本申請要求2014年2月4日提交的61/935,763號美國臨時申請和2015年2月4日提交的14/613,658號美國實用申請的權益。

技術領域

本發(fā)明大體涉及通過5-脂氧合酶活化蛋白(FLAP)抑制劑的給藥治療由各種腦損傷事件(例如創(chuàng)傷性腦損傷、中風、多發(fā)性硬化、阿爾茨海默氏病和創(chuàng)傷后應激障礙)造成的神經(jīng)炎癥和神經(jīng)炎癥介導的損傷的方法。

背景技術：

根據(jù)疾病控制與預防中心(CDC)的統(tǒng)計，每年單是美國就報道有超過250萬創(chuàng)傷性腦損傷(TBI)的病例。據(jù)信，每年美國超過5百萬-6百萬的TBI病例沒有報道，因為這些病例的嚴重程度被認為不需要到醫(yī)院進行治療，被稱為輕度TBI(mTBI)，因此，這些病例在非醫(yī)院環(huán)境下進行治療或根本不進行任何治療。這些統(tǒng)計數(shù)據(jù)沒有包括在日常處于美國外的許多沖突中的軍人身上發(fā)生的許多TBI事件(無論是mTBI還是更嚴重的TBI)。這些統(tǒng)計數(shù)據(jù)也沒有包括美國境外的其他人身上發(fā)生的TBI事件。醫(yī)學界最近才認識到，所謂的輕度TBI的后果長期看來并不是輕度的。流行病學研究已經(jīng)確定，mTBI是一個主要的公共健康問題。臨床研究證據(jù)已經(jīng)表明，在腦損傷發(fā)生幾個月到幾年后，除了更嚴重的TBI之外，對于一些患者甚至是mTBI可導致長期的身體和神經(jīng)認知癥狀。人TBI的神經(jīng)病理學的特點是，借助于反應性星形膠質細胞、激活的小膠質細胞以及灰質區(qū)和白質束的微出血的佐證，彌漫性軸突損傷導致各腦區(qū)的功能連接的改變和長期的神經(jīng)炎癥。

急性和慢性腦損傷和退行性疾病可激活常駐腦細胞(如星形膠質細胞和小膠質細胞)并募集周邊的免疫細胞至受損的腦區(qū)，導致擴大神經(jīng)炎癥和惡化腦損害。白三烯(LT)是介導炎癥的有效的生物活性脂質。墨菲RC等，美國科學院院報(Proc Natl Acad Sci USA)，76：4275-4279頁，1979年。通過細胞的機械損傷和來自于膜甘油磷脂的花生四烯酸(AA)的酶法消解，導致開始生物合成白三烯。弗爾科G和墨菲RC，藥理學評述(Pharmacol Rev)，58，375-388頁，2006年。5-脂氧合酶(5-LO)和5-脂氧合酶活化蛋白(FLAP)的酶促作用將AA轉化成白三烯A₄(LTA₄)。該LTA₄很快通過LTA₄水解酶轉化為白三烯B₄(LTB₄)或通過LTC₄合酶轉化為白三烯C₄(LTC₄)。然后LTC₄可轉化為白三烯D₄(LTD₄)和白三烯E₄(LTE₄)，這三種白三烯(LTC₄，LTD₄，LTE₄)被統(tǒng)稱為半胱氨酰白三烯。半胱氨酰白三烯的作用最初在哮喘領域被研究，其中，已知它們能夠引起血管滲透性、外滲大分子、刺激細胞因子的釋放和收縮支氣管平滑肌。博伊斯JA，免疫學評述(Immunol.Rev)，217，168-185頁，2007年。白三烯在健康的大腦是檢測不到的。法里亞斯S等，神經(jīng)創(chuàng)傷期刊(J，Neurotraum)，26，1977-1986頁，2009年。但是，在創(chuàng)傷性腦損傷(TBI)或中風后，白三烯通過涉及浸潤嗜中性粒細胞或內源性小膠質細胞和內源性腦細胞的跨細胞機制合成。法里亞斯S，神經(jīng)化學期刊(J，Neurochem)，103，1310-1318頁，2007年；法里亞斯S等，神經(jīng)創(chuàng)傷期刊(J，Neurotraum)，26，1977-1986頁，2009年。

人們迫切需要一種能夠改善伴隨腦損傷事件(如TBI、中風、多發(fā)性硬化和阿爾茨海默氏病)的神經(jīng)炎癥和神經(jīng)退行性疾病的方法。此外，最近的一些研究似乎表明，創(chuàng)傷后應激障礙(PTSD)可具有神經(jīng)退行性疾病構成，因此，其也是用于降低神經(jīng)退行性疾病和神經(jīng)炎癥的方法的潛在候選。預防這些腦損傷事件的一系列的繼發(fā)性物理效應和認知影響是十分有利的。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明論證，在創(chuàng)傷性腦損傷(TBI)后的早期產(chǎn)生的白三烯標志著包括血腦屏障(BBB)破壞和水腫的不良反應、導致額外的細胞死亡的早期不利事件、軸突損傷和神經(jīng)損傷。另外，本發(fā)明公開并示出，腦損傷事件導致多個腦區(qū)內的長期的神經(jīng)炎癥。本申請的發(fā)明人使用腦損傷的兩種動物模型，具體為TBI的大鼠液壓沖擊損傷模型和輕度TBI的小鼠閉合性顱腦損傷(CHI)模型。發(fā)明人認為，對于除了包括中風、多發(fā)性硬化、阿爾茨海默氏病和創(chuàng)傷后應激障礙(PTSD)的TBI之外的其他腦損傷事件，該結果能夠給出指導和治療建議。發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)，通過到達中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)的FLAP抑制劑的給藥來阻滯白三烯的生成，顯著地阻滯了TBI后發(fā)生的水腫、BBB破壞、細胞死亡、神經(jīng)炎癥以及認知和運動障礙。已知FLAP抑制劑具有幾種可行的外周給藥途徑(包括口服、靜脈、栓劑和腹腔)，而且沒有報道其具有毒性或有害作用。發(fā)明人證明，繞過血腦屏障的鼻腔給藥途徑，使得FLAP抑制劑迅速地遞送給大腦，相對于全身遞送進入血液和循環(huán)系統(tǒng)而言涉及較少的藥物。因此，這類抗炎劑有希望用于介入TBI、中風、多發(fā)性硬化、阿爾茨海默氏病和創(chuàng)傷后應激障礙(PTSD)后的治療。目前還沒有治療能夠減輕TBI后的腦損傷和神經(jīng)機能障礙。

本發(fā)明進一步公開，當FLAP抑制劑在腦損傷事件前給藥，它們減輕細胞死亡、水腫和認知缺陷。因此，除了在腦損傷后不久使用FLAP抑制劑以阻滯或減輕繼發(fā)性損傷或者在長期患神經(jīng)炎癥后使用FLAP抑制劑，F(xiàn)LAP抑制劑在腦損傷事件(如TBI)中作為潛在的預防藥而具有預防作用，具有高風險的頭部損傷的群體(包括從事高度的身體接觸運動的運動員和處于戰(zhàn)斗場中的軍人)可以長期地服用FLAP抑制劑或者在預期他們易患頭部創(chuàng)傷或腦損傷的事件前服用FLAP抑制劑。第二代FLAP抑制劑具有較長的半衰期，因此可能每天給藥一次就可以防止其免受腦損傷。據(jù)信，本發(fā)明的FLAP抑制劑可用于治療與中風、多發(fā)性硬化、阿爾茨海默氏病和創(chuàng)傷后應激障礙相關的神經(jīng)炎癥。

阻滯或減弱TBI后的繼發(fā)性腦損傷的藥物很可能會防止TBI后的大多數(shù)死亡和長期殘疾。與其他藥物遞送方式相比，藥物通過鼻腔給藥具有幾大優(yōu)勢：1)鼻腔給藥繞過BBB，從而增加大腦生物利用度并允許使用不能穿過血腦屏障的化合物，2)鼻腔給藥限制了藥物進入體循環(huán)的量，從而減少對肝臟和心臟潛在的毒性，3)鼻腔給藥非常迅速，這是介入TBI的一個關鍵因素，以及4)鼻腔給藥的方法快捷而簡單，使其非常適用于預防用途或者在TBI事件后立刻服藥治療。

在一個實施例中，本發(fā)明提供一種治療動物的由腦損傷事件導致的神經(jīng)炎癥的方法，包括以下步驟：提供5-脂氧合酶活化蛋白(FLAP)抑制劑，其中，所述FLAP抑制劑能夠跨越動物的血腦屏障；一定量的所述FLAP抑制劑在腦損傷事件前或腦損傷事件后的時間對所述動物給藥，其中，所述量和所述時間足以使所述FLAP抑制劑降低由于所述腦損傷事件而在所述動物的大腦中產(chǎn)生的白三烯的水平。

在一個實施例中，本發(fā)明提供一種降低動物的由腦損傷事件造成的中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)炎癥介導的損害的方法，包括以下步驟：提供5-脂氧合酶活化蛋白(FLAP)抑制劑，其中，所述FLAP抑制劑能夠跨越動物的血腦屏障；一定量的所述FLAP抑制劑在腦損傷事件前或腦損傷事件后的時間對所述動物給藥，其中，所述量和所述時間足以使所述FLAP抑制劑降低所述動物的由腦損傷事件造成的中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)炎癥介導的損害。

在一個實施例中，本發(fā)明提供一種治療動物的由腦損傷事件導致的神經(jīng)炎癥的方法，包括以下步驟：提供5-脂氧合酶活化蛋白(FLAP)抑制劑；一定量的所述FLAP抑制劑在腦損傷事件前或腦損傷事件后的時間通過鼻腔途徑對所述動物給藥，其中，所述量和所述時間足以使所述FLAP抑制劑降低由于所述腦損傷事件而在所述動物的大腦中產(chǎn)生的白三烯的水平。

在一個實施例中，本發(fā)明提供一種降低動物的由腦損傷事件造成的中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)炎癥介導的損害的方法，包括以下步驟：提供5-脂氧合酶活化蛋白(FLAP)抑制劑；一定量的所述FLAP抑制劑在腦損傷事件前或腦損傷事件后的時間通過鼻腔途徑對所述動物給藥，其中，所述量和所述時間足以使所述FLAP抑制劑降低所述動物的由腦損傷事件造成的中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)炎癥介導的損害。

附圖說明

對于本領域的技術人員來說，結合優(yōu)選實施例的詳細描述，本發(fā)明的這些和其它特征以及優(yōu)點將變得更加顯而易見。伴隨詳細描述的附圖描述如下。

圖1是緊接著腦損傷事件或神經(jīng)炎癥并響應該腦損傷事件或神經(jīng)炎癥而在腦組織中跨細胞地生物合成白三烯的原理圖；

圖2A(左圖)是在TBI后6h利用蘇木精和伊紅(H&E)對同側左腦半球和對側右腦半球的皮質的染色的示意圖；

圖2B(右圖)證明嗜中性粒細胞或單核細胞有助于在TBI后在腦中產(chǎn)生損傷引起的白三烯，其通過長春花堿的預治療的效果進行佐證；

圖3A示出假致傷動物1h后和TBI致傷動物1h后(通過液壓沖擊損傷)的同側腦半球和對側腦半球內的LTC₄的水平；

圖3B示出空白動物、假致傷動物和TBI后頭部損傷動物的左腦半球和右腦半球內的合成LTC₄的進程；

圖4示出FLAP抑制劑MK-886在TBI前的給藥顯著地減少兩個腦半球內產(chǎn)生的白三烯LTC₄；

圖5示出FLAP抑制劑MK-886在TBI后15min的給藥完全阻滯損傷引起的白三烯LTC₄的合成；

圖6示出FLAP抑制劑MK-886在TBI前30min的預治療降低TBI后72h測定的細胞死亡的體積；

圖7的上圖示出FLAP抑制劑MK-886在TBI前或后的給藥減輕TBI后的水腫，F(xiàn)PI后72h獲得的典型的T2加權的MRI圖像，下圖示出通過使用Fiji(NIH)從各動物組獲得的5個連續(xù)的T2-MRI切片計算的平均歸一化腦腫脹的MRI定量分析；

圖8示出FLAP抑制劑MK-886在TBI后30min的給藥減少海馬CA1區(qū)的BBB滲透性，圖8A是在TBI后5h，進入海馬細胞層的EB(紅色)和進入同側海馬的DAPI(藍色)的典型的熒光圖像，圖8B是在TBI后15min，接受賦形劑或者MK-886的動物的同側CA1海馬細胞層的EB外滲的圖像的放大圖，以及圖8C是在海馬區(qū)的EB+細胞的量的EB-DAPI熒光共定位分析，柱＝200μm；

圖9示出FLAP抑制劑MK-886在TBI后30min的給藥減弱TBI，LTP后的海馬的長時程增強的不足，通過測量來自于假致傷大鼠(空心三角形，n＝8)、在FPI后30min注射賦形劑(實心圓，n＝7)或MK-886(紅色正方形，n＝7)的FPI損傷大鼠的海馬切片，數(shù)據(jù)被表示為對照fEPSP斜率的a％，所示的每個數(shù)據(jù)點是由每隔20s測量的六個數(shù)據(jù)的平均值，假致傷n＝8，F(xiàn)PI n＝9，插圖描繪一個典型的假致傷fEPSP；

圖10示出FLAP抑制劑MK-886在TBI后30min的給藥減輕在徑向臂水迷宮的學習和記憶中的TBI-引起的障礙，在第2天反向任務的堅持性測試中，第3次游泳的堅持性(在前目標臂內的持續(xù)時間)變化表示為在第1次游泳中的堅持性的百分比，以及第2天反向任務的成績表現(xiàn)為在反向任務的第11次-第15次游泳中所犯的錯誤數(shù)(平均+/-SEM)；

圖11示出FLAP抑制劑MK-886在TBI后15min的給藥減輕由TBI引起的運動缺陷，表現(xiàn)為在轉棒上具有改進的平衡運動性能；

圖12是根據(jù)本發(fā)明的FPI模型中的白三烯和TBI之間的關系的概要和示意圖；

圖13示出MK-886(實心三角形)與MK-591(實心圓形)對人全血中產(chǎn)生的LTB₄和5-HETE的效力的比較；

圖14是示出FLAP抑制劑的鼻內遞送的一個例子的示意圖；

圖15示出FLAP抑制劑MK-591在鼻腔給藥(MK-591)30min后的在大腦幾個區(qū)域中的水平與在血漿中的水平；

圖16示出FLAP抑制劑MK-591在腹腔給藥30min后的在大腦和血漿中的水平；

圖17A示出白三烯LTC₄和LTD₄在體外以劑量依賴的方式引起神經(jīng)細胞凋亡、細胞程序性死亡，圖17B示出利用DAPI和活性胱天蛋白酶9(箭頭)的抗體染色的細胞，從而驗證神經(jīng)元由于內在細胞凋亡而死亡；

圖18A，18B和18C示出假手術小鼠和小鼠閉合性顱腦損傷(CHI)模型中的小鼠在證實創(chuàng)傷性腦損傷的措施(呼吸暫停、翻正反射和掉落等待時間)方面的比較；

圖19A和19B示出假手術小鼠和小鼠閉合性顱腦損傷(CHI)模型中的小鼠的輕度TBI的兩個標記物的血漿水平之間的比較，該水平的測量在損傷后標注下的時間進行，標記物為以mg/ml計的膠質纖維酸性蛋白(GFAP)和以pg/ml計的泛素羧基末端水解酶(UCHL)；

圖20示出假手術小鼠和小鼠閉合性顱腦損傷(CHI)模型中的小鼠在損傷7天和30天后(dpi)的典型的T2加權的MRI圖像，基準尺為2mm，沒有檢測到水腫；

圖21示出在7dpi組化地利用H&E和在30dpi免疫組化地利用髓過氧化物酶(MPO)對假手術小鼠和小鼠閉合性顱腦損傷(CHI)模型中的小鼠的腦切片染色的典型圖像；

圖22A和圖22B示出在7dpi和30dpi組化地利用H&E、在7dpi和30dpi免疫組化地利用GFAP、在7dpi和30dpi免疫組化地利用離子鈣接頭蛋白抗原1(Iba-1)分別對假手術小鼠和小鼠閉合性顱腦損傷(CHI)模型中的小鼠的冠狀腦切片染色的典型圖像；圖22C是小鼠大腦的冠狀橫截面視圖，示出特別關注的區(qū)域，即大腦皮質層(CTX)、外囊(EC)、海馬CA區(qū)和齒狀回(DG)；

圖23A和23B示出在7dpi和30dpi免疫組化地利用GFAP、在7dpi和30dpi免疫組化地利用離子鈣接頭蛋白抗原1(Iba-1)分別對假手術小鼠和小鼠閉合性顱腦損傷(CHI)模型中的小鼠的皮質腦切片染色的典型圖像，下方也示出了典型的染色切片的圖，該圖示出利用相同的標記物對7dpi(左邊)和30dpi(右邊)的相似切片進行定量分析；

圖24A和24B示出在7dpi和30dpi免疫組化地利用GFAP、在7dpi和30dpi免疫組化地利用Iba-1分別對假手術小鼠和小鼠閉合性顱腦損傷(CHI)模型中的小鼠的外囊腦切片染色的典型圖像，下方也示出了典型的染色切片的圖，該圖示出利用相同的標記物對7dpi(左邊)和30dpi(右邊)的相似切片進行定量分析；

圖25A和25B示出在7dpi和30dpi免疫組化地利用GFAP、在7dpi和30dpi免疫組化地利用Iba-1分別對假手術小鼠和小鼠閉合性顱腦損傷(CHI)模型中的小鼠的齒狀回腦切片染色的典型圖像，下方也示出了典型的染色切片的圖，該圖示出利用相同的標記物對7dpi(左邊)和30dpi(右邊)的相似切片進行定量分析；

圖26A示出，響應于7dpi對假手術小鼠和小鼠閉合性顱腦損傷(CHI)模型中的小鼠的CA3的Schaffer側枝的刺激，CA1輻射層的長時程增強(LTP)的圖，其是隨著時間繪制的歸一化至預高頻刺激(HFS)基線的fEPSP記錄的最初的斜率的平均值，圖26B示出相同的樣品在58-60min的平均值；

圖27示出在7dpi免疫組化地利用GFAP和Iba-1分別對假手術小鼠和小鼠閉合性顱腦損傷模型中的小鼠的大腦皮質切片染色的典型圖像，該小鼠在死亡前和損傷后的6天內的每天腹腔注射接受5mg/kg的賦形劑(-)或MK591(+)；

圖28示出在7dpi利用GFAP和Iba-1免疫組化地對假手術小鼠和小鼠閉合性顱腦損傷(CHI)模型中的小鼠的皮層、外囊和齒狀回染色的定量分析，該小鼠在死亡前的6天內每天腹腔注射接受5mg/kg的賦形劑(-)或MK591(+)；

圖29示出持續(xù)的神經(jīng)炎癥的通路，根據(jù)本發(fā)明所呈現(xiàn)的結果，該通路據(jù)信存在于CHI(mTBL的實驗模型)所帶來的TBI中。

具體實施方式

本文的說明書和權利要求中包括以下縮寫和術語，除非另有說明，這些縮寫和術語具有確定的含義：花生四烯酸(AA)；5-脂氧合酶(5-LO)；血腦屏障(BBB)；伊文思藍(EB)；場興奮性突觸后電位(fEPSP)；5-脂氧合酶活化蛋白(FLAP)；液壓沖擊損傷(FPI)；長時程增強(LTP)；徑向臂水迷宮(RAWM)；反相液相色譜耦合串聯(lián)質譜(RP LC-MS/MS)；創(chuàng)傷性腦損傷(TBI)；人全血(HWB)；術語動物是指包括動物界的所有成員的上位概念，包括所有的哺乳動物，例如，人，家養(yǎng)動物和非家養(yǎng)動物的總稱；閉合性顱腦損傷(CHI)，特別是本說明書中所描述的小鼠模型；蘇木精和伊紅(H&E)；膠質纖維酸性蛋白(GFAP)；泛素羧基末端水解酶L1(UCHL-1)，髓過氧化物酶(MPG)，離子鈣接頭蛋白抗原1(Iba-1)，毫克(mg)，毫升(ml或mL)，皮克(pg)，納克(ng)，毫米(mm)，損傷后天數(shù)(dpi)。

蛋白5-脂氧合酶活化蛋白在20世紀80年代后期和90年代早期被發(fā)現(xiàn)，篩選為白三烯抑制劑。5-脂氧合酶(5-LO)和5-脂氧合酶活化蛋白(FLAP)的酶促作用將來自于膜甘油磷脂的花生四烯酸(AA)轉化成白三烯A₄(LTA₄)。這就啟動了白三烯的級聯(lián)，其中，LTA₄很快被LTA₄水解酶轉化為白三烯B₄(LTB₄)或被LTC₄合酶轉化為白三烯C₄(LTC₄)。然后LTC₄可轉化為白三烯D₄(LTD₄)和白三烯E₄(LTE₄)，這三種白三烯(LTC₄，LTD₄，LTE₄)被統(tǒng)稱為半胱氨酰白三烯。

FLAP發(fā)現(xiàn)后不久，F(xiàn)LAP抑制劑(包括吲哚MK-886、喹啉BAY X1005，和喹啉-吲哚MK-591)被發(fā)現(xiàn)并在哮喘的人體試驗中進行測試。B.S.Friedman，E.H.Bel，A.Buntinx，W.Tanaka，Y.H.Han，S.Shingo，R.Spector，P.Sterk，口服白三烯抑制劑(MK-886)阻滯過敏原引起的氣道反應，Am.Rev,Respir,Dis.147，839-844頁，1993年；B.Dahlen，M.Kumlin，E.Ihre，O.S.E.Dahlén，在過敏性哮喘患者中通過白三烯生物合成抑制劑BAY X1005抑制過敏原引起的氣道阻塞和白三烯的生成，Thorax 52，342-347頁，1997年；Z.Diamant，M.C.Timmers，H.Van Der Veen，B.S.Friedman,M.De Smet，M.Depre，D.Hilliard，E.H.Bel，P.J.Sterk，一種新型的5-脂氧合酶活化蛋白抑制劑MK-0591在哮喘患者體內的白三烯生物合成和過敏原引起的氣道反應中的作用，J.Allergy Clin,Immun，95，42-51頁，1995年。所有這些最初發(fā)現(xiàn)的FLAP抑制劑在阻滯哮喘患者的白三烯的產(chǎn)生上顯示出良好的安全性和功效，但是，當白三烯受體拮抗劑zafirlukast(Accolate^TM)、montelukast(Singulair^TM)、pranlukast(Onon^TM)和5-LO抑制劑zileuton(Zyflo^TM)進入市場并批準用于治療哮喘時，這些FLAP抑制劑的發(fā)展進入停滯階段。該FLAP抑制劑MK-886是1-[(4-氯苯基)甲基]-3-[(1,1-二甲基乙基)硫代]-α,α-二甲基-5-(1-甲基乙基)-1H-吲哚-2-丙酸。FLAP抑制劑MK-591是(3-[1-(4-氯芐基)-3-(叔丁基硫代)-5-(喹啉-2-基-甲氧基)-吲哚-2-基]-2,2-二甲基丙酸。FLAP抑制劑BAY-X1005是(R)-α-環(huán)戊基-4-(2-喹啉甲氧基)苯乙酸。

由于上面列出的FLAP抑制劑的發(fā)現(xiàn)已經(jīng)比較成熟，其有希望成為進一步藥物開發(fā)的領域。根據(jù)本發(fā)明的給藥的途徑，所有的FLAP抑制劑都可以在本發(fā)明中找到應用，那些具體提及的抑制劑僅僅是合適的化合物的例子，其并不是唯一有用的FLAP抑制劑。在本發(fā)明的一個實施例中，F(xiàn)LAP抑制劑通過下列途徑之一進行全身給藥：靜脈注射、腹腔途徑、口服途徑或者作為栓劑。當通過這些途徑中的任一種進行給藥的時候，合適的FLAP抑制劑能夠跨越血腦屏障，其程度足以向大腦區(qū)域提供足夠抑制FLAP的生物可利用的FLAP抑制劑，從而降低大腦中的神經(jīng)炎癥相關的白三烯。正如藥學領域的技術人員所公知的那樣，所選的FLAP抑制劑的分配系數(shù)優(yōu)選為使得相對于循環(huán)系統(tǒng)和其它組織中的濃度，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)(更具體地在大腦中的濃度)中具有足夠的濃度。優(yōu)選地，F(xiàn)LAP抑制劑針對FLAP的半抑制濃度(IC₅₀)為10nmol或更低，更優(yōu)選為5nmol或更低。

在本發(fā)明的另一實施例中，F(xiàn)LAP抑制劑經(jīng)由鼻內途徑給藥。當FLAP抑制劑通過這個途徑給藥時，F(xiàn)LAP抑制劑能夠繞過血腦屏障，并經(jīng)由鼻粘膜直接進入大腦，其沿著三叉和嗅覺神經(jīng)通路通過胞外機制傳遞以由此進入大腦。對于這條途徑，F(xiàn)LAP抑制劑不需要跨越血腦屏障的能力，因為這條路徑避開了血腦屏障。FLAP抑制劑在載體內制備，該載體可包括脂質、一種或多種植物油、磷脂酰絲氨酸或它們的混合物。這條途徑由于避開了血腦屏障而允許使用非極性的FLAP抑制劑。

除了MK-591和MK-886之外，本發(fā)明中的有用的FLAP抑制劑的其他例子包括，例如：3-[3-叔丁基磺?；?1-[4-(6-乙氧基吡啶基-3-基)芐基]-5-(5-甲基吡啶基-2-甲氧基)-1H-吲哚-2-基]-2,2-二甲基丙酸11cc(葛蘭素史克的原AM803，現(xiàn)GSK-2190915)；1-戊烷基-3-(2-碘苯甲酰)吲哚(AM679，大麻素)。

本發(fā)明直指使用FLAP抑制劑以減輕與腦損傷事件相關的繼發(fā)性神經(jīng)炎癥介導的神經(jīng)退行性疾病。據(jù)信，使用FLAP抑制劑可減輕一些腦損傷事件，作為示例地包括：創(chuàng)傷性腦損傷(TBI)、創(chuàng)傷后應激障礙(PTSD)、中風、多發(fā)性硬化、帕金森癥和阿爾茨海默氏病。

圖1是立即響應腦損傷事件(例如TBI)而在腦組織中跨細胞地生物合成白三烯的原理圖。來自于原發(fā)性損傷的受損細胞和軸突滲出三磷酸腺苷(ATP)和谷氨酸，其與小膠質細胞受體結合并由此引起鈣的內流。該鈣的內流激活鈣依賴性胞漿型磷脂酶A2(cPLA2)。該磷脂酶使得AA從膜磷脂中釋放出來，該AA被轉化為5-羥基二十碳四烯酸(5-HETE)，然后在5-LO及其活化蛋白FLAP的雙重作用下轉化為LTA₄。所產(chǎn)生的LTA₄然后通過LTA₄水解酶轉化成LTB₄，其是一種募集嗜中性粒細胞的有效的趨化介質，或者LTA₄被運出小膠質細胞并進入相鄰的星形膠質細胞和可能的神經(jīng)元，并且通過LTC₄合酶的作用轉化為LTC₄、LTD₄和LTE₄。早期產(chǎn)生的白三烯加劇了炎癥、BBB破壞和水腫，進而導致了更多的細胞死亡、軸突損傷和神經(jīng)系統(tǒng)障礙。正如將在本說明書中示出的那樣，通過FLAP抑制劑(如MK-886)阻滯白三烯的產(chǎn)生可以顯著地阻滯水腫、細胞死亡和神經(jīng)功能障礙。如圖1中進一步所示，插圖中示出的上曲線是生成LTC₄的時間進程，下曲線是生成LTD₄的時間進程，其在TBI接下來的4h內達到峰值，隨后在TBI后24h降至0。

在本說明書中，正如下面更全面描述的那樣，我們使用了兩個物種(大鼠和小鼠)的兩個TBI模型。在大鼠模型中，TBI事件通過使用側方液壓沖擊損傷(FPI)引起，而在小鼠模型中，TBI事件通過電磁控制活塞裝置(ImpactOne)使用閉合性顱腦損傷(CHI)引起。兩個模型均顯示本發(fā)明在減輕TBI影響上的價值。

實驗規(guī)程

動物

成年雄性SD大鼠(9-11周齡，250-300克；Harlan實驗室)被單獨飼養(yǎng)在自由獲取食物和水的溫控和光控的籠舍中。成年雄性C57B16/J小鼠(10-12周齡)被單獨飼養(yǎng)在自由獲取食物和水的溫控和光控的籠舍中。所描述的所有程序均在University of Colorado Institutional Animal Care and Use Committee批準的規(guī)程下操作，并遵守National institutes of Health(NIH)的Guide for the Care and Use of Laboratory Animals。

創(chuàng)傷性腦損傷(TBI)模型實驗：大鼠的側方液壓沖擊損傷(FPI)

開顱手術和側方液壓沖擊損傷(FPI)通過使用已經(jīng)經(jīng)過驗證并公布的程序進行。Farias S等，J.Neurotraum，26，1977-1986頁，2009年；Frey LC等，J.Neurosci.Methods，177，267-272頁，2009年。因為該治療規(guī)程是一個TBI模型，受該規(guī)程規(guī)范的動物被稱為具有TBI。簡而言之，大鼠用3-5％的異氟烷(Isosol,VEDCO inc.,St.Joseph,MO)通過鼻錐麻醉，并固定在立體定向頭架上。開顱創(chuàng)建一個3毫米(mm)的骨孔，開顱中心位于前囟后3mm，左矢狀縫旁3.5mm，保持暴露的硬膜完整。一個鋼支架螺絲釘埋入對側的頭骨中。內徑為3.5mm的Luer鎖輪轂圍繞著開顱手術的中心設置，其通過氰基丙烯酸膠粘劑和螺帽與頭骨結合。牙科用丙烯酸(Snap，Parkell，Inc.，Edgewood，NJ)倒在輪轂和螺絲釘周圍。在丙烯酸硬化后，圍繞著螺帽涂上抗生素軟膏，并將動物放回到它們的籠子中。第二天，大約15-20h后，在誘導箱內利用異氟烷麻醉該動物，并將它立即連到FPI裝置上，使其在從麻醉中蘇醒前接受20ms脈沖的加壓的無菌鹽水的2.7個大氣壓(atm)的壓力，以在開顱手術后的完整的硬腦膜的表面模擬中等程度的沖擊。假致傷動物進行開顱手術和麻醉并連到FPI裝置上，但是它們并沒有接受流體脈沖。在開顱手術前，所有的動物接受皮下注射鎮(zhèn)痛藥、叔丁啡、0.05mg/kg Buprenex，并且在隨后的兩天每12h進行注射。在損傷后喂食濕潤的食物，并且每天監(jiān)測所有動物的健康和體重變化。

輕度創(chuàng)傷性腦損傷(mTBI)模型實驗：小鼠的閉合性顱腦損傷(CHI)

簡單地說，成年雄性小鼠用3-5％的異氟烷通過鼻錐麻醉。由沿中線切口頭皮暴露出頭骨。然后將小鼠固定至立體定位架，利用電磁控制活塞裝置ImpactOne沖擊左側頂葉皮層。角度設定為20°，探針尺寸為5mm，速度為5m/s，停頓時間為100ms。假致傷小鼠經(jīng)歷同樣的過程直到固定到立體定位架，但是它們并沒有接受沖擊。在切開頭皮前，所有的動物接受皮下注射鎮(zhèn)痛藥、叔丁啡、0.05mg/kg Buprenex，并且在隨后的兩天每12h進行注射。在損傷后喂食濕潤的食物，并且每天監(jiān)測所有動物的健康和體重變化。

長春花堿給藥

兩組大鼠(每組四只)接受上述FPI。在FPI前四天，利用3-3.5％的異氟烷對每只動物短暫麻醉少于5min，并利用NaCl(0.9％，2ml/kg，賦形劑)進行IV給藥，或者利用長春花堿硫酸鹽(0.5mg/kg)IV給藥相同體積。在給藥4天后，長春花堿治療的動物的嗜中性粒細胞的消耗通過全血細胞計數(shù)(CBC)進行驗證。兩組均通過斷頭處死，在FPI后1h提取腦脂質。所形成的LTC₄的量通過RP LC-MS/MS進行測量，并且通過每mg蛋白歸一化，使用單因素方差分析進行比較，以及使用Student-Newman-Keuis法進行多重對比。

靜脈注射FLAP抑制劑MK-886和賦形劑

吲哚FLAP抑制劑MK-886通過以2.5mg/ml的劑量，溶解于二甲基亞砜(DMSO)中制備，然后用0.9％的鹽水稀釋至10％的DMSO。將大鼠簡單地利用3-3.5％的異氟烷進行麻醉，6mg/kg劑量的MK-886或者賦形劑通過尾靜脈注射靜脈給藥(IV)。在接受其他的程序前，所有動物允許保持清醒。

嚙齒動物的大腦中的白三烯的測量

大鼠腦脂質的提取。將來自同側和對側腦半球的皮質和海馬區(qū)收集到4ml的80％甲醇中，用Dounce勻漿器進行勻漿，并向該勻漿中加入內標物。蛋白含量使用雙金雞寧酸法(BCA)進行蛋白測定，以將脂質水平歸一化為組織的量。樣品沉淀并收集上清液。樣品稀釋至低于15％的最終的甲醇濃度，然后用固相萃取柱(Strata C18-E，100mg/1ml，Phenomenex，Torrence CA)萃取脂質。洗出液(1ml的甲醇)蒸干，并在70μl的高效液相色譜(HPLC)溶劑A(8.3mM的乙酸利用NH₄OH緩沖至pH5.7)，加上20ml的溶劑B(體積比為65/35的乙腈-甲醇)中再生。

反相液相色譜-耦合串聯(lián)質譜(RP LC-MS/MS)測量白三烯。將每個樣品等分為35μl，注入HPLC系統(tǒng)并利用C18柱(Columbus 150x1mm，5μm Phenomenex)進行反相層析，利用流動相溶劑B以50μl/min的流速進行25％-100％的線性梯度洗脫。溶劑B通過24min從25％提高到85％，通過26min提高到100％，并在接下來的12min保持在100％。HPLC的流出物直接連接到三重質譜儀(Sciex API 2000，PE-Sciex，Thornhill，Ontario，Canada)的電噴霧源，在負離子模式下使用特定轉變的多反應監(jiān)測(MRM)進行質譜分析，m/z624→272的是LTC₄，m/z495→177的是LTD₄，m/z335→195的是LTB₄，m/z339→197的是d4-LTB₄，以及m/z629→277的是d5-LTC₄。使用前述的標準同位素稀釋曲線進行定量。Farias等，J.Neurochem.，103，1310-1318頁，2007年，從Cayman Chemical，Ann Arbor，MI參照白三烯標準和穩(wěn)定的同位素類似物。

磁共振成像(MRI)

采集。所有MRI研究在University of Colorado Animal Imaging Shared Resource(AISR)進行。FPI模型的大鼠在損傷后72h進行MRI成像，使用T2-加權和Gd-增強的T1加權序列。小鼠在7dpi和30dpi進行MRI成像，使用T2加權序列。對于所有的MRI，動物用2.5％的異氟烷進行麻醉。使用4.7 Tesla Bruker PharmaSean進行掃描，具有38mm內徑的正交鳥籠線圈(調諧到200.27MHz的¹H頻率)被用于RF傳輸和接收。使用RARE(快速采集弛豫增強)序列來獲得T2加權軸向MR掃描，該序列具有以下參數(shù)：FOV：4.6cm；TE/TR：32/5000ms；切片厚度＝1.20mm；切片間距1.20mm(無間隙)；切片數(shù)量＝20；平均數(shù)量＝4/相編碼步驟；矩陣尺寸＝128x256。在0.2mmol/kg的通過IV給藥前或后，使用MSME(多層多回波)序列(11.0/700ms的TE/TR)獲得T1加權的MR圖像。

T2-加權的MRI分析。對于各大鼠，跨越損傷的整個區(qū)域的5個切片(1.2mm厚)被用于計算FPI-相關的腦腫脹。受損的同側腦半球的直徑從中線(Fiji/ImageJ，NIH)到皮質的最寬處進行測量。然后，同側(ipsi)和對側(contra)腦半球的直徑之間的差值通過使用以下公式計算并歸一化到對側腦半球的直徑中：

{(同側腦半球的直徑-對側腦半球的直徑)/對側腦半球的直徑}×100

T1-加權的MRI分析。對于各大鼠，對軟腦膜中的展示出同側和對側的T1-加權的后-Gd高信號之間的可見區(qū)別的所有的圖像進行分析。在前-Gd圖像中檢測不到軟腦膜的高信號。Fiji(ImageJ)軟件被用來描繪并計算每個切片中的像素強度的面積，然后將其乘以1.2mm(連續(xù)的MR圖像之間的距離)以得到T1-加權的后-Gd高信號的體積。各大鼠的所有的被選的切片的體積相加以得到每只大鼠的軟腦膜的Gd外滲的總體積。各組中的所有大鼠的平均值以mm³被報告。

組化染色前的腦組織固定的通用操作流程

在指定的時間點，經(jīng)腹腔注射50mg/kg戊巴比妥鈉對動物進行深度麻醉，用冰冷的肝素化生理鹽水經(jīng)心灌注，然后利用新鮮制備的4％多聚甲醛的磷酸鹽緩沖生理鹽水(PBS)進行固定。取出大腦，在4℃的4％多聚甲醛/PBS中保持4h進行后固定。大腦隨后在4℃的20％蔗糖的PBS中脫水直至沉底，包埋OCT混合物(Sakura Finetek USA Inc.，Torrance，CA)，并在-70℃保存直到切片。

伊文思藍的給藥和外滲分析

FPI前1h，大鼠經(jīng)腹腔(IP)注射5ml含2％w/v伊文思藍(EB)溶液的生理鹽水。FPI后6h，經(jīng)腹腔注射50mg/kg戊巴比妥鈉對動物進行深度麻醉，用200ml冰冷的肝素化生理鹽水經(jīng)心灌注，然后利用100ml新鮮制備的含4％多聚甲醛的磷酸鹽緩沖生理鹽水(PBS)進行固定。取出大腦，在4℃的4％多聚甲醛/PBS中保持4h進行后固定。大腦隨后在4℃的20％蔗糖的PBS中脫水直至沉底，包埋OCT混合物(Sakura Finetek USA Inc.，Torrance，CA)，并在-70℃保存。全腦冠狀切片30μm，并且典型的跨越每只動物的270μm增量的整個海馬切片被安裝到載玻片，并用含4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)的Fluoromount-G(SouthernBiotech，Birmingham，AL)蓋玻片覆蓋。EB-陽性腦區(qū)域的圖像通過Zeiss Axioplan2顯微鏡(配備有HB0100w/2燈、Photometrics CoolSnapfx camera Roper Scientific和IPLab software BD Biosciences)進行拍攝。每個切片的圖像使用Fiji/ImageJ(NIH)縫合在一起，并且使用細胞計數(shù)器量化海馬細胞層的EB-陽性細胞。

電生理

制備海馬切片。FPI后四天處死動物，或者在CHI模型動物的附圖中所指示的時間處死動物，將大腦迅速地取出并浸入冰冷的含蔗糖的切割緩沖液(87mM NaCl，2.5mM KCl，7mM MgCl₂，0.5mM的CaCl₂，1.25mM NaH₂PO₄，25mM D-葡萄糖，35mM蔗糖，和25mM的NaHCO₃)中40-60s以冷卻大腦的內部。使用McIlwain組織切片機進行橫切片(厚度400μm)，切片單獨存儲孵育至少60min。孵育后，單張切片被轉移到記錄槽，并在31℃下利用2-3ml/min的體積流速的人工腦脊液(aCSF)進行灌流。該aCSF含有：126mM NaCl，3.0mM KCl，1.0mM MgSO₄，2.0mM的CaCl₂，1.2mM NaH₂PO₄，11mM D-葡萄糖，和25.9mM的NaHCO₃。雙極鎢刺激電極被放置在Schaffer側枝(SC)通路，以誘發(fā)突觸的場興奮性突觸后電位(fEPSP)，該fEPSP通過輻射層中的內充有aCSF的附近的玻璃微穿刺針記錄。

基線記錄。在對切片進行每個實驗前，通過增加激勵電壓和記錄突觸響應生成輸入輸出曲線，直到獲得某個最大值，或者在fEPSP響應上觀察到的群體峰電位。此外，運行雙脈沖比值(PPR)，由此，刺激對以50ms的刺激內間隔作用于CA3軸突。PPR通過{(第2個脈沖刺激誘發(fā)的fEPSP的幅度)/(第1個脈沖刺激誘發(fā)的fEPSP的幅度)}×100進行計算。

長時程增強的測量。放置在CA3-CA1樹突場層中的雙極鎢電極誘發(fā)fEPSP響應。測試刺激被設置為每20s遞送一次刺激強度，該強度設置為最大突觸響應的40-50％。高頻刺激(HFS)由兩串100Hz的控制刺激強度的刺激(每串刺激持續(xù)1s)組成，串間間隔為20s。fEPSP通過放置在細胞體層的約200-300μm的輻射層中的內充有人工腦脊液(aCSF)的玻璃微穿刺針記錄。這種刺激在對照動物或假手術動物上產(chǎn)生持續(xù)60min以上的長時程增強(LTP)響應。通過從初始負偏轉原點的10-30％之間測量的斜率來計算fEPSP的斜率。示出的每個時間點是至少6個20s間隔的測量值的平均值。

大鼠的徑向臂水迷宮測試

徑向臂水迷宮(RAWM)由六個50cm的徑向臂組成，該徑向臂從直徑為160cm的中央?yún)^(qū)輻射伸出，其構成的水槽內容置20.5℃的水，4個壁面環(huán)繞，每個徑向臂具有獨特的模式。逃生平臺位于其中一個徑向臂的末端并且淹沒在黑色不透明的水(non-toxic Dust Free Black Powder Paint，Rich Art)下。在開顱前一天和FPI后三天，對大鼠進行引導，每只大鼠2min。第1天和FPI后的第4天的試驗包括：將動物放置于其中一個臂內，給動物最多60s以找到目標臂中的平臺。如果動物沒有在60s內找到逃逸平臺，將大鼠引導到目標臂并使它在平臺上停留15s。進行15次訓練，訓練之間的間隔為5min。每次訓練的開始臂以偽隨機的方式確定，其為5個非目標臂中的3個隨機序列。開始臂和目標臂對于每只大鼠是不同的，但相對目標臂的位置是不確定的，以避免位置和方向性偏倚。第2天(進行15次訓練的接下來的一天)進行測試。前5次訓練的平臺設置在第一天中的目標臂中，然后在第6-15次訓練中將平臺移動至新的臂。每次訓練的開始臂以偽隨機的方式確定，借此，直到動物跑完所有其他的臂后(訓練10)，動物才從第1天的目標臂中開始。每只動物的30次訓練的每次的視頻通過使用TopScan(Cleversys Inc.)跟蹤軟件分析其錯誤次數(shù)和堅持性持續(xù)時間。錯誤是指進入非目標臂或進入目標臂但沒有達到平臺。

FLAP抑制劑MK-591的鼻腔給藥

為了進行鼻腔給藥和隨后的組織收集，利用3.5％異氟烷對大鼠進行麻醉，并將其放在加熱墊上呈仰臥位置。配以脂質載體的60μg的喹啉-吲哚FLAP抑制劑MK-591通過F20移液槍給藥。具體而言，槍頭上形成4μl的液滴，每2min將該液滴滴入交替的鼻孔中，直到總共8個4μl的液滴給藥完成。在開始鼻腔給藥后的30min，從心臟收集血液，以15ml/min的速度用60ml冰冷的0.9％NaCl和360ml的4％多聚甲醛經(jīng)心灌注大鼠。腦組織在冰上分割成解剖區(qū)域、稱重、液氮速凍、-70℃保存直到分析。組織和血漿中的MK-591的水平通過串聯(lián)質譜法進行測定。

小鼠組化和免疫組化

小鼠、假致傷小鼠和CHI治療小鼠通過上述的腦組織固定的通用過程以制備包埋石蠟的大腦。對于H&E的組化染色和髓過氧化物酶(MPO)、膠質纖維酸性蛋白(GFAP)和離子鈣接頭蛋白抗原1(Iba-1)的免疫組化染色，切片厚度為6μm。使用Aperio ImageScope軟件掃描、上傳和查看染色切片。使用Aperio軟件和它的Positive Pixel Count Algorithm of Image Scope(將強陽性像素的分數(shù)與指定圖像區(qū)域的總染色像素相比)進行染色量化。

統(tǒng)計分析

除非另有說明，所有顯示的數(shù)據(jù)為平均值+/-平均值的標準差。結果通過SPSS20(IBM)或者Prism5.0(GraphPad)進行分析。除非另有說明，所有的分析通過：兩組數(shù)據(jù)使用雙尾非配對T檢驗，兩組或更多組數(shù)據(jù)使用單因素ANOVA后利用Tukey的HSD進行多重比較。LTP I-O曲線通過雙因素重復測定ANOVA進行分析。RAWM的第一天的學習曲線折疊成三次游泳的組，通過雙因素重復測定ANOVA后對每個折疊時間點進行單因素ANOVA。反轉任務的第一次訓練和第三次訓練之間的RAWM堅持性表示為初始值的百分比(第一次游泳＝100％；第三次游泳＝第三次游泳/第一次游泳×100)，其通過受試者內的雙因素重復測定ANOVA后利用兩次訓練之間的雙尾配對T檢驗進行分析。Alpha被設定為p<0.05以確定所有試驗的顯著性。

大鼠FPI模型的實驗結果

圖2A(左圖)示出，在TBI后6h利用蘇木精和伊紅(H&E)對FPI模型的大鼠的同側左腦半球和對側右腦半球的皮質的染色。該TBI后6h的H&E染色表明，在同側腦半球具有大量的細胞損傷的跡象，而在對側腦半球顯示為更為完整的細胞和少得多的損傷。圖2B(右圖)證明，嗜中性粒細胞有助于在TBI后的大腦中產(chǎn)生損傷引起的白三烯，其通過長春花堿的效果進行佐證。在大鼠模型中，相比于在對側腦半球的水平，同側腦半球在TBI后的LTC₄的水平顯著地升高。參見標記為-長春花堿的柱。如果在TBI實驗前通過0.5mg/kg長春花堿IV治療耗盡大鼠的嗜中性粒細胞，同側腦半球中的白三烯的產(chǎn)量顯著降低。通過長春花堿減少的白三烯僅見于血腦屏障被削弱的同側腦半球。數(shù)據(jù)代表每組4-5只動物。結果是平均值+/-SEM。**P<0.01。

圖3A示出通過RP LC-MS/MS測定的假致傷動物1h后和FPI損傷動物1h后的同側腦半球和對側腦半球內的LTC₄的水平。結果表明，假致傷動物具有很少的LTC₄，而且右腦半球和左腦半球之間沒有差異。FPI致傷動物的相應結果則顯示：同側腦半球和對側腦半球內的LTC₄的水平均顯著提高。在同側腦半球內的增加量比在對側腦半球內的增加量高得多。

圖3B示出空白動物、假致傷動物和TBI后頭部損傷動物的左腦半球和右腦半球內的合成LTC₄的進程。反相液相色譜耦合串聯(lián)質譜(RP LC-MS/MS)被用來測定白三烯?？瞻椎奈词軅拇竽X中未檢測出LTC₄和LTD₄。假致傷動物的LTC₄水平與未受傷的動物的LTC₄水平并沒有顯著區(qū)別。在通過FPI進行TBI實驗后，白三烯迅速產(chǎn)生。同側的左腦半球內的LTC₄水平(14.35+/-2.31pg/mg蛋白)是對側的右腦半球內的LTC₄水平(3.62+/-2.73pg/mg蛋白)的4倍高。類似的結果同樣適用于LTD₄(未示出)，其與LTC₄通過神經(jīng)元組織代謝形成LTD₄保持一致。數(shù)據(jù)代表每組4-5只動物。結果是平均值+/-SEM。假致傷動物的同源腦半球的顯著性差異(***P<0.001；**P<0.01；*P<0.05)。對側腦半球的顯著性差異(^###P<0.001)。

圖3B的結果表明，損傷引起的白三烯的產(chǎn)生是非常迅速的，在TBI后1-3h達到峰值，并在24h下降到無法檢測的水平。為了確定MK-886在損傷前和損傷后的給藥對阻滯白三烯的形成上的功效，在TBI前30min或TBI后15min，利用單劑量為0.9％無菌鹽水和10％DMSO中的6mg/kg的MK-886或相同體積的賦形劑進行注射。在損傷后的時間點，動物被處死，提取脂質并通過RP LC-MS/MS分析測定腦區(qū)域中的LTC₄水平。單劑量為6mg/kg的MK-886在TBI前30min通過尾靜脈注射對動物IV給藥，結果顯示，在TBI后1h顯著降低白三烯的產(chǎn)生。利用MK-886治療的損傷動物的同側左腦半球內的LTC₄水平比利用賦形劑治療的損傷動物的LTC₄水平低85％。利用賦形劑治療的動物的水平為20.00+/-2.71pg/mg蛋白，而利用MK-886治療的動物的水平為3.39+/-0.42pg/mg蛋白。利用MK-886治療的損傷動物的對側右腦半球內的LTC₄水平比利用賦形劑治療的損傷動物的LTC₄水平低64％。利用賦形劑治療的動物的水平為7.19+/-0.63pg/mg蛋白，而利用MK-886治療的動物的水平為2.6+/-0.8pg/mg蛋白。圖4示出FLAP抑制劑MK-886在TBI前30min的給藥顯著地降低了兩個腦半球內產(chǎn)生的白三烯LTC₄。單劑量為6mg/kg的FLAP抑制劑MK-886在FPI前30min通過尾靜脈注射對動物IV給藥，結果顯示，在損傷后1h測定的白三烯的產(chǎn)生顯著降低。每組使用4-5只動物。結果是平均值+/-SEM。(***P<0.001；**P<0.01)。

在另一實驗中，單劑量的MK-886在TBI后15min注入大鼠。利用賦形劑治療的動物的同側腦半球內的平均LTC₄水平(23.41+/-1.98pg/mg蛋白)顯著高于(P<0.001，T檢驗)對側腦半球內的LTC₄水平(7.92+/-1.02pg/mg蛋白)。MK-886在TBI后15min的給藥將同側腦半球和對側腦半球內的LTC₄水平均降至檢測閾值以下。圖5示出FLAP抑制劑MK-886在TBI后15min的給藥將損傷引起的白三烯LTC₄的合成阻滯至低于檢測水平。圖5示出在損傷后15min注射賦形劑(-)或者MK-886(+)的大鼠的同側腦半球和對側腦半球內的白三烯LTC₄水平的定量分析。結果顯示，MK-886在TBI后15min的給藥完全阻滯了預期中的由TBI帶來的LTC₄水平的上升。在經(jīng)過MK-886治療后，LTC₄就檢測不到了。數(shù)值是平均值-/+SEM，n＝4，n.d.＝檢測不到。*p<0.05，與同側腦半球不同，T檢驗。

為了調查損傷的同側皮質和海馬內產(chǎn)生的LTC₄的相對量，這些腦區(qū)在RP LC-MS/MS分析之前從損傷的大鼠解剖下來。利用賦形劑治療的動物的同側皮質內的LTC₄為9.67+/-1.18pg/mg蛋白，而海馬內的LTC₄為6.05+/-3.70pg/mg蛋白。與全腦半球的結果類似，利用MK-886治療的動物的同側皮質和海馬內檢測不到LTC₄。這些結果連同圖4的結果證明，在進行TBI實驗前30min或者TBI實驗后15min給藥，該FLAP抑制劑MK-886有效地阻滯了白三烯的生物合成。

圖6示出FLAP抑制劑MK-886的給藥降低了TBI后72h測定的細胞死亡的體積。單劑量為6mg/kg的FLAP抑制劑MK-886在TBI前30min通過尾靜脈注射對大鼠IV給藥。在72h后進行測定，預治療的動物的由TBI引起的細胞死亡顯著減少。結果表示為±平均值±SEM。利用賦形劑治療的動物的顯著性差異(*P<0.05)。

在另一實驗中，T2-加權MRI被用來研究大鼠在TBI后72h的白三烯對TBI相關的腦水腫的功效。在TBI前30min、TBI后15min或TBI后60min，利用MK-886注射大鼠。假致傷動物和注射賦形劑的動物的其他組作為對照。假致傷動物的同側左腦半球和對側右腦半球未見T2-加權高信號，且其高度和寬度對稱。相反地，與對側腦半球相比，TBI損傷動物的大腦的同側腦半球始終表現(xiàn)出T2-加權高信號和單側的腫脹。

相對于對側腦半球的同側腦半球的水腫被量化。與正常的大腦腫脹(0.00+/-0.03％)相比，假致傷動物的腦半球之間沒有區(qū)別。相反地，與假致傷動物相比，通過賦形劑治療的損傷動物具有顯著多的腦腫脹，賦形劑＝8.68+/-0.09％，p<0.001，單因素ANOVA后Tukey的HSD。與通過賦形劑治療的動物相比，MK-886在損傷前30min或損傷后15min給藥的動物具有顯著少的腫脹。TBI前30min的數(shù)值為4.12+/-0.08％，p＝0.004；TBI后15min的數(shù)值為4.26+/-0.05％，p＝0.028。與通過賦形劑治療的動物相比，TBI后60min利用MK-886注射的動物沒有顯著區(qū)別，TBI后60min的數(shù)值為8.98+/-1.0％，p＝0.999。這些結果表明，在TBI之前或者TBI之后不久的對白三烯的產(chǎn)生的阻滯降低72h處的損傷相關的腦腫脹的量。

圖7示出FLAP抑制劑MK-886在TBI前30min或TBI后15min對大鼠的給藥減輕水腫。上圖是TBI事件后72h獲得的典型的T2加權的MRI圖像。無TBI的假致傷的大腦的同側左腦半球和對側右腦半球并不顯示出T2像素高信號，且在形狀和大小上對稱。通過TBI致傷的動物的大腦主要在同側皮質中顯示出標志著水含量和單側腫脹的T2像素高信號。通過使用Fiji(NIH)從各動物獲得的5個連續(xù)的T2-MRI切片計算的平均歸一化腦腫脹的MRI定量分析。數(shù)值是平均值+/-SEM，假致傷(n＝4)。賦性劑(n＝8)，MK-886在損傷前30min給藥(n＝10)，MK-886在損傷后15min給藥(n＝5)。柱＝5mm。結果表明，與不利用MK-886治療的TBI組相比，MK-886在TBI前30min或者后15min的給藥顯著地降低腦腫脹。*p<0.05，與賦性劑TBI組不同，與假致傷沒有顯著不同，單因素ANOVA后Tukey的HSD。

在大鼠TBI后72h，用Gd-增強的T1-加權MRI來評估白三烯對TBI相關的BBB破壞的作用。給大鼠靜脈注射反向增強劑Gd(沉積在BBB破壞的腦區(qū)并便于T1-加權MRI掃描)。通過后-Gd圖像中的像素高信號的升高來檢測Gd外滲，該外滲在TBI損傷動物的同側軟腦膜區(qū)域(表面)被專門檢測。Gd在該區(qū)域存在的最大可能是由于大腦的這個高度血管化的區(qū)域中的血管被機械剪切。每只動物中的Gd外滲的總體積(后-Gd像素高信號)被量化。TBI導致Gd外滲加劇，而且，MK-886在損傷前30min(p＝0.419)、損傷后15min(p＝0.970)或者損傷后60min(p＝0.994)(單因素ANOVA，后Tukey的HSD)的給藥對其沒有影響。雖然MK-886對Gd外滲沒有明顯的影響，但是白三烯對BBB滲透性的調節(jié)可能被大腦表面的血管的機械性損傷而屏蔽。

本發(fā)明利用伊文思藍(EB)的熒光來評估大鼠FPI模型中的BBB滲透性。EB(<lkDa)是對血清白蛋白具有很強親和力(67kDa)的偶氮染料。所得的EB-白蛋白復合物在BBB破壞后進入主質。熒光顯微鏡被用來對腦切片(來自于損傷后5h)進行成像，利用EB的內在熒光特性(在620nm激發(fā)，在680nm發(fā)射)。這種方法比常用的腦勻漿中EB的比色讀數(shù)(Uyama O，J.Cerebr.Blood F.Met.，8，282-284頁，1988年)的靈敏度更高，并且可以用于定位BBB滲透性。由于EB-白蛋白復合物分布在滲透點附近的細胞中，這種方法可以進行BBB破壞的微檢測。與此相一致地，最亮的EB信號利用4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)熒光協(xié)同定位，說明細胞被染色。圍繞著EB-陽性細胞簇可以觀察到微弱的細胞外熒光。不意外的是，EB陽性細胞的最大密度位于鄰近損傷部位的同側皮層和同側海馬中，還有一些細胞零星地位于丘腦和黑質體中。在相應的對側腦區(qū)中沒有檢測到EB。由于海馬相對于主損傷部位位置較遠且介導記憶和學習過程，發(fā)明人對海馬內的EB陽性細胞進行計數(shù)來衡量主質的BBB破壞。MK-886在TBI后15min的給藥顯著地減少CA1區(qū)域的EB-陽性細胞的數(shù)目。利用賦形劑治療TBI的值是148.75+/-45.65，而利用MK-886治療TBI的值是69.25+/-36.82，p＝0.035，T檢驗。這些結果表明，在易受損傷的選擇的腦區(qū)內，白三烯可以介導BBB滲透性，F(xiàn)LAP抑制劑阻滯白三烯介導的BBB破壞。

圖8示出在大鼠FPI模型中，F(xiàn)LAP抑制劑MK-886在TBI后30min的給藥降低了海馬CA1區(qū)的BBB滲透性。圖8A是在TBI后5h，進入海馬細胞層的EB(紅色)和進入同側海馬的DAPI(藍色)的典型的熒光圖像。圖8B是在TBI后15min，接受賦形劑或者MK-886的動物的同側CA1海馬細胞層的EB外滲的圖像的放大圖。圖8C是在海馬區(qū)的EB陽性細胞(EB+細胞)的量的EB-DAPI熒光共定位分析，柱＝200μm。數(shù)值是平均值+/-SEM；n＝4。*p<0.05，T檢驗。FLAP抑制劑在損傷前30min的給藥得到相似的結果，數(shù)據(jù)沒有示出。

為了檢查TBI后的海馬的功能完整性，長時程增強(LTP)的電生理測量被記錄在TBI(通過FPI模型)后4天的大鼠海馬切片中。LTP被用來衡量突觸可塑性，且被認為能代表學習和記憶的分子機制。通過刺激CA3-CA1的Schaffer側枝通路并記錄CA1樹突場層，誘發(fā)突觸的場興奮性突觸后電位(fEPSP)響應。假致傷動物和TBI損傷動物之間的fEPSP的輸入-輸出曲線沒有差異(F(4381)＝0.5329，p＝0.992，雙因素重復測定ANOVA)，而且假致傷動物和TBI損傷動物之間的成對脈沖比測量也沒有差異(T(22)＝1.883，p＝0.073，T檢驗)，表明這些組的基礎突觸傳遞的水平相似。這與發(fā)明人以前的研究結果一致：在TBI一周內，通過H&E染色沒有實質性的海馬細胞損失，且海馬神經(jīng)絲蛋白水平?jīng)]有變化。響應于高頻刺激(253.51+/-69.48％，58-60min，持續(xù)3個記錄時間點)，假致傷動物的海馬切片顯示出強勁的LTP。相反地，未注射的TBI損傷動物的海馬切片并不表達LTP(135.06％+/-42.62％，與假致傷動物不同，p＝0.007，所有組的單因素ANOVA后Tukey的HSD)。類似于未注射的TBI損傷動物，注入賦形劑的TBI損傷動物的海馬切片也未能在高頻刺激后表現(xiàn)出LTP。然而，在TBI前30min或TBI后30min接受MK-886注射的動物表現(xiàn)出正常的LTP。兩者均顯著不同于注射賦形劑的動物。TBI賦形劑的數(shù)值為130.86％+/-55.63％；MK-886在損傷前30min給藥的TBI的數(shù)值為242.75+/-76.94％，p＝0.032；MK-886在損傷后30min給藥的TBI的數(shù)值為256.13+/-85.27％，p＝0.007，單因素ANOVA后Tukey的HSD。但是，如果MK-886在損傷后60min給送，藥物不能防止在賦形劑治療的動物中觀察到的LTP不足，數(shù)值為145.46+/-18.30，p＝0.994。這些結果表明，阻滯白三烯的早期產(chǎn)生減弱了損傷后的動物在海馬突觸可塑性中的損傷引起缺陷，并建議在嚙齒類動物損傷后的1h的時間窗口內利用MK-886進行治療，對于人來說，該時間窗口很可能是2-3h。

圖9示出在大鼠FPI模型中，F(xiàn)LAP抑制劑MK-886在TBI后30min的給藥減弱TBI后的海馬的長時程增強(LTP)的不足。通過來自于假致傷大鼠(空心三角形，n＝8)、在FPI后30min注射賦形劑(實心圓，n＝7)或MK-886(紅色正方形，n＝7)的FPI損傷大鼠的海馬切片來檢測LTP。各組的平均LTP響應(平均值+/-SEM對照斜率)在引起LTP后58-60min進行測定。*p<0.05，**P<0.01，與FPI賦形劑不同，與假致傷沒有顯著區(qū)別，單因素ANOVA后Tukey的HSD。

為了驗證TBI引起的LTP不足在海馬依賴型空間學習和記憶上的障礙的反映，利用藥物或賦形劑治療的假致傷大鼠和TBI損傷大鼠在TBI后4-5天進行徑向臂水迷宮(RAWM)測試。與Morris水迷宮相比，RAWM在評估嚙齒類動物的認知障礙上具有優(yōu)勢，因為進入沒有逃生平臺的臂的數(shù)目可被用于評估學習，而不是找到平臺的等待時間，從而消除由實驗組之間的游泳速度差異引起的誤差。在損傷后30min，利用賦形劑或MK-886注射假致傷動物和TBI治療動物。在行為試驗的第一天，動物完成15次游泳訓練，在訓練中，它們利用視覺線索探索迷宮以找到其中一個臂中的隱藏的逃生平臺，這個臂被稱為目標臂。在初始任務學習中的賦形劑動物和MK-886治療動物(在假致傷組內或在TBI組內)之間并沒有顯著差異(F(3155)＝2.437，p＝0.083，雙因素重復測定ANOVA)，而且在任意3次游泳群組的組之間也沒有顯著差異(每次游泳群組單因素ANOVA)。在行為試驗的第二天，動物在迷宮內完成5次游泳訓練，目標臂的位置與前一天相同。然后，逃生平臺在后10次訓練中被轉移到新的位置(反向任務)，以評估動物學習和記憶新目標臂位置的能力。在反向任務的前3次訓練中，前目標臂的堅持性通過在原來具有平臺的臂內所花費的總游泳時間的百分比來計算。在第1次游泳時，任何組之間的堅持性均沒有顯著差異(F(331)＝0.713，p＝0.522，單因素ANOVA)。兩個假致傷組均很快地在第1次游泳和第3次游泳之間認識到：平臺已經(jīng)不再位于前目標臂內。同樣地，利用MK-886治療的TBI大鼠通過第3次游泳在前目標臂中花費更少的時間(整體聯(lián)動，損傷(假致傷/FPI)×藥物(MK-886/賦形劑)×訓練(第1次游泳-第3次游泳)，F(xiàn)(162)＝5.564，p＝0.025，在受試者內雙因素重復測定ANOVA后T檢驗，假賦形劑，p＝0.001；假MK-886，p＝0.006；FPI MK-886，p＝0.035)。但是，注射賦形劑的TBI動物未能認識到：平臺位置在第1次游泳和第3次游泳之間已經(jīng)變化(P＝0.758)。反向任務的最后5次游泳訓練(第6次游泳-第11次游泳)被用于評估繼續(xù)學習。與給予藥物或賦形劑的假致傷動物相比，賦形劑治療的TBI大鼠繼續(xù)在每次游泳中犯顯著較多的錯誤(TBI賦形劑＝2.33+/-1.21；假致傷賦形劑＝0.755+/-0.705，p＝0.003；假致傷MK-886＝0.850+/-0.583，p＝0.005；單因素ANOVA后Tukey的HSD)。給予MK-886的TBI動物與任一個假致傷組并沒有不同，但是與TBI-賦形劑動物顯著不同(1.26+/-0.700，p＝0.044)。這些數(shù)據(jù)表明，MK-886減弱TBI損傷引起的空間學習和記憶的缺陷。

圖10示出在大鼠FPI模型中，F(xiàn)LAP抑制劑MK-886在TBI后30min的給藥減輕在徑向臂水迷宮的學習和記憶中的TBI-引起的障礙。在第2天的反向任務的堅持性測試中，第3次游泳的堅持性(在前目標臂內的持續(xù)時間)變化表示為在第1次游泳中的堅持性的百分比。*p<0.05，**p<0.01，雙因素重復測定ANOVA后T檢驗。第2天反向任務的成績表現(xiàn)為在反向任務的第11次-第15次游泳中所犯的錯誤數(shù)(平均值+/-SEM)。*p≤0.05，**p<0.01，與FPI賦形劑不同，與任一假致傷組不具有區(qū)別，單因素ANOVA后Tukey的HSD。

在圖11所示的結果表明，在大鼠FPI模型中，F(xiàn)LAP抑制劑MK-886減輕TBI后的運動障礙。與賦形劑治療的動物相比，在TBI后15min MK-886給藥的動物在轉棒上具有改進的平衡運動性能。在轉棒測試中，棒的旋轉被設定為在300s的進程中從0加速到50rpm。損傷后的每次所選時間點進行4次訓練，每只動物的各次訓練和平均時間被記錄下來。PT是損傷前的培訓。數(shù)值是平均值-/+SEM。n＝6-9。結果表明，與那些利用賦形劑治療的動物相比，MK-886治療的動物在第1周和第2周內具有更好的響應。最終，所有組的表現(xiàn)趨于相同。

圖12是基于上述相對于FPI模型所討論的結果，根據(jù)本發(fā)明的白三烯和TBI之間的關系的概要和示意圖。不拘泥于理論，根據(jù)本發(fā)明目前呈現(xiàn)的證據(jù)，TBI后的事件按照以下順序產(chǎn)生。創(chuàng)傷時的原發(fā)性腦損傷導致ATP從受損細胞漏出進入細胞外空間、腦主質出血和軸膜滲透性的局限性改變。在釋放后，ATP與小膠質細胞結合導致鈣離子內流和胞漿型磷脂酶A2(cPLA₂)的激活，它將AA從膜磷脂中釋放出來。AA被轉化為5-HETE，然后由5-LO和FLAP轉化為LTA₄。LTA₄然后通過LTA₄水解酶被轉化為LTB₄，其是一種募集嗜中性粒細胞的有效的趨化介質，或者LTA₄被運出小膠質細胞并進入相鄰的星形膠質細胞和可能的神經(jīng)元，并且通過LTC₄酶的作用轉化為半胱氨酰白三烯(LTC₄、LTD₄和LTE₄)。早期產(chǎn)生的白三烯的副作用包括白細胞浸潤、BBB破壞和水腫。水腫看來介入水通道蛋白水通道。如果未加抑制，這些有害的事件進一步導致軸突損傷、細胞死亡、運動缺陷和認知障礙。

圖13示出在人全血中的MK-886(實心三角形虛線)與MK-591(實心圓形實線)的體外效力的比較。結果是這兩種FLAP抑制劑對LTB₄的產(chǎn)生和5-HETE的產(chǎn)生的影響。已知吲哚乙酸FLAP抑制劑(如MK-886、MK-591)顯示出高的血漿蛋白結合性。因此，與抑制劑和FLAP結合的親和力相比，這些FLAP抑制劑在體內阻滯白三烯的效力高100倍。發(fā)明人開發(fā)了一種生物測定方法，它使用人全血精確地預測FLAP抑制劑的體內效力。簡言之，在FLAP抑制劑的濃度未升高或升高的情況下，將全血與鈣離子載體(如A2387或酵母聚糖)一起孵育。在37℃下孵育30min后，將樣品離心，并將血漿上清液利用反相液相色譜耦合串聯(lián)質譜來定量LTB₄、5-HETE和AA的生成。藥物的IC₅₀通過非線性回歸分析(GraphPadPrism)進行測定。結果表明，F(xiàn)LAP抑制劑MK-886和MK-591在蛋白質的存在下具有預期的和報告的IC₅₀。正如預期的那樣，F(xiàn)LAP抑制劑并不影響AA生成，數(shù)據(jù)未示出。當FLAP抑制劑是水溶性差的藥物時，發(fā)明人已經(jīng)表明，這種疏水性的藥物可配制在載體中，該載體包含一種或多種植物油(如橄欖油)和公認為安全(GRAS)列表中找到的磷脂酰絲氨酸，這些藥物然后可以快速地傳遞并靶向至大腦和上部脊髓。Hanson LR等，Drug Delivery，19(3)，149-54頁，2012年。

如上所述的數(shù)據(jù)是利用FLAP抑制劑IV或IP注射大鼠產(chǎn)生的。圖14是示出FLAP抑制劑的鼻內遞送的方法的示意圖。鼻內藥物遞送繞過血腦屏障，直接從鼻粘膜遞送藥物至大腦和上部脊髓，其沿著三叉和嗅覺神經(jīng)通路通過胞外機制傳遞，從而增加大腦的生物利用度。鼻腔給藥限制藥物進入體循環(huán)的量，從而降低藥物試劑的非期望的對身體的副作用(例如肝臟和心臟毒性)。通過這條途徑，藥物的輸送是非常迅速的(10min內到達大腦)，干預TBI的關鍵因素正如上面所述的數(shù)據(jù)，而且鼻腔給藥的方法十分快速和簡單，使得它非常適合于各種環(huán)境。

與MK-886相比，F(xiàn)LAP抑制劑MK-591更有效且具有更長的t_1/2。MK-591在脂質載體溶液中的配制如上所述。圖15示出在鼻腔給藥(MK-591)30min后的FLAP抑制劑MK-591在大鼠的幾個腦區(qū)中的水平與在血漿中的水平。大鼠用3.5％的異氟烷短暫麻醉，MK-591(60μg/32μl脂質載體)的鼻腔給藥包括：8個4μl的等分試樣被交替滴入每只鼻孔之間的鼻粘膜。通過藥物濃度達到200nM的目標來確定藥物的量，該濃度相當于與FLAP結合的Kd值的100倍。在單劑藥給藥30min后，使用肝素針從麻醉動物收集血液，通過離心從血液中分離血漿。然后，在依然麻醉的狀態(tài)下用生理鹽水灌注動物，以從腦血管的血液中除去藥物。在灌注后處死動物，并迅速地取出腦區(qū)。血漿和腦組織樣品均在液氮中冷凍，隨后儲存在-80℃下。外周血漿和主質腦組織中的藥物水平通過確證的串聯(lián)質譜平臺進行評估。數(shù)值表示為MK-591的ng數(shù)/mg組織。MK-591的最高水平出現(xiàn)在嗅球中，接下來是海馬和皮質。MK-591在皮質中的濃度為200nM(目標濃度)。與到達大腦的藥物量相比，藥物在血漿中的水平較低。這些結果表明，F(xiàn)LAP抑制劑MK-591的鼻內遞送是可能的，而且在各種腦區(qū)迅速實現(xiàn)生理水平。

圖16示出FLAP抑制劑MK-591在腹腔給藥30min后的的大鼠的大腦半球和血漿水平。利用MK-591(20％的DMSO/生理鹽水溶液中10mg/kg)腹腔注射大鼠。在單劑藥給藥30min后，使用肝素針從麻醉動物收集血液，通過離心從血液中分離血漿。然后，在依然麻醉的狀態(tài)下用生理鹽水灌注動物，以從腦血管的血液中除去藥物。在灌注后處死動物，并迅速地取出腦半球。血漿和腦組織樣品均在液氮中冷凍，隨后儲存在-80℃下。外周血漿和大腦中的藥物水平通過確證的串聯(lián)的RP-LC/MS/MS平臺進行評估。與鼻內方法不同的是，大多數(shù)藥物存在于血漿中，腦組織中的藥物水平低得多。利用1ml＝1mg進行換算。血液的總體積為2ml(或2mg)。大腦半球(減去小腦)的總重量為0.150mg。數(shù)值利用MK-591的ng數(shù)/mg組織表示。這些結果表明，與IP給藥相比，鼻內遞送在將FLAP抑制劑傳遞至TBI影響區(qū)域的方面具有最大效果。

圖17A和圖17B的結果表明，白三烯LTC₄和LTD₄在體外以劑量依賴的方式引起神經(jīng)細胞凋亡、細胞程序性死亡。來自于新生大鼠的原代培養(yǎng)神經(jīng)元在LTC₄或LTD₄的濃度遞增的情況下溫育16h。通過對表現(xiàn)出核縮合的DAPI-染色神經(jīng)元的計數(shù)來確定凋亡神經(jīng)元的數(shù)量，并表示為總神經(jīng)元的百分比。通過活性胱天蛋白酶9(箭頭)的抗體對神經(jīng)元的染色來確定神經(jīng)元由于內在細胞凋亡而死亡。結果表明，白三烯引起神經(jīng)元的內在細胞凋亡。這些數(shù)據(jù)與最近報道的“白三烯(除了它們的抗炎作用)通過調節(jié)分泌酶活性而刺激β-淀粉樣蛋白的產(chǎn)生”相一致。已知β-淀粉樣蛋白通過引起凋亡而殺死神經(jīng)元。結合上述數(shù)據(jù)的這些結果表明，白三烯在大腦中同時具有促炎癥和直接神經(jīng)毒性的作用。

小鼠CHI模型的實驗結果

在第二個物種(小鼠)中，測試另一TBI模型以確認并擴展上面報告的結果。在小鼠閉合性顱腦損傷(CHI)的模型中，電磁控制的活塞被用來使受試者動物接收輕度TBI，所使用的具體過程如上面的實驗規(guī)程部分中所述。在第一組試驗中利用三個損傷嚴重程度的措施來確定CHI的效果。這三個措施是呼吸暫停、翻正時間和掉落等待時間。呼吸暫停和翻正反射措施在CHI過程后立即進行。呼吸暫停的措施是指受試者在CHI后開始自主呼吸的時間，而翻正時間是指受試者從側躺到四肢站立的重新翻正反射所花的時間。呼吸暫停和翻正反射的組合相當于人在TBI后的意識喪失。掉落等待時間措施在CHI后1h進行，并測量受試者在摔倒前可以抓住金屬絲網(wǎng)和懸吊在金屬絲網(wǎng)上的時間長短。結果如圖18A-圖18C所示。在圖18A中示出呼吸暫停措施，正如預期的那樣，假致傷小鼠沒有出現(xiàn)呼吸暫停，而CHI小鼠的平均呼吸暫停時間超過100s。同樣地，假致傷小鼠的翻正反射非常短，而CHI小鼠的平均時間超過500s，增加了7倍。至于掉落等待時間，CHI小鼠的掉落等待時間顯著變短，表明它們的抓握能力已經(jīng)下降。假手術小鼠可以懸掛的時間比CHI小鼠長7倍。結果表明，經(jīng)過CHI規(guī)程的小鼠表現(xiàn)出輕度TBI(mTBI)事件的所有表征，并且驗證了規(guī)程。數(shù)目和顯著性程度如下：呼吸暫停措施****p<0.0001，假手術n＝29，CHI n＝66；翻正反射****p<0.0001，假手術n＝29，CHI n＝66；掉落等待時間**p<0.0056，假手術n＝29，CHI n＝66。

使用CHI模型，一些小鼠進行假手術或CHI致傷，然后在致傷后的時間間隔對小鼠進行麻醉，并使用22gauge針頭通過心臟穿刺收集血液樣品。將樣品放置在肝素微量離心管。通過以7000rpm進行15min的離心從全血中制備血漿，并在-80℃存儲，直至使用市售Elisa試劑盒進行分析。隨在血漿中的兩種生物標志物是膠質纖維酸性蛋白(GFAP)和泛素羧基末端水解酶L-1(UCHL-1)。這兩種生物標志物與人mTBI事件相關聯(lián)，GFAP指示著星形膠質細胞的死亡，而UCHL-1與神經(jīng)元細胞死亡相關聯(lián)。GFAP的結果示于圖19A，正如預期的那樣，假手術小鼠的水平保持穩(wěn)定。CHI小鼠在損傷后1h顯示出峰值GFAP水平，且該水平在損傷后12h內恢復到基礎水平。CHI小鼠還表現(xiàn)出UCHL-1水平的升高，該水平在損傷后2h達到最大，通過損傷后2h回到基礎水平。這些措施進一步確認，CHI模型在受試小鼠上產(chǎn)生期望的mTBI。每個時間點假手術n＝3-5只小鼠，每個時間點CHI n＝4-9。在1h的GFAP的顯著性是**p＝0.0014。在0.5h的UCHL-1的顯著性是*p＝0.0193，并且在1h是*p＝0.0223。

為了評價CHI規(guī)程導致的水腫，小鼠或者進行假手術或者進行CHI致傷，然后在7dpi或30dpi將小鼠進行T2加權MRI。無論是假手術小鼠還是CHI小鼠，所有的小鼠均沒有在CHI后的任何時間表現(xiàn)出任何T2加權像素高信號，這表明沒有發(fā)生水腫，進一步驗證這是一個合適的mTBI模型。在人mTBI的大多數(shù)病例中，沒有陽性MRI是非常常見的。圖20示出假手術小鼠和CHI小鼠在7dpi和30dpi的典型MRI圖像，基準尺為2mm。

為了檢查CHI帶來的神經(jīng)炎癥，小鼠接受CHI規(guī)程，然后各個腦區(qū)利用H&E、髓過氧化物酶(MPO，嗜中性粒細胞的標志物)、GFAP(反應性星形膠質細胞的標志物)和Iba-1(激活的小膠質細胞的標志物)進行染色。

圖21示出在7dpi利用H&E染色或者在30dpi利用MPO染色假手術小鼠和CHI小鼠的典型例子的結果。在檢查的所有時間點，沒有任何證據(jù)顯示出病變，也沒有證據(jù)表明在該區(qū)域的嗜中性粒細胞浸潤。通過H&E染色顯示沒有發(fā)生挫傷或細胞損失，通過MPO染色評估沒有發(fā)生顯著血腦屏障破壞。在CHI后沒有在小鼠身上發(fā)生明顯損害，這些都是人mTBI研究中常見的。與FPI模型相反，這個模型中的浸潤免疫細胞并沒有觀察到明顯損傷。通過CT或傳統(tǒng)MRI掃描人的mTBI的研究中，其一般沒有病理，如挫傷或者出血。這些結果與“CHI是人的mTBI的良好模型”相一致。

在CHI小鼠的大腦中并沒有宏觀變化，與此相反，微觀水平上具有標志著神經(jīng)炎癥的大規(guī)模改變。圖22A和圖22B示出在7dpi和30dpi利用H&E、GFAP、Iba-1對假手術小鼠和CHI小鼠的冠狀腦切片染色的典型圖像。圖22C示出關注的區(qū)域，包括：大腦皮質層(CTX)、外囊(EC)、海馬CA區(qū)和齒狀回(DG)。CHI后顯示出GFAP和Iba-1的最高反應活性的區(qū)域是CTX、EC和DG。如圖22A和圖22B所示，相比于假手術小鼠，在7dpi和30dpi均在CHI小鼠中具有顯著的GFAP染色。正如預期的那樣，染色的最大量出現(xiàn)在CHI的同側腦半球。CTX、EC和DG區(qū)域是行使典型的大腦功能、學習和記憶的關鍵。EC是含有皮層間(corticocortical)關聯(lián)纖維(負責連接大腦的一個皮質到其它皮質)的大白質束，它是用于從基底前腦到大腦皮質的膽堿能纖維的路徑。大腦的這個區(qū)域還示出了人mTBI后的彌散張量成像的結構改變。DG是介導神經(jīng)發(fā)生的子區(qū)域，其是學習和記憶的關鍵。齒狀回的顆粒下區(qū)的神經(jīng)祖細胞通過成年產(chǎn)生新的神經(jīng)元。使用放射性碳測年技術的對人的最近的研究表明，神經(jīng)發(fā)生的水平非常巨大，在成年后每天增加約1400新顆粒神經(jīng)元。這些新生顆粒神經(jīng)元在記憶模式分離中發(fā)揮重要作用，而且，神經(jīng)障礙被認為通過削弱記憶的規(guī)律化而導致焦慮癥。這種障礙隱藏在焦慮癥中可見的病態(tài)恐懼反應中，如創(chuàng)傷后應激障礙和恐慌癥。因此，如在本發(fā)明中所示的齒狀回中的神經(jīng)炎癥可能在TBI和PTSD之間建立機械連結。

圖23A示出在7dpi和30dpi利用GFAP對假手術小鼠和CHI小鼠的皮質的典型染色，下方示出典型的樣品，對多只小鼠的結果進行定量分析。典型的切片示出CHI小鼠中的GFAP的明顯增加，該增加持續(xù)了至少30dpi。定量結果顯示，在7dpi和30dpi測定的GFAP陽性顯著升高。數(shù)目和顯著性為：7dpi假手術n＝7，CHI n＝8，*p＝0.0188；30dpi假手術n＝7，CHI n＝11，**p＝0.0021。圖23B示出在7dpi和30dpi利用Iba-1對假手術小鼠和CHI小鼠的皮質的典型染色，下方示出典型的樣品，對多只小鼠的結果進行定量分析。典型的切片示出CHI小鼠中的Iba-1的明顯增加，其在7dpi的時候非常高，在30dpi依然升高。定量結果顯示，在7dpi，CHI小鼠具有顯著升高的Iba-1反應性。在30dpi依然升高，但在本研究中，該升高并不顯著。數(shù)目和顯著性為：7dpi假手術n＝6，CHI n＝7，*p＝0.0233；30dpi假手術n＝7，CHI n＝9。

圖24A示出在7dpi和30dpi利用GFAP對假手術小鼠和CHI小鼠的外囊的典型染色，下方示出典型的樣品，對多只小鼠的結果進行定量分析。典型的切片示出CHI小鼠中的GFAP的明顯增加，該增加持續(xù)了至少30dpi。定量結果顯示，在7dpi和30dpi測定的GFAP陽性顯著升高。數(shù)目和顯著性為：7dpi假手術n＝7，CHI n＝8，**p＝0.0019；30dpi假手術n＝7，CHI n＝11，**p＝0.0021。圖24B示出在7dpi和30dpi利用Iba-1對假手術小鼠和CHI小鼠的外囊的典型染色，下方示出典型的樣品，對多只小鼠的結果進行定量分析。典型的切片示出CHI小鼠中的Iba-1的明顯增加，其在7dpi的時候非常高，在30dpi依然明顯升高。定量結果顯示，在7dpi，CHI小鼠具有顯著升高的Iba-1反應性。在30dpi依然明顯升高。數(shù)目和顯著性為：7dpi假手術n＝6，CHI n＝7，*p＝0.0181；30dpi假手術n＝9，CHI n＝11，*p＝0.0268。

圖25A示出在7dpi和30dpi利用GFAP對假手術小鼠和CHI小鼠的齒狀回的典型染色，下方示出典型的樣品，對多只小鼠的結果進行定量分析。典型的切片示出CHI小鼠中的GFAP的明顯增加，其在30dpi消退。定量結果顯示，在7dpi測定的GFAP陽性顯著升高，而在30dpi回到假手術水平。數(shù)目和顯著性為：7dpi假手術n＝7，CHI n＝7，***p＝0.0003；30dpi假手術n＝7，CHI n＝10。圖25B示出在7dpi和30dpi利用Iba-1對假手術小鼠和CHI小鼠的齒狀回的典型染色，下方示出典型的樣品，對多只小鼠的結果進行定量分析。典型的切片在7dpi示出CHI小鼠中的Iba-1的明顯增加，而在30dpi消退。定量結果顯示，在7dpi，CHI小鼠具有顯著升高的Iba-1反應性。數(shù)據(jù)還顯示在30dpi，Iba水平回落到假手術小鼠水平。數(shù)目和顯著性為：7dpi假手術n＝6，CHI n＝7，**p＝0.0054；30dpi假手術n＝7，CHI n＝9。至少在反應性星形膠質細胞和激活的小膠質細胞的水平方面，齒狀回是唯一的在損傷后30天示出炎癥消退的區(qū)域。因為齒狀回是經(jīng)歷神經(jīng)發(fā)生的唯一區(qū)域，推測激活神經(jīng)發(fā)生可能通過創(chuàng)建一個富含神經(jīng)元營養(yǎng)因子的環(huán)境而具有大腦修復的功能。

為了檢查神經(jīng)炎癥對認知功能的影響，當豐富的反應性星形膠質細胞和小膠質細胞出現(xiàn)的時候，在7dpi測定長時程增強(認為是隱藏的學習和記憶突觸機制)，如圖23-圖25所示。結果如圖26A和圖26B所示，并且其產(chǎn)生與上述的大鼠FPI模型相似。與假手術小鼠的切片相比，CHI小鼠的海馬切片在高頻刺激(HFS)后顯示出顯著減少的高信號，如圖26A和26B所示。長時程增強(LTP)的程度不足比我們在之前的TBI的大鼠FPI模型中觀察到不足要少，與損傷的嚴重程度相一致，小鼠CHI模型中的損傷程度小的多。數(shù)目和顯著性如下：假手術n＝7，CHI n＝12，****p<0.0001。

如上所述，在輕度FPI腦損傷后，F(xiàn)LAP抑制劑有效地阻滯水腫、BBB破壞、細胞損失和認知障礙。為了檢測FLAP抑制劑是否能夠在mTBI后阻滯慢性神經(jīng)炎癥，假手術小鼠和CHI小鼠通過IP注射5mg/5kg的賦形劑或MK-591，損傷后6天，每天給藥1次。在7dpi，小鼠經(jīng)心灌注后被處死，固定的大腦被除去，切片，并利用GFAP和Iba-1進行免疫組化染色。圖27示出用賦形劑治療(-)或用MK-591(+)治療的3假手術和3CHI小鼠的大腦皮質區(qū)域的典型染色。在已被注射FLAP抑制劑MK-591的CHI小鼠中，GFAP和Iba-1的染色均顯著減少。在假手術小鼠和CHI小鼠的大腦皮質、外囊和齒狀回中的GFAP和Iba-1的染色的量被量化，結果如圖28所示。在CHI接下來的6天，每天給藥MK-591一次，顯著阻滯在3個關注區(qū)域的GFAP和Iba-1染色的升高。這些數(shù)據(jù)表明，F(xiàn)LAP抑制劑不僅在TBI后不久阻滯白三烯介導的炎癥，就像TBI的大鼠FPI模型中觀察到的那樣，而且它們在單一CHI后很多天的對神經(jīng)炎癥的阻滯依然有效。圖28中的數(shù)值是在每個組內的平均值+/-SEM，數(shù)據(jù)被報告為上述的假手術組+/-MK-591的陽性的百分比。數(shù)目和顯著性如下：-MK-591假手術n＝7，CHI n＝8；+MK-591假手術n＝10，CHI n＝10，顯著性是*p<0.05和**p<0.01。

圖29是本發(fā)明的CHI模型中所示出的mTBI后的持續(xù)的神經(jīng)炎癥中的白三烯的作用的示意圖。腦損傷(例如彌漫性軸突損傷)導致從受損軸突中釋放包括ATP的分子，該ATP能夠結合小膠質細胞并導致鈣離子內流。細胞內的鈣離子的增加激活鈣依賴性胞漿型磷脂酶A2(cPLA2)，其切割膜磷脂產(chǎn)生游離的花生四烯酸(AA)。酶5-LO和FLAP將AA轉化為前體LTA₄，LTA₄被轉化為LTB₄，其是一種募集其他免疫細胞到損傷區(qū)域的有效的趨化介質?？商娲鼗蚋郊拥?，LTA₄被轉化為半胱氨酰LTC₄、LTD₄和LTE₄，已知它們在涉及嗜中性粒細胞浸潤的更嚴重的損傷模型中刺激細胞因子和趨化因子的釋放，增加血管滲透性。白三烯可以在損傷的炎癥反應中非常迅速地上升，因為用于產(chǎn)生這些脂質介體的酶和底物已經(jīng)存在于組織中，從而規(guī)避對轉錄或翻譯事件的需要。如果持續(xù)不斷地話，炎癥反應本身導致進一步的腦損傷，其在正反饋機制中引起更多的炎癥。本發(fā)明的支持這一理論的數(shù)據(jù)是，mTBI引起固有的神經(jīng)炎性響應(涉及內源性腦細胞，不依賴于外圍免疫細胞浸潤)。FLAP抑制劑阻滯這一響應的能力可平移至許多涉及增強的神經(jīng)炎癥或可能涉及增強神經(jīng)炎癥的人腦疾病。

本發(fā)明涉及預防包括血腦屏障(BBB)破壞和水腫的腦損傷事件、導致額外的細胞死亡的早期不利事件、軸突損傷和神經(jīng)障礙的不利影響。本發(fā)明還涉及減少據(jù)信隱藏在許多腦損傷事件中的長期的神經(jīng)炎癥。發(fā)明人已使用兩種大腦損傷的動物模型，特別是大鼠的液壓沖擊損傷TBI模型和小鼠的閉合性顱腦損傷(CHI)mTBI模型；然而，據(jù)信，該結果對其他腦損傷事件，包括中風、多發(fā)性硬化、阿爾茨海默氏病和創(chuàng)傷后應激障礙(PTSD)具有指導意義。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，通過在腦損傷事件前或不久后的FLAP抑制劑的給藥阻滯白三烯的產(chǎn)生，其顯著阻滯水腫、BBB破壞、細胞死亡、認知和運動障礙和在腦損傷事件后發(fā)生的長期神經(jīng)炎癥。FLAP抑制劑的給藥的最有效的途徑被認為是經(jīng)由鼻內遞送的方法，雖然其它途徑也可以使用，包括口服、靜脈、腹腔和通過栓劑。FLAP抑制劑的給藥顯著地降低了一系列腦損傷后的細胞破壞事件的嚴重性。預防性地或在腦損傷后不久地使用該FLAP抑制劑有望顯著改善全腦功能恢復，并防止許多與腦損傷事件相關的不良后果。發(fā)明人認為，本發(fā)明的結果可使FLAP抑制劑應用于許多腦損傷事件，包括TBI、中風、多發(fā)性硬化、阿爾茨海默氏病、創(chuàng)傷后應激障礙。本發(fā)明指出，在腦損傷事件之前預防性地使用FLAP抑制劑，和在腦損傷事件之后使用FLAP抑制劑均是有效的。任何FLAP抑制劑的有效劑量都將部分地由它的IC₅₀和它的生物利用度來決定，因為血漿蛋白與許多FLAP抑制劑的結合能力可能降低它們的生物利用度。如上所述，正常大腦條件下，大腦中檢測不到白三烯，也沒有證據(jù)表明存在神經(jīng)炎癥。在許多腦損傷事件(如TBI)之后，大腦中的白三烯急劇上升，而且證據(jù)表明存在長期的持續(xù)的神經(jīng)炎癥。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中使用FLAP抑制劑可改善這些腦損傷有關的事件，并防止本發(fā)明所述的由白三烯的上升和神經(jīng)炎癥而介導的進一步的CNS損傷。在腦損傷事件之前，和在腦損傷事件之后使用FLAP抑制劑均是有效的。事實表明，在腦損傷事件之前15min使用FLAP抑制劑，可以顯著減少由腦損傷事件導致的損害。FLAP抑制劑的給藥時間與腦損傷事件之間的較長的時間周期被認為是更有效的。類似地，可以在腦損傷事件后使用FLAP抑制劑，并且仍然提供對抗白三烯增加和神經(jīng)炎癥的保護。

前面已經(jīng)根據(jù)有關法律標準描述了本發(fā)明，因此描述是示例性的，而在本質上不具有限制性。所公開的實施例的變型和修改對于本領域的技術人員來說可以是顯而易見的并落入本發(fā)明的范圍之內。因此，本發(fā)明的法律保護的范圍應當通過研究以下權利要求來進行確定。