注的影響

環(huán)巴胺給藥結(jié)束后尾靜脈給予488標(biāo)記的凝集素(488-lectin)，劑量為5mg/kg，1h后二氧化碳窒息處死動(dòng)物后迅速用PBS及4％多聚甲醛溶液灌流，并制備冰凍切片；采用CD31抗體對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞免疫熒光染色后，共聚焦顯微鏡下120×視野下隨機(jī)選擇5個(gè)視野進(jìn)行觀察并采用Image J軟件計(jì)算分析功能化血管(488⁺CD31⁺)占所有血管(CD31⁺)的比例，以該指標(biāo)來(lái)評(píng)價(jià)腫瘤組織內(nèi)的血流灌注情況，結(jié)果顯示，環(huán)巴胺處理后，腫瘤內(nèi)部功能化的血管明顯增多，從處理前的32.6±4.4％增加到了72.9±5.8％，大大提升了腫瘤內(nèi)的血流灌注(如圖5所示)；

環(huán)巴胺給藥結(jié)束后尾靜脈注射超聲造影劑微泡，超聲成像法觀察瘤內(nèi)血流灌注，結(jié)果顯示，環(huán)巴胺處理后，腫瘤內(nèi)部血流灌注的速度增加了25％以上(如圖6所示)；

結(jié)果表明，由于環(huán)巴胺破壞了腫瘤內(nèi)的基質(zhì)的形成，解除了以FNs為代表的豐富的腫瘤基質(zhì)對(duì)腫瘤血管的擠壓，使得部分受擠壓的血管在擠壓解除后重新獲得灌流，成為有功能的血管，從而增加了腫瘤的瘤內(nèi)灌注，為納米藥物的有效遞送建立了條件。

實(shí)施例4：納米藥物的制備與表征

本實(shí)施例采用常見(jiàn)的可生物降解聚合物之一PEG3000-PLA30000和代表性小分子抗腫瘤藥物紫杉醇(PTX)制備納米藥物(NP-PTX)。制備方法為單次乳化溶酶蒸發(fā)法；具體操作如下：24mg聚乙二醇-聚乳酸(MPEG-PLA)和2mg PTX用1mL二氯甲烷溶解后加入到5mL 0.6％的膽酸鈉溶液中，然后冰水浴5s/5s脈沖超聲15次，功率為200W。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去二氯甲烷后濃縮至合適濃度即得未修飾納米粒(NP)，電鏡下納米粒子大小均一，分散性好，表面光滑呈規(guī)則圓球形(如圖7A所示)，粒度/電位測(cè)定儀結(jié)果顯示納米粒粒徑為109.9±4.7nm(如圖7B所示)，電位為10.6±0.9mv，適合腫瘤的體內(nèi)遞藥；熒光標(biāo)記的納米藥物制備方法同上，只需要將一定量的熒光素替代PTX和PEG-PLA用1mL二氯甲烷溶解后同法制備納米藥物；

紫杉醇膠束的制備與表征：采用薄膜水化制備載紫杉醇膠束，20mg聚乙二醇-聚乳酸(MPEG2000-PLA1000)和2mg PTX用4mL乙腈溶解后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)成膜，除去乙腈，加去離子水水化，粒度/電位測(cè)定儀結(jié)果顯示膠束粒徑為20.3±1.2nm，電位為-5.5±0.3mv，適合腫瘤的體內(nèi)遞藥。

實(shí)施例5，Hedgehog通路抑制劑使用后對(duì)納米藥物瘤內(nèi)分布的影響

荷瘤鼠采用環(huán)巴胺處理結(jié)束后，用近紅外染料DiR標(biāo)記納米粒，按10μg/kg劑量尾靜脈給藥24h后給藥24h后置于小動(dòng)物活體成像儀中行活體成像觀察NP-DiR在腫瘤內(nèi)的分布，隨后二氧化碳窒息法處死小動(dòng)物模型后PBS及4％多聚甲醛溶液心臟灌流，獲取腫瘤組織及其他正常器官(包括肝，脾，心，肺，腎和腦)，將離體組織再次置于小動(dòng)物活體成像儀內(nèi)，獲取熒光信號(hào)并分析離體組織內(nèi)的熒光分布，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，環(huán)巴胺處理更有利于納米粒在腫瘤內(nèi)聚(圖8A)，離體組織成像及半定量結(jié)果證實(shí)，環(huán)巴胺處理組的腫瘤組織內(nèi)平均熒光強(qiáng) 度是空白制劑處理組腫瘤組織的1.8倍左右，而正常器官中的平均熒光值與空白制劑處理組相比沒(méi)有顯著性差異(圖8B和C)，說(shuō)明環(huán)巴胺的處理可以有效增加納米粒在腫瘤組織內(nèi)的分布，但是對(duì)正常器官內(nèi)的納米粒分布沒(méi)有影響。

實(shí)施例6，Hedgehog通路抑制劑使用后對(duì)納米藥物瘤內(nèi)穿透的影響

荷瘤鼠采用環(huán)巴胺處理結(jié)束后，用綠色熒光探針香豆素-6標(biāo)記納米粒，按0.05mg/kg劑量尾靜脈給藥，4h后二氧化碳窒息法處死動(dòng)物，PBS及4％多聚甲醛溶液灌流小鼠并取瘤制備冰凍切片并采用免疫熒光染色的方法對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞染色；采用羊來(lái)源的多克隆CD31抗體(1:100)為一抗標(biāo)記腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞，二抗采用Cy3^TM標(biāo)記的驢抗羊二抗(1:100)，染色結(jié)束后Hochest33342染細(xì)胞核并用抗熒光淬滅劑封片，并通過(guò)共聚焦顯微鏡觀察納米粒在腫瘤內(nèi)的分布，并分析其與腫瘤內(nèi)血管的關(guān)系，共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果顯示，環(huán)巴胺處理組納米粒子可以廣泛地分布在腫瘤內(nèi)部，并可穿透血透到達(dá)距離血管較遠(yuǎn)處的腫瘤部位(如圖9F-J所示)，而空白制劑處理組中，納米粒子主要部分在血管附近，未能有效地分穿透布到整個(gè)腫瘤實(shí)質(zhì)中(如圖9A-E所示)，由于環(huán)巴胺的作用破壞了腫瘤基質(zhì)，一方面減少了納米藥物瘤內(nèi)穿透的阻力，可以使納米藥物有效遞送到腫瘤組織深處，另一方面增加了腫瘤內(nèi)血流灌注區(qū)域，可使納米藥物較為均一地分布到整個(gè)腫瘤組織中。

實(shí)施例7，Hedgehog通路抑制劑提高了納米藥物對(duì)胰腺癌的治療效果

制備包載經(jīng)典化療藥物紫杉醇的納米粒(NP-PTX)。待腫瘤直徑達(dá)到4-5mm時(shí)，將24只荷胰腺癌裸鼠模型隨機(jī)平均分成四組，每組6只。a，對(duì)照組(三周空白制劑灌胃，從第二周開(kāi)始尾靜脈給予生理鹽水)；b，環(huán)巴胺組(三周環(huán)巴胺制劑灌胃，從第二周開(kāi)始尾靜脈給予生理鹽水)；c，NP-PTX組(三周空白制劑灌胃，從第二周開(kāi)始尾靜脈給予NP-PTX)；d，環(huán)巴胺+NP-PTX組(三周環(huán)巴胺制劑灌胃，從第二周開(kāi)始尾靜脈給予NP-PTX)。尾靜脈給藥開(kāi)始計(jì)為第0d，尾靜脈給藥后繼續(xù)給予環(huán)巴胺灌胃一周，每三天給予一次NP-PTX(PTX劑量為6mg/kg)，每三天記錄一次腫瘤的體積及荷瘤小鼠體重,給藥五次后繼續(xù)觀察三天后采用二氧化碳窒息法處死模型小鼠，取瘤稱(chēng)重并制備冰凍切片,采用TUNEL 染色觀察腫瘤細(xì)胞的凋亡，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，環(huán)巴胺組(b組)與對(duì)照組(a組)之間在腫瘤大小及腫瘤重量方面沒(méi)有顯著性差異，表明環(huán)巴胺的處理不影響腫瘤的生長(zhǎng)。與對(duì)照組及環(huán)巴胺組相比，環(huán)巴胺+NP-PTX組(d組)和NP-PTX組(c組)對(duì)腫瘤生長(zhǎng)產(chǎn)生了一定的抑制作用，而且環(huán)巴胺+NP-PTX組腫瘤生長(zhǎng)抑制作用顯著優(yōu)于NP-PTX組(如圖10A,C,D所示)，按腫瘤體積抑制率和腫瘤重量抑制率計(jì)算，NP-PTX組，對(duì)腫瘤的生長(zhǎng)抑制率分別為26.3％和29.5％，而環(huán)巴胺+NP-PTX組對(duì)腫瘤的生長(zhǎng)抑制率分別為55.2％和63.3％。腫瘤TUNEL染色結(jié)果顯示，對(duì)照組和環(huán)巴胺組僅能檢測(cè)到散在的個(gè)別凋亡細(xì)胞，NP-PTX組可以見(jiàn)到略多的凋亡細(xì)胞，但仍然呈散在分布，而環(huán)巴胺給藥后聯(lián)合NP-PTX給藥組可以見(jiàn)到比例明顯增多的凋亡細(xì)胞(如圖10E所示)，與腫瘤生長(zhǎng)的體積變化曲線(xiàn)相一致。說(shuō)明環(huán)巴胺的處理可以有效增加納米藥物對(duì)腫瘤的生長(zhǎng)抑制作用，而僅僅依靠EPR效應(yīng)的普通納米粒藥物對(duì)胰腺癌腫瘤的抑制作用很有限；

將紫杉醇納米粒替換為紫杉醇膠束(Micelle-PTX)，同上開(kāi)展紫杉醇膠束的藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)分組情況如下：對(duì)照組(三周空白制劑灌胃，從第二周開(kāi)始尾靜脈給予生理鹽水)；環(huán)巴胺組(三周環(huán)巴胺制劑灌胃，從第二周開(kāi)始尾靜脈給予生理鹽水)；Micelle-PTX組(三周空白制劑灌胃，從第二周開(kāi)始尾靜脈給予Micelle-PTX)；環(huán)巴胺+Micelle-PTX組(三周環(huán)巴胺制劑灌胃，從第二周開(kāi)始尾靜脈給予Micelle-PTX)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖11所示，與對(duì)照組及環(huán)巴胺組相比，環(huán)巴胺+Micelle-PTX組對(duì)腫瘤生長(zhǎng)產(chǎn)生了顯著的抑制作用，而且顯著優(yōu)于NP-PTX組。