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一種肺干細胞培養(yǎng)基、注射液及其制備方法與流程

文檔序號:12143866閱讀:來源:國知局

技術(shù)特征:

1.肺干細胞在制備治療肺癌及肺纖維化的藥物制劑中的應用。

2.如權(quán)利要求1所述的應用,其特征在于,肺干細胞和DC-CIK聯(lián)合在制備治療肺癌及肺纖維化的藥物制劑中的應用。

3.一種治療肺癌及肺纖維化的注射液,其特征在于,所述注射液包括肺干細胞、DC-CIK和注射混合液;每ml注射混合液含1×106-5×106個肺干細胞和6×105-7×105個DC-CIK;所述注射混合液包括以下質(zhì)量百分比的成分:0.5-1%葡萄糖酸-δ-內(nèi)酯、2-5%聚乙二醇、0.2-0.5%聚乙烯吡咯烷酮、0.3-0.5%磷酸烯醇式丙酮酸和2-5%葡聚糖;余量為生理鹽水。

4.如權(quán)利要求3所述的治療肺癌及肺纖維化的注射液,其特征在于,所述注射混合液還包括以下質(zhì)量百分比的成分:1-3%聚谷氨酸、5-7%聚賴氨酸和0.1-0.3%粒徑為15nm的磁鐵礦;所述聚谷氨酸、聚賴氨酸及磁鐵礦與肺干細胞制成磁性微球。

5.一種權(quán)利要求4所述的治療肺癌及肺纖維化的注射液的制備方法,其特征在于,所述制備方法包括如下步驟:

1)肺干細胞的培養(yǎng);

2)DC-CIK的制備;

3)磁性微球的制備:

a)將聚谷氨酸和聚賴氨酸溶于水中,使用0.22μm的微孔濾膜過濾除菌,制得水溶液;

b)將培養(yǎng)的肺干細胞用磷酸鹽緩沖液洗3次,然后再用磷酸鹽緩沖液配置成細胞懸液;

c)將經(jīng)過高壓滅菌的磁鐵礦加入步驟a)制得的水溶液中,制得混懸液;

d)將步驟b)制得的細胞懸液和步驟c)制得的混懸液混合均勻,高速剪切乳化,制得初乳;將初乳置于高壓勻質(zhì)機中乳化,制得乳液;將乳液超微粉碎,制得磁性微球;

4)將葡萄糖酸-δ-內(nèi)酯、磷酸烯醇式丙酮酸及葡聚糖混勻,并溶于生理鹽水中,進行滅菌處理,制得混合液,備用;

5)將步驟3)制得的磁性微球加入步驟4)制得的混合液中,并加入聚乙二醇和聚乙烯吡咯烷酮,混合均勻,制得注射液。

6.一種培養(yǎng)肺干細胞的培養(yǎng)基,其特征在于,所述培養(yǎng)基由DMEM培養(yǎng)液和溶質(zhì)組成,所述溶質(zhì)及其在DMEM培養(yǎng)液中的濃度為12-15μg/ml乙二胺四乙酸二鈉、20-30ng/ml轉(zhuǎn)鐵蛋白、1-2.5μg/ml賴氨酸、25-40ng/ml谷氨酸、50-66ng/ml谷胱甘肽、5-7.5μg/ml維生素C和35-40ng/ml堿性成纖維細胞生長因子。

7.如權(quán)利要求6所述的培養(yǎng)基,其特征在于,所述溶質(zhì)還包括濃度為1-2ng/ml甘油磷酸鈉和0.2-0.5ng/ml肝素鈉。

8.一種應用權(quán)利要求6所述培養(yǎng)基培養(yǎng)肺干細胞的方法,其特征在于,所述培養(yǎng)方法包括以下步驟:

a.取胎齡為12-16周的離體胚胎,無菌取出肺,去掉薄膜、氣管及支氣管,并將其剪成1mm3小塊,然后用含有5%雙抗的生理鹽水清洗三遍;

b.然后向經(jīng)過步驟a處理肺中加入濃度為20mg/ml的膠原酶Ⅰ和 20mg/ml的膠原酶Ⅱ,37℃水浴消化30min,之后用終止液終止消化,用吸管吹打散,200目濾網(wǎng)過濾,1000轉(zhuǎn)/分離心5min,棄上清,加入初級培養(yǎng)基,并用NaHCO3調(diào)節(jié)PH至7.0-7.2,放入培養(yǎng)瓶中,于37℃和5%CO2的條件下培養(yǎng),24h;

c.將培養(yǎng)瓶中懸浮的細胞倒入另一瓶,貼壁細胞棄掉;

d.收集懸浮細胞,加入權(quán)利要求4的培養(yǎng)基,于37℃、5%CO2的的條件下培養(yǎng)5-7天,收獲后得到培養(yǎng)的肺干細胞。

9.如權(quán)利要求8所述的方法,其特征在于,所述初級培養(yǎng)基由RPMI 1640培養(yǎng)液、10%胎牛血清和初級溶質(zhì)組成;所述初級溶質(zhì)及其在RPMI 1640培養(yǎng)液中的濃度為:1mol/Lβ-巰基乙醇、1mol/L丙酮酸鈉和1mol/L谷氨酰胺。

10.一種權(quán)利要求3或4所述的治療肺癌及肺纖維化的注射液在制備治療肺癌及肺纖維化的藥物中的應用。

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