本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，特別涉及一種肺干細胞培養(yǎng)基、注射液及其制備方法。
背景技術(shù)：
早在20世紀(jì)60年代發(fā)現(xiàn)造血干細胞后，對干細胞的研究就取得了突飛猛進的發(fā)展。干細胞是一類具有潛能的細胞，具有自我更新和高度增殖能力，按分化程度的不同，可分為全能干細胞、胚胎肝細胞、多能干細胞。成體中已經(jīng)證實存在間充質(zhì)干細胞、造血干細胞、肝臟干細胞和腸干細胞；他們長期存在于相應(yīng)的組織中，在維持組織更新和損傷修復(fù)中起到關(guān)鍵的作用。目前關(guān)于肺干細胞的研究較少，并且其在相應(yīng)的組織中發(fā)揮的作用人們也不得而知。
此外，由于肺干細胞在保存及使用過程中穩(wěn)定性差，容易發(fā)生細胞聚集成團的問題，為了更加深入地研究肺干細胞的用途，將其制成制劑的形式利于保存。現(xiàn)有技術(shù)中有公開將干細胞制成注射劑來使用，例如CN102008507公開了一種人臍帶間充質(zhì)干細胞抗肝纖維化注射液及其制備方法，CN104857022公開了一種間充質(zhì)干細胞注射液，現(xiàn)有技術(shù)還未發(fā)現(xiàn)存在注射液。
再者，肺干細胞的培養(yǎng)過程需要特殊的培養(yǎng)基，如果培養(yǎng)基選擇不當(dāng)，制備的肺干細胞得率低，并且活性差。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明確定了肺干細胞與肺癌和肺纖維化存在的關(guān)聯(lián)，并且提供了一種穩(wěn)定性高的注射液，同時研發(fā)了一種能夠提高肺干細胞得率的培養(yǎng)基及培養(yǎng)方法。
本發(fā)明具體技術(shù)方案如下：
本發(fā)明一方面提供了肺干細胞在治療肺癌及肺纖維化的藥物制劑中的應(yīng)用。
本發(fā)明經(jīng)過試驗得出，肺干細胞可用于治療肺癌及肺纖維化，并且不易復(fù)發(fā)，治療效果顯著。
本發(fā)明另一方面提高了肺干細胞和DC-CIK聯(lián)合在制備治療肺癌及肺纖維化的藥物制劑中的應(yīng)用。其中，DC-CIK和肺干細胞具有殺傷肺癌及肺纖維化細胞的作用，而肺干細胞進一步還起到修復(fù)受損傷組織的作用。
DC-CIK是指與DC細胞共培養(yǎng)的CIK細胞。
本發(fā)明另一方面提供了一種治療肺癌及肺纖維化的注射液，該注射液包括肺干細胞、DC-CIK和注射混合液；每ml注射混合液含1×106-5×106個肺干細胞和6×105-7×105個DC-CIK；所述注射混合液包括以下質(zhì)量百分比的成分：0.5-1％葡萄糖酸-δ-內(nèi)酯、2-5％聚乙二醇、0.2-0.5％聚乙烯吡咯烷酮、0.3-0.5％磷酸烯醇式丙酮酸和2-5％葡聚糖；余量為生理鹽水。
本發(fā)明所提供的注射液可用于治療肺癌及肺纖維化，起到修復(fù)肺組織的作用，并且不易復(fù)發(fā)，提高了患者的壽命及生活質(zhì)量。
本發(fā)明通過在注射液內(nèi)加入葡萄糖酸-δ-內(nèi)酯等成分后，制得的注射液穩(wěn)定性高，為肺干細胞提供了一個良好的滲透壓環(huán)境，利于生長，同時可防止肺干細胞的聚集，使得其不易聚集成團，從而保證了單個細胞的分離狀態(tài)，利于提高細胞的存活率，并且還能夠為肺干細胞提供能量，增加肺干細胞的活率，維持肺干細胞的正常代謝能力。
進一步的改進，所述注射混合液還包括以下質(zhì)量百分比的成分：1-3％聚谷氨酸、5-7％聚賴氨酸和0.1-0.3％粒徑為15nm的磁鐵礦；所述聚谷氨酸、聚賴氨酸及磁鐵礦與肺干細胞制成磁性微球。本發(fā)明通過將肺干細胞制備磁性微球后，不但進一步提高了肺干細胞的穩(wěn)定性，使其具有緩釋性、適宜的滲透性、良好的組織相容性，并能夠克 服外來因素的干擾，提高細胞的存活能力；同時提高了肺干細胞的靶向性，使其直接作用于病灶，提高治療效果。
本發(fā)明另一方面還提供了注射液的制備方法，該方法包括如下步驟：
1)肺干細胞的培養(yǎng)；
2)DC-CIK的制備；
3)磁性微球的制備：
a)將聚谷氨酸和聚賴氨酸溶于水中，使用0.22μm的微孔濾膜過濾除菌，制得水溶液；
b)將培養(yǎng)的肺干細胞用磷酸鹽緩沖液洗3次，然后再用磷酸鹽緩沖液配置成細胞懸液；
c)將經(jīng)過高壓滅菌的磁鐵礦加入步驟a)制得的水溶液中，制得混懸液；
d)將步驟b)制得的細胞懸液和步驟c)制得的混懸液混合均勻，高速剪切乳化，制得初乳；將初乳置于高壓勻質(zhì)機中乳化，制得乳液；將乳液超微粉碎，制得磁性微球；
4)將葡萄糖酸-δ-內(nèi)酯、磷酸烯醇式丙酮酸及葡聚糖混勻，并溶于生理鹽水中，進行滅菌處理，制得混合液，備用；
5)將步驟3)制得的磁性微球加入步驟4)制得的混合液中，并加入聚乙二醇和聚乙烯吡咯烷酮，混合均勻，制得注射液。
優(yōu)選地，所述DC-CIK的制備方法如下：取新鮮人臍帶血，提取單個核細胞，加入無血清培養(yǎng)基，放入CO2培養(yǎng)箱，1小時后，將懸浮細胞轉(zhuǎn)入另一培養(yǎng)瓶，懸浮細胞用于培養(yǎng)CIK和NK，貼壁細胞用于培養(yǎng)DC；貼壁細胞第一天加入GM-CSF，IL-4，第五天加入脂多糖，第六天加入肺癌 細胞抗原負(fù)載，第七八天收貨DC細胞，分別和CIK混合培養(yǎng)，至14天收集細胞。
本發(fā)明另一方面提供一種培養(yǎng)肺干細胞的培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基由DMEM培養(yǎng)液和溶質(zhì)組成，所述溶質(zhì)及其在DMEM培養(yǎng)液中的濃度為12-15μg/ml乙二胺四乙酸二鈉、20-30ng/ml轉(zhuǎn)鐵蛋白、1-2.5μg/ml賴氨酸、25-40ng/ml谷氨酸、50-66ng/ml谷胱甘肽、5-7.5μg/ml維生素C和35-40ng/ml堿性成纖維細胞生長因子。
進一步的改進，所述溶質(zhì)還包括濃度為1-2ng/ml甘油磷酸鈉和0.2-0.5ng/ml肝素鈉。
本發(fā)明所提供的肺干細胞專用培養(yǎng)基，在能有效提高細胞擴增速度的同時保持肺干細胞的干性，不影響其分化性能，延長傳代次數(shù)。
本發(fā)明另一方面還提供了培養(yǎng)肺干細胞的方法，所述方法包括以下步驟：
a.取胎齡為12-16周的離體胚胎，無菌取出肺，去掉薄膜、氣管及支氣管，并將其剪成1mm3小塊，然后用含有5％雙抗的生理鹽水清洗三遍；
b.然后向經(jīng)過步驟a處理肺中加入濃度為20mg/ml的膠原酶Ⅰ和20mg/ml的膠原酶Ⅱ，37℃水浴消化30min，之后用終止液終止消化，用吸管吹打散，200目濾網(wǎng)過濾，1000轉(zhuǎn)/分離心5min，棄上清，加入初級培養(yǎng)基，并用NaHCO3調(diào)節(jié)PH至7.0-7.2，放入培養(yǎng)瓶中，于37℃和5％CO2的條件下培養(yǎng)，24h；
c.將培養(yǎng)瓶中懸浮的細胞倒入另一瓶，貼壁細胞棄掉；
d.收集懸浮細胞，加入權(quán)利要求4的培養(yǎng)基，于37℃、5％CO2的的條件下培養(yǎng)5-7天，收獲后得到培養(yǎng)的肺干細胞。
其中，雙抗為細胞培養(yǎng)添加物：青霉素及鏈霉素溶液，是一種含有青霉素(10000IU)和鏈霉素(10000μg/mL)在100倍的工作濃度的混合液。
結(jié)合肺干細胞生長特性，通過大量試驗總結(jié)出上述肺干細胞的培養(yǎng)方法及條件，能有效維持肺干細胞的最佳狀態(tài)，提高肺干細胞的擴增能力。
進一步的改進，所述初級培養(yǎng)基由RPMI1640培養(yǎng)液、10％胎牛血清和初級溶質(zhì)組成；所述初級溶質(zhì)及其在RPMI1640培養(yǎng)液中的濃度為：1mol/Lβ-巰基乙醇、1mol/L丙酮酸鈉和1mol/L谷氨酰胺。
進一步的改進，步驟d所述的培養(yǎng)基由DMEM培養(yǎng)液和溶質(zhì)組成，所述溶質(zhì)及其在DMEM培養(yǎng)液中的濃度為12-15μg/ml乙二胺四乙酸二鈉、20-30ng/ml轉(zhuǎn)鐵蛋白、1-2.5μg/ml賴氨酸、25-40ng/ml谷氨酸、50-66ng/ml谷胱甘肽、5-7.5μg/ml維生素C和35-40ng/ml堿性成纖維細胞生長因子。
本發(fā)明另一方面還提供了治療肺癌及肺纖維化的注射液在制備治療肺癌及肺纖維化的藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明提供了肺干細胞在治療肺癌及肺纖維化中的應(yīng)用，其能夠有效地治療肺癌和肺纖維化，并且不易復(fù)發(fā)，此外本發(fā)明還提供了一種肺干細胞的注射液，其能夠保證肺干細胞的穩(wěn)定性，使其不易聚集成團，并且使其具有生物靶向性、適宜的滲透性及很好的物理特性，進而提高了肺癌及肺纖維化的治療效果。并且本發(fā)明提供的肺干細胞培養(yǎng)方法及其專用培養(yǎng)基，能有效維持肺干細胞的最佳狀態(tài)，引導(dǎo)細胞增殖，且降低培養(yǎng)和收獲過程中肺干細胞的損傷率和死亡率，縮短生長周期；在能有效提高細胞擴增速度的同時保持肺干細胞的干性，不影響其分化性能，延長傳代次數(shù)。
具體實施方式
實施例1
一種治療肺癌及肺纖維化的注射液，所述注射液包括肺干細胞、DC-CIK和注射混合液；每ml注射混合液含1×106個肺干細胞和6×105個DC-CIK；所述注射混合液包括以下質(zhì)量百分比的成分：0.7％葡萄糖酸 -δ-內(nèi)酯、3％聚乙二醇0.4％聚乙烯吡咯烷酮、0.4％磷酸烯醇式丙酮酸和2％葡聚糖；余量為生理鹽水。
實施例2
一種治療肺癌及肺纖維化的注射液，所述注射液包括肺干細胞、DC-CIK和注射混合液；每ml注射混合液含2×106個肺干細胞和7×105個DC-CIK；所述注射混合液包括以下質(zhì)量百分比的成分：1％葡萄糖酸-δ-內(nèi)酯、2％聚乙二醇、0.5％聚乙烯吡咯烷酮、0.3％磷酸烯醇式丙酮酸、5％葡聚糖、1％聚谷氨酸、7％聚賴氨酸、和0.1％粒徑為15nm的磁鐵礦；所述聚谷氨酸、聚賴氨酸及磁鐵礦與肺干細胞制成磁性微球；余量為生理鹽水。
實施例3
一種治療肺癌及肺纖維化的注射液，所述注射液包括肺干細胞、DC-CIK和注射混合液；每ml注射混合液含5×106個肺干細胞和6.5×105個DC-CIK；所述注射混合液包括以下質(zhì)量百分比的成分：0.5％葡萄糖酸-δ-內(nèi)酯、5％聚乙二醇、0.2％聚乙烯吡咯烷酮、0.5％磷酸烯醇式丙酮酸、4％葡聚糖、3％聚谷氨酸、5％聚賴氨酸和0.3％粒徑為15nm的磁鐵礦；所述聚谷氨酸、聚賴氨酸及磁鐵礦與肺干細胞制成磁性微球；余量為生理鹽水；
所述注射液的制備方法為：
1)肺干細胞的培養(yǎng)；
2)DC-CIK的制備；
3)磁性微球的制備：
a)將聚谷氨酸和聚賴氨酸溶于水中，使用0.22μm的微孔濾膜過濾除菌，制得水溶液；
b)將培養(yǎng)的肺干細胞用磷酸鹽緩沖液洗3次，然后再用磷酸鹽緩沖液配置成細胞懸液；
c)將經(jīng)過高壓滅菌的磁鐵礦加入步驟a)制得的水溶液中，制得混懸液；
d)將步驟b)制得的細胞懸液和步驟c)制得的混懸液混合均勻，高速剪切乳化，制得初乳；將初乳置于高壓勻質(zhì)機中乳化，制得乳液；將乳液超微粉碎，制得磁性微球；
4)將葡萄糖酸-δ-內(nèi)酯、磷酸烯醇式丙酮酸及葡聚糖混勻，并溶于生理鹽水中，進行滅菌處理，制得混合液，備用；
5)將步驟3)制得的磁性微球加入步驟4)制得的混合液中，并加入聚乙二醇和聚乙烯吡咯烷酮，混合均勻，制得注射液。
實施例4
一種治療肺癌及肺纖維化的注射液，所述注射液包括肺干細胞、DC-CIK和注射混合液；每ml注射混合液含5×106個肺干細胞和6×105個DC-CIK；所述注射混合液包括以下質(zhì)量百分比的成分：0.6％葡萄糖酸-δ-內(nèi)酯、3％聚乙二醇、0.3％聚乙烯吡咯烷酮、0.4％磷酸烯醇式丙酮酸、3％葡聚糖、2％聚谷氨酸、6％聚賴氨酸、和0.2％粒徑為15nm的磁鐵礦；所述聚谷氨酸、聚賴氨酸、磁鐵礦與肺干細胞制成磁性微球；余量為生理鹽水；
所述注射液的制備方法為：
1)肺干細胞的培養(yǎng)；
a.取胎齡為12-16周的離體胚胎，無菌取出肺，去掉薄膜、氣管及支氣管，并將其剪成1mm3小塊，然后用含有5％雙抗的生理鹽水清洗三遍；
b.然后向經(jīng)過步驟a處理肺中加入濃度為20mg/ml的膠原酶Ⅰ和 20mg/ml的膠原酶Ⅱ，37℃水浴消化30min，之后用終止液終止消化，用吸管吹打散，200目濾網(wǎng)過濾，1000轉(zhuǎn)/分離心5min，棄上清，加入初級培養(yǎng)基，并用NaHCO3調(diào)節(jié)PH至7.0-7.2，放入培養(yǎng)瓶中，于37℃和5％CO2的條件下培養(yǎng)，24h；
c.將培養(yǎng)瓶中懸浮的細胞倒入另一瓶，貼壁細胞棄掉；
d.收集懸浮細胞，加入培養(yǎng)基，于37℃、5％CO2的的條件下培養(yǎng)5-7天，收獲后得到培養(yǎng)的肺干細胞；所述培養(yǎng)基由DMEM培養(yǎng)液和溶質(zhì)組成，所述溶質(zhì)及其在DMEM培養(yǎng)液中的濃度為13μg/ml乙二胺四乙酸二鈉、25ng/ml轉(zhuǎn)鐵蛋白、2μg/ml賴氨酸、30ng/ml谷氨酸、60ng/ml谷胱甘肽、6μg/ml維生素C和37.5ng/ml堿性成纖維細胞生長因子；
2)DC-CIK的制備；
3)磁性微球的制備：
a)將聚谷氨酸和聚賴氨酸溶于水中，使用0.22μm的微孔濾膜過濾除菌，制得水溶液；
b)將培養(yǎng)的肺干細胞用磷酸鹽緩沖液洗3次，然后再用磷酸鹽緩沖液配置成細胞懸液；
c)將經(jīng)過高壓滅菌的磁鐵礦加入步驟a)制得的水溶液中，制得混懸液；
d)將步驟b)制得的細胞懸液和步驟c)制得的混懸液混合均勻，高速剪切乳化，制得初乳；將初乳置于高壓勻質(zhì)機中乳化，制得乳液；將乳液超微粉碎，制得磁性微球；
4)將葡萄糖酸-δ-內(nèi)酯、磷酸烯醇式丙酮酸及葡聚糖混勻，并溶于生理鹽水中，進行滅菌處理，制得混合液，備用；
5)將步驟3)制得的磁性微球加入步驟4)制得的混合液中，并加入 聚乙二醇和聚乙烯吡咯烷酮，混合均勻，制得注射液。
實施例5
一種培養(yǎng)肺干細胞的培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基由DMEM培養(yǎng)液和溶質(zhì)組成，所述溶質(zhì)及其在DMEM培養(yǎng)液中的濃度為12μg/ml乙二胺四乙酸二鈉、30ng/ml轉(zhuǎn)鐵蛋白、1μg/ml賴氨酸、25ng/ml谷氨酸、66ng/ml谷胱甘肽、7.5μg/ml維生素C和40ng/ml堿性成纖維細胞生長因子。
實施例6
一種培養(yǎng)肺干細胞的培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基由DMEM培養(yǎng)液和溶質(zhì)組成，所述溶質(zhì)及其在DMEM培養(yǎng)液中的濃度為15μg/ml乙二胺四乙酸二鈉、20ng/ml轉(zhuǎn)鐵蛋白、2.5μg/ml賴氨酸、40ng/ml谷氨酸、50ng/ml谷胱甘肽、5μg/ml維生素C、35ng/ml堿性成纖維細胞生長因子、1ng/ml甘油磷酸鈉和0.2ng/ml肝素鈉。
實施例7
一種培養(yǎng)肺干細胞的方法，該培養(yǎng)方法包括以下步驟：
a.取胎齡為12-16周的離體胚胎，無菌取出肺，去掉薄膜、氣管及支氣管，并將其剪成1mm3小塊，然后用含有5％雙抗的生理鹽水清洗三遍；
b.然后向經(jīng)過步驟a處理肺中加入濃度為20mg/ml的膠原酶Ⅰ和20mg/ml的膠原酶Ⅱ，37℃水浴消化30min，之后用終止液終止消化，用吸管吹打散，200目濾網(wǎng)過濾，1000轉(zhuǎn)/分離心5min，棄上清，加入初級培養(yǎng)基，并用NaHCO3調(diào)節(jié)PH至7.0-7.2，放入培養(yǎng)瓶中，于37℃和5％CO2的條件下培養(yǎng)，24h；
c.將培養(yǎng)瓶中懸浮的細胞倒入另一瓶，貼壁細胞棄掉；
d.收集懸浮細胞，加入實施例5的培養(yǎng)基，于37℃、5％CO2的的條件下培養(yǎng)5-7天，收獲后得到培養(yǎng)的肺干細胞。
實施例8
一種治療肺癌及肺纖維化的注射液的制備方法，該制備方法包括如下步驟：
1)肺干細胞的培養(yǎng)；
2)DC-CIK的制備；
3)磁性微球的制備：
a)將聚谷氨酸和聚賴氨酸溶于水中，使用0.22μm的微孔濾膜過濾除菌，制得水溶液；
b)將培養(yǎng)的肺干細胞用磷酸鹽緩沖液洗3次，然后再用磷酸鹽緩沖液配置成細胞懸液；
c)將經(jīng)過高壓滅菌的磁鐵礦加入步驟a)制得的水溶液中，制得混懸液；
d)將步驟b)制得的細胞懸液和步驟c)制得的混懸液混合均勻，高速剪切乳化，制得初乳；將初乳置于高壓勻質(zhì)機中乳化，制得乳液；將乳液超微粉碎，制得磁性微球；
4)將葡萄糖酸-δ-內(nèi)酯、磷酸烯醇式丙酮酸及葡聚糖混勻，并溶于生理鹽水中，進行滅菌處理，制得混合液，備用；
5)將步驟3)制得的磁性微球加入步驟4)制得的混合液中，并加入聚乙二醇和聚乙烯吡咯烷酮，混合均勻，制得注射液。
實施例9
一種治療肺癌及肺纖維化的注射液的制備方法，該制備方法包括如下步驟：
1)肺干細胞的培養(yǎng)；
a.取胎齡為12-16周的離體胚胎，無菌取出肺，去掉薄膜、氣管及支 氣管，并將其剪成1mm3小塊，然后用含有5％雙抗的生理鹽水清洗三遍；
b.然后向經(jīng)過步驟a處理肺中加入濃度為20mg/ml的膠原酶Ⅰ和20mg/ml的膠原酶Ⅱ，37℃水浴消化30min，之后用終止液終止消化，用吸管吹打散，200目濾網(wǎng)過濾，1000轉(zhuǎn)/分離心5min，棄上清，加入初級培養(yǎng)基，并用NaHCO3調(diào)節(jié)PH至7.0-7.2，放入培養(yǎng)瓶中，于37℃和5％CO2的條件下培養(yǎng)，24h；所述初級培養(yǎng)基由RPMI1640培養(yǎng)液、10％胎牛血清和初級溶質(zhì)組成；所述初級溶質(zhì)及其在RPMI1640培養(yǎng)液中的濃度為：1mol/Lβ-巰基乙醇、1mol/L丙酮酸鈉和1mol/L谷氨酰胺；
c.將培養(yǎng)瓶中懸浮的細胞倒入另一瓶，貼壁細胞棄掉；
d.收集懸浮細胞，加入實施例5的培養(yǎng)基，于37℃、5％CO2的的條件下培養(yǎng)5-7天，收獲后得到培養(yǎng)的肺干細胞；
2)DC-CIK的制備；
3)磁性微球的制備：
a)將聚谷氨酸和聚賴氨酸溶于水中，使用0.22μm的微孔濾膜過濾除菌，制得水溶液；
b)將培養(yǎng)的肺干細胞用磷酸鹽緩沖液洗3次，然后再用磷酸鹽緩沖液配置成細胞懸液；
c)將經(jīng)過高壓滅菌的磁鐵礦加入步驟a)制得的水溶液中，制得混懸液；
d)將步驟b)制得的細胞懸液和步驟c)制得的混懸液混合均勻，高速剪切乳化，制得初乳；將初乳置于高壓勻質(zhì)機中乳化，制得乳液；將乳液超微粉碎，制得磁性微球；
4)將葡萄糖酸-δ-內(nèi)酯、磷酸烯醇式丙酮酸及葡聚糖混勻，并溶于生理鹽水中，進行滅菌處理，制得混合液，備用；
5)將步驟3)制得的磁性微球加入步驟4)制得的混合液中，并加入聚乙二醇和聚乙烯吡咯烷酮，混合均勻，制得注射液。
對照實施例1
一種治療肺癌及肺纖維化的注射液，所述注射液包括肺干細胞、DC-CIK和注射混合液；每ml注射混合液含1×106個肺干細胞和7×105個DC-CIK；所述注射混合液包括以下質(zhì)量百分比的成分：10％臨床級DMSD、3％聚乙二醇0.4％聚乙烯吡咯烷酮、6％羥乙基淀粉和2％葡聚糖；余量為生理鹽水。
對照實施例2
一種治療肺癌及肺纖維化的注射液，所述注射液包括肺干細胞、DC-CIK和注射混合液；每ml注射混合液含2×106個肺干細胞和6×105個DC-CIK；所述注射混合液包括以下質(zhì)量百分比的成分：1％葡萄糖酸-δ-內(nèi)酯、2％聚乙二醇、0.5％聚乙烯吡咯烷酮、0.3％磷酸烯醇式丙酮酸、5％葡聚糖、1.5％海藻酸鈉、0.5％殼聚糖和2％粒徑為25nm的親水性順磁四氧化三鐵納米粒；所述海藻酸鈉、殼聚糖和親水性順磁四氧化三鐵納米粒與肺干細胞制成磁性微囊；余量為生理鹽水。
試驗1：注射液中肺干細胞活率檢測
1)分組
試驗1組：施用實施例1的注射液；
試驗2組：施用實施例2的注射液；
對照1組：施用對照實施例1的注射液；
對照2組：施用對照實施例2的注射液。
2)試驗方法
測定細胞存活率的方法：將血球計數(shù)板及蓋板搽拭干凈，并將蓋片蓋在計數(shù)板上；將0.5ml的細胞懸液加入試管中；加入1.5ml0.2％臺盼蘭染液；將細胞懸液吸出10μl，滴加在蓋片邊緣，使懸液充滿蓋片和 計數(shù)板之間；靜置1min；隨機選取幾個視野，共計數(shù)300個細胞，并計數(shù)其中死細胞數(shù)目，計細胞活力，重復(fù)計數(shù)5次取均數(shù)。
取試驗組和對照組的注射液，放于4℃保存，分別在2h，6h，10h、12h和24h的時間點，取樣測定細胞存活率，并將試驗組和對照組的注射液凍存1年后，在37℃水浴復(fù)蘇，測試細胞存活率，檢測結(jié)果見表1。
表1注射液中肺干細胞的存活率檢測結(jié)果
由表1可以看出，本發(fā)明所述的注射液和對照組在0h時，細胞活率相差不大，但對照1組在4℃下保存24h后降低到接近國家最低標(biāo)準(zhǔn)，48h后細胞活率已經(jīng)不能達到50％標(biāo)準(zhǔn)；而本發(fā)明所述的注射液在4℃下條件下，保存時間長達3天，大大方便臨床使用；另外本發(fā)明通過將肺干細胞與特殊的材料制成磁性微球后，可顯著提高細胞的存活率。
試驗例2本發(fā)明提供的注射液的磁響應(yīng)性測試
將實施例2和對照實施例2的注射液以2.0ml/min的速度流經(jīng)一石英比色池，分別在有磁場作用下，用紫外-可見分光光度計檢測比色池中透光度變化來判斷微球的磁響應(yīng)性。
檢測比色池中溶液透光率隨時間的變化以考察微球的磁響應(yīng)性和靶向給藥能力，檢測結(jié)果見表2。
表2本發(fā)明注射液磁響應(yīng)性結(jié)果
從表2中可以看出，本發(fā)明實施例2提供的注射液，當(dāng)由磁場存在下，溶液的透過率下降的比對照實施例2更明顯，約在4h后達到了一定值，說明比色池中實施例2的磁性微球的濃度達到最大，明顯高于其他部位，可見由聚賴氨酸、聚谷氨酸和磁鐵礦制備的磁性微球的磁響應(yīng)性能強于殼聚糖和海藻酸鈉制成的微球，更適合作為肺干細胞靶向給藥的載體。
試驗例3本發(fā)明提供的肺干細胞及其注射液對肺癌及肺纖維化的效果試驗
3.1肺干細胞及其注射液對肺癌細胞株A549細胞的抑瘤效果
取對數(shù)生長期肺癌A549細胞，用MEM(高糖)+10％胎牛血清+雙抗+1mol/L谷氨酰胺培養(yǎng)至單層，消化液消化，終止消化，收集細胞；調(diào)節(jié)細胞濃度為5×104個/ml，在BALB/c-nu小鼠背部皮下接種A549細胞0.1ml，待皮下移植瘤體積達到75mm3左右時，按瘤體積將小鼠平均分成5組，每組3只。分組情況如下：
對照組：給予生理鹽水；
陽性對照組：給予30μM Genistein酪氨酸蛋白激酶抑制劑；(μM表示微摩爾μmoL/L)；
肺干細胞：給予肺干細胞磷酸鹽緩沖液(2×106個/ml)20ml；
實施例1組：給予實施例1的注射液50ml；
實施例2組：給予實施例2的注射液50ml；
每個6小時給予一次，連續(xù)給予48h后，處死小鼠，切除肺腫瘤，稱取瘤重。瘤重抑制率(％)＝(1-試驗組瘤重均值/對照組瘤重值)×100％。結(jié)果見表3。
表3各組對A549細胞裸鼠重量生長的影響
從表中可以看出，本發(fā)明提供的肺干細胞及其注射液對肺癌細胞株A549具有很好的抑制作用，療效與陽性對照組相當(dāng)。
3.2肺干細胞及其注射液對肺纖維化的治療效果
博來霉素致肺纖維化動物模型的肺組織病理學(xué)和生理學(xué)改變與人肺纖維化相似；當(dāng)成纖維細胞增多時，Ⅰ型膠原產(chǎn)物顯著增加，使Ⅰ型膠原產(chǎn)物與Ⅲ型膠原比例失調(diào)，導(dǎo)致膠原沉積，形成肺纖維化。羥脯氨酸為膠原纖維所特有，其它蛋白中不存在或含量非常低，因此，測定肺組織中羥脯氨酸含量可評價肺纖維化的嚴(yán)重程度。
將75只健康SD大鼠隨機分為對照組、肺干細胞組、博來霉素組、實施例1組和實施例2組；
將75只SD大鼠分別用1％戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后，仰臥固定于鼠板上，頸部去毛后乙醇消毒，縱行切開頸前皮膚，分離組織后暴露氣管；其中，對照組注入無菌生理鹽水200μl，其余各組向氣管內(nèi)注入博萊霉素(5mg/kg，5g/L)，注射后迅速將動物直立，旋轉(zhuǎn)，使藥液在肺內(nèi)分布均勻；
各組大鼠于氣管內(nèi)注射當(dāng)天開始還需連續(xù)灌胃21天，其中，對照組與博萊霉素組給予生理鹽水2ml灌胃，肺干細胞組給予肺干細胞磷酸鹽緩沖溶液(2×106個/ml)灌胃10ml灌胃；實施例1組和實施例2組分別給予實施例1和實施例2的注射液，各50ml；氣管內(nèi)注射后第21天，殺鼠取肺；觀察肺組織形態(tài)結(jié)構(gòu)變化及各組大鼠肺中羥脯氨酸的含量見表4。
表4肺組織形態(tài)觀測及羥脯氨酸含量的結(jié)果
從表中可以看出肺干細胞及其注射液可顯著降低肺纖維化的程度，并且可顯著降低肺中羥脯氨酸的含量，起到治療肺纖維化的作用。
試驗例4肺干細胞體外培養(yǎng)擴增情況
1)分組
試驗1組：本發(fā)明實施例5所述的培養(yǎng)基；
試驗2組：本發(fā)明實施例6所述的培養(yǎng)基；
對照組：DMEM培養(yǎng)液；
2)試驗方法
體外培養(yǎng)擴增方法，選實施例7所述的方法。
3)肺干細胞體外擴增情況
采用臺盼藍經(jīng)典染色法對細胞進行計數(shù)，按照實施例7的方法培養(yǎng)擴增肺干細胞，接種時細胞為1×106個/ml，分別統(tǒng)計原代干細胞、第3代、第6代和第9代干細胞的數(shù)量，結(jié)果見表5。
表5肺干細胞體外培養(yǎng)擴增細胞數(shù)量
由表中可以看出，本發(fā)明所述的肺干細胞的培養(yǎng)基和培養(yǎng)方法可以有效的體外培養(yǎng)肺干細胞。