本發(fā)明涉及癌癥的免疫療法領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明涉及抗免疫原性糖肽的抗體、含該抗體的藥物組合物及其在癌癥療法中的用途。

發(fā)明背景

Globo H是一種六糖且屬于過度表達(dá)于各種上皮癌細(xì)胞(包括乳腺癌細(xì)胞、結(jié)腸癌細(xì)胞、卵巢癌細(xì)胞、胰腺癌細(xì)胞、肺癌細(xì)胞和前列腺癌細(xì)胞)的表面上的大量腫瘤相關(guān)碳水化合物抗原。Globo H的異常表達(dá)使其成為免疫療法及研發(fā)Globo H-陽性癌癥的癌癥疫苗的引人注目的候選者。

然而，如同大多數(shù)碳水化合物抗原一樣，Globo H通常為免疫系統(tǒng)所耐受，因此，Globo H所誘導(dǎo)的免疫原性有限。另外，生產(chǎn)抗特異性免疫原的抗體通常涉及兩種淋巴細(xì)胞(B細(xì)胞及輔助T細(xì)胞)的協(xié)同相互作用。但是，Globo H無法單獨激活輔助T細(xì)胞，這也是因于Globo H的免疫原性差。因此，以Globo H的免疫接種通常具有以下特征：免疫球蛋白M(IgM)的滴度低且無法類別轉(zhuǎn)化為免疫球蛋白G(IgG)，以及抗體親和力成熟無效。

已開發(fā)出各種途徑來解決上述缺陷。在某些研究中，具有T-表位的外來載體蛋白質(zhì)或肽(諸如鑰孔戚血藍(lán)素(KLH)或去毒破傷風(fēng)類毒素(TT))已與碳水化合物抗原綴合，以期改善碳水化合物抗原的免疫原性。US 20010048929提供一種多價免疫原性分子，其包括含至少一個功能T細(xì)胞表位的載體分子和多個各連接至該載體分子及各含至少一種功能B細(xì)胞表位的不同碳水化合物片段，其中該載體分子賦予該多個碳水化合物片段提高的免疫原性，且其中該碳水化合物片段是Globo H、LeY或STn。US 20120328646提供一種含有經(jīng)由對硝基苯基連接子以化學(xué)方式綴合至免疫原性載體白喉毒素交叉反應(yīng)物質(zhì)197(DT-CRM 197)(Th表位)的Globo H(B細(xì)胞表位)的基于碳水化合物的疫苗，其在乳腺癌模型中提供免疫原性，結(jié)果顯示在異種移植研究中的腫瘤形成延遲。US 20120263749涉及一種用于治療癌癥的多價疫苗，其包含至少兩個選自包含以下的組的綴合抗原：諸如Globo H、Lewis抗原和神經(jīng)節(jié)苷脂的糖脂抗原、多糖抗原、粘蛋白抗原、糖基化粘蛋白抗原和適合的佐劑。

盡管如此，將碳水化合物綴合至載體蛋白質(zhì)帶來幾個新的問題。根據(jù)Ingale等人，外來載體蛋白質(zhì)及將載體蛋白質(zhì)與碳水化合物連接在一起的連接子可引發(fā)強(qiáng)烈B細(xì)胞反應(yīng)，從而導(dǎo)致抑制抗碳水化合物表位的抗體反應(yīng)(Ingale S.等人，Robust immune responses elicited by a fully synthetic three-component vaccine.Nat Chem Biol.2007年10月；3(10):663-7.Epub 2007年9月2日)。此外，Ingale等人也指出，綴合化學(xué)難以控制，得到組成及結(jié)構(gòu)具有不確定性的綴合物，其可影響免疫反應(yīng)的可再現(xiàn)性?？紤]到上述因素，Ingale等人認(rèn)為，使用碳水化合物-蛋白質(zhì)綴合物的臨床前及臨床研究導(dǎo)致混合結(jié)果并不出人意料。例如，Kuduk等人教示，在佐劑QS-21存在下用綴合至KLH的Tn-抗原的三聚體簇的免疫接種在小鼠中引起適度IgG抗體效價(Kuduk SD等人，Synthetic and immunological studies on clustered modes of mucin-related Tn and TF O-linked antigens:the preparation of a glycopeptide-based vaccine for clinical trials against prostate cancer.J Am Chem Soc.1998；120:12474–12485)；而Slovin等人教示，相同疫苗在復(fù)發(fā)性前列腺癌患者的臨床試驗中提供低中值IgG及IgM抗體效價(Slovin SF等人，F(xiàn)ully synthetic carbohydrate-based vaccines in biochemically relapsed prostate cancer:clinical trial results with alpha-N-acetylgalactosamine-O-serine/threonine conjugate vaccine.J Clin Oncol.2003；21:4292–4298)。

此外，對于具有免疫低下狀態(tài)的癌癥患者，具體地在接受化療或放射療法的患者以及晚期癌癥患者中，主動免疫干預(yù)的療效通常有限，因為這些患者可能無法產(chǎn)生足夠引發(fā)抗腫瘤效應(yīng)的抗體。

鑒于前文，此項技術(shù)中存在研發(fā)用于改良基于碳水化合物的疫苗的免疫接種和/或療效的替代性策略的需求。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

下文呈現(xiàn)本公開的簡單概述，以供讀者的基本理解。此發(fā)明內(nèi)容并非本公開的詳盡概述，且其并未明確本發(fā)明的關(guān)鍵/決定性元素或描述本發(fā)明的范圍。其唯一目的是簡單呈現(xiàn)本文所公開的一些概念，作為稍后呈現(xiàn)的較詳細(xì)描述的引子。

本公開涉及一種如本公開的上述任何方面/實施方案的特異性結(jié)合Globo H的抗體。

根據(jù)某些實施方案，該抗體是單克隆抗體。

根據(jù)可選實施方案，該抗體是嵌合或人源化抗體。

在另一方面，本公開涉及一種用于治療有此需要的受試者的癌癥的藥物組合物。

根據(jù)本公開的一個實施方案，該藥物組合物包含(1)治療有效量的如本公開的任何上述方面/實施方案的抗體，以及視情況(2)藥學(xué)上可接受的載體。

在另一方面，本公開涉及一種用于治療有此需要的受試者的癌癥的方法。

根據(jù)本公開的實施方案，該方法包括向該受試者施用如本公開的任何上述方面/實施方案的抗體或藥物組合物。

附圖簡述

圖1A至E說明細(xì)胞結(jié)合分析的結(jié)果(A：同種型；B：VK9；C：MZ-2；D：對照血清；E：α-Globo H血清)。

圖2說明根據(jù)本公開的幾個工作實例的抗Globo H IgG抗體對原發(fā)性卵巢癌細(xì)胞的結(jié)合親和力。

圖3是說明根據(jù)本公開的一個工作實例的系列聚糖-珠粒結(jié)合分析的結(jié)果的FACS圖表。

圖4A和B顯示據(jù)本公開的一個工作實例的抗-Globo H IgG抗體的蛋白質(zhì)折疊的模擬(A：小鼠MZ-2單克隆抗體；B：人源化MZ-2單克隆抗體)。

圖5A至E顯示根據(jù)本公開的一個工作實例的抗-Globo H IgG抗體的結(jié)合親和力，其代表締合及解離曲線擬合及解離常數(shù)(A：mMZ-2；B：cMZ-2；C：hMZ-2L；D：MK-1；E：hMZ-2Lw)。

圖6顯示，含有超過1.6μg/ml hMZ-2Lw抗體的人類血清在乳腺癌MCF-7細(xì)胞中引起補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性。

圖7顯示，濃度高于約10及20μg/ml的hMZ-2Lw抗體在人類卵巢癌細(xì)胞株TOV21G中產(chǎn)生劑量依賴性細(xì)胞毒性。

圖8顯示，濃度高于約10及20μg/ml的hMZ-2Lw抗體在人類胰腺癌細(xì)胞株HPAC中產(chǎn)生劑量依賴性細(xì)胞毒性。

圖9A和B顯示本發(fā)明hMZ-2Lw和MK1抗體對MCF-7細(xì)胞(乳腺癌細(xì)胞株)的抗原依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC)活性。

圖10A和B顯示本發(fā)明hMZ-2Lw和MK1抗體對TOV21G細(xì)胞(卵巢癌細(xì)胞株)的抗原依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC)活性。

圖11顯示施用hMZ-2Lw和MK1抗體兩者顯著抑制腫瘤生長，而對照IgG不會實質(zhì)上影響腫瘤生長。

圖12顯示hMZ-2抗體在乳腺癌皮下模型MCF-7細(xì)胞中的結(jié)果。

圖13A和B顯示hMZ-2抗體在胰腺癌皮下模型HPAC細(xì)胞中的結(jié)果。(A：腫瘤照片；B：腫瘤尺寸減小)

圖14顯示，MZ-2抗體抑制表達(dá)Globo H的TOV21G細(xì)胞的遷移。

圖15顯示，MZ-2抗體抑制表達(dá)Globo H的TOV21G細(xì)胞的遷移。

發(fā)明詳述

本發(fā)明至少基于重組抗體特異性結(jié)合Globo H以治療癌癥表達(dá)腫瘤相關(guān)碳水化合物抗原的發(fā)現(xiàn)。

定義

除非本文另有定義，否則本發(fā)明中所用科學(xué)及技術(shù)術(shù)語應(yīng)具有本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解和使用的含義。除非上下文另有要求，否則應(yīng)理解，單數(shù)術(shù)語應(yīng)包括其復(fù)數(shù)形式，且復(fù)數(shù)術(shù)語包括單數(shù)。具體而言，如本文和權(quán)利要求中所使用，除非上下文另有明確指示，否則單數(shù)形式“一個(a)”和“一種(an)”包括復(fù)數(shù)形式。同樣，如本文和權(quán)利要求中所使用，術(shù)語“至少一個”和“一個或多個”具有相同含義，且包括一個、二個、三個或更多。

盡管描述本發(fā)明的寬廣范圍的數(shù)值范圍和參數(shù)是近似值，但描述于具體實例中的數(shù)值盡可能精確地報告。然而，任何數(shù)值固有地包含必然由見于各次試驗測量的標(biāo)準(zhǔn)偏差所導(dǎo)致的特定誤差。同樣，如本文所使用，術(shù)語“約”通常意指在給定值或范圍的10％、5％、1％或0.5％內(nèi)。或者，當(dāng)由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員考慮時，術(shù)語“約”意指在平均值的可接受標(biāo)準(zhǔn)偏差內(nèi)。除在操作/工作實例中以外，或除非另有明確規(guī)定，否則本文所公開的所有數(shù)值范圍、量、值及百分比(諸如那些材料的用量、持續(xù)時間、溫度、操作條件、量的比率及其類似物者)應(yīng)理解為在所有情形下經(jīng)術(shù)語“約”修飾。因此，除非有相反指示，否則描述于本發(fā)明及附隨權(quán)利要求中的數(shù)字參數(shù)為可視需要變化的近似值。至少，各數(shù)字參數(shù)應(yīng)至少根據(jù)所報告的有效數(shù)字及通過應(yīng)用普通舍入技術(shù)理解。

如本文所使用的術(shù)語“抗原”定義為可引起免疫反應(yīng)的物質(zhì)。該免疫反應(yīng)可包括產(chǎn)生抗體或激活特定免疫機(jī)能健全的細(xì)胞，或兩者。如本文所使用，術(shù)語“免疫原”是指能誘導(dǎo)產(chǎn)生抗體的抗原。同樣，術(shù)語“免疫原性”通常是指免疫原或抗原刺激免疫反應(yīng)的能力。

術(shù)語“表位”是指常規(guī)地通過免疫球蛋白VH/VL對結(jié)合的結(jié)構(gòu)單元。表位定義抗體的最小結(jié)合部位，且因此代表抗體的特異性的目標(biāo)。

如本文所使用的術(shù)語“抗體”是指能識別或結(jié)合抗原的完整抗體分子或者其片段、變體或衍生物。大多數(shù)天然抗體具有通過二硫鍵彼此連接的兩條重鏈及兩條輕鏈。輕鏈包括一個可變域(VL)及一個恒定域(CL)；而重鏈包括一個可變域(VH)及三個恒定域(CH1、CH2及CH3，統(tǒng)稱為CH)。輕鏈可變區(qū)(VL)及重鏈可變區(qū)(VH)決定對抗原的結(jié)合識別及特異性。VH及VL區(qū)可進(jìn)一步細(xì)分為具有超變性的區(qū)域，稱為互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)，其間穿插有較保守的區(qū)域，稱為框架區(qū)(FR)。各VH及VL由按以下順序自胺基端排列至羧基端的三個CDR及四個FR組成：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。輕鏈恒定區(qū)域(CL)及重鏈恒定區(qū)域(CH)賦予重要的生物性質(zhì)，諸如抗體鏈締合、分泌、經(jīng)胎盤活動性、互補(bǔ)結(jié)合及結(jié)合于Fc受體(FcR)。

如本文所使用，“抗體可變域”是指抗體分子的輕鏈及重鏈的包含互補(bǔ)決定區(qū)(CDR；即CDR1、CDR2和CDR3)及框架區(qū)(FR)的部分。根據(jù)本文所用方法，分配給CDR及FR的氨基酸位置可根據(jù)Kabat(Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institutes of Health,Bethesda,Md.,1987及1991))定義?？贵w或抗原結(jié)合片段的氨基酸編號也是根據(jù)Kabat的定義。

如本文所使用，“互補(bǔ)決定區(qū)”(CDR，即CDR1、CDR2和CDR3)是指抗體可變域的氨基酸殘基，其存在是結(jié)合抗原所必需的。各可變域通常具有三個確定為CDR1、CDR2和CDR3的CDR區(qū)。H-CDR是指重鏈的CDR，且L-CDR是指輕鏈的CDR。

如本文所使用，“單克隆抗體”是指由單一類型的產(chǎn)抗體細(xì)胞獲得的抗體分子。

術(shù)語“嵌合抗體”是指包含來自一種來源或物種的可變區(qū)和衍生自不同來源或物種的恒定區(qū)的至少一部分的抗體，其通常通過重組DNA技術(shù)制備。嵌合抗體的CDR優(yōu)選具有一個來源，而抗體的剩余部分具有不同來源。具體地，在本發(fā)明中，嵌合抗體可為人源化抗體，其中已將非人類抗體的抗原結(jié)合序列/可變域接枝至人類抗體框架區(qū)上。

如本文所使用，術(shù)語“人源化抗體”是指含來自非人類(例如，鼠科)抗體及人類抗體的序列的抗體形式。這些抗體包含衍生自非人類免疫球蛋白的最小序列。一般而言，人源化抗體將包括實質(zhì)上所有至少一個及通常兩個可變域，其中所有或?qū)嵸|(zhì)上所有高變環(huán)對應(yīng)非人類免疫球蛋白的高變環(huán)，且所有或?qū)嵸|(zhì)上所有FR區(qū)均為人類免疫球蛋白序列的FR區(qū)。人源化抗體視情況也將包括(通常)人類免疫球蛋白的免疫球蛋白恒定區(qū)(Fc)的至少一部分。嚙齒動物抗體的人源化形式基本上將包含相同親本嚙齒動物抗體的CDR序列，但可包括某些氨基酸取代，以增加親和力、增加人源化抗體的穩(wěn)定性或出于其他原因。然而，因為CDR環(huán)交換會不均一地產(chǎn)生具有與來源抗體相同的結(jié)合性質(zhì)的抗體，所以也可在人源化抗體中引入框架殘基(FR)、參與支持CDR環(huán)的殘基的變化，以保留抗原結(jié)合親和力。

除非另有規(guī)定，否則在本文所用的肽標(biāo)記法中，按照標(biāo)準(zhǔn)用法及習(xí)慣，左手方向是氨基酸(N端)方向，且右手方向是羧基端(C端)方向。

相對于本文所確定的氨基酸序列的“氨基酸序列同一性百分比(％)”定義為在比對序列及視需要引入空隙以實現(xiàn)最大百分比的序列同一性，以及不考慮任何保守取代作為序列同一性的一部分之后，候選序列中的氨基酸殘基與特定多肽序列中的氨基酸殘基一致的百分比。為了確定序列同一性百分比的比對可以各種在專業(yè)技術(shù)內(nèi)的方式實現(xiàn)，例如，使用可公開獲得的計算機(jī)軟件，諸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)軟件。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可測定衡量比對的適合的參數(shù)，包括達(dá)成最大限度比對所比較序列的全長所需的任何算法。基于本文目的，兩個氨基酸序列的序列比較通過國立生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information)(NCBI)在線提供的計算機(jī)程序Blastp(蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)BLAST)而進(jìn)行。具體而言，給定氨基酸序列A相對于給定氨基酸序列B的氨基酸序列同一性百分比(其或者可表述為相對于給定氨基酸B具有某％氨基酸序列同一性的給定氨基酸序列A)由如下公式計算：

其中在用程序比對A與B時，X是通過序列比對程序BLAST記為一致匹配的氨基酸殘基的數(shù)量，且其中Y是A或B中氨基酸殘基的總數(shù)量，以較短者為準(zhǔn)。

如本文所述，蛋白質(zhì)/多肽的氨基酸序列的少量變動視為被當(dāng)前所公開及主張的發(fā)明概念所涵蓋，前提是氨基酸序列的變動保持至少80％，諸如至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％及99％。具體地，涵蓋保守氨基酸置換。保守置換是發(fā)生在側(cè)鏈相關(guān)的氨基酸家族內(nèi)的那些。基因編碼的氨基酸通常分成以下家族：(1)酸性天冬氨酸、谷氨酸；(2)堿性賴氨酸、精氨酸、組氨酸；(3)非極性丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸；以及(4)不帶電極性甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸。更優(yōu)選的家族是：絲氨酸和蘇氨酸是脂族羥基家族；天冬酰胺和谷氨酰胺是含酰胺家族；丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸是脂族家族；且苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸是芳族家族。例如，可合理地預(yù)期，單獨用異亮氨酸或纈氨酸置換亮氨酸，用谷氨酸置換天冬氨酸，用絲氨酸置換蘇氨酸，或類似地用結(jié)構(gòu)相關(guān)氨基酸置換氨基酸將不會對所得分子的結(jié)合或性質(zhì)具有重大影響，特別是在該置換并未涉及框架部位內(nèi)的氨基酸的情形下?？赏ㄟ^分析多肽衍生物的特異活性，輕易確定氨基酸變化是否產(chǎn)生功能肽。可由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員輕易制備蛋白質(zhì)/多肽的片段或類似物。片段或類似物的優(yōu)選胺基-及羧基-端出現(xiàn)在靠近功能域邊界。

如本文所使用，“抗體突變體”或“抗體變體”是指物種依賴性抗體的氨基酸序列變體，其中物種依賴性抗體的一個或多個氨基酸殘基已經(jīng)修飾。這些突變體必定與物種依賴性抗體具有小于100％序列同一性或相似性。在一個實施方案中，該抗體突變體將具有相對于物種依賴性抗體的重鏈或輕鏈可變域的氨基酸序列具有至少75％，更優(yōu)選至少80％，更優(yōu)選至少85％，更優(yōu)選至少90％以及最優(yōu)選至少95％氨基酸序列同一性或相似性的氨基酸序列。本文將相對于此序列的同一性或相似性定義為在比對序列及視需要引入空隙以實現(xiàn)最大百分比的序列同一性后，候選序列中的氨基酸序列與物種依賴性抗體殘基一致(即，相同殘基)或相似(即，基于常見側(cè)鏈性質(zhì)來自相同族群的氨基酸殘基，參見下文)的百分比。在可變域外的N端、C端或內(nèi)部延伸、缺失，或插入抗體序列均不應(yīng)視為影響序列同一性或相似性。

如本文所使用，術(shù)語抗體的“抗原結(jié)合部分”(或簡稱“抗原部分”)是指抗體的全長或者其保留特異性結(jié)合于抗原的能力的一個或多個片段。已顯示，抗體的抗原結(jié)合功能可由全長抗體的片段執(zhí)行。涵蓋在術(shù)語抗體的“抗原結(jié)合部分”內(nèi)的結(jié)合片段的實例包括Fab片段，一種由V_L、V_H、C_L及CH1結(jié)構(gòu)域組成的單價片段；F(ab)₂片段，一種包含兩個在鉸鏈區(qū)處由二硫鍵連接的Fab片段的二價片段；由V_H及CH1結(jié)構(gòu)域組成的Fd片段；由抗體的單臂的V_L及V_H結(jié)構(gòu)域組成的Fv片段；由V_H結(jié)構(gòu)域組成的dAb片段(Ward等人，1989 Nature 341:544-546)；以及分離的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)或包含這些抗原結(jié)合部分的任何融合蛋白。

除非與上下文相反，否則本文使用術(shù)語“治療”來廣泛地包括產(chǎn)生期望藥理和/或生理效果的預(yù)防性(例如，防范性)、治愈性或緩解性措施。優(yōu)選地，就部分或完全治愈或預(yù)防癌癥而言，該效果是治療性的。同樣，如本文所使用的術(shù)語“治療(treatment)”及“治療(treating)”是指向患有癌癥、具有癌癥癥狀、繼發(fā)于癌癥的疾病或病癥、癌癥傾向的受試者施加或施用本發(fā)明免疫原性糖肽、抗體或含上述任一個的藥物組合物，目的在于部分或完全緩解、改善、舒緩癌癥的一種或多種癥狀或特征、延遲其發(fā)作、抑制其進(jìn)展、減輕其嚴(yán)重性和/或降低其發(fā)生率。通常，“治療”不僅包括改良癥狀或減少疾病標(biāo)記物，而且包括中止或減緩不進(jìn)行治療將預(yù)期的癥狀的進(jìn)展或惡化。本文也可在狹義上使用術(shù)語“治療”，其僅是指旨在改善和/或治愈患者或受試者中已經(jīng)存在的疾病狀態(tài)或病狀的治愈性或緩解性措施。

如本文所使用的術(shù)語“預(yù)防”是指阻止在患者或受試者中出現(xiàn)疾病狀態(tài)或病狀的預(yù)防性措施。預(yù)防也可包括減少患者或受試者中出現(xiàn)疾病狀態(tài)或病狀的可能性及阻礙或阻止該疾病狀態(tài)或病狀的發(fā)作。

如本文所使用的術(shù)語“有效量”是指組分足以產(chǎn)生期望反應(yīng)的量。有效量可以(例如)克、毫克或微克表示，或表示為毫克/千克體重(mg/kg)。該術(shù)語也是指含活性組分或組分組合的藥物組合物的量。具體的有效或充足量將隨以下因素而變化：諸如接受治療的特定病狀、患者的身體條件(例如患者的體重、年齡或性別)、接受治療的哺乳動物或動物類型、治療持續(xù)時間、并行療法(若有)的性質(zhì)及所用具體制劑及化合物或其衍生物的結(jié)構(gòu)。

如本文所使用，術(shù)語“治療有效量”是指活性組分足以產(chǎn)生期望治療反應(yīng)的量。治療有效量也是其中治療有益效果超過化合物或組合物的任何毒性或有害效果的量。

如本文所使用，“藥學(xué)上可接受的載體”為適合受試者使用，而無不當(dāng)?shù)挠泻Ω弊饔?諸如毒性、刺激及過敏反應(yīng))且符合合理的效益/風(fēng)險比的一種。同樣，在與藥物組合物的其他成分兼容的意義上，各載體必須是“可接受的”。該載體可呈固體、半固體或液體稀釋劑、乳膏或膠囊的形式。在與制劑的其他成分兼容的意義上，載體必須是“可接受的”，且經(jīng)選擇以最大限度減少活性劑的任何降解及最大限度減少在受試者中的任何有害副作用。

術(shù)語“受試者”是指可用抗體治療的哺乳動物，包括人類。術(shù)語“受試者”意指男性及女性，除非具體指明一種性別。

所有確定的專利及其他公開案明確地以引用的方式并入本文中，目的在于描述及公開(例如)可與本發(fā)明相關(guān)的這些公開案中所述方法。提供這些公開案僅為了引用其先于本申請案的申請日期的公開內(nèi)容。就此而言，任何內(nèi)容均不應(yīng)視為承認(rèn)本發(fā)明者無權(quán)因為是先前發(fā)明或因為任何其他原因而先于這些公開內(nèi)容。所有關(guān)于日期的描述或關(guān)于這些文件的內(nèi)容的表述基于本申請者可獲得的信息，且并非以任何方式承認(rèn)該等日期或這些文件的內(nèi)容的正確性。

除非另外定義，否則本文中使用的所有技術(shù)及科學(xué)術(shù)語具有與如本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常所理解的相同含義。雖然任何已知方法、裝置及材料均可用于實踐或測試本發(fā)明，但本文描述相關(guān)方法、裝置及材料。

用于預(yù)防和/或治療癌癥的抗體

本文提供特異性結(jié)合于Globo H或其衍生物的新穎重組抗-Globo H抗體及抗-Globo H-結(jié)合肽，及其用于抗腫瘤免疫療法(諸如癌癥治療)的方法。結(jié)合于癌癥抗原后，抗體可誘導(dǎo)抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性、激活補(bǔ)體系統(tǒng)及防止受體與其配體(諸如Globo H)相互作用。在一個實施方案中，包含本文所述抗-Globo H-結(jié)合肽或抗-Globo H抗體的組合物可用于抗癌癥療法。此外，包含抗-Globo H-結(jié)合肽或抗-Globo H抗體的組合物可與其他抗腫瘤劑組合。具體地，本實施方案提供特異性抗-Globo H抗體的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)序列，其可用于各種抗-Globo H-結(jié)合肽中。具體地，本發(fā)明提供可結(jié)合于Globo H或其衍生物的人源化或嵌合抗體或者抗原結(jié)合片段。

一方面，本發(fā)明提供分離的抗-Globo H抗體或其抗原結(jié)合部分，其包含以下至少一種：由GFSLSTFDMGVG(SEQ ID NO:1)、GSSLSTFDVGVG(SEQ ID NO:2)、GFSLGTFDLGIG(SEQ ID NO:3)、GFSLSTFDLGIG(SEQ ID NO:4)的氨基酸殘基或其氨基酸序列相對于SEQ ID NO:1至4中任一個具有至少80％同一性的變體組成的重鏈互補(bǔ)決定區(qū)1(H-CDR1)；由HIWWDDDKYYNPA(SEQ ID NO:5)、HIWGDDDKYYNPA(SEQ ID NO:6)的氨基酸殘基或其氨基酸序列相對于SEQ ID NO:5及6中任一個具有至少80％同一性的變體組成的重鏈CDR2(H-CDR2)；以及由LYGNYLTSFYCDY(SEQ ID NO:7)或LSGNYLTSFYCDY(SEQ ID NO:8)、LYGNYLRSYYCDY(SEQ ID NO:9)的氨基酸殘基或其氨基酸序列相對于SEQ ID NO:7至9中任一個具有至少80％同一性的變體組成的重鏈CDR3(H-CDR3)；和

以下至少一種：由SASSSVSYMH(SEQ ID NO:10)、SASSRVSYMH(SEQ ID NO:11)、SARSSVSYMH(SEQ ID NO:12)、RASSSVSYMH(SEQ ID NO:13)的氨基酸殘基或其氨基酸序列相對于SEQ ID NO:10至13中任一個具有至少80％同一性的變體組成的輕鏈CDR1(L-CDR1)；由ATSNLAS(SEQ ID NO:14)、WTSDRYS(SEQ ID NO:15)、DTSKLAS(SEQ ID NO:16)的氨基酸殘基或其氨基酸序列相對于SEQ ID NO:14至16中任一個具有至少80％同一性的變體組成的輕鏈CDR2(L-CDR2)；以及由QQWSSNPFT(SEQ ID NO:17)、QQWSSNPLT(SEQ ID NO:18)、QQHLHIPYT(SEQ ID NO:19)的氨基酸殘基或其氨基酸序列相對于SEQ ID NO:17至19中任一個具有至少80％同一性的變體組成的輕鏈CDR3(L-CDR3)；以使得該分離的抗體或其抗原結(jié)合部分結(jié)合于Globo H。優(yōu)選地，如上所述的序列同一性為至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。

在另一個實施方案中，本發(fā)明提供一種分離的抗-Globo H抗體或其抗原結(jié)合部分，其包含(i)重鏈可變區(qū)，其包括包含選自由SEQ ID NO:1至4組成的組的H-CDR1、選自由SEQ ID NO:5及6組成的組的H-CDR2及選自由SEQ ID NO:7至9組成的組的H-CDR3的重鏈可變區(qū)，以及(ii)輕鏈可變區(qū)，其包括選自由SEQ ID NO:10至13組成的組的L-CDR1、選自由SEQ ID NO:14至16組成的組的L-CDR2及選自由SEQ ID NO:17至19組成的組的L-CDR3。優(yōu)選地，H-CDR1是SEQ ID NO:3；H-CRD2是SEQ ID NO:5；H-CDR3是SEQ ID NO:8；L-CDR1是SEQ ID NO:10；L-CDR2是SEQ ID NO:16；且L-CDR3是SEQ ID NO:18。

在其他實施方案中，H-CDR1具有SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的氨基酸序列；H-CDR2具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列；H-CDR3具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列；L-CDR1具有SEQ ID NO:12的氨基酸序列；L-CDR2具有SEQ ID NO:16的氨基酸序列，且L-CDR3具有SEQ ID NO:18的氨基酸序列。

一方面，本發(fā)明提供一種重鏈可變區(qū)，其包括包含選自由SEQ ID NO:1至4組成的組的H-CDR1、選自由SEQ ID NO:5及6組成的組的H-CDR2及選自由SEQ ID NO:7至9組成的組的H-CDR3的重鏈可變區(qū)。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供一種重鏈可變區(qū)，其包含作為H-CDR1的SEQ ID NO:3、作為H-CDR2的SEQ ID NO:5及作為H-CDR3的SEQ ID NO:8。

一方面，本發(fā)明提供一種輕鏈可變區(qū)，其包括選自由SEQ ID NO:10至13組成的組的L-CDR1、選自由SEQ ID NO:14至16組成的組的L-CDR2及選自由SEQ ID NO:17至19組成的組的L-CDR3。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供一種輕鏈可變區(qū)，其包含作為L-CDR1的SEQ ID NO:12、作為L-CDR2的SEQ ID NO:16及作為L-CDR3的SEQ ID NO:18。

在一個實施方案中，該分離的抗-Globo H抗體是單克隆抗體。Globo H的單克隆抗體可根據(jù)相關(guān)技術(shù)中的知識及技術(shù)制備。例如，其可通過給測試受試者注射本發(fā)明Globo H綴合物，然后分離表達(dá)具有期望序列或功能特性的抗體的雜交瘤制備。

利用常規(guī)程序(例如，通過使用能特異性結(jié)合于編碼單克隆抗體的重鏈及輕鏈的基因的寡聚核苷酸探針)很容易分離及定序編碼單克隆抗體的DNA。雜交瘤細(xì)胞充當(dāng)此DNA的優(yōu)選來源。分離后，可將DNA置于表達(dá)載體中，然后使其轉(zhuǎn)染進(jìn)入不會以其他方式產(chǎn)生免疫球蛋白的宿主細(xì)胞(諸如大腸桿菌(E.coli)細(xì)胞、猿COS細(xì)胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞或骨髓瘤細(xì)胞)，以在重組宿主細(xì)胞中合成單克隆抗體。下文將更詳細(xì)地描述抗體的重組生產(chǎn)。

在另一個實施方案中，抗體或抗體片段可自利用已知的常規(guī)技術(shù)產(chǎn)生的抗體噬菌體文庫中分離；例如使用噬菌體文庫分別分離鼠科及人類抗體。后續(xù)公開案描述通過鏈改組生產(chǎn)高親和力(nM范圍)人類抗體、以及組合感染及活體內(nèi)重組作為構(gòu)筑極大型噬菌體文庫的策略。因此，這些技術(shù)是用于分離單克隆抗體的常規(guī)單克隆抗體雜交瘤技術(shù)的可行替代。

在一個實施方案中，本發(fā)明提供一種分離的抗-Globo H抗體，其包含(i)重鏈可變區(qū)，其包含相對于SEQ ID NO:140至163中的任一氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列，以及(ii)輕鏈可變區(qū)，其包含相對于SEQ ID NO:164至199中的任一氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列。優(yōu)選地，如上所述的序列同一性為至少90％、91％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。

在一個實施方案中，本發(fā)明提供一種分離的抗-Globo H抗體，其包含(i)重鏈可變區(qū)，其包含相對于SEQ ID NO:147的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列，以及(ii)輕鏈可變區(qū)，其包含相對于SEQ ID NO:195的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供一種分離的抗-Globo H抗體，其包含(i)重鏈可變區(qū)，其包含由SEQ ID NO:147組成的氨基酸序列，以及(ii)輕鏈可變區(qū)，其包含由SEQ ID NO:195組成的氨基酸序列(MZ-2抗體)。編碼具有SEQ ID NO:147的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)的核苷酸如下：

編碼具有SEQ ID NO:195的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)的核苷酸如下：

MZ-2系列的重鏈可變區(qū)

MZ-2系列的輕鏈可變區(qū)

在另一個實施方案中，本發(fā)明分離的抗-Globo H抗體是能特異性結(jié)合于Globo H的人源化或嵌合抗體或者其片段。

在另一個實施方案中，本發(fā)明提供一種人源化抗-Globo H抗體或其抗原結(jié)合部分，其包含(i)重鏈可變區(qū)，其包含相對于SEQ ID NO:20至43中的任一氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列，以及(ii)輕鏈可變區(qū)，其包含相對于SEQ ID NO:44至79及200至235中的任一氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列。優(yōu)選地，如上所述的序列同一性為至少90％、91％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。

在另一個實施方案中，本發(fā)明提供一種人源化抗-Globo H抗體或其抗原結(jié)合部分，其包含(i)重鏈可變區(qū)，其包含選自由SEQ ID NO:20至43組成的組的氨基酸序列，以及(ii)輕鏈可變區(qū)，其包含選自由SEQ ID NO:44至79及200至235組成的組的氨基酸序列。在另一個實施方案中，該人源化抗-Globo H抗體或其抗原結(jié)合部分包括包含由SEQ ID NO:27組成的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)，以及包含由SEQ ID NO:75組成的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)(hMZ-2Lw抗體)。在另一個實施方案中，該人源化抗-Globo H抗體或其抗原結(jié)合部分包括包含由SEQ ID NO:27組成的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)，以及包含由SEQ ID NO:231組成的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。

hMZ-2系列的重鏈可變區(qū)

hMZ-2系列的輕鏈可變區(qū)

在另一個實施方案中，本發(fā)明提供一種人源化抗-Globo H抗體或其抗原結(jié)合部分，其包含(i)重鏈可變區(qū)，其包含相對于SEQ ID NO:80至103中的任一氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列，以及(ii)輕鏈可變區(qū)，其包含相對于SEQ ID NO:104至139中的任一氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列。優(yōu)選地，如上所述的序列同一性為至少90％、91％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。

在另一個實施方案中，本發(fā)明提供一種人源化抗-Globo H抗體或其抗原結(jié)合部分，其包含(i)重鏈可變區(qū)，其包含選自由SEQ ID NO:80至103組成的組的氨基酸序列，以及(ii)輕鏈可變區(qū)，其包含選自由SEQ ID NO:104至139組成的組的氨基酸序列。

在另一個實施方案中，該人源化抗-Globo H抗體或其抗原結(jié)合部分包括包含由SEQ ID NO:90組成的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)，以及包含由SEQ ID NO:135組成的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)(MK1抗體)。

MK1系列的重鏈可變區(qū)

MK1系列的輕鏈可變區(qū)

人源化抗體具有一個或多個來自非人類來源的氨基酸殘基。非人類氨基酸殘基通常稱為“輸入”殘基，且通常取自“輸入”可變域。通?？砂凑沾隧椉夹g(shù)中已知的常規(guī)方法，通過用嚙齒動物CDR群或CDR序列取代人類抗體的相應(yīng)序列進(jìn)行人源化。因此，這些“人源化”抗體是其中實質(zhì)上少于完整的人類可變域已經(jīng)被非人類物種的相應(yīng)序列取代的抗體。在操作時，人源化抗體通常是其中一些CDR殘基及可能一些FR殘基經(jīng)非人類(例如，嚙齒動物)抗體中類似位點的殘基取代的人類抗體。

選擇用于制造人源化抗體的人類可變域(輕鏈及重鏈)對減少抗原性極為重要。針對已知人類可變域序列的整個文庫篩選嚙齒動物抗體的可變域的序列。然后接受最接近嚙齒動物序列的人類序列作為人源化抗體的人類框架(FR)。另一方法使用衍生自輕鏈或重鏈的特定子群的所有人類抗體的共有序列的特定框架。幾種不同人源化抗體可使用相同框架。

另外，重要的是，使經(jīng)人源化的抗體保留有針對抗原的高親和力及其他有利生物性質(zhì)。為實現(xiàn)此目標(biāo)，根據(jù)一種優(yōu)選方法，通過使用親本及人源化序列的三維模型分析親本序列及各種概念人源化產(chǎn)品的方法制備人源化抗體。三維免疫球蛋白模型通?？梢匀〉茫覟楸绢I(lǐng)域的技術(shù)人員所熟悉。可獲得說明及顯示選定候選免疫球蛋白序列的可能三維構(gòu)型結(jié)構(gòu)的計算機(jī)程序。檢查這些顯示物即可分析殘基在候選免疫球蛋白序列的功能中的可能作用，即分析影響候選免疫球蛋白結(jié)合其抗原的能力的殘基。以此方式，F(xiàn)R殘基可選自接受者及輸入序列并組合，使得達(dá)到期望抗體特性，諸如提高針對目標(biāo)抗原的親和力。一般而言，CDR殘基直接且最顯著地參與影響抗原結(jié)合。

在一個實施方案中，本發(fā)明提供一種嵌合抗-Globo H抗體或其抗原結(jié)合部分，其包含(i)重鏈可變區(qū)，其包含相對于SEQ ID NO:140至163中的任一氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列，其中該等氨基酸序列的倒數(shù)第三個序列V變成I，以及(ii)輕鏈可變區(qū)，其包含相對于SEQ ID NO:164至199中的任一氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列。優(yōu)選地，如上所述的序列同一性為至少90％、91％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。

在一個實施方案中，本發(fā)明提供一種嵌合抗-Globo H抗體或其抗原結(jié)合部分，其包含(i)重鏈可變區(qū)，其包含相對于SEQ ID NO:147的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列，其中該氨基酸序列的倒數(shù)第三個序列V變成I，以及(ii)輕鏈可變區(qū)，其包含相對于SEQ ID NO:195的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供一種分離的抗-Globo H抗體(cMZ-2)，其包含(i)重鏈可變區(qū)，其包含由SEQ ID NO:147組成的氨基酸序列，其中該氨基酸序列的倒數(shù)第三個序列V變成I，以及(ii)輕鏈可變區(qū)，其包含由SEQ ID NO:195組成的氨基酸序列。

嵌合抗體可根據(jù)此項技術(shù)中已知的常規(guī)方法生產(chǎn)。此項技術(shù)中已知生產(chǎn)嵌合抗體的方法。參見例如Morrison,Science 229:1202(1985)；Oi等人，BioTechniques 4:214(1986)；Gillies等人，(1989)J.Immunol.Methods 125:191-202；美國專利第5,807,715號、第4,816,567號及第4,816,397號。此外，可使用開發(fā)用于生產(chǎn)“嵌合抗體”的技術(shù)(Morrison等人，1984,Proc.Natl.Acad.Sci.81:851-855；Neuberger等人，1984,Nature 312:604-608；Takeda等人，1985,Nature 314:452-454，所述文獻(xiàn)以全文引用的方式并入本文中)，其通過剪接具有適合的抗原特異性的小鼠抗體分子的基因以及來自具有適合的生物活性的人類抗體分子的基因。在一些實施方案中，可用(例如)小鼠單克隆抗體的輕鏈及重鏈的恒定域取代1)(例如)人類抗體的那些區(qū)域以產(chǎn)生嵌合抗體或2)非免疫球蛋白多肽以產(chǎn)生融合抗體。在其他實施方案中，恒定域被截短或移除，以產(chǎn)生單克隆抗體的期望抗體片段。此外，可變區(qū)的定點或高密度突變可用于優(yōu)化單克隆抗體的特異性、親和力等。

本發(fā)明抗體的組合物

在另一方面，本發(fā)明提供一種包含抗-Globo H抗體或其抗原結(jié)合部分的藥物組合物。本發(fā)明抗體也可配制成藥物組合物。除該抗體或其抗原結(jié)合部分以外，該藥物組合物還包含藥學(xué)上可接受的載體。

施用本文所述抗-Globo H抗體或其抗原結(jié)合部分可包括配制成用于胃腸外施用(例如，靜脈內(nèi))、經(jīng)粘膜(例如，經(jīng)鼻內(nèi))、經(jīng)眼或其他施用模式的藥物組合物或藥物制劑。在一些實施方案中，本文所述抗-Globo H抗體或其抗原結(jié)合部分可與任何藥學(xué)上可接受的載體化合物、材料或組合物一起施用，其導(dǎo)致有效治療受試者。因此，用于本文所述方法的藥物制劑/組合物可包含如本文所述的抗-Globo H抗體或其抗原結(jié)合部分及一種或多種藥學(xué)上可接受的載體。

短語“藥學(xué)上可接受的”是指那些在合理范圍的醫(yī)療判斷下適于與人類及動物組織接觸而無過度毒性、刺激性、過敏反應(yīng)或其他問題或并發(fā)癥，且符合合理的效益/風(fēng)險比的化合物、材料、組合物和/或劑型。如本文所使用的短語“藥學(xué)上可接受的載體”意指參與維持如本文所述的抗-Globo H抗體或其抗原結(jié)合部分的穩(wěn)定性、溶解性或活性的藥學(xué)上可接受的材料、組合物或媒介物，諸如液體或固體填充劑、稀釋劑、賦形劑、溶劑、介質(zhì)、包封材料、制造助劑(例如，潤滑劑、滑石粉、硬脂酸鎂、硬脂酸鈣或硬脂酸鋅，或硬脂酸)或溶劑包封材料。各載體必須在與制劑的其他成分兼容的意義上是“可接受的”且對患者不會造成傷害。術(shù)語“賦形劑”、“載體”、“藥學(xué)上可接受的載體”及類似用語在本文中可互換使用。

如本文所述的抗-Globo H抗體或其抗原結(jié)合部分可特別地經(jīng)配制，以向受試者施用呈固體、液體或凝膠形式的化合物，其包括那些適合以下者：(1)胃腸外施用，例如通過皮下、肌肉內(nèi)、靜脈內(nèi)或硬膜外注射，例如作為無菌溶液或混懸液，或持續(xù)釋放制劑；(2)局部施加，例如，作為霜劑、油膏或控制釋放貼片或噴霧施加至皮膚；(3)經(jīng)陰道內(nèi)或直腸內(nèi)，例如，作為子宮托、霜劑或發(fā)泡體；(4)經(jīng)眼；(5)經(jīng)皮；(6)經(jīng)粘膜；或(79)經(jīng)鼻。此外，如本文所述的抗-Globo H抗體或其抗原結(jié)合部分可植入患者內(nèi)或用藥物遞送系統(tǒng)注射。

根據(jù)下文呈現(xiàn)的各種工作實例，一周施用本發(fā)明抗體兩次的成年C57BL/6小鼠(重20至25克)在接種后第3至21天實現(xiàn)腫瘤尺寸減小。因此，在本發(fā)明的某些實施方案中，針對小鼠的抗體的治療有效量可表示為0.8至100mg/kg體重。上述鼠科有效量的HED是約0.65至81.5mg/kg體重。根據(jù)本發(fā)明的各種實施方案，當(dāng)受試者是人類時，抗體的治療有效量可為至少1mg/kg。依據(jù)疾病的類型及嚴(yán)重性，約1mg/kg至150mg/kg(例如，0.1至20mg/kg)的如本文所述的抗-Globo H抗體或其抗原結(jié)合部分是施用至受試者的初始候選劑量，無論(例如)通過一次或多次施用還是通過連續(xù)輸注。典型日劑量可介于約1mg/kg至約100mg/kg或更多的范圍內(nèi)，端視上述因素而定。典型劑量包括(例如)5mg/kg、10mg/kg、20mg/kg及30mg/kg。就在幾天或更長時間內(nèi)重復(fù)施用而言，依據(jù)病狀，治療持續(xù)至(例如)癌癥得到治療，其為由上文所述或此項技術(shù)中已知的方法測量。

施用模式

在另一方面，本發(fā)明提供一種治療和/或預(yù)防癌癥的方法，其包括向有此需要的受試者施用治療有效量的如本文所述的抗-Globo H抗體或其抗原結(jié)合部分或包含如本文所述的抗-Globo H抗體或其抗原結(jié)合部分的藥物組合物。

向受試者施用該抗體或包含其的藥物組合物賦予該受試者被動保護(hù)，且因此為癌癥(諸如腫瘤相關(guān)碳水化合物表達(dá)癌；優(yōu)選地，乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、結(jié)腸直腸癌及肺癌)提供預(yù)期療效。

在一些實施方案中，將如本文所述的抗-Globo H抗體或其抗原結(jié)合部分或包含如本文所述的抗-Globo H抗體或其抗原結(jié)合部分的藥物組合物施用至患有癌癥的受試者，該癌癥欲通過全身遞送該制劑或遞送至所需表面或目標(biāo)的任何施用模式抑制，且施用模式可包括但不限于注射、輸注、滴注及吸入施用。在如本文所述的抗-Globo H抗體或其抗原結(jié)合部分或包含如本文所述的抗-Globo H抗體或其抗原結(jié)合部分的藥物組合物可保護(hù)免于在腸中滅活的程度而言，也涵蓋口服施用形式?！白⑸洹卑ǖ幌抻陟o脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、動脈內(nèi)、鞘內(nèi)、室內(nèi)、囊內(nèi)、眼窩內(nèi)、心內(nèi)、皮內(nèi)、腹膜內(nèi)、經(jīng)氣管、皮下、表皮下、關(guān)節(jié)內(nèi)、囊下、蜘蛛膜下、脊柱內(nèi)、大腦脊柱內(nèi)及胸骨內(nèi)注射及輸注。在一個優(yōu)選實施方案中，用于本文所述方法中的如本文所述的抗-Globo H抗體或其抗原結(jié)合部分或包含如本文所述的抗-Globo H抗體或其抗原結(jié)合部分的藥物組合物通過靜脈內(nèi)輸注或注射施用。

如本文所使用的短語“胃腸外施用”及“經(jīng)胃腸外施用”是指不同于經(jīng)腸及局部施用的施用模式，通常通過注射。如本文所使用的短語“全身施用”、“經(jīng)全身施用”、“外周施用”及“經(jīng)外周施用”是指不同于直接進(jìn)入目標(biāo)位點、組織或器官(諸如腫瘤位點)地施用雙特異性或多特異性多肽劑，以使得其進(jìn)入受試者的循環(huán)系統(tǒng)，且因此經(jīng)歷代謝及其他類似過程。

在一些實施方案中，本文所提供的通過向患有癌癥或具有患癌癥風(fēng)險的受試者施用治療有效量的如本文所述的抗-Globo H抗體或其抗原結(jié)合部分或包含如本文所述的抗-Globo H抗體或其抗原結(jié)合部分的藥物組合物抑制或治療該受試者的癌癥的方法可還包括施用一種或多種其他治療，諸如血管生成抑制劑、化療、放射、手術(shù)或本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知可預(yù)防和/或治療癌癥的其他治療。

提供以下實施例來闡述本發(fā)明的某些方面及協(xié)助本領(lǐng)域的技術(shù)人員實施本發(fā)明。這些實施例絕不應(yīng)視為以任何方式限制本發(fā)明范圍。無需進(jìn)一步詳述，據(jù)信本領(lǐng)域的技術(shù)人員基于本文描述即可最大限度使用本發(fā)明。本文所引用的所有公開案的全文以引用的方式并入本文中。

實施例

實施例1 生產(chǎn)抗Globo H的單克隆抗體、嵌合抗體和人源化抗體

以皮下注射6μg Globo H-PADRE糖肽(其中PARDE代表多肽AKXVAAWTLKAAA(SEQ ID NO:238))和50μl弗氏完全佐劑(CFA；來自Sigma)免疫接種成年雌性C57BL/6小鼠(各組n＝3；5周齡大；平均重量16至20克；購自Biolasco,Taiwan)。以2周間隔提供四次免疫接種。第四次免疫接種三天后，收獲經(jīng)免疫的脾細(xì)胞，并用無血清培養(yǎng)基清洗。隨后，將1x10⁸個單細(xì)胞懸浮的脾細(xì)胞與2x10⁷個FO細(xì)胞混合在一起，并在37℃下，于1ml 50％PEG 1500溶液(Roche)中進(jìn)行細(xì)胞融合，然后逐滴添加13ml溫?zé)酭PMI培養(yǎng)基(Gibco)。對融合細(xì)胞離心，并用完全培養(yǎng)基清洗兩次。再將細(xì)胞懸浮于具有1xBM-調(diào)整的H1雜交瘤選殖補(bǔ)充劑(Roche)的完全培養(yǎng)基中，并接種于96孔盤中。就目標(biāo)特異性B細(xì)胞-骨髓瘤細(xì)胞融合而言，經(jīng)免疫脾細(xì)胞與Globo H-生物素(10μg/ml)在4℃下于無血清RPMI培養(yǎng)基中孵育3小時。用相同培養(yǎng)基清洗三次后，使帶有Globo H-生物素的細(xì)胞以1x10⁸個細(xì)胞/ml的濃度再次懸浮，并與鏈霉抗生物素(50μg/ml)在4℃下孵育30分鐘。與此同時，F(xiàn)O細(xì)胞與50μg/ml NHS-生物素在4℃下孵育1小時。然后用無血清RPMI培養(yǎng)基清洗兩種經(jīng)處理的細(xì)胞三次。然后，將1x10⁸個脾細(xì)胞與2x10⁷個FO細(xì)胞混合在一起，并如上所述進(jìn)行化學(xué)細(xì)胞融合。細(xì)胞融合后，將細(xì)胞在含1xHAT培養(yǎng)基(Gibco)的RPMI 1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，以備進(jìn)一步篩選。

透過有限稀釋，通過對經(jīng)Globo H-生物素抗原涂布的盤的ELISA分析，篩選產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。獲得能分泌高效價抗-Globo H IgG或IgM抗體的五種純系(分別命名為MZ-1至MZ-5)。

來自這些雜交瘤細(xì)胞株的上清液也接受細(xì)胞結(jié)合分析。簡而言之，100μl來自雜交瘤培養(yǎng)物的上清液與2x105個MCF-7細(xì)胞孵育，然后通過流式細(xì)胞儀以下文提及的適合的熒光二級抗體進(jìn)行分析。用2ml 1x PBS清洗細(xì)胞一次。離心后，棄去清洗緩沖液，并再將細(xì)胞懸浮于100μl以1:100稀釋的PE抗小鼠IgG-Fc(Jackson immunoresearch)或100μl以1:100稀釋的PE抗小鼠IgM(eBioscience)中，并再次在室溫下孵育20分鐘。用PBS清洗細(xì)胞，并在離心后再懸浮于200μl 1x PBS中。通過流式細(xì)胞儀檢測抗體與細(xì)胞的結(jié)合。圖1A至E中提供的結(jié)果顯示，MZ-2雜交瘤所產(chǎn)生的單克隆抗體(參見圖1C)(下文為MZ-2抗體)對MCF-7細(xì)胞具有良好結(jié)合親和力。為了比較，也分析市售抗-Globo H IgG3抗體(參見圖E)、VK9抗體(參見圖B)(eBioscience)。

首先將MZ-2抗體的重鏈和輕鏈的可變區(qū)選殖至人類IgG1和κ鏈保守區(qū)表達(dá)載體，以形成小鼠-人類嵌合MZ-2(cMZ-2)。cMZ-2抗體已基于結(jié)構(gòu)分析和序列同源性通過CDR接枝進(jìn)行人源化。人源化MZ-2抗體(hMZ-2)可輕易在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)為重組IgG，并保留親本小鼠抗體的抗原結(jié)合親和力和特異性。我們進(jìn)一步通過使CDR和位于CDR側(cè)面的框架序列選擇性突變改良其結(jié)合親和力。通過電穿孔將人源化構(gòu)筑體進(jìn)一步轉(zhuǎn)染至FO細(xì)胞中，并通過相關(guān)抗生素篩選以產(chǎn)生穩(wěn)定表達(dá)純系。通過流式細(xì)胞儀分析，檢查由FO細(xì)胞所產(chǎn)生的抗體。為獲得大規(guī)模hMZ-2抗體進(jìn)行活體內(nèi)抗腫瘤分析，首先將1x106個hMZ-2表達(dá)FO細(xì)胞i.p.注射至NOD/SCID小鼠中。2周后收獲這些小鼠的腹水，并通過蛋白質(zhì)G瓊脂糖柱來純化所產(chǎn)生的抗體。對由此獲得的hMZ-2抗體定序。將hMZ-2抗體、hMz-2Lw(重鏈可變區(qū)：SEQ ID No.27；輕鏈可變區(qū)SEQ ID No.75)和MK1(重鏈可變區(qū)：SEQ ID No.290；輕鏈可變區(qū)SEQ ID No.135)用于以下實施例中。

實施例2 MZ-2單克隆抗體對原發(fā)性卵巢癌細(xì)胞的結(jié)合親和力

在IRB核準(zhǔn)且患者同意下獲得原發(fā)性人類卵巢癌組織。通過MASC腫瘤解離試劑盒(MASC，130-095-929)消化卵巢癌組織。在4℃.下用MZ-2單克隆抗體(10μg/ml；100μl)將單細(xì)胞混懸液染色30分鐘，并用二級抗體抗小鼠IgG1 PE(1:50；eBioscience,2-405-82)染色，然后在室溫下用4％多聚甲醛固定1分鐘。然后在4℃下用FITC-綴合小鼠抗人類EpCAM(1:50；biolegend，324204)和小鼠抗人類SSEA4(1:50；biolegend，330408)將細(xì)胞染色30分鐘。在Becton Dickinson FACScan(BD FACSCalibur)上進(jìn)行流式細(xì)胞分析。圖2顯示，本發(fā)明MZ-2單克隆抗體較好地結(jié)合于原發(fā)性卵巢癌細(xì)胞。通過代表性流式細(xì)胞儀顯示，大多數(shù)上皮原發(fā)性癌細(xì)胞經(jīng)MZ-2或SSEA4抗體染色。EpCAM染色此處表示上皮細(xì)胞的標(biāo)記物。

實施例3 MZ-2抗體的特異性分析

通過功能性珠粒綴合緩沖液組(BD)，將生物素化碳水化合物經(jīng)由抗生物素蛋白綴合于BD細(xì)胞珠粒上。首先，對75μL功能性珠粒超音處理，并在室溫下與1.9μL 1M DTT孵育1小時。同時，將20μL各生物素-碳水化合物(0.2mg/mL)與90μg經(jīng)馬來酰亞胺活化的中性鏈親和素(1mg/mL于偶合緩沖液中；Pierce)混合，并在室溫下孵育1小時。用1mL偶合緩沖液清洗珠粒3次，并再懸浮于20μL偶合緩沖液中。然后將碳水化合物與經(jīng)設(shè)計珠粒混合在一起，并另外孵育一小時。然后將2μL N-乙基馬來酰亞胺(2mg/mL含于DMSO中，Pierce)添加至綴合珠粒，并另外孵育15分鐘。清洗3次后，將該等珠粒懸浮于500μL儲存緩沖液中備用。

為檢測抗-Globo H抗體的特異性和相對效價，混合各組碳水化合物綴合珠粒，并各自以1:50稀釋。然后將50μL珠?；旌衔镛D(zhuǎn)移至V型底96孔盤，并與50μL以1:1000稀釋的血清或1μg/mL MZ-2抗體混合。孵育30分鐘后，用150μL清洗緩沖液清洗珠粒，并另外用100μL PE-綴合2Ab(Jackson Immunoresearch)染色。通過FACS檢測抗-Globo H抗體的結(jié)合。圖3顯示，MZ-2抗體的特異性是由MZ-2和嵌合MZ-2抗體僅結(jié)合于Globo H-綴合珠粒，但不結(jié)合于SSEA3-或SSEA4-綴合珠粒的事實指示。

實施例4 模擬小鼠和人源化MZ-2單克隆抗體的蛋白質(zhì)折疊

通過免疫球蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(Prediction of Immunoglobulin Structure)在線程序模擬原始和人源化MZ-2純系中的可變區(qū)的3-D結(jié)構(gòu)。圖4A和B顯示小鼠MZ-2單克隆抗體(圖4A)和人源化MZ-2單克隆抗體(圖4B)的蛋白質(zhì)折疊模擬。

實施例5 本發(fā)明抗體的締合和解離曲線擬合以及KD計算

通過Biolayer干涉儀，使用FortrBio OcTet系統(tǒng)檢測抗-Globo H抗體的結(jié)合親和力。簡而言之，首先將傳感器浸泡于20μM生物素化Globo H中，以將Globo H涂布于其表面上。將MZ-2純系(mMZ-2)、小鼠-人類嵌合MZ-2純系(cMZ-2)和人源化MZ-2純系(hMZ-2L、MK-1或hMZ-2Lw)連續(xù)稀釋至1333、444.4、148.1、49.4和16.5nM，并分別與涂布Globo H的傳感器孵育。使用10mM甘氨酸(pH 1.5)作為再生緩沖液。圖5A和B顯示對MZ-2抗體進(jìn)行生物傳感器(biacore)完整結(jié)合動力學(xué)分析。詳細(xì)結(jié)合動力學(xué)參數(shù)(締合速率，ka，解離速率，kd，以及親和力常數(shù)，KD)通過完整動力學(xué)分析測定。顯示各抗體的感測圖。三種人源化MZ-2抗體(hMZ-2L(參見圖5C)、MK-1(參見圖5D)和hMZ-2Lw(參見圖5E))以及嵌合MZ-2(cMZ-2)抗體(參見圖5B)的KD值類似。

實施例6 嵌合MZ-2(IgG1 κ)對乳腺癌MCF-7細(xì)胞的CDC分析

在RPMI 1640培養(yǎng)基中，將MCF-7、TOV21G Globo H(+)和HPAC細(xì)胞調(diào)整為2x106個細(xì)胞/mL，并將50μL稀釋細(xì)胞的等分試樣添加至流管中。在RPMI 1640培養(yǎng)基中，將嵌合MZ-2抗體稀釋至2x指定濃度，并將50μL等分試樣添加至各具有癌細(xì)胞的流管中。將人類IgG(Fitzgerald，31-AI06)稀釋至相同濃度作為對照。15分鐘后，將100μL來自健康人類提供者的正常人類血清添加至各管中，并在37℃下孵育2小時。用完全培養(yǎng)基清洗細(xì)胞一次，并再懸浮于200μL具有0.5μg/mL的碘化丙錠的完全培養(yǎng)基中。用FACS分析死亡細(xì)胞的百分比。

如圖6中所報告，補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性(CDC)分析的結(jié)果顯示，含超過1.6μg/ml hMZ-2Lw抗體的人類血清在乳腺癌MCF-7細(xì)胞中引起補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性。CDC以劑量依賴性方式增加。在卵巢癌和胰腺癌細(xì)胞中也觀察到類似趨勢，其中濃度高于約10和20μg/ml的hMZ-2Lw抗體在人類卵巢癌細(xì)胞株TOV21G(圖7)或胰腺癌細(xì)胞株HPAC(參見圖8)中產(chǎn)生劑量依賴性細(xì)胞毒性。

實施例7 hMZ-2Lw和MK1抗體對MCF-7細(xì)胞的ADCC分析

簡而言之，預(yù)先將7.5x10³個(100μL)各細(xì)胞接種于96-孔分析盤(Corning目錄號3917)的指定孔中，并在37℃下于CO2培養(yǎng)箱中孵育過夜。將人源化抗-Globo H抗體純系hMZ-2Lw或MK1稀釋至3x最高分析濃度和8次4x連續(xù)稀釋。使用相同濃度的正常人類IgG作為對照。通過ADCC Reporter生物分析試劑盒(Promega目錄號G7010)，以10:1的E/T比進(jìn)行ADCC分析，并通過化學(xué)發(fā)光讀取器(EnSpire 2300，PerkinElmer)檢測。誘導(dǎo)的ADCC反應(yīng)的倍數(shù)按照下文等式計算：

誘導(dǎo)倍數(shù)計算值＝RLU(誘導(dǎo)–背景)/RLU(無抗體對照–背景)

圖9A和B以及圖10A和B分別概述本發(fā)明hMZ-2Lw和MK1抗體對MCF-7細(xì)胞(乳腺癌細(xì)胞株)和TOV21G細(xì)胞(卵巢癌細(xì)胞株)的抗原依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC)活性。一般而言，這些結(jié)果顯示，本發(fā)明人源化MZ-2抗體可在MCF-7和TOV21G細(xì)胞中引起有效且劑量依賴性ADCC。

實施例8 人源化MZ-2抗體、hMZ-2Lw和MK1的抗腫瘤效果

為建立腹膜內(nèi)卵巢腫瘤模型，將1x10⁶個TOV21G細(xì)胞經(jīng)腹膜內(nèi)(i.p.)注射至5周齡雌性NU/NU小鼠(BioLASCO Taiwan)中。兩天后，將小鼠分成4組，并經(jīng)由尾部靜脈(i.v.)途徑施用100μg(以5mg/kg的治療劑量)人類IgG、抗-GloboH抗體hMZ-2Lw或MK1，一周兩次。將未經(jīng)處理的小鼠設(shè)定為對照。為監(jiān)測腫瘤生長，在各不同批次實驗中，給荷瘤小鼠i.p.注射200μL熒光素(3.9mg/ml)，并通過非侵入式IVIS系統(tǒng)(Xenogen)以固定曝露條件檢測各小鼠的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度。圖11中的代表性照片顯示，施用hMZ-2Lw和MK1抗體均顯著抑制腫瘤生長，而對照IgG抗體實質(zhì)上不影響腫瘤生長。然而，本發(fā)明hMZ-2抗體顯著減小腫瘤尺寸。在處理后24天時，提供hMZ-2Lw抗體的小鼠中的腫瘤幾近消失。

為建立皮下乳腫瘤模型，首先將17b-雌二醇(Innovative Research of America，SE-121)皮下(s.c.)植入至NU/NU小鼠(BioLASCO Taiwan)中。三天后，將與基質(zhì)膠混合的3x10⁶個MCF-7細(xì)胞s.c.植入(異種移植)至小鼠中。腫瘤挑戰(zhàn)18天后，將小鼠分成3組(n＝7)，并i.v.(經(jīng)由尾部靜脈)用治療劑量(5mg/kg)的人類IgG(100μg/小鼠)或100μg/小鼠的hMZ-2Lw抗體處理，一周兩次。將無處理的小鼠設(shè)定為對照。每周用卡尺測量腫瘤尺寸。圖12中顯示hMZ-2抗體在乳腺癌皮下模型MCF-7細(xì)胞中的結(jié)果。圖13A和B顯示hMZ-2抗體在胰腺癌皮下模型HPAC細(xì)胞中的結(jié)果。

實施例9 MZ-2抗體抑制表達(dá)Globo H的TOV21G細(xì)胞的遷移(I)

簡而言之，在1mL培養(yǎng)基中混合2×10⁵個Globo H-陽性TOV21G細(xì)胞和5μg小鼠IgG1同種型或MZ-2抗體(hMZ-2Lw)，并在37℃下孵育15分鐘。然后用1x PBS清洗這些細(xì)胞三次，并再懸浮于培養(yǎng)基中至2×10⁵個/mL。將一百微升細(xì)胞轉(zhuǎn)移至轉(zhuǎn)移盤(Corning)的插片中，并在CO₂培養(yǎng)箱中孵育24小時。使用未經(jīng)抗體處理的細(xì)胞或Globo H-陰性TOV21G細(xì)胞作為對照。通過棉花棒移除轉(zhuǎn)移盤膜頂側(cè)面上的那些細(xì)胞。用4％甲醛固定透過膜(底側(cè))遷移的細(xì)胞，并用結(jié)晶紫(crystal violate)染色。通過組織掃描儀(TissueGnostics)計數(shù)遷移細(xì)胞的數(shù)量。圖14顯示，MZ-2抗體抑制表達(dá)Globo H的TOV21G細(xì)胞的遷移。

實施例10 MZ-2抗體抑制表達(dá)Globo H的TOV21G細(xì)胞的遷移(II)

簡而言之，在0.5mL培養(yǎng)基中混合2×10⁵個表達(dá)Globo H的TOV21G細(xì)胞和5μg小鼠IgG1同種型(eBioscience)或MZ-2抗體(hMZ-2Lw)，并在37℃下孵育15分鐘。然后用1x PBS清洗那些細(xì)胞三次，并再懸浮于培養(yǎng)基中至4×10⁵個/mL。將一百微升細(xì)胞轉(zhuǎn)移至24-孔盤的創(chuàng)傷愈合培養(yǎng)插片(Ibid目錄號80241)的孔中，并在CO₂培養(yǎng)箱中孵育8小時。使用未經(jīng)抗體處理的細(xì)胞或Globo H-陰性TOV21G細(xì)胞作為對照。然后移除該插片，并另外保持培養(yǎng)該等細(xì)胞18小時。在移除插片后0小時至18小時，通過CCD相機(jī)拍攝細(xì)胞圖像。注意，經(jīng)MZ-2抗體處理的細(xì)胞間隔大于經(jīng)IgG1同種型對照處理者。圖15顯示，MZ-2抗體抑制表達(dá)Globo H的TOV21G細(xì)胞的遷移。

實施例11 分析本發(fā)明其他抗體

使如本文所述的具有重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的本發(fā)明抗體接受實施例2的結(jié)合親和力分析、實施例5的締合和解離分析、實施例6的CDC分析、實施例7的ADCC分析和實施例8的抗腫瘤分析，且顯示與cMZ-2抗體、hMZ-2Lw抗體和MK-1抗體類似的結(jié)果。例如，具有SEQ ID NO:27的重鏈可變區(qū)和SEQ ID NO:231的輕鏈可變區(qū)的抗體的KD值在1x10^-7至1x10^-10nM的范圍內(nèi)。