本發(fā)明涉及用于治療特征為血管畸形，具體特征為內(nèi)皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，尤其是腦海綿狀畸形的病變的Wnt/β-聯(lián)蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑。該抑制劑可以是小分子、蛋白質(zhì)、肽或反義核酸。本發(fā)明還涉及藥物組合物和治療方法。

發(fā)明背景

作為稱為腦海綿狀畸形(CCM)的疾病的特征的血管畸形主要集中在中樞神經(jīng)系統(tǒng)，并且它們一般顯示出多內(nèi)腔和血管泄漏(Clatterbuck，2001#17；Wong，2000#18)。病理性血管的這種器官定位可能導(dǎo)致多種神經(jīng)癥狀，包括出血性中風(fēng)³。在人類中，稱為CCM1、CCM2和CCM3的三種獨(dú)立基因中任一種的突變已經(jīng)與CCM的家族變體關(guān)聯(lián)⁵。在鼠模型中，在新生兒中任意CCM基因的內(nèi)皮特異性功能喪失突變^6，7可重現(xiàn)腦血管表型。另外，對(duì)CCM3的組成型內(nèi)皮選擇性滅活是胚胎致死性的，由于血管發(fā)育的一般性問題⁸。雖然，CCM3的神經(jīng)特異性突變?cè)谏贁?shù)情況中可能誘導(dǎo)腦血管表型⁹，這些數(shù)據(jù)強(qiáng)烈地表明內(nèi)皮細(xì)胞中CCM基因的突變導(dǎo)致CCM病理性表型。然而，這些基因在內(nèi)皮細(xì)胞中的作用基質(zhì)很大程度上仍然是未知的。迄今為止，CCM疾病的唯一療法是手術(shù)⁴。

已經(jīng)報(bào)道了在培養(yǎng)的主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞中敲減CCM1蛋白質(zhì)促進(jìn)Wnt/b-聯(lián)蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)¹⁰。然而，迄今為止，還沒有顯示b-聯(lián)蛋白途徑在體內(nèi)血管病灶形成中的相關(guān)性。一些研究已經(jīng)顯示在胚胎發(fā)育期間腦血管發(fā)生和血腦屏障微血管的正確分化需要規(guī)范Wnt/b-聯(lián)蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的活化^11-13。需要在成人中緊密調(diào)節(jié)這些效果以避免不受控制的血管增殖。事實(shí)上，在生理?xiàng)l件中，b-聯(lián)蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)在產(chǎn)后劇烈降低，并且在成人中是基本上不可檢測的¹³。

WO2009148709公開了用于在血管中降低血管透過性并且治療或預(yù)防與血管內(nèi)皮的缺陷或損傷相關(guān)的病癥的組合物和方法。例如，可使用本發(fā)明的組合物和方法來治療血管發(fā)育異常，如腦海綿狀畸形(CCM)。這些方法一般與抑制RhoA GTP酶水平或活性的組合物，如3-羥基-3甲基戊二酰-輔酶A(HMG-CoA)還原酶的抑制劑的使用相關(guān)。該應(yīng)用提供，例如，RhoA GTP酶抑制劑、他汀分子如辛伐他汀、或含氮二膦酸酯如帕米膦酸鹽、奈立膦酸鹽、奧帕膦酸鹽、阿倫膦酸鹽、伊班膦酸鹽、利塞膦酸鹽和唑來膦酸鹽。

在WO2012135650中，缺少環(huán)加氧酶抑制活性的舒林酸衍生物與含有衍生物的藥物組合物一起提供并用于治療或預(yù)防癌癥。舒林酸衍生物也適于治療慢性炎性病癥。還提供了用于制備衍生物的方法。還要求其在阿爾茨海默病中的用途。

Kundu JK等[“β-聯(lián)蛋白-介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)：用抗炎物質(zhì)進(jìn)行化學(xué)預(yù)防的新分子靶標(biāo)(Beta-catenin-mediated signaling：a novel molecular target for chemoprevention with anti-inflammatory substances)”Biochimica et Biophysica Acta 1765(2006)：14-24]聚焦于β-聯(lián)蛋白-介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，尤其是涉及其對(duì)癌發(fā)生的貢獻(xiàn)，以及由非甾族抗炎藥物和具有抗炎性質(zhì)的化學(xué)預(yù)防光化學(xué)物對(duì)不當(dāng)實(shí)現(xiàn)的β-聯(lián)蛋白-介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)節(jié)。在表1和2中，Kundu等列出了所有能夠調(diào)節(jié)β-聯(lián)蛋白-介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的物質(zhì)，其是非甾族抗炎藥物(NSAID)和抗炎光化學(xué)物。以下描述了其他β-聯(lián)蛋白抑制劑及其作用機(jī)制：Anastas和Moon，2013，Nature Rev-Cancer，13，11-26；Rosenbluh等，2014，Trends Pharmac.Sci 35，103-109；Takahashi-Yanaga和Kahn，2010，Clin Cancer Res 16.3153-3162。

在McDonald DA等(“法舒地爾減少腦海綿狀畸形的鼠模型中的病灶負(fù)荷(Fasudil decreases lesion burden in murine model of cerebral cavernous malformation)”，Stroke 43，571-574.2012)中，用Rho激酶抑制劑法舒地爾(Fasudil)來治療CCM1疾病模型。

然而，仍然需要針對(duì)CCM的藥物治療，因?yàn)槟壳霸摷膊H可通過手術(shù)治療。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

在本發(fā)明中，發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在內(nèi)皮細(xì)胞中β-聯(lián)蛋白(b-聯(lián)蛋白或β-聯(lián)蛋白)的轉(zhuǎn)錄活性改變導(dǎo)致體內(nèi)CCM的病變表型。在此，報(bào)告了CCM3事實(shí)上在體外和體內(nèi)均為一種內(nèi)皮細(xì)胞b-聯(lián)蛋白轉(zhuǎn)錄活性的調(diào)節(jié)劑。

此外，發(fā)明人已驚訝地發(fā)現(xiàn)能夠降低b-聯(lián)蛋白-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄活性的試劑能夠降低腦或視網(wǎng)膜血管畸形的數(shù)量和程度并且防止出現(xiàn)新的血管病灶。

在本發(fā)明中，令人驚訝地發(fā)現(xiàn)能夠降低β-聯(lián)蛋白-介導(dǎo)的活性的化合物，如NSAID舒林酸硫化物和舒林砜，顯著降低在內(nèi)皮-細(xì)胞-特異性CCM3敲除基因的小鼠的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中血管病灶的數(shù)量和尺寸，該小鼠是腦海綿狀畸形(CCM)模型。CCM是一種影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)血管的疾病，其逐漸畸形，漏損并且易于出血。器官位置對(duì)于神經(jīng)學(xué)影響和治療性介入而言都是關(guān)鍵的，其迄今為止只有手術(shù)。因此，能夠降低β-聯(lián)蛋白-介導(dǎo)的活性的化合物代表了用于抑制血管病灶形成的藥物工具，尤其是對(duì)于受到CCM的家族變體影響的患者，他們隨時(shí)間持續(xù)發(fā)生新畸變。

本發(fā)明所示的結(jié)果可應(yīng)用于以血管畸變?yōu)樘卣鞯娜魏尾±韺W(xué)。這種病理學(xué)顯示了內(nèi)皮細(xì)胞中細(xì)胞與細(xì)胞連接的拆散以及EndMT(內(nèi)皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化)、標(biāo)志物(如Klf4、Klf2、Ly6a、S100a4、CD44、Id1、a-Sma、Slug、PAI1、N-鈣粘蛋白、Zeb2，F(xiàn)adini等，2012；Margariti等，2012；Li等，2012；Liang等，2011；Stein等，2006；Medici等，2012)的表達(dá)。

本發(fā)明還基于以下驚人驚訝的發(fā)現(xiàn)，使用例如NSAID、舒林砜(依昔舒林)對(duì)Wnt/β-聯(lián)蛋白途徑，尤其是β-聯(lián)蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的抑制，抑制了EndMT標(biāo)志物的表達(dá)。這種標(biāo)志物存在于以血管畸形，如CCM為特征的病變中。

在第一方面中，本發(fā)明提供了用于治療和/或預(yù)防以血管畸形為特征的病變的Wnt/β-聯(lián)蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的抑制劑。

優(yōu)選地，該抑制劑是β-聯(lián)蛋白抑制劑，尤其是β-聯(lián)蛋白轉(zhuǎn)錄信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的抑制劑和/或β-聯(lián)蛋白核易位的抑制劑。

該抑制劑更優(yōu)選是小分子抑制劑。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，該抑制劑選自下組：槲皮素、ZTM000990、PKF118-310、PKF118-744、PKF115-584、PKF-222-815、CPG049090、PNU-74654、ICG-001、NSC668036、N′-[(E)-(5-甲基-2-呋喃基)亞甲基]-2-苯氧基苯甲酰肼、N′-[(E)-1-(5-甲基-2-噻吩基)亞乙基]-2-苯氧基乙酰肼、5-[2-(5-甲基-2-呋喃基)乙基]-2-(2-噻吩基)-1H-吲哚、2-(2-呋喃基)-5-[(E)-2-(5-甲基-2-呋喃基)乙烯基]-1H-吲哚、N-[(E)-(5-甲基-2-呋喃基)亞甲基]-4-(4-吡啶基)-8-喹啉-胺、2-(2-呋喃基)-5-[2-(5-甲基-2-呋喃基)乙基]-1H-吲哚、7-{(2E)-2-[(5-甲基-2-呋喃基)亞甲基]肼基}-N-(2-苯基乙基)-5，6-二氫苯并[h]異喹啉-9-羧酰胺、1-{[(E)-(5-甲基-2-呋喃基)亞甲基]氨基}-3-(4-吡啶基)-2，4-(1H，3H)-喹唑啉二酮、N-(5-甲基-2-呋喃基)-N-(2′-苯氧基[1，1′-二苯基]-3-基)胺、4-{[7-(5-甲基-2-呋喃基)-2-萘基]氧基}吡啶、N-(5-溴-1，3，4-噁二唑-2-基)-4-羥基-2-氧代-6-苯基-2H-吡喃-3-羧酰胺、4-羥基-N-(5-甲基-2-呋喃基)-2-氧代-6-苯基-2H-吡喃-3-羧酰胺、3-[(E)-2-(5-溴-1，3，4-噻二唑-2-基)乙烯基]-4-羥基-6-苯基-2H-吡喃-2-酮、N-(5-溴-1，3，4噻二唑-2-基)-4-羥基-2-氧代-6-苯基-2H-吡喃-3-羧酰胺、5-[(3-氨基-1H-1，2，4-三唑-5-基)甲基]-3-[3-氟-4-(4-嗎啉基)苯基]-1，3-噁唑烷-2-酮、4-[(3-氨基-1H-1，2，4-三唑-5-基)甲基]-1-[3-氟-4-(4-嗎啉基)苯基]-2-咪唑烷酮、1-二苯甲基-4-(5-溴-2-糠酰)哌嗪、1-二苯甲基-4-[(5-甲基-2-噻吩基)羰基]哌嗪、(2E)-2-[1-(4-甲基-2-噻吩基)亞乙基]肼羧酸芐酯、2-(4-氯苯基)-6-甲基-5-(5-甲基-1，3，4-噁二唑-2-基)[1，3]噻唑并[3，2-b][1，2，4]三唑、N-(5-甲基-3-異噁唑基)-N′-[(5-苯基-1，3，4-噁二唑-2-基)羰基]脲、N-[3-(2-{[(5-氯-2-噻吩基)甲基]磺?；鶀肼基)-3-氧代丙基]苯磺酰胺-5-[3-(4-苯氧基苯基)丙基]-1，3，4-噁二唑-2-醇、N-(3-甲基-5-異噁唑基)-4-苯氧基苯甲酰胺、4-羥基-N-(3-甲基-5-異噁唑基)-2-氧代-6-苯氧基-2H-吡喃-3-羧酰胺、2-苯氧基-N′-[(Z)-苯基(2-噻吩基)亞甲基]苯甲酰肼、2-苯胺基-N′-[(Z)-2-呋喃基(苯基)亞甲基]苯甲酰肼、4-[(Z)-1-(3-甲基-5-異噁唑基)-2-苯基乙烯基]苯基2-(1-吡咯烷基)乙基醚、5-甲基-2-糠醛[(3Z)-2-氧代-1-(4-吡啶基)-1，2-二氫-3H-二氫亞吲哚-3-基]腙、(2Z)-N-[(5-甲基-2-呋喃基)甲基]-2-[2-氧代-1-(4-吡啶基)-1，2-二氫-3H-二氫亞吲哚-3-基]乙酰胺、(2Z)-N-[(3-甲基-5-異噁唑基)甲基]-2-[2-氧代-1-(4-吡啶基)-1，2-二氫-3H-二氫亞吲哚-3-基]乙酰胺、(2-氯-1，3-噻唑-5-基)甲基4-(4-嗎啉基磺?；?苯基醚、N-(4，5-二氫萘并[1，2-d][1，3]噻唑-2-基)-N-(4-苯氧基丁基)甲磺酰胺、N-(6-甲氧基-4，5-二氫萘并[1，2-d][1，3]噻唑-2-基)-N-[2-(1-甲基-3-苯基丙氧基)乙基]乙酰胺、4-{2-[(5-甲基-2-呋喃基)甲氧基]亞芐基}-1-(4-吡啶基磺?；?哌啶、4-{2-[(5-溴-2-呋喃基)甲氧基]亞芐基}-1-異煙堿基哌啶、N-(4，5-二氫萘并[1，2-d][1，3]噻唑-2-基)-N-(4-苯基戊基)乙酰胺、N-(4，5-二氫-3H-萘并[1，2-d]咪唑-2-基)-N-[2-(2-苯基乙氧基)乙基]甲磺酰胺、N′-[(Z)-(5-甲基-2-呋喃基)(2-吡啶基)亞甲基]-2-苯氧基苯甲酰肼、舒林酸硫化物、舒林砜及其藥學(xué)上可接受的鹽，羥基羅漢松樹脂、六氯酚、PPARγ激動(dòng)劑、或PPARγ-無活性類似物、水飛薊賓、奶薊草提取物(cardio mariano)、EGCG(表沒食子兒茶素-3-沒食子酸酯)、白茶/綠茶、蘿卜硫素、白藜蘆醇、姜黃素、吲哚-3-甲醇、烏索酸、二十二碳六烯酸、染料木黃酮、β-拉帕醌和表I所列化合物[http://web.stanford.edu/group/nusselab/cgi-bin/wnt/]。

已經(jīng)報(bào)告表I所列化合物通過靶向途徑的各種組分來抑制Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，導(dǎo)致其抑制。參見Dodge，Annu Rev Pharmacol Toxicol.2011；51：289-310，Chen，Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol.2010年8月；299(2)：G293-300，Barker Nat Rev Drug Discov.2006年12月；5(12)：997-1014，綜述。這些抑制劑全部構(gòu)成本發(fā)明的一部分。

表I：Wnt/b-聯(lián)蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑

抑制劑優(yōu)選是舒林酸或舒林酸硫化物或舒林砜或其類似物或衍生物。

舒林砜也稱為依昔舒林、fgn1或

抑制劑可以是PDE5(磷酸二酯酶5)的抑制劑或PKG(蛋白激酶G或環(huán)狀GMP-依賴性蛋白激酶)的激活劑。PDE5和PKG分別是舒林酸硫化物和依昔舒林的直接和間接靶標(biāo)(通過調(diào)節(jié)環(huán)狀GMP水平)并且調(diào)節(jié)β-聯(lián)蛋白的磷酸化并抑制β-聯(lián)蛋白-驅(qū)動(dòng)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑(Tinsley等，2011；Thompson等，2000；Li等，2001)。

更優(yōu)選的，抑制劑選自下組：水飛薊賓、EGCG(表沒食子兒茶素-3-沒食子酸酯)、白茶/綠茶、蘿卜硫素、白藜蘆醇、姜黃素、吲哚-3-甲醇、烏索酸、二十二碳六烯酸、染料木黃酮和β-拉帕醌。

在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，Wnt/β-聯(lián)蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑是蛋白質(zhì)或肽。

優(yōu)選地，直接給予蛋白質(zhì)或肽，或通過給予的表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)。

蛋白質(zhì)或肽優(yōu)選是Chibby、軸蛋白、HDPR1、ICAT、或包含LXXLL肽(SEQ ID NO：19)的融合蛋白、DKK1、針對(duì)卷曲蛋白的抗體如OMP-18R5。

DKK1(Dickkopf，Dkk)是Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的負(fù)調(diào)節(jié)劑(Glinka，1998；Niehrs，1999)。分泌Dkk蛋白并富含半胱氨酸。Dkk并不結(jié)合Wnt但與Wnt共受體LRP相互作用。可在治療上并在實(shí)驗(yàn)室中使用針對(duì)卷曲蛋白的抗體如OMP-18R5。其與多種卷曲蛋白受體相互作用(Gurney等，Proc Natl Acad Sci USA.2012年7月17日；109(29)：11717-22)。

更優(yōu)選地，Wnt/β-聯(lián)蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑是反義核酸分子。更優(yōu)選全長反義β-聯(lián)蛋白構(gòu)建體、β-聯(lián)蛋白siRNA，或β-聯(lián)蛋白shRNA。

在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，由適于給予對(duì)象的重組表達(dá)系統(tǒng)來表達(dá)抑制劑。

在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，重組表達(dá)系統(tǒng)包含內(nèi)皮或大腦內(nèi)皮特異性啟動(dòng)子元件，并且任選地包含誘導(dǎo)物/抑制物元件。

在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，抑制物包封在納米顆粒中，優(yōu)選該納米顆粒經(jīng)工程改造以靶向病理性內(nèi)皮細(xì)胞。

在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，血管畸形的特征在于內(nèi)皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化或與內(nèi)皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)的血管畸形(Medici等，2012；Fadini等，2012)。在本發(fā)明的血管畸形中，存在內(nèi)皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化。

優(yōu)選地，血管畸形在中樞神經(jīng)系統(tǒng)和/或視網(wǎng)膜血管系統(tǒng)內(nèi)。

更優(yōu)選，該病變選自：骨化進(jìn)行性纖維發(fā)育不良(Medici D等，Nature Medicine 16：1400，2010)、心臟纖維化、腎纖維化、肺纖維化(Medici D和Kalluri R Semin Cancer Biol 22：379，2012)和腦海綿狀畸形。

病變更優(yōu)選是腦海綿狀畸形。

在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，腦海綿狀畸形是由選自以下的基因中的至少一個(gè)中的功能喪失突變所導(dǎo)致：CCM1(KRITl)、CCM2(OSM)或CCM3(PDCD10)。

腦海綿狀畸形更優(yōu)選是偶發(fā)性的或家族性的。

本發(fā)明的另一個(gè)目的是用于治療和/或預(yù)防特征為血管畸形的病變的包含有效量的至少一種上述定義的抑制劑和藥學(xué)上可接受的載劑的藥物組合物。

該藥物組合物優(yōu)選還包含有效量的至少另一種治療劑。

在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，其他治療劑選自下組：抗氧化劑、TGF-β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑抑制劑、BMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑抑制劑、VEGF信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑抑制劑、Yap信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑抑制劑、他汀(參見例如Hwang等，2013，Int J.Oncol 43，261-270)以及RhoA GTP酶水平和/或活性的抑制劑。

在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，藥學(xué)上可接受的載劑是納米顆粒，優(yōu)選該納米顆粒經(jīng)工程改造以靶向病理性內(nèi)皮細(xì)胞。

本發(fā)明的另一個(gè)目的是治療和/或預(yù)防以血管畸形為特征病變的方法，包括給予有此需要的對(duì)象有效量的wnt/β-聯(lián)蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑。

可通過不同途徑，包括口服來給予這些化合物，并且可以安全并在CCM(偶發(fā)性或家族性的腦海綿狀畸形)患者中減少血管畸形并防止新血管病灶出現(xiàn)上有效的劑量給予。

在本發(fā)明中，Wnt/β-聯(lián)蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)是化學(xué)工具，其作用的最后結(jié)果是抑制由β-聯(lián)蛋白驅(qū)動(dòng)的轉(zhuǎn)錄應(yīng)答。這些抑制劑的靶標(biāo)可以是Wnt/β-聯(lián)蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的任何步驟和分子組分。

具體地，Wnt/β-聯(lián)蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的抑制劑是β-聯(lián)蛋白抑制劑。β-聯(lián)蛋白抑制劑是β-聯(lián)蛋白活性和/或信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的抑制劑。該抑制劑可直接或間接通過a)對(duì)β-聯(lián)蛋白的作用，b)促進(jìn)β-聯(lián)蛋白降解，c)干擾β-聯(lián)蛋白的表達(dá)，d)與其他試劑競爭結(jié)合β-聯(lián)蛋白來抑制β-聯(lián)蛋白活性。該抑制劑可以是β-聯(lián)蛋白介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄和/或β-聯(lián)蛋白活性的其他水平的抑制劑。該抑制劑是β-聯(lián)蛋白轉(zhuǎn)錄信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的抑制劑。該抑制劑也可抑制或防止活性β-聯(lián)蛋白的核積聚。

在本發(fā)明中，存在特異性抑制細(xì)胞培養(yǎng)物和/或?qū)ο蟮腤nt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的多種方式。a)使用靶向途徑的各種組分的RNAi，如LRP/Arrow、蓬亂蛋白(Dishevelled)，這已經(jīng)顯示在果蠅S2細(xì)胞中(Matsubayashi 2004，Cong等，2004)和哺乳動(dòng)物細(xì)胞(Lu等，2004)都有非常好的效果。b)存在已經(jīng)顯示出不同程度抑制Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的多種小分子。參見表I及其靶標(biāo)。在這些中，IWP已經(jīng)顯示出在通過抑制porcupine來阻斷Wnt分泌中有效(Chen等，2009)。c)(分泌的)Wnt信號(hào)可被過量的結(jié)合其受體結(jié)構(gòu)域的配體卷曲蛋白(Frizzled)阻斷。該結(jié)構(gòu)域最佳呈現(xiàn)為其在FRP/Frz形式中的天然融合?；蛘撸淇墒褂肎PI錨在靶細(xì)胞表面上表達(dá)，這效果良好(Cadigan，1998)。d)另一種抑制Wnt的方式是添加過量的Dickkopf(Dkk)蛋白質(zhì)(Glinka，1998)。這在細(xì)胞培養(yǎng)和體內(nèi)效果良好。Dkk結(jié)合至Wnt的LRP共受體。e)為了封閉細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，多個(gè)工作人員已經(jīng)使用顯性陰性蓬亂蛋白(Wallingford，2000)。f)過表達(dá)完整軸蛋白，一種Wnt途徑的負(fù)調(diào)節(jié)劑，效果良好(Zeng，1997，Itoh 1998；Willert，1999)。g)過表達(dá)全長GSK也可有效阻斷Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(He，1995)。h)存在可用于阻斷核中Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的TCF的多種顯性陰性形式(Molenaar，1996)。i)可在治療上并在實(shí)驗(yàn)室中使用針對(duì)卷曲蛋白的抗體OMP-18R5。其與多種卷曲蛋白受體相互作用(Gurney等，2012)。

在本發(fā)明中，以血管畸形為特征的病變呈現(xiàn)任意類型的血管并且分布于局部異常組織，其中內(nèi)皮細(xì)胞顯示紊亂的細(xì)胞與細(xì)胞連接和/或內(nèi)皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EndMT)標(biāo)志物(如Klf4、Klf2、Ly6a、S100a4、CD44、Id1、a-Sma、Slug、PAI1、N-鈣粘蛋白、Zeb2，F(xiàn)adini等，2012；Margariti等，2012；Li等，2012；Liang等，2011；Stein等，2006；Medici等，2012)的表達(dá)和/或屏障功能損傷。壁細(xì)胞，如周細(xì)胞的結(jié)合也可能收到損傷。在腦海馬狀畸形(CCM)病變中發(fā)現(xiàn)這種畸形的示例。

在本發(fā)明中，特征為EndMT的血管畸形是血管的局部失常，其中內(nèi)皮細(xì)胞已經(jīng)喪失內(nèi)皮分化。結(jié)果，內(nèi)皮層的功能收到損傷并且受到這種異常影響的血管區(qū)域在結(jié)構(gòu)上異常、高度滲透性、發(fā)炎并且易于出血。

根據(jù)本發(fā)明的方面，特征為血管畸形的病變的治療和/或預(yù)防可有效減輕血管畸形的至少一種癥狀，尤其是特征為EndMT的血管畸形，尤其是CCM。

當(dāng)治療特征為血管畸形的病變的背后原因時(shí)，認(rèn)為可類似地實(shí)現(xiàn)對(duì)癥狀的控制。通過對(duì)癥狀的控制，應(yīng)該能夠維持癥狀的嚴(yán)重性(即，控制癥狀的惡化或進(jìn)展)，或者更優(yōu)選地，可整體或部分降低癥狀的嚴(yán)重性。

癥狀包括擴(kuò)張血管的異常簇、癲癇發(fā)作、中風(fēng)癥狀、出血和頭痛、病灶。癥狀一般取決于畸形的位置并且可包括：癲癇發(fā)作的嚴(yán)重性、持續(xù)時(shí)間和強(qiáng)度，神經(jīng)缺陷如手臂和大腿虛弱無力以及與視覺、平衡、記憶和注意力相關(guān)的問題，頭痛的嚴(yán)重性、持續(xù)時(shí)間和強(qiáng)度，大腦中稱為出血(hemorrhage)的流血，其可破壞周圍的腦組織。

可使用β-聯(lián)蛋白的一種或多種不同抑制劑中的任意一種，及其組合。這些可包括，但不限于，小分子抑制劑、蛋白質(zhì)和肽抑制劑、以及反義(RNAi)抑制劑。

示例性的小分子抑制劑包括但不限于，NSAID如吲哚美辛、舒林酸、舒林酸硫化物、舒林砜、阿司匹林、羅非考昔、雙氯芬酸、塞來昔布、美洛昔康、依托度酸、萘丁美酮。

示例性的小分子抑制劑包括槲皮素(Park等，″槲皮素，針對(duì)SW480結(jié)腸癌細(xì)胞中β-聯(lián)蛋白/Tcf的強(qiáng)效抑制劑(Quercetin，a potent inhibitor against beta-catenin/Tcf signaling in SW480colon cancer cells)″，Biochem Biophys Res Commun.328(1)：227-34(2005)，其通過引用全文納入本文)；化合物如ZTM000990、PKF118-310、PKF118-744、PKF115-584、PKF-222-815、CPG049090、PNU-74654、ICG-001、NSC668036、和以下中公開的其他化合物：Trosset et al.，″抑制蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用：通過病毒和生物物理篩選發(fā)現(xiàn)藥物狀β-聯(lián)蛋白抑制劑(Inhibition of protein-protein interactions：The discovery of druglike beta-catenin inhibitors by combining virtual and biophysical screening)″，In Proteins：Structure，F(xiàn)unction，and Bioinformatics 64(1)：60-67(2006)和Barker等，″挖掘用于癌癥治療的Wnt途徑(Mining the Wnt Pathway for Cancer Therapeutics)″，Nature Reviews Drug Discovery 5：997-1014(2006)，其各自通過引用全文納入本文；LC-363(馬里蘭州日耳曼敦的阿瓦隆制藥公司(Avalon Pharmaceuticals，Germantown，Md.))；化合物如N′-[(E)-(5-甲基-2-呋喃基)亞甲基]-2-苯氧基苯甲酰肼、N′-[(E)-1-(5-甲基-2-噻吩基)亞乙基]-2-苯氧基乙酰肼、5-[2-(5-甲基-2-呋喃基)乙基]-2-(2-噻吩基)-1H-吲哚、2-(2-呋喃基)-5-[(E)-2-(5-甲基-2-呋喃基)乙烯基]-1H-吲哚、N-[(E)-(5-甲基-2-呋喃基)亞甲基]-4-(4-吡啶基)-8-喹啉-胺、2-(2-呋喃基)-5-[2-(5-甲基-2-呋喃基)乙基]-1H-吲哚、7-{(2E)-2-[(5-甲基-2-呋喃基)亞甲基]肼基}-N-(2-苯基乙基)-5，6-二氫苯并[h]異喹啉-9-羧酰胺、1-{[(E)-(5-甲基-2-呋喃基)亞甲基]氨基}-3-(4-吡啶基)-2，4-(1H，3H)-喹唑啉二酮、N-(5-甲基-2-呋喃基)-N-(2′-苯氧基[1，1′-二苯基]-3-基)胺、4-{[7-(5-甲基-2-呋喃基)-2-萘基]氧基}吡啶、N-(5-溴-1，3，4-噁二唑-2-基)-4-羥基-2-氧代-6-苯基-2H-吡喃-3-羧酰胺、4-羥基-N-(5-甲基-2-呋喃基)-2-氧代-6-苯基-2H-吡喃-3-羧酰胺、3-[(E)-2-(5-溴-1，3，4-噻二唑-2-基)乙烯基]-4-羥基-6-苯基-2H-吡喃-2-酮、N-(5-溴-1，3，4噻二唑-2-基)-4-羥基-2-氧代-6-苯基-2H-吡喃-3-羧酰胺、5-[(3-氨基-1H-1，2，4-三唑-5-基)甲基]-3-[3-氟-4-(4-嗎啉基)苯基]-1，3-噁唑烷-2-酮、4-[(3-氨基-1H-1，2，4-三唑-5-基)甲基]-1-[3-氟-4-(4-嗎啉基)苯基]-2-咪唑烷酮、1-二苯甲基-4-(5-溴-2-糠酰)哌嗪、1-二苯甲基-4-[(5-甲基-2-噻吩基)羰基]哌嗪、(2E)-2-[1-(4-甲基-2-噻吩基)亞乙基]肼羧酸芐酯、2-(4-氯苯基)-6-甲基-5-(5-甲基-1，3，4-噁二唑-2-基)[1，3]噻唑并[3，2-b][1，2，4]三唑、N-(5-甲基-3-異噁唑基)-N′-[(5-苯基-1，3，4-噁二唑-2-基)羰基]脲、N-[3-(2-{[(5-氯-2-噻吩基)甲基]磺?；鶀肼基)-3-氧代丙基]苯磺酰胺-5-[3-(4-苯氧基苯基)丙基]-1，3，4-噁二唑-2-醇、N-(3-甲基-5-異噁唑基)-4-苯氧基苯甲酰胺、4-羥基-N-(3-甲基-5-異噁唑基)-2-氧代-6-苯氧基-2H-吡喃-3-羧酰胺、2-苯氧基-N′-[(Z)-苯基(2-噻吩基)亞甲基]苯甲酰肼、2-苯胺基-N′-[(Z)-2-呋喃基(苯基)亞甲基]苯甲酰肼、4-[(Z)-1-(3-甲基-5-異噁唑基)-2-苯基乙烯基]苯基2-(1-吡咯烷基)乙基醚、5-甲基-2-糠醛[(3Z)-2-氧代-1-(4-吡啶基)-1，2-二氫-3H-二氫亞吲哚-3-基]腙、(2Z)-N-[(5-甲基-2-呋喃基)甲基]-2-[2-氧代-1-(4-吡啶基)-1，2-二氫-3H-二氫亞吲哚-3-基]乙酰胺、(2Z)-N-[(3-甲基-5-異噁唑基)甲基]-2-[2-氧代-1-(4-吡啶基)-1，2-二氫-3H-二氫亞吲哚-3-基]乙酰胺、(2-氯-1，3-噻唑-5-基)甲基4-(4-嗎啉基磺酰基)苯基醚、N-(4，5-二氫萘并[1，2-d][1，3]噻唑-2-基)-N-(4-苯氧基丁基)甲磺酰胺、N-(6-甲氧基-4，5-二氫萘并[1，2-d][1，3]噻唑-2-基)-N-[2-(1-甲基-3-苯基丙氧基)乙基]乙酰胺、4-{2-[(5-甲基-2-呋喃基)甲氧基]亞芐基}-1-(4-吡啶基磺?；?哌啶、4-{2-[(5-溴-2-呋喃基)甲氧基]亞芐基}-1-異煙堿基哌啶、N-(4，5-二氫萘并[1，2-d][1，3]噻唑-2-基)-N-(4-苯基戊基)乙酰胺、N-(4，5-二氫-3H-萘并[1，2-d]咪唑-2-基)-N-[2-(2-苯基乙氧基)乙基]甲磺酰胺、N′-[(Z)-(5-甲基-2-呋喃基)(2-吡啶基)亞甲基]-2-苯氧基苯甲酰肼，及其在Moll等的美國專利申請(qǐng)公開號(hào)20040204477中公開的藥學(xué)上可接受的鹽，其通過引用全文納入本文；羥基羅漢松樹脂(Mutanen的美國專利號(hào)6,271,257，其通過引用全文納入本文)；六氯酚(Park等，″六氯酚通過促進(jìn)Siah-介導(dǎo)的β-聯(lián)蛋白降解來抑制Wnt/β-聯(lián)蛋白途徑(Hexachlorophene Inhibits Wnt/[beta]-Catenin Pathway by Promoting Siah-Mediated[beta]-Catenin Degradation)″，Molecular Pharmacology Fast Forward(2006年5月30日)，其通過引用全文納入本文)；和PPAR[γ]激動(dòng)劑(例如，曲格列酮)和PPAR[γ]-無活性類似物(例如，[Δ]2TG和STG28)(Wei等，″噻唑烷二酮類通過靶向Skpl-Cull-F-盒蛋白質(zhì)E3泛素連接酶的F-盒蛋白質(zhì)獨(dú)立于過氧化物酶增殖物活化的受體[γ]調(diào)節(jié)β-聯(lián)蛋白和其他細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的表達(dá)(Thiazolidinediones Modulate the Expression of[beta]-Catenin and Other Cell-Cycle Regulatory Proteins by Targeting the F-Box Proteins of Skp1-Cull-F-box Protein E3Ubiquitin Ligase Independently of Peroxisome Proliferator-Activated Receptor[gamma])″，Molecular Pharmacology Fast Forward(2007年6月14日)，其通過引用全文納入本文)。

示例性的小分子抑制劑包括光化學(xué)物水飛薊賓、奶薊草提取物(cardio mariano)、EGCG(表沒食子兒茶素-3-沒食子酸酯)、白茶/綠茶、蘿卜硫素、白藜蘆醇、姜黃素、吲哚-3-甲醇、烏索酸、二十二碳六烯酸、染料木黃酮、β-拉帕醌。

示例性的蛋白質(zhì)和肽抑制劑包括，但不限于，chibby過表達(dá)(Schuierer等，″在結(jié)腸癌細(xì)胞系中β-聯(lián)蛋白抑制劑Chibby的降低表達(dá)(Reduced expression of beta-catenin inhibitor Chibby in colon carcinoma cell lines)″，World J Gastroenterol 12(10)：1529-1535(2006)，其通過引用全文納入本文)；軸蛋白過表達(dá)(Nakamura等，″軸蛋白，Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的抑制劑，與β-聯(lián)蛋白、GSK-3β和APC相互作用并且降低β-聯(lián)蛋白水平(Axin，an inhibitor of the Wnt signalling pathway，interacts with beta-catenin，GSK-3beta and APC and reduces the beta-catenin level)″，Genes Cells 3：395-403(1998)，其通過引用全文納入本文)；HDPR1過表達(dá)(Yao等，″HDPR1，一種WNT/β-聯(lián)蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的新抑制劑，通常在肝細(xì)胞癌中下調(diào)：涉及甲基化介導(dǎo)的基因沉默(HDPR1，a novel inhibitor of the WNT/beta-catenin signaling，is frequently downregulated in hepatocellular carcinoma：involvement of methylation-mediated gene silencing)″，Oncogene24：1607-1614(2005)，其通過引用全文納入本文)；ICAT過表達(dá)(Tago等，″通過ICTA，一種新β-聯(lián)蛋白相互作用蛋白質(zhì)來抑制Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(Inhibition of Wnt signaling by ICAT，a novel beta-catenin-interacting protein)″，Genes Dev.14：1741-1749(2000)；Genbank登錄號(hào)BAB03458，其各自通過引用全文納入本文)；和LXXLL(SEQ ID NO：19)Blaschuk等的美國專利號(hào)6,677,116中公開的肽類型，其通過引用全文納入本文。這些蛋白質(zhì)或多肽抑制劑可直接給予或通過基因治療方法體內(nèi)表達(dá)，如下所述。

示例性的反義β-聯(lián)蛋白構(gòu)建體包括以下中報(bào)告的那些：Green等，″β-聯(lián)蛋白反義治療降低結(jié)腸癌異種移植物的β-聯(lián)蛋白表達(dá)和腫瘤生長速率(Beta-catenin Antisense Treatment Decreases Beta-catenin Expression and Tumor Growth Rate in Colon Carcinoma Xenografts)″，J Surg.Res.101(1)：16-20(2001)；Veeramachaneni，″β-聯(lián)蛋白下調(diào)抑制食道癌細(xì)胞生長(Down-regulation of Beta Catenin Inhibits the Growth of Esophageal Carcinoma Cells)″，J.Thoracic Cardiovasc.Surg.127(1)：92-98(2004)；Bennett等的美國專利號(hào)6,066,500，其各自通過引用全文納入本文。

示例性的siRNA構(gòu)建體描述于Verma等，″針對(duì)β-聯(lián)蛋白的小干擾RNA抑制體外和體內(nèi)結(jié)腸癌細(xì)胞生長(Small Interfering RNAs Directed Against Beta-catenin Inhibit the in vitro and in vivo Growth of Colon Cancer Cells)″，Clin.Cancer Res.9(4)：1291-300(2003)，其通過引用全文納入本文；并且其他針對(duì)β-聯(lián)蛋白的siRNA可購自圣克魯茲生物技術(shù)公司(Santa Cruz Biotechnology，Inc)。

示例性的shRNA構(gòu)建體描述于Gadue等，″誘導(dǎo)使用胚胎干細(xì)胞的原始條痕板形成體外模型需要Wnt和TGF-β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(Wnt and TGF-[beta]Signaling are Required for the Induction of an in vitro Model of Primitive Streak Formation using Embryonic Stem Cells)″，Proc.Natl.Acad.Sci.USA103(45)：16806-16811，其通過引用全文納入本文；并且其他針對(duì)β-聯(lián)蛋白的shRNA可購自超級(jí)陣列生物科學(xué)公司(Super Array Bioscience Corporation)、OG技術(shù)公司(OriGene)、和奧本生物系統(tǒng)公司(Open Biosystems)。

RNAi試劑可直接給予或通過基因治療方法給予。因此，也可給予編碼這些RNAi試劑的DNA分子(表達(dá)載體)。

對(duì)于基因治療方法，多肽或RNA分子的治療劑可以表達(dá)治療劑的DNA分子的形式給予患者。在體內(nèi)，在給予DNA分子之后，治療劑經(jīng)表達(dá)并且對(duì)患者發(fā)揮其作用用于治療和/或預(yù)防以血管畸形為特征的病變。

用于本發(fā)明的方法的核酸試劑(包括RNA和DNA)可以多種本領(lǐng)域已知的方式遞送至對(duì)象，包括通過使用基因治療載體和上述方法。可用于基因治療的載體，例如，可轉(zhuǎn)染到對(duì)象細(xì)胞中的載體內(nèi)可含有核酸并在其中提供治療性核酸試劑的表達(dá)。這類載體包括染色體載體(例如，人工染色體)、非染色體載體，和合成核酸。載體也包括質(zhì)粒、病毒和噬菌體，如逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、慢病毒載體、腺病毒載體和腺相關(guān)載體。

可使用離體或體內(nèi)方法將核酸試劑轉(zhuǎn)入對(duì)象。離體方法包括將核酸體外轉(zhuǎn)入細(xì)胞(例如，通過轉(zhuǎn)染、感染或注射)，該細(xì)胞然后轉(zhuǎn)入或給予對(duì)象。該細(xì)胞可以是，例如，衍生自對(duì)象的細(xì)胞(例如，淋巴細(xì)胞)或同種異體細(xì)胞。例如，可將細(xì)胞直接植入對(duì)象的特定組織中或在包封在人工聚合物基質(zhì)內(nèi)之后植入。核酸也可被體外遞送到對(duì)象中。例如，可在有效運(yùn)載體，例如，能夠在體內(nèi)有效遞送核酸至細(xì)胞的任意制劑或組合物中給予核酸。病毒載體內(nèi)含有的核酸可通過使用病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)或感染在體內(nèi)遞送至細(xì)胞。也可通過物理手段，例如，通過電穿孔、脂質(zhì)、陽離子脂質(zhì)、脂質(zhì)體、DNA槍、磷酸鈣沉淀、注射、或遞送裸核酸將核酸和載體遞送至細(xì)胞。

作為上述核酸非感染遞送的替代，裸DNA或感染性轉(zhuǎn)化載體可用于遞送，從而裸DNA或感染性轉(zhuǎn)化載體含有編碼例如，β-聯(lián)蛋白的多肽或核酸抑制劑的重組基因。然后在轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中表達(dá)核酸分子。

重組基因包括，可操作地互相偶聯(lián)的，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中可操作的上游啟動(dòng)子和任選的其他合適的調(diào)節(jié)元件(即，增強(qiáng)子或誘導(dǎo)元件)，編碼治療性核酸(上述)或多肽的編碼序列，和下游轉(zhuǎn)錄終止區(qū)。任意合適的組成型啟動(dòng)子或誘導(dǎo)性啟動(dòng)子可用于調(diào)節(jié)重組基因的轉(zhuǎn)錄，并且本領(lǐng)域技術(shù)人員易于選擇和利用這類啟動(dòng)子，無論是現(xiàn)在已知的或以后開發(fā)的。啟動(dòng)子也可對(duì)于血管內(nèi)皮中的表達(dá)有特異性，如Tie-2啟動(dòng)子或VE-鈣粘蛋白啟動(dòng)子(Corada M等，Nature Comm 4：2609，2013)；也可使用其他腦內(nèi)皮特異性啟動(dòng)子，如Slco1c1(D.A.Ridder等，J Exp Med 208(13)：2615，2011)。

組織特異性啟動(dòng)子也可使用例如TetO應(yīng)答元件變成誘導(dǎo)性/抑制性。也可使用其他誘導(dǎo)性元件?？刹捎靡阎闹亟M技術(shù)來制備重組基因，將其轉(zhuǎn)入表達(dá)載體中(如果使用)，并將該載體或裸DNA給予患者。示例性的過程描述于Sambrook等，1-3《分子克?。簩?shí)驗(yàn)室手冊(cè)》(MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL)(第2版，1989)，其通過引用全文納入本文。本領(lǐng)域技術(shù)人員易于根據(jù)需要使用本文所述的過程的已知變體修改這些過程。

可使用任意合適的病毒或感染性轉(zhuǎn)化。示例性的病毒載體包括，但不限于，腺病毒、腺相關(guān)病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒(包括慢病毒)。

優(yōu)選治療劑以包含藥學(xué)上可接受的運(yùn)載體和一種或多種活性試劑的藥物組合物的形式給予患者，該活性試劑通過作用于β-聯(lián)蛋白、通過促進(jìn)β-聯(lián)蛋白降解、與其他試劑間接競爭結(jié)合β-聯(lián)蛋白、或通過干擾β-聯(lián)蛋白表達(dá)直接抑制β-聯(lián)蛋白活性。

本發(fā)明的藥物組合物優(yōu)選是單一單位劑型的形式，其含有一定量的有效治療和/或預(yù)防以本文所述類型的血管畸形為特征的病變的治療劑。該藥物組合物也可包含合適的賦形劑，或穩(wěn)定劑，并且可以是固體或液體形式，如片劑、囊劑、粉末、溶液、懸液或乳液。一般而言，該組合物將含有約0.01至99％，約5至95％的活性化合物和運(yùn)載體。當(dāng)與合適的運(yùn)載體和任意賦形劑或穩(wěn)定劑組合時(shí)，單獨(dú)或以組合物形式給予的治療劑可通過以下給予：口服、胃腸外、皮下、透皮、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、鼻內(nèi)滴注、植入、腔內(nèi)或膀胱內(nèi)滴注、眼內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、損傷內(nèi)、施用于粘膜例如鼻腔、咽喉和支氣管的粘膜(即，吸入)、或大腦內(nèi)給予。

對(duì)于大多數(shù)治療性目的，可以固體或液體形式的溶液或懸液口服，通過液體形式的溶液或懸液注射，或通過霧化溶液或懸液的吸入給予。

含有治療劑的固體單位劑型可以是常規(guī)類型。固體形式可以是囊劑，如含有治療劑和運(yùn)載體的普通明膠類型，例如，潤滑劑和惰性填料，如乳糖、蔗糖或玉米淀粉。在另一實(shí)施方式中，用常規(guī)片劑基料如乳糖、蔗糖或玉米淀粉，粘合劑如阿拉伯膠或明膠，崩解劑如玉米淀粉、馬鈴薯淀粉或藻酸以及潤滑劑如硬脂酸或硬脂酸鎂，將治療劑制成片劑。

對(duì)于注射劑量，可在作為運(yùn)載體的生理上或藥學(xué)上可接受的稀釋劑中制備治療劑的溶液或懸液。這類運(yùn)載體包括無菌液體，如水和油，添加或不添加表面活性劑和其他藥學(xué)上和上例上可接受的組分，包括佐劑、賦形劑或穩(wěn)定劑。油的例子是石油、動(dòng)物、植物或合成來源的油，例如花生油、大豆油或礦物油。通常，水、鹽水、右旋糖水溶液和相關(guān)糖溶液以及二醇如丙二醇或聚乙二醇是優(yōu)選的液體運(yùn)載體，尤其對(duì)于注射溶液。

用作氣霧劑時(shí)，可將溶液或混懸液形式的治療劑與合適的推進(jìn)劑，例如烴推進(jìn)劑如丙烷、丁烷或異丁烷以及常規(guī)輔料一起包裝到加壓的氣霧劑容器中。治療劑也可以非加壓形式，例如用噴霧器或霧化器給藥。

除了旨在立即將治療劑遞送至患者的上述制劑以外，也可考慮緩釋制劑。優(yōu)選地，緩釋制劑是包括其中捕獲治療劑的基質(zhì)的可植入裝置?？赏ㄟ^選擇加載到載劑中的藥物的量和材料來控制試劑的釋放。本領(lǐng)域已知多種合適的可植入遞送系統(tǒng)，如Ishikawa等的美國專利號(hào)6,464,687，Guillen的美國專利號(hào)6,074,673，其各自通過引用全文納入本文。

可使用任意合適的生物相容基質(zhì)配制可植入緩釋藥物遞送系統(tǒng)，該基質(zhì)中可加載試劑用于緩釋遞送。這些包括但不限于微球、水凝膠、聚合儲(chǔ)器、膽固醇基質(zhì)、聚合系統(tǒng)和非聚合系統(tǒng)等。示例性的聚合基質(zhì)包括，但不限于，聚(乙烯-共聚-乙酸乙烯酯)、聚-L-丙交酯、聚-D-丙交酯、聚乙交酯、聚(乳酸-共-羥基乙酸)、聚酐、聚原酸酯、聚己內(nèi)酯、聚磷(polyphospagene)、蛋白性聚合物、聚醚、硅酮、及其組合。

或者，對(duì)于DNA基治療劑，遞送治療劑的合適載劑包括溶解的膽固醇作為添加劑用于與陽離子脂質(zhì)、陽離子聚合物或枝狀聚合物絡(luò)合的DNA。優(yōu)選地，使用環(huán)糊精，優(yōu)選甲基-[β]-環(huán)糊精使膽固醇溶解。Esuvaranathan等的美國專利公開號(hào)20020146830中描述了這種類型的制劑，其通過引用全文納入本文。

也考慮Wnt/β-聯(lián)蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑與一種或多種其他治療劑聯(lián)用。例如，為了治療以血管畸形為特征的病變，用上述Wnt/β-聯(lián)蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑之一的治療與另一種對(duì)以由血管畸形為特征的病變的已知治療聯(lián)用，包括但不限于，抗氧化劑、TGF-β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑、BMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑抑制劑、VEGF信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑抑制劑、Yap信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑抑制劑、他汀(參見例如，Hwang等，2013，Int J.Oncol 43，261-270)和RhoA GTP酶水平和/或活性的其他抑制劑及其組合。

因此，本發(fā)明還涉及包含2種或更多種活性劑的制劑或治療系統(tǒng)，其中之一是β-聯(lián)蛋白的抑制劑。

本發(fā)明的優(yōu)選抑制劑進(jìn)一步列于以下，選自：

舒林酸，也稱為(Z)-5-氟-2-甲基-1-[4-(甲基亞磺?；?亞芐基]茚-3-乙酸或2-[(3Z)-6-氟-2-甲基-3-[(4-甲基亞磺酰基苯基)亞甲基]茚-1-基]乙酸；舒林酸硫化物，也稱為(Z)-5-氟-2-甲基-1-[4-(甲硫基)亞芐基]茚-3-乙酸或2-[(3Z)-6-氟-2-甲基-3-[(4-甲基亞磺?；交?亞甲基]茚-1-基]乙酸；舒林砜，也稱為(Z)-5-氟-2-甲基-1-[4-(甲基磺酰基)亞芐基]茚-3-乙酸或2-[(3Z)-6-氟-2-甲基-3-[(4-甲基磺?；交?亞甲基]茚-1-基]乙酸；磷酸-舒林酸，也稱為(Z)-5-氟-2-甲基-1-[4-(甲基亞磺?；?亞芐基]茚-3-乙酸4-二乙氧基磷酰氧基丁酯或2-[(3Z)-6-氟-2-甲基-3-[(4-甲基亞磺?；交?亞甲基]茚-1-基]乙酸4-二乙氧基磷酰氧基丁酯；磷酸-舒林酸硫化物，也稱為2-[(3Z)-6-氟-2-甲基-3-[(4-甲基硫烷基苯基)亞甲基]茚-1-基]乙酸酯；磷酸-舒林砜，稱為2-[(3Z)-6-氟-2-甲基-3-[(4-甲基磺酰基苯基)亞甲基]茚-1-基]乙酸4-二乙氧基磷酰氧基丁酯；水飛薊賓，也稱為2，3-二氫-3-(4-羥基-3-甲氧基苯基)-2-(羥基甲基)-6-(3，5，7-三羥基-4-氧代苯并吡喃-2-基)苯并二氧芑；姜黃素，也稱為(E，E)-1，7-雙(4-羥基-3-甲氧基苯基)-1，6-庚二烯-3，5-二酮；白藜蘆醇，也稱為3，4’，5-三羥基-反式芪；鹽霉素，及其藥學(xué)上可接受的鹽或類似物。類似物是在結(jié)構(gòu)上相似但在元素組成上不同的化合物。結(jié)構(gòu)研究對(duì)于產(chǎn)生類似物，尤其是舒林酸代謝物的類似物以鑒定可能增強(qiáng)其化學(xué)活性同時(shí)降低其毒性的化學(xué)修飾而言有非常積極的作用(例如，磷酸化⁵⁷或芐基酰胺衍生化，Whitt等，2012，Cancer Prev.Res.5，822-833)。

“藥學(xué)上可接受的鹽”包含通過用有機(jī)或無機(jī)堿成鹽獲得的常規(guī)無毒鹽。無機(jī)鹽是，例如，金屬鹽，尤其是堿金屬鹽，堿土金屬鹽和過渡金屬鹽(如，鈉、鉀、鈣、鎂、鋁)。也可用堿，如氨或仲胺或叔胺(如二乙基胺、三乙基胺、哌啶、哌嗪、嗎啉)，或用堿性氨基酸，或用糖胺(如葡甲胺)，或用氨基醇(如3-氨基丁醇或2-氨基乙醇)來獲得鹽。

此外，本發(fā)明的化合物可以是非溶劑合物或者是與藥學(xué)上可接受的溶劑如水，乙醇等形成溶劑合物。

本發(fā)明還包括藥物組合物，其特征為含有選自以下的一種或多種活性成分：舒林酸、舒林酸硫化物、舒林砜、磷酸-舒林酸、磷酸-舒林酸硫化物、磷酸-舒林砜、水飛薊賓、姜黃素、白藜蘆醇、和鹽霉素，與藥學(xué)上可接受的運(yùn)載體、賦形劑和稀釋劑，所述藥物組合物用于治療以血管畸形為特征的病變，尤其是腦海綿狀畸形(CCM)。

本發(fā)明的組合物可通過任意接受的給藥模式或用于相似應(yīng)用的試劑給予。因此，給藥可以是，例如，口服、鼻內(nèi)、胃腸外(靜脈內(nèi)、皮下、肌內(nèi))、口頰、舌下、直腸、局部、透皮、膀胱內(nèi)，或使用任何其他給藥途徑。

可按照已知方法在藥學(xué)上配制化合物。藥物組合物可以基于治療需要進(jìn)行選擇。這些組合物可以通過摻混制備并且適當(dāng)?shù)卣{(diào)配成口服或胃腸外給藥，這樣，可以片劑、膠囊、口服制劑、粉末劑、顆粒劑、丸劑、注射劑或可滴注的液體溶液、混懸劑或栓劑。

用于口服給藥的片劑和囊劑一般以單位劑型呈現(xiàn)并且含有常規(guī)賦形劑如粘合劑、填充劑、稀釋劑、壓片劑、潤滑劑、去污劑、崩解劑、著色劑、風(fēng)味劑和濕潤劑?？墒褂帽绢I(lǐng)域熟知方法對(duì)片劑進(jìn)行包衣。

合適的填充劑包括纖維素、甘露醇、乳糖和其他類似試劑。合適的崩解劑包括聚乙烯吡咯烷酮和淀粉衍生物，如淀粉乙醇酸鈉。合適的潤滑劑包括，例如，硬脂酸鎂。合適的濕潤劑包括月桂基硫酸鈉。

口服固體組合物可以通過摻混、填充或壓片的常規(guī)方法制備。摻混操作可以重復(fù)進(jìn)行，從而將有效成分分布到含有大量填充劑的組合物中。這些操作是常規(guī)的。

口服液體制劑可以是例如水性或油性混懸劑、溶液劑、乳劑、糖漿或酏劑的形式，或者可以是臨用前用水或合適載劑重建的干燥產(chǎn)品。這類液體制劑可含有常規(guī)的添加劑，例如助懸劑，如山梨糖醇、糖漿、甲基纖維素、明膠、羥乙基纖維素、羧甲基纖維素、硬脂酸鋁凝膠、或氫化食用脂；乳化劑，如卵磷脂、去水山梨糖醇單油酸酯或阿拉伯膠；非水性載劑(可包括食用油)，如杏仁油、分餾椰子油，油酯(如甘油、丙二醇或乙醇的酯)；防腐劑，如對(duì)羥基苯甲酸甲酯或丙酯或者山梨酸，需要時(shí)還可含有常規(guī)的調(diào)味劑或著色劑。

口服制劑也包括常規(guī)緩釋制劑，例如腸溶包衣片或顆粒。

對(duì)于胃腸外給藥(例如，推注或連續(xù)輸注)，可制備含有化合物和無菌載劑的流體單位劑型(例如，在安瓿中或在多劑容器中)。化合物可以懸浮或溶解，取決于載劑和濃度。通常通過將化合物溶解在運(yùn)載體中，過濾消毒，裝入合適的藥瓶并密封來制備胃腸道外給藥溶液。有利的是，可將佐劑如局部麻醉劑、防腐劑和緩沖劑溶解于載劑中。為了增加穩(wěn)定性，組合物可以在填充小瓶并且真空下除水后進(jìn)行冷凍。胃腸外混懸劑可以以基本上相同的方式進(jìn)行制備，只是化合物懸浮在載劑中而非溶解在其中，在懸浮于無菌載劑中之前暴露于環(huán)氧乙烷進(jìn)行滅菌。有利的是，組合物可以包含表面活性劑或濕潤劑以便于本發(fā)明化合物的均勻分布。

對(duì)于含服或舌下給藥，組合物可以是片劑、錠劑、軟錠劑或凝膠。

化合物可以被藥學(xué)配制成栓劑或保留灌腸劑，例如含有常規(guī)栓劑基質(zhì)如可可豆脂、聚乙二醇或其他甘油酯，用于直腸給藥。

另一種給予本發(fā)明化合物的方式涉及局部治療。局部制劑可以包括例如：軟膏劑，乳膏劑，洗劑，凝膠，溶液劑，糊劑和/或并且包含脂質(zhì)體，膠束和/或微球。軟膏劑的例子包括：油脂性軟膏，例如植物油，動(dòng)物脂肪，半固體烴，可乳化的軟膏，例如硫酸羥基硬脂精，無水羊毛脂，十六醇，甘油單硬脂酸酯，硬脂酸，水溶性軟膏，含有各種分子量的聚乙二醇。如制劑專家所知，乳膏劑是粘稠液體或半固體乳劑，含有油相、乳化劑和水相。油相通常含有凡士林油和醇如十六或十八醇。乳膏制劑中的乳化劑選自非離子型、陰離子型、陽離子型或兩性表面活性劑。可加入分散劑如醇或甘油用于制備凝膠?？赏ㄟ^精細(xì)粉碎和/或混合來分散膠凝劑。

給予本發(fā)明化合物的另一種方法涉及透皮遞送。常見的透皮制劑包括傳統(tǒng)的水性和非水性載劑(vector)，例如乳膏、油、洗劑或糊劑或者可以以膜或者加藥貼劑的形式提供。

制劑參考參見雷明頓的書(《雷明頓：藥物科學(xué)與實(shí)踐》“Remington：The Science and Practice of Pharmacy”，LWW出版社(Lippincott Williams&Wilkins)，2000)。

本發(fā)明還包括通過經(jīng)工程改造以靶向例如，如CCM病灶中那樣表達(dá)EndMT標(biāo)志物(如Klf4、Klf2、Ly6a、S100a4、CD44、Id1、a-Sma、Slug、PAI1、N-鈣粘蛋白、Zeb2，其他標(biāo)志物示于Fadini等，2012；Margariti等，2012；Li等，2012；Liang等，2011；Stein等，2006；Medici等，2012)的病理性內(nèi)皮細(xì)胞的合成納米顆粒的給藥(Davis等，2010，Nature 464，1067-1071；Dashi等，2012Adv Mater.，24，3864-3869)?？稍谶@類納米顆粒中包封小分子、蛋白質(zhì)、肽、反義核酸。

上述用途和方法也包括相對(duì)于給予選自舒林酸、舒林酸硫化物、舒林砜、磷酸-舒林酸、磷酸-舒林酸硫化物、磷酸-舒林砜、水飛薊賓、姜黃素(參見例如Cheng等，2013，Int J.of Oncology 43，895-902)、白藜蘆醇、和鹽霉素的化合物同時(shí)或延遲的共同給予其他治療劑的可能性。

在前述用途和方法中，選自舒林酸、舒林酸硫化物、舒林砜、磷酸-舒林酸、磷酸-舒林酸硫化物、磷酸-舒林砜、水飛薊賓、姜黃素、白藜蘆醇、和鹽霉素的化合物的劑量可根據(jù)多種因素變化，包括患者類型和條件、疾病嚴(yán)重程度、給藥模式和時(shí)間、飲食和藥物組合。作為指示，它們可以0.001至1000mg/kg/天的劑量范圍內(nèi)給予。就具體患者確定最優(yōu)劑量為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知。優(yōu)選的劑量范圍是1至10mg/kg/天，最優(yōu)選的范圍是10至100mg/kg/天。更優(yōu)選的劑量范圍是100至200mg/kg/天。更優(yōu)選的劑量范圍是200至500mg/kg/天。更優(yōu)選的劑量范圍是500至1,000mg/kg/天。優(yōu)選地，本發(fā)明的抑制劑通過口服給予。

作為常規(guī)做法，組合物通常伴有書寫或者印刷的針對(duì)治療過程的使用說明。

通過參考下圖非限制性實(shí)施例闡述本發(fā)明。

圖1.CCM3-ECKO(CCM3的內(nèi)皮-細(xì)胞-特異性純合缺失)小鼠腦和視網(wǎng)膜血管中的內(nèi)皮細(xì)胞顯示出強(qiáng)化的β-聯(lián)蛋白轉(zhuǎn)錄活性。a-c.來自野生型(WT)和CCM3-ECKO小鼠(具有CCM3基因的內(nèi)皮-細(xì)胞-特異性-失活的小鼠)的腦切片(a，b)和視網(wǎng)膜(c，平面固定)(a，c，XY軸；b，沿著X軸的Z凸起)的b-gal代表性免疫染色，b-gal作為血小板-內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子陽性(內(nèi)皮)細(xì)胞中β-聯(lián)蛋白轉(zhuǎn)錄活性的基因報(bào)告物。用DAPI對(duì)核進(jìn)行染色。箭，b-gal-陰性核；箭頭，b-gal-陽性核。以63倍放大倍數(shù)在50個(gè)隨機(jī)視場中對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞核進(jìn)行計(jì)數(shù)。使用對(duì)于內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行的血小板-內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子的標(biāo)記對(duì)隨機(jī)視場計(jì)數(shù)的定量(參見方法)發(fā)現(xiàn)來自野生型BAT-gel小鼠的對(duì)照腦內(nèi)皮細(xì)胞的b-gal-陽性核(每個(gè)視場0.86±0.15個(gè)陽性核；陽性核占600個(gè)總內(nèi)皮核的7.2％)在CCM3-ECKO腦內(nèi)皮細(xì)胞中顯著增加6倍(每個(gè)視場6.0±1.7個(gè)陽性核；陽性核占700個(gè)總內(nèi)皮核的42.9％)(p＜0.05；t-檢驗(yàn))。在這些CCM3-ECKO腦內(nèi)皮細(xì)胞中，b-gal-陽性核在建立的海綿狀和毛細(xì)血管擴(kuò)張癥中有類似的分布。

b-gal-陽性核在來自CCM3-ECKO小鼠的腦和視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞中的豐度高于對(duì)照細(xì)胞。對(duì)于視網(wǎng)膜(c)，顯示了中間區(qū)域的兩條靜脈。a-c中的樣品來自dpn 9同窩鼠仔。比例尺，20mm。

圖2.培養(yǎng)中的CCM3-敲除內(nèi)皮細(xì)胞顯示出活性β-聯(lián)蛋白離開細(xì)胞-細(xì)胞連接處并且其濃縮到核中，其中他們有轉(zhuǎn)錄活性。a，b.野生型(WT)和CCM3-敲除(KO)內(nèi)皮細(xì)胞的活性β-聯(lián)蛋白的代表性免疫染色。原代培養(yǎng)物(a)和細(xì)胞系(b)。用DAPI對(duì)核進(jìn)行染色。箭頭，β-聯(lián)蛋白-陽性核。在這些CCM3-敲除內(nèi)皮細(xì)胞中，CCM3轉(zhuǎn)錄本減少70％～90％(原代培養(yǎng)物)并且無法通過rtPCR檢測到(系)。比例尺，20mm。c.對(duì)野生型(WT)和CCM3-敲除(KO)內(nèi)皮細(xì)胞系的膜(M)、胞質(zhì)(C)和核(N)隔室的代表性細(xì)胞分級(jí)分離和Western印跡?？傆?jì)，膜和核活性β-聯(lián)蛋白分別減少34％～42％，減少58％～75％，和增加51％～66％；與野生型內(nèi)皮細(xì)胞相比，活性β-聯(lián)蛋白在CCM3-敲除中的胞質(zhì)中幾乎無法檢測到。在野生型中，CCM3在胞質(zhì)中富集；在CCM3敲除中，Western印跡沒有檢測到CCM3。d，e.對(duì)野生型(WT)和CCM3-敲除(KO)內(nèi)皮細(xì)胞系中沒有(-)和有(+)顯性陰性Tcf4表達(dá)的內(nèi)皮祖細(xì)胞表型/EndMT標(biāo)志物(e)和典型β-聯(lián)蛋白靶標(biāo)(d)的定量。數(shù)據(jù)是來自三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的三次重復(fù)rtPCR試驗(yàn)的平均值(±SD)。微管蛋白轉(zhuǎn)錄本a和b，其不是CCM3敲除的靶標(biāo)，沒有受到顯性陰性Tcf4的修飾(未公開結(jié)果)。**，p＜0.01，CCM3敲除對(duì)比對(duì)照(WT)。^，p＜0.05；^^，p＜0.01，CCM3敲除加上顯性陰性Tcf4(+)對(duì)比CCM3敲除加上GFP(-)(t-檢驗(yàn))。

圖3.CCM3-敲除內(nèi)皮細(xì)胞顯示出舒林酸硫化物對(duì)β-聯(lián)蛋白靶基因轉(zhuǎn)錄的抑制以及誘導(dǎo)活性β-聯(lián)蛋白從核向粘著連接的再定位。a.通過rtPCR對(duì)原代培養(yǎng)物中野生型(WT)和CCM3-敲除(KO)腦內(nèi)皮細(xì)胞中β-聯(lián)蛋白靶基因(參見b)Klf4、Ly6a、S100a4和Id1的轉(zhuǎn)錄的舒林酸硫化物抑制的定量。*，p＜0.05；**，p＜0.01(t-檢驗(yàn))，比較基本條件下的CCM3-敲除對(duì)比WT。^^，p＜0.01(t-檢驗(yàn))，比較CCM3敲除加上舒林酸硫化物對(duì)比載劑處理的CCM3敲除。b.通過rtPCR對(duì)(a)中測試的基因的轉(zhuǎn)錄的顯性陰性Tcf4抑制的定量。*，p＜0.05；**，p＜0.01(t-檢驗(yàn))，比較基本條件下的CCM3-敲除對(duì)比WT。^，p＜0.05；^^，p＜0.01(t-檢驗(yàn))，CCM3敲除加上顯性陰性Tcf4(+)硫化物對(duì)比CCM3敲除加上GFP(-)。c.在舒林酸硫化物處理下的原代培養(yǎng)物中腦內(nèi)皮細(xì)胞的代表性免疫染色。在這些CCM3-敲除內(nèi)皮細(xì)胞中，舒林酸硫化物介導(dǎo)的活性β-聯(lián)蛋白(載劑處理的KO中的箭頭)從核(參見DAPI染色中的相應(yīng)箭頭)再分布到細(xì)胞-細(xì)胞連接。在KO中，舒林酸硫化物處理后觀察到的活性β-聯(lián)蛋白和VE-鈣粘蛋白的共定位。比例尺，15mm。底部兩排：在這些CCM3-敲除內(nèi)皮細(xì)胞中，舒林酸硫化物抑制Klf4和S100a4(白色核箭頭)的過表達(dá)?？偤藶镈API-陽性或由白色線列出。在這些CCM3-敲除內(nèi)皮細(xì)胞中，Klf4只在核并且S100a4同時(shí)在核和胞質(zhì)中。比例尺，30mm。

圖4.CCM3-ECKO小鼠腦血管中的內(nèi)皮細(xì)胞顯示舒林酸硫化物抑制β-聯(lián)蛋白轉(zhuǎn)錄活性并且誘導(dǎo)VE-鈣粘蛋白從擴(kuò)散的分布向粘著連接的再定位。不用(載劑)和用舒林酸硫化物處理的CCM3-ECKO小鼠的腦切片的代表性免疫染色。a.舒林酸硫化物-介導(dǎo)的核中b-gal反應(yīng)性消除(頂部，箭，對(duì)比底部，箭頭)，b-gal作為血小板-內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子陽性(內(nèi)皮)細(xì)胞中β-聯(lián)蛋白轉(zhuǎn)錄活性的基因報(bào)告物。各組圖顯示XY軸(主圖)，和沿著X軸的Z凸起(下圖)。用DAPI對(duì)核進(jìn)行染色。比例尺，25mm。b.這些血管CCM3-ECKO內(nèi)皮細(xì)胞中舒林酸硫化物-介導(dǎo)的VE-鈣粘蛋白從擴(kuò)散分布向細(xì)胞-細(xì)胞連接的再分布(中間組圖，箭頭)，分布類似于匹配的野生型(WT)小鼠(右組圖，箭頭)。a和b中的切片來自dpn 9同窩鼠仔。比例尺，30mm。

圖5.CCM3-ECKO小鼠的腦血管中的內(nèi)皮細(xì)胞顯示舒林酸硫化物對(duì)祖細(xì)胞和EndMT標(biāo)志物的過表達(dá)的抑制。代表性的免疫染色顯示在這些血管CCM3-ECKO內(nèi)皮細(xì)胞(血小板-內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子陽性；同工凝集素B4陽性)的核中濃縮的Klf4(頂部，箭頭)、S100a4(中間，箭頭)、和Id1(底部，箭頭)。舒林酸硫化物強(qiáng)力降低了Klf4、S100a4和Id1(箭)的這種核反應(yīng)性，分布類似于匹配的野生型(WT)小鼠(右組圖，箭)。腦切片來自dpn9同窩鼠仔。比例尺，30mm。

圖6.CCM3-ECKO小鼠中的腦和視網(wǎng)膜血管顯示出舒林酸硫化物誘導(dǎo)的病灶減少。a.不用(載體)和用舒林酸硫化物處理CCM3-ECKO小鼠的腦切片的血管病灶的代表性免疫染色，如桑葚(多海綿狀)，單海綿狀和毛細(xì)血管擴(kuò)張癥(Telang)。如⁶³所述對(duì)病灶進(jìn)行分類。b.上圖：對(duì)(a)中所示的腦病灶的定量(具體參見方法)。來自5只獨(dú)立幼崽的同窩鼠仔(dpn 9鼠仔)：載劑處理(n＝8)或舒林酸硫化物處理(n＝7)。*，p＜0.005，威爾科克森符號(hào)秩檢驗(yàn)。下圖：對(duì)腦病灶尺寸的定量(mm，參見方法)。*，p＜0.05，t-檢驗(yàn)。c.對(duì)不用(載劑)和用舒林酸硫化物處理的野生型(WT)和CCM3-ECKO小鼠(dpn 9同窩鼠仔)的視網(wǎng)膜中血管的血小板-內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子(內(nèi)皮細(xì)胞)的代表性免疫染色。從靜脈(箭)發(fā)展出多內(nèi)腔血管病灶(箭頭)。舒林酸硫化物(右下)減少了畸形(箭頭)和靜脈直徑(箭)，(也參見e)。d.對(duì)(c)中所示的視網(wǎng)膜血管病灶的定量，顯示為受到血管病灶影響的視網(wǎng)膜周邊的百分比(對(duì)于載劑和舒林酸硫化物n＝14，參見方法)。*，p＜0.05，t-檢驗(yàn)。e.對(duì)(c)中所示的視網(wǎng)膜血管病灶的代表性免疫染色。以及外周血管畸形，舒林酸硫化物誘導(dǎo)的靜脈直徑減小(具體參見文本)。這些CCM3-ECKO小鼠的動(dòng)脈沒有顯示出這種異常的表型(內(nèi)皮細(xì)胞同工凝集素B4標(biāo)記)。比例尺，100mm(a)；700mm(c)；60mm(e)。

圖7.CCM3-ECKO小鼠中的腦內(nèi)皮細(xì)胞顯示出增強(qiáng)的β-聯(lián)蛋白轉(zhuǎn)錄活性，其早于TGF-β/BMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)活化。a.在CCM3重組(1dpn)后的早期(3dpn)和晚期(9dpn)時(shí)間點(diǎn)對(duì)來自野生型(WT)和CCM3-ECKO小鼠的腦切片內(nèi)皮細(xì)胞中β-gal(β-聯(lián)蛋白轉(zhuǎn)錄活性的基因報(bào)告物)(紅色，上圖)和p-Smad1(TGF-β/BMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)活化的標(biāo)志物)(紅色，下圖)的代表性免疫染色。DAPI-染色的核是藍(lán)色的。b.顯示了β-gal(紅色)、p-Smad1(綠色)和足糖萼蛋白(藍(lán)色)的共染色。在(a)和(b)中，在3dpn鼠仔(a中海綿狀和b中毛細(xì)血管擴(kuò)張)中血管畸形的內(nèi)皮細(xì)胞中，箭，β-gal-和p-Smad1-陽性核；空心箭，p-Smad1陰性核。插圖，方框區(qū)域的放大。比例尺，50μm；a)中的插圖，10μm。c.對(duì)3和9dpn時(shí)的WT和CCM3-ECKO鼠仔的腦切片中的β-gal-陽性和p-Smad1陽性內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行定量。在來自三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中的匹配的同窩鼠仔的樣品中各條件的63倍放大倍數(shù)的40個(gè)隨機(jī)視場中計(jì)算至少450個(gè)核的總數(shù)。*，對(duì)比所示對(duì)照，p＜0.01(t-檢驗(yàn))。

圖8.CCM3-ECKO小鼠中的腦內(nèi)皮細(xì)胞在任意尺寸的病灶中以及假性-正?；苤酗@示出增強(qiáng)的β-聯(lián)蛋白介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄，而僅在較大的病灶中可檢測到TGF-β/BMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。a.在9dpn時(shí)來自野生型(WT)和CCM3-ECKO小鼠的腦切片中內(nèi)皮細(xì)胞(足糖萼蛋白陽性，綠色)中β-gal(紅色，上圖)和p-Smad1(phosphoSer463/465)(紅色，下圖)的代表性免疫染色。用DAPI對(duì)核進(jìn)行染色(藍(lán)色)。CCM3-ECKO中顯示了假-正常血管以及增加尺寸的血管病灶。箭，p-Smad1-或β-gal-陽性核；空心箭，p-Smad1-陰性核。比例尺為50μm。使用p-Smad3抗體獲得類似結(jié)果(未公開結(jié)果)。b.和c.各種條件計(jì)數(shù)的總共至少250個(gè)內(nèi)皮核上β-gal-陽性或p-Smad1-陽性內(nèi)皮核的百分比。在來自匹配的同窩CCM3-ECKO(5只)和WT(5只)小鼠的腦切片中63倍放大倍數(shù)的20個(gè)隨機(jī)視場中計(jì)算的β-gal-和p-Smad1-陽性和內(nèi)皮細(xì)胞核。*，p＜0.05，t-檢驗(yàn)。

圖9.CCM3-ECKO小鼠中的腦內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)與增強(qiáng)的β-聯(lián)蛋白轉(zhuǎn)錄活性相關(guān)的干細(xì)胞/EndMT標(biāo)志物。a，b，c，d.在1dpn的CCM3重組后的3dpn(出生后的天數(shù))和9dpn時(shí)，對(duì)來自野生型(WT)和CCM3-ECKO小鼠的腦切片的β-gal(紅色)與足糖萼蛋白(藍(lán)色，以鑒定內(nèi)皮細(xì)胞)和不同干細(xì)胞/EndMT標(biāo)志物(Klf4，Ly6a，S100a4，Id1，全部綠色)的代表性免疫染色。箭指向同時(shí)表達(dá)β-gal和干細(xì)胞/EndMT標(biāo)志物(參見合并，各組圖中的右列，黃色)的內(nèi)皮核(足糖萼蛋白陽性細(xì)胞)。比例尺為40μm。e.對(duì)內(nèi)皮核陽性β-gal，Klf4，S100a4和Id1(單陽性)，及其在3和9dpn時(shí)的WT和CCM3-ECKO鼠仔的腦切片中共定位的定量。對(duì)于各干細(xì)胞/EndMT標(biāo)志物與β-gal的共定位，發(fā)明人區(qū)分的2個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞群：β-gal陽性群，其中發(fā)明人計(jì)算EndMT陽性核的數(shù)量，和EndMT陽性群，其中發(fā)明人計(jì)算β-gal陽性核的數(shù)量。該分析顯示Klf4、S100a4和Id1表達(dá)與3dpn鼠仔中的β-聯(lián)蛋白轉(zhuǎn)錄活性高度關(guān)聯(lián)，而其在9dpn鼠仔中部分非偶聯(lián)。

在來自三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中的匹配的同窩鼠仔的樣品中各條件的63倍放大倍數(shù)的50個(gè)隨機(jī)視場中計(jì)算至少600個(gè)核的總數(shù)。*，p＜0.05對(duì)比代表性WT值(t-檢驗(yàn))；^，p＜0.05對(duì)比3dpn CCM3-ECKO鼠仔中的值。

圖10.在培養(yǎng)中的CCM缺陷型內(nèi)皮細(xì)胞中誘導(dǎo)End-MT標(biāo)志物和β-聯(lián)蛋白靶基因。在培養(yǎng)的內(nèi)皮中刪除CCM1或CCM2或CCM3中的任一個(gè)誘導(dǎo)β-聯(lián)蛋白驅(qū)動(dòng)的轉(zhuǎn)錄活化，如與相應(yīng)WT相比軸蛋白2的增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄。EndMt標(biāo)志物(Klf4，Cd44和S100a4)也上調(diào)，附圖報(bào)告rtPCR。

圖11.核β-聯(lián)蛋白在CCM1-KO內(nèi)皮細(xì)胞中有轉(zhuǎn)錄活性并且活化EndMT標(biāo)志物的轉(zhuǎn)錄。a.活性β-聯(lián)蛋白(在殘基37/41上去磷酸)在培養(yǎng)中的CCM1-KO內(nèi)皮細(xì)胞的核中濃縮(箭)，而在野生型內(nèi)皮細(xì)胞中，其不在核中且位于細(xì)胞-細(xì)胞接觸處。b.核β-聯(lián)蛋白在CCM1-KO內(nèi)皮細(xì)胞中在轉(zhuǎn)錄上有效，如在Top-fop閃光試驗(yàn)中對(duì)比WT增強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄響應(yīng)所示。c.β-聯(lián)蛋白導(dǎo)致CCM1-KO內(nèi)皮細(xì)胞中EndMT標(biāo)志物的表達(dá)，如依昔舒林所示。抑制*，p＜0.05對(duì)比相應(yīng)溶劑處理的值(t-檢驗(yàn))。

圖12.CCM3-敲除內(nèi)皮細(xì)胞顯示β-聯(lián)蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞自主性Wnt-受體獨(dú)立活化。a，b，c，d.在未刺激的CCM3-敲除(KO)內(nèi)皮細(xì)胞中軸蛋白2和S100a4轉(zhuǎn)錄的β-聯(lián)蛋白驅(qū)動(dòng)的活化不受porcupine抑制劑IWP2或IWP12(a，b)或Lrp競爭物Dkk1(0.5uM)(c)的抑制，其在野生型和CCM3-敲除內(nèi)皮細(xì)胞系中有效抑制軸蛋白的Wnt3a-誘導(dǎo)的刺激(d)。S100a4的轉(zhuǎn)錄既不受野生細(xì)胞中Wnt3a的誘導(dǎo)，也不受CCM3-敲除細(xì)胞中Dkk1的抑制。e，f.與野生型內(nèi)皮細(xì)胞相比，在基礎(chǔ)條件中和在CCM3-敲除中Wnt3a刺激之后，Wnt共受體Lrp6活化(磷酸化)程度都較低。顯示了(f)中定量的代表三個(gè)獨(dú)立試驗(yàn)的Western印跡。*，p＜0.05對(duì)比WT(t-檢驗(yàn))。g，h.用Wnt3a急性刺激(48小時(shí))不能在野生型內(nèi)皮細(xì)胞中誘導(dǎo)干細(xì)胞/EndMT標(biāo)志物的表達(dá)，而用β-聯(lián)蛋白Lef-ΔβCTA的活化形式持續(xù)刺激(7天)旁路Wnt受體則可以(Vleminckx等，1999)。*，p＜0.05對(duì)比WT(t-檢驗(yàn))。i.典型β-聯(lián)蛋白靶基因(軸蛋白2，Ccnd1，Nkd1)和干細(xì)胞/EndMT標(biāo)志物(S100a4，Id1)的活化是野生型內(nèi)皮細(xì)胞中對(duì)siRNA沉默VE-鈣粘蛋白的早期響應(yīng)(48小時(shí))。對(duì)于siRNA敲減CCM3的類似急性響應(yīng)，參見圖17。*，p＜0.05對(duì)比陰性對(duì)照siRNA-處理的細(xì)胞(t-檢驗(yàn))。

圖13.VE-鈣粘蛋白沉默后的連接拆散誘導(dǎo)了內(nèi)皮細(xì)胞中活性β-聯(lián)蛋白的核積聚。然而，沒有強(qiáng)化Smad1磷酸化。a.野生型內(nèi)皮細(xì)胞系中通過siRNA的VE-鈣粘蛋白急性下調(diào)后(48小時(shí))活性β-聯(lián)蛋白(紅色)和VE-鈣粘蛋白(綠色)的代表性免疫染色。連接拆散和VE-鈣粘蛋白下調(diào)(箭)伴隨活性β-聯(lián)蛋白的核積聚(箭頭)。DAPI顯示的核是藍(lán)色的。用陰性(非靶向)siRNA處理對(duì)照(Ctr siRNA)。比例尺為30μm。b.在相同細(xì)胞中，VE-鈣粘蛋白敲減并不刺激Smad1磷酸化，如Western印跡中測量。

圖14.CCM1、2和3刪除的常見特征是連接解散。海綿狀血管瘤的內(nèi)皮細(xì)胞系(病灶)顯示紊亂的粘著連接(VE-鈣粘蛋白染色，紅色)。顯示了CCM1-ECKO，CCM2-ECKO和CCM3-ECKO鼠仔(7dpn并且在1dpn時(shí)融除CCM基因)的腦切片。相比之下，VE-鈣粘蛋白在野生型(WT)同窩鼠仔的腦內(nèi)皮細(xì)胞中規(guī)律地分布于細(xì)胞-細(xì)胞接觸處。核由DAPI染色成藍(lán)色。在下圖中放大來自CCM-ECKO腦的切片的黃色方框區(qū)域。

圖15.在CCM3-flox/flox-Cdh5(PAC)-CreERT2小鼠中CRE重組酶的內(nèi)皮選擇性表達(dá)之后(他莫昔芬誘導(dǎo)的CRE重組酶內(nèi)皮細(xì)胞特異性表達(dá)和CCM3基因重組)，該小鼠模型的腦和視網(wǎng)膜顯示形成血管病灶。這些畸形從靜脈血管中發(fā)展，即使CRE重組酶也在動(dòng)脈中有活性。a.在dpn1時(shí)用他莫昔芬處理CCM3-flox/flox-Cdh5(PAC)-CreERT2小鼠(10mg/kg體重，如方法中所述)以誘導(dǎo)CRE重組酶的內(nèi)皮細(xì)胞特異性表達(dá)和floxed/floxed CCM3基因重組(CCM3-ECKO小鼠)。解剖后肉眼觀察形貌顯示小腦和視網(wǎng)膜中的明顯病灶(箭頭)。在腦中，也可觀察到一些表面血管畸形(小箭頭)，但大部分病灶僅可在切片和免疫染色之后檢測到，如正文所示。在用他莫昔芬處理3-4天后開始出現(xiàn)這些病灶，并且它們的尺寸逐漸增大。在他莫昔芬處理后10天，這些CCM3-ECKO小鼠開始死亡，有明顯出血性小腦。他莫昔芬在不表達(dá)CRE重組酶的CreERT2陰性的CCM3-floxed/floxed-Cdh5(PAC)小鼠和在雜合CCM3-floxed/+-Cdh5(PAC)-CreERT2小鼠中都不誘導(dǎo)任何表型。野生型(WT)小鼠是用他莫昔芬處理的CCM3+/+-Cdh5(PAC)-CreERT2小鼠。用于溶解他莫昔芬的載劑處理的CCM3-floxed/floxed-Cdh5(PAC)-CreERT2小鼠也顯示出WT表型。比例尺，1cm。b.CCM3-flox/flox-Cdh5(PAC)-CreERT2小鼠與Rosa 26-增強(qiáng)綠色熒光蛋白(EYFP)小鼠(Srinivas等，2001)雜交以通過EYFP的表達(dá)監(jiān)測CRE重組酶的表達(dá)。在來自CCM3+/+-Cdh5(PAC)-CreERT2-R26-EYFP小鼠和CCM3-flox/flox-Cdh5(PAC)-CreERT2-R26-EYFP(CCM3-ECKO)小鼠的視網(wǎng)膜的血管中，由報(bào)告基因EYFP的表達(dá)來顯示Cre-誘導(dǎo)的重組(通過他莫昔芬處理，如上所述)。這頻繁發(fā)生在這兩種小鼠模型的動(dòng)脈(箭頭)、靜脈(箭)和毛細(xì)血管中，并且由EYFP和血小板-內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子(內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物)標(biāo)記的廣泛共定位顯示。與載劑處理的野生型小鼠相比，在CCM3-ECKO鼠仔的新鮮分離的腦毛細(xì)血管中通過rtPCR評(píng)價(jià)的CCM3轉(zhuǎn)錄本減少超過80％。比例尺，200mm。c.在CCM3-flox/flox-Cdh5(PAC)-CreERT2(CCM3-ECKO)小鼠的視網(wǎng)膜中，畸形僅發(fā)生在血管網(wǎng)絡(luò)的靜脈側(cè)，其可以在視網(wǎng)膜中在形態(tài)上(如b中)并通過內(nèi)皮粘蛋白陽性染色(箭)區(qū)分。箭頭顯示動(dòng)脈血管，其是內(nèi)皮粘蛋白陰性且同工凝集素B4陽性。發(fā)明人還觀察到在內(nèi)皮特異性消融CCM1(Maddaluno等，2013)和CCM2(Boulday等，2011)之后類似的靜脈特異性缺陷。比例尺，700mm。在b和c中，顯示了來自dpn9同窩鼠仔的視網(wǎng)膜。

圖16.CCM3-敲除內(nèi)皮細(xì)胞系顯示出對(duì)β-聯(lián)蛋白靶基因和祖細(xì)胞/EndMT標(biāo)志物轉(zhuǎn)錄的抑制(a)，對(duì)活性β-聯(lián)蛋白定位至核的抑制和對(duì)與VE-鈣粘蛋白一起結(jié)合粘著連接的誘導(dǎo)(b)，對(duì)β-聯(lián)蛋白和VE-鈣粘蛋白復(fù)合物免疫共沉淀損失的抑制(c)，和Top/Fop閃光試驗(yàn)中對(duì)熒光素酶報(bào)告基因的β-聯(lián)蛋白/Tcf4-依賴性轉(zhuǎn)錄的抑制(d)。a.對(duì)舒林酸硫化物、舒林砜、和已經(jīng)報(bào)告靶向β-聯(lián)蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的不同步驟的其他藥物在這些野生型(WT)和CCM3-敲除上皮細(xì)胞系中對(duì)β-聯(lián)蛋白靶基因(軸蛋白2)和內(nèi)皮祖細(xì)胞/EndMT標(biāo)志物(Klf4，S100a4)的影響的定量。舒林酸硫化物和舒林砜在這些CCM3-敲除內(nèi)皮細(xì)胞中顯示出對(duì)軸蛋白2、Klf4和S100a4轉(zhuǎn)錄強(qiáng)誘導(dǎo)的最大抑制。在本文測試的其他藥物中，水飛薊賓有效針對(duì)這三種轉(zhuǎn)錄本，而鹽霉素僅顯著降低軸蛋白2和S100a4。數(shù)據(jù)是至少三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均rtPCR值，各自一式三份進(jìn)行。*，p＜0.05，**，p＜0.01對(duì)比載劑處理的CCM3-敲除內(nèi)皮細(xì)胞中的相應(yīng)轉(zhuǎn)錄本(t-檢驗(yàn))。其他詳細(xì)內(nèi)容參見方法。在CCM3敲除之后5-25代的細(xì)胞獲得相當(dāng)?shù)慕Y(jié)果。b.在這些野生型(WT)和CCM3-敲除內(nèi)皮細(xì)胞系中，舒林酸硫化物對(duì)從粘著連接重定位至核中的活性β-聯(lián)蛋白的影響的代表性免疫染色。在這些CCM3-敲除內(nèi)皮細(xì)胞中，活性β-聯(lián)蛋白和VE-鈣粘蛋白從細(xì)胞-細(xì)胞接觸處(粘著連接)丟失(頂部主圖，XY軸；小下圖，沿X軸的Z凸起)?；钚驭?聯(lián)蛋白(KO載劑，箭頭)在核中濃縮(參見DAPO染色中的相應(yīng)箭頭)(右圖)。用舒林酸硫化物處理使活性β-聯(lián)蛋白恢復(fù)分布至粘著連接(右圖，舒林酸硫化物，箭頭，和小右下圖，舒林酸硫化物，小箭頭，沿Z軸分布)并且觀察到活性β-聯(lián)蛋白和VE-鈣粘蛋白的共定位(箭頭)。沿X軸的Z凸起的下圖：內(nèi)皮細(xì)胞頂側(cè)極性標(biāo)志物足糖萼蛋白，顯示在這些CCM3-敲除內(nèi)皮細(xì)胞中的極性標(biāo)志物損失。足糖萼蛋白從頂側(cè)表面(左圖，WT，箭)重定位以異位分布到CCM3敲除的基側(cè)(右圖，載劑，箭頭)，如CCM1敲除所報(bào)告⁴⁶。由白線顯示核(DAPI)。舒林酸硫化物重新建立足糖萼蛋白的正確頂側(cè)分布(右圖，舒林酸硫化物，箭)。比例尺，30mm。c.對(duì)舒林酸硫化物對(duì)β-聯(lián)蛋白和VE-鈣粘蛋白復(fù)合物的免疫共沉淀的影響的代表性Western印跡(上)和定量(下)。上圖：用VE-鈣粘蛋白抗體(IP：VE)對(duì)野生型(WT)和CCM3-敲除內(nèi)皮細(xì)胞的總提取物和免疫沉淀物的Western印跡。通過舒林酸硫化物處理，恢復(fù)了CCM3敲除中VE-鈣粘蛋白的水平降低(與總舒林酸硫化物-KO和載劑-WT相比)。下圖：通過測量為β-聯(lián)蛋白/VE-鈣粘蛋白比例的共沉淀復(fù)合物，通過舒林酸硫化物處理，CCM3敲除中β-聯(lián)蛋白和VE-鈣粘蛋白之間顯著減少的結(jié)合(35％±0.32SD，*，p＜0.05，載劑-KO對(duì)比載劑-WT)恢復(fù)到野生型細(xì)胞(WT)中觀察到的水平(^，p＜0.05，舒林酸硫化物-KO對(duì)比載劑-KO，t-檢驗(yàn))。使用ImageJ，以三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的方式，對(duì)來自Western印跡的條帶的定量。d.在Top/Fop閃光試驗(yàn)中(詳細(xì)內(nèi)容參見方法)，舒林酸硫化物抑制(^，p＜0.05，舒林酸硫化物-KO對(duì)比載劑-KO，t-檢驗(yàn))熒光素酶報(bào)告基因的β-聯(lián)蛋白/Tcf4-依賴性轉(zhuǎn)錄的顯著增加(**，p＜0.01，載劑-KO對(duì)比載劑-WT，t-檢驗(yàn))。轉(zhuǎn)染效率(β-半乳糖苷酶活性)標(biāo)準(zhǔn)化的Top-閃光和Fop-閃光值之間的比例顯示為與載劑-WT的比例(相對(duì)Top/Fop-閃光值)相比的倍數(shù)變化。

圖17.CCM3-敲除內(nèi)皮細(xì)胞系顯示舒林酸硫化物對(duì)內(nèi)皮祖細(xì)胞/EndMT20標(biāo)志物過表達(dá)的抑制。相應(yīng)的免疫染色顯示，與野生型(WT)相比，在這些CCM3-敲除(KO)內(nèi)皮細(xì)胞中Klf4、S100a4、Id1和CD44的表達(dá)增加。用DAPI對(duì)核染色(由白線顯示)。CCM3-敲除中Klf4(頂排)和Id1(第三排)的過表達(dá)局限于核中(箭頭指向KO，載劑中的白色核)。類似地，S100a4(第二排)同時(shí)是核(KO，載劑，白色核，箭頭)和胞質(zhì)的(KO，載劑)，而CD44(底排)大多數(shù)是胞質(zhì)的(KO，載劑)。用舒林酸硫化物處理(右圖)在這些CCM3-敲除(KO)內(nèi)皮細(xì)胞中強(qiáng)力減少了這些蛋白質(zhì)的過表達(dá)。在CCM3-敲除腦內(nèi)皮細(xì)胞的原代培養(yǎng)物中觀察到相當(dāng)?shù)慕Y(jié)果，如圖3所示。比例尺，30mm。

圖18.如方法中所述，用載劑或舒林酸硫化物處理(從dpn2開始)的CCM3-ECKO鼠仔(dpn9時(shí))顯示舒林酸硫化劑減少了腦血管中的畸形。用血小板-內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子(內(nèi)皮細(xì)胞)對(duì)腦切片的代表性免疫染色。a.從背側(cè)表面進(jìn)入腦的上矢狀竇血管。對(duì)于CCM3敲除(載劑)，具有大直徑的直血管似乎在形成海綿狀的出芽分支處終止。在相當(dāng)?shù)难苤?，該CCM3敲除中舒林酸硫化物處理極大地降低了這些血管的直徑并且促進(jìn)表觀正常的末端支化。組圖顯示了20倍放大獲得的樣品共聚焦光學(xué)切片的最大突出。比例尺，100mm。如a中那樣處理CCM3-ECKO鼠仔的內(nèi)矢狀切片中的病灶。對(duì)于CCM3敲除(載劑)，蓋侖(Galean)大腦大靜脈的末端區(qū)顯示桑葚狀的病灶，其顯示在分支血管的末端處形成(箭頭)。該CCM3敲除中舒林酸硫化物治療極大地減少了桑葚狀芽末端。比例尺，100mm。

圖19.與舒林酸硫化物的效果相似，CCM3-敲除內(nèi)皮細(xì)胞系顯示出對(duì)活性β-聯(lián)蛋白和VE-鈣粘蛋白從細(xì)胞-細(xì)胞接觸處(粘著連接)損失，活性β-聯(lián)蛋白在核中積聚，和祖細(xì)胞/EndMT標(biāo)志物過表達(dá)的抑制。代表性的免疫染色顯示，這些CCM3-敲除內(nèi)皮細(xì)胞(KO，載劑，箭頭)中，活性β-聯(lián)蛋白從細(xì)胞-細(xì)胞接觸處損失(上排)及其重定位至核(第二排)被舒林砜處理抑制。用DAPI對(duì)核進(jìn)行染色。類似地，VE-鈣粘蛋白從細(xì)胞-細(xì)胞接觸處損失被舒林砜處理抑制(第三排)。舒林砜處理也強(qiáng)力降低了這些CCM3-敲除(KO)內(nèi)皮細(xì)胞中Klf4(核，載劑，箭頭)和S100a4(胞質(zhì)和核)的過表達(dá)(下排)。在VE-鈣粘蛋白、Klf4和S100a4染色中，用白線表示核(DAPI)。比例尺，30mm。

圖20.與舒林酸硫化物的效果相似，CCM3-flox/flox-Cdh5(PAC)-CreERT2-BAT-gal(CCM3-ECKO)小鼠顯示舒林砜減少腦血管中的畸形。在dpn1時(shí)用他莫昔芬處理這些小鼠(10mg/kg體重，如方法中所述)以誘導(dǎo)CRE重組酶的內(nèi)皮細(xì)胞特異性表達(dá)和floxed/floxed CCM3基因重組(CCM3-ECKO小鼠)。從dpn2開始，也每天用載劑或用舒林砜(30mg/kg)處理它們。a.解剖后的dpn9鼠仔的肉眼觀察形貌顯示在CCM3-ECKO小鼠小腦中的明顯病灶(箭頭)。比例尺，0.65cm。下圖：對(duì)小腦的進(jìn)一步放大。比例尺，0.3cm。b.對(duì)來自3個(gè)載劑處理和3個(gè)舒林砜處理的CCM3-敲除小鼠的全腦中桑葚狀(多內(nèi)腔)、單海綿狀、或毛細(xì)血管擴(kuò)張病灶的主要腦病灶的情況的定量(如62中所述，參見方法)。沿矢狀軸對(duì)腦進(jìn)行切片(150mm切片，冠狀切片)，用血小板-內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子(內(nèi)皮細(xì)胞)染色并且通過寬視野熒光顯微鏡(10倍和20倍放大)檢驗(yàn)。*，p＝0.0053，0.006，0.004，分別針對(duì)桑葚狀、單海綿狀和毛細(xì)血管擴(kuò)張病灶(威爾科克森檢驗(yàn))。c.對(duì)VE-鈣粘蛋白、Klf4和S100a4定位的代表性免疫染色。左圖：舒林砜使載劑處理的CCM3-ECKO小鼠中VE-鈣粘蛋白從擴(kuò)散狀態(tài)恢復(fù)至定位于細(xì)胞-細(xì)胞連接處(箭頭)。中圖，右圖：從載劑處理的CCM3-ECKO小鼠中Klf4(中圖)和S100a4(右圖)的表達(dá)的核心染色中，舒林砜使針對(duì)Klf4和S100a4的這種核反應(yīng)性降低。用同工凝集素B4或血小板-內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行染色。比例尺，15mm。

發(fā)明詳述

方法

CCM3-flox/flox小鼠中內(nèi)皮細(xì)胞特異性重組以生成CCM3-ECKO小鼠

在TaconicArtemis(德國科隆)生成CCM3-flox/flox小鼠。插入2個(gè)P-lox序列，其側(cè)接鼠CCM3基因的外顯子4和5，在CRE重組酶切割后產(chǎn)生功能喪失突變。這些CCM3-flox/flox小鼠與Cdh5(PAC)-CreERT2小鼠(Wang等，2010)雜交，針對(duì)CRE重組酶的他莫昔芬誘導(dǎo)性內(nèi)皮細(xì)胞特異性表達(dá)和CCM3基因重組。CCM3-flox/flox-Cdh5(PAC)-CreERT2小鼠進(jìn)一步與BAT-gal小鼠雜交(Maretto等，2003)以監(jiān)測β-聯(lián)蛋白轉(zhuǎn)錄信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的活化，并且與Rosa 26-增強(qiáng)綠色熒光蛋白(EYFP)(Rosa26EYFP)小鼠雜交(Srinivas等，2001)以通過EYFP的表達(dá)監(jiān)測CRE重組酶的表達(dá)。他莫昔芬(西格瑪公司(Sigma))溶于玉米油和10％乙醇中(10mg/ml)，然后在單次胃內(nèi)給予dpn 1-2鼠仔之前在玉米油中1∶5稀釋(35mg/kg體重)，如14中所述。對(duì)照(野生型)小鼠包括用用于溶解他莫昔芬的載劑(玉米油加2％乙醇)處理的CCM3-flox/flox-Cdh5(PAC)-CreERT2-BAT-gal小鼠，和用他莫昔芬處理的CCM3+/+--Cdh5(PAC)-CreERT2-BAT-gal小鼠。

如上述針對(duì)CCM3-ECKO小鼠所詳述，已經(jīng)從CCM1-flox/flox和CCM2-flox/flox小鼠中獲得了CCM1-ECKO和CCM2-ECKO，參見Maddaluno等，2013和Boulday等，2011。

小鼠基因分型

以下探針用于小鼠基因分型：野生型CCM3等位基因：5’GAT AGG AATTAT TAC TGC CCT TCC 3’(SEQ ID No.1)，5’GAC AAG AAA GCA CTG TTG ACC 3’(SEQ ID No.2)；CRE重組酶誘導(dǎo)的重組之后刪除的CCM3基因：5’GAT AGG AAT TAT TAC TGC CCT TCC 3’(SEQ ID No.3)，5’GCT ACC AAT CAG CTT CTT AGC CC 3’(SEQ ID No.4)，Cdh5(PAC)-CreERT2基因：5′CCA AAA TTT GCC TGC ATT ACC GGT CGA TGC 3′(SEQ ID No.5)，5′ATC CAG GTT ACG GAT ATA GT 3′(SEQ ID No.6)；BAT-gal基因：5′CGG TGA TGG TGC TGC GTT GGA 3′(SEQ ID No.7)，5′ACC ACC GCA CGA TAG AGA TTC 3′(SEQ ID No.8)；Rosa 26EYFP基因：5′GCG AAG AGT TTG TCC TCA ACC 3′(SEQ ID No.9)，5′GGA GCG GGA GAA ATG GAT ATG 3’(SEQ ID No.10)，5′AAA GTC GCT CTG AGT TGT TAT 3′(SEQ ID No.11)。

用舒林酸硫化物和舒林砜處理

舒林酸硫化物(西格瑪公司)和舒林砜(西格瑪公司)都溶解于DMSO中并在玉米油中進(jìn)一步1∶50稀釋。從誘導(dǎo)重組后的一天開始，每天胃內(nèi)給予它們(30mg/kg體重)。僅用載劑(玉米油加2％DMSO)平行處理對(duì)照小鼠。發(fā)明人沒有觀察到與載劑處理的小鼠相比，藥物處理的CCM3-ECKO小鼠中出現(xiàn)增加的來自血管病灶的出血或死亡率。

用IWP2、IWP12、DKK1和Wnt3a處理

在所示試驗(yàn)之前，向融合細(xì)胞中加入藥物持續(xù)48小時(shí)。同時(shí)來自西格瑪-奧德里奇公司的IWP2和IWP12的終濃度為0.5，2，5μM。藥物溶于DMSO，對(duì)照處理(載劑)為0.1％DMSO終濃度，如用于藥物處理那樣。鼠重組Dkk1(R&D公司)為細(xì)胞上0.5μM。附圖說明中所示時(shí)間的鼠重組Wnt3a(R&D公司)為5ng/ml。

在體外分離中，培養(yǎng)和重組來自CCM3-flox/flox小鼠的內(nèi)皮細(xì)胞。

如前所述¹³，從腦中分離來自CCM3-flox/flox小鼠(8-10周齡)的內(nèi)皮細(xì)胞。如前所述⁵⁹，通過在培養(yǎng)第1天用AdenoCre病毒載體處理細(xì)胞來誘導(dǎo)floxed CCM3基因的重組。對(duì)照內(nèi)皮細(xì)胞是用AdenoGFP代替AdenoCre處理的相同內(nèi)皮細(xì)胞制備物的等份。如正文所述，在分析之前，細(xì)胞維持在培養(yǎng)中持續(xù)另外7天。在處理細(xì)胞之前，進(jìn)行48小時(shí)的藥物處理。

在一些實(shí)驗(yàn)中，來自CCM3-flox/flox小鼠(8-10周齡)的肺的內(nèi)皮細(xì)胞系通過表達(dá)多瘤中間T基因在培養(yǎng)物中永生化⁶⁰。用AdenoCre病毒載體(對(duì)照細(xì)胞中用AdenoGFP)來實(shí)現(xiàn)CCM3基因的融除。這些細(xì)胞然后在培養(yǎng)物中保持至25代，而在這種CCM3融除效果中沒有可檢測的變化。這些內(nèi)皮細(xì)胞系以與體外腦內(nèi)皮細(xì)胞的原代培養(yǎng)物和體內(nèi)腦內(nèi)皮細(xì)胞相當(dāng)?shù)姆绞綄?duì)CCM3的缺失作出響應(yīng)。

對(duì)培養(yǎng)中的細(xì)胞的藥物處理

在所示試驗(yàn)之前，向融合細(xì)胞中加入藥物持續(xù)48小時(shí)。使用的終濃度為：135mM舒林酸硫化物，125mM舒林砜，200mM水飛薊賓，40mM姜黃素，40mM白藜蘆醇，和250mM鹽霉素(全部來自西格瑪-奧德里奇公司)。所有這些藥物溶于DMSO，對(duì)照處理(載劑)為0.1％DMSO終濃度，如用于藥物處理那樣。

對(duì)培養(yǎng)中的腦切片、視網(wǎng)膜和細(xì)胞的用于熒光顯微術(shù)的免疫染色

來自鼠仔的腦和眼在解剖后立即固定在3％多聚甲醛中，并且這種固定在4℃下持續(xù)過夜。在即將染色之前將視網(wǎng)膜從眼上整體切下。固定的腦包埋在4％低熔點(diǎn)瓊脂糖中使用切片機(jī)(1000Plus，美國密蘇里州圣路易斯的切片機(jī)公司(The Vibratome Company))并沿矢狀軸(150mm)切片。

分別在12孔和96孔板中對(duì)懸浮樣品的腦切片和視網(wǎng)膜進(jìn)行染色。它們?cè)?℃下在含有1％魚皮明膠和0.5％曲通X100和5％驢血清的含0.01％硫柳汞的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中過夜封閉。樣品在4℃下用在含有1％魚皮明膠和0.25％曲通X100的含0.01％硫柳汞的PBS中稀釋的一抗過夜孵育。在用含0.1％曲通X100的PBS洗滌之后，在室溫下加入在含有1％魚皮明膠和0.25％曲通X100的含0.01％硫柳汞的PBS中的二抗持續(xù)4小時(shí)。用DAPI的孵育在PBS中持續(xù)4小時(shí)，然后在PBS中多次洗滌，用3％多聚甲醛在室溫下后固定5分鐘，并且在PBS中另外洗滌。腦切片固定在含DAPI的Vectashield中，并且用指甲油固定蓋玻片，視網(wǎng)膜固定在含DAPI的Prolong金中。

如前所述對(duì)體外培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行固定和染色⁴⁶。

抗體

使用以下抗體：抗-血小板-內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子(倉鼠；MAB1398Z，密理博公司(Millipore))；抗-β-半乳糖苷酶(雞；ab9361，阿柏堪穆公司(Abcam))；抗-VE-鈣粘蛋白(大鼠單克隆；550548，BD生命科學(xué)公司)；抗-VE-鈣粘蛋白(山羊；sc-6458，圣克魯茲公司(Santa Cruz))；抗-活性-β-聯(lián)蛋白(小鼠單克隆克隆8E7)，在Ser37和Thr41上去磷酸化，密理博公司)；抗-總-β-聯(lián)蛋白(小鼠單克隆；細(xì)胞信號(hào)公司(Cell Signaling))；抗-S100a4(兔；07-2274，密理博公司)；抗-Klf4(山羊；AF3158，R&D公司)；抗-CD44(大鼠；553131，BD生命科學(xué)公司)；抗-ID1(兔；sc-488，圣克魯茲公司)；抗-aSMA(小鼠單克?。籉3777，西格瑪公司)；抗-GFP(兔；A-6455，英杰公司)；抗-足糖萼蛋白(山羊；AF1556，R&D公司)；抗-磷酸-組蛋白H3(兔；ab51776，密理博公司)；抗-CCM3(兔；歐基公司(Eurogentec))；抗-p-Smad1(兔；9516，細(xì)胞信號(hào)公司)；抗-內(nèi)皮粘蛋白(兔；sc-65495，圣克魯茲公司)；抗-β-微管蛋白(小鼠單克??；T9026，西格瑪公司)。由Alexa555-偶聯(lián)的鏈霉素(分子探針公司(Molecular Probes))顯示了生物素-偶聯(lián)的同工凝集素B4(載體實(shí)驗(yàn)室公司(Vector Lab))也用于鑒定視為網(wǎng)膜和腦切片中的內(nèi)皮細(xì)胞。

用于免疫熒光的二抗是-Alexa448和抗-Alexa555，以及Cy3-偶聯(lián)的抗體，其在驢中針對(duì)合適動(dòng)物物種的免疫球蛋白產(chǎn)生(分子探針公司或杰克遜實(shí)驗(yàn)室公司(Jackson Laboratories))。

用于Western印跡的二抗是HRP-連接的抗-小鼠、抗-大鼠和抗-兔抗體(細(xì)胞信號(hào)公司)，和HRP-連接的抗-山羊抗體(普洛麥格公司(Promega))。

rtPCR

用RNeasy試劑盒(74106；普洛麥格公司)來進(jìn)行RNA提取。RNA(1μg)用隨機(jī)六聚物(高能cDNA庫試劑盒；應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)逆轉(zhuǎn)錄。使用7900HT熱循環(huán)儀(ABI/Prism)用TaqMan基因表達(dá)試驗(yàn)(應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)來擴(kuò)增cDNA。對(duì)于各樣品，用比較閾值循環(huán)(Ct)方法來確定表達(dá)水平，并標(biāo)準(zhǔn)化至編碼18S和甘油醛3-磷酸脫氫酶(GAPDH)的管家基因。對(duì)于擴(kuò)增，使用已經(jīng)驗(yàn)證識(shí)別rtPCR中的小鼠轉(zhuǎn)錄本的以下探針(應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)：軸蛋白2、Nkd1、Lef1、ccnd1、cMyc、Klf4、Ly6a、S100a4、Id1、Cdh2、Acta2、CD44。

如下定制設(shè)計(jì)鑒定CCM3mRNA轉(zhuǎn)錄本的探針：正向，CGAGTCCCTCCTTCGTATGG(SEQ ID No.12)；反向，GCTCTGGCCGCTCAATCA(SEQ ID No.13)；報(bào)告序列，CTGATGACGTAGAAGAGTACA(SEQ ID No.14)。

Top/Fop-閃光試驗(yàn)

為了監(jiān)測報(bào)告靶標(biāo)的β-聯(lián)蛋白依賴性轉(zhuǎn)錄，使用Top-Flash質(zhì)粒(0.3mg/cm²細(xì)胞培養(yǎng)面積)，其含有7個(gè)控制螢火蟲熒光素酶轉(zhuǎn)錄的Tcf/Lef結(jié)合位點(diǎn)(Lluis等，2008)。按照生產(chǎn)商的說明(英杰公司)，使用Lipofectamine2000將其轉(zhuǎn)染到來自肺的內(nèi)皮細(xì)胞中。共轉(zhuǎn)染用于b-gal的組成型表達(dá)的pCMV質(zhì)粒(0.1mg/cm²)，用于將熒光素酶表達(dá)標(biāo)準(zhǔn)化至轉(zhuǎn)染效率。作為陰性對(duì)照，使用Fop-Flash質(zhì)粒，其含有6個(gè)小啟動(dòng)子上游的突變的(即，無活性)Tcf/Lef位點(diǎn)和螢火蟲熒光素酶基因(0.3mg/cm²)。其與b-gal質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染，用于標(biāo)準(zhǔn)化，如上所述。使用用于聯(lián)合檢測螢火蟲熒光素酶和b-gal的雙光報(bào)告基因試驗(yàn)系統(tǒng)(應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)。按照生產(chǎn)商說明進(jìn)行細(xì)胞提取和化學(xué)發(fā)光檢測(Glomax 96微孔板光度計(jì)；普洛麥格公司)。

Western印跡和免疫沉淀

使用標(biāo)準(zhǔn)流程通過Western印跡和免疫沉淀來提取并分析蛋白質(zhì)內(nèi)容物⁴⁶。核分級(jí)分離如前所述⁶²。

評(píng)價(jià)病灶負(fù)荷

對(duì)于病灶的分類和計(jì)數(shù)，來自dpn9同窩鼠仔的全腦進(jìn)行切片并針對(duì)血小板-內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子免疫染色，如之前和方法中所述。然后在寬視野熒光顯微鏡(10倍和20倍)下檢查切片。如63中所述，病灶分類為桑葚狀(多海綿狀，超過2個(gè)連續(xù)海綿狀的組)、單海綿狀(單根擴(kuò)張血管，最大直徑容納超過25個(gè)紅細(xì)胞)、或毛細(xì)血管擴(kuò)張癥(具有異常擴(kuò)張的內(nèi)腔的曲折小血管)。通過將全部類型的病灶加和來計(jì)算病灶總數(shù)。

由于切片為150mm厚，對(duì)可跨2個(gè)切片的桑葚狀病灶的數(shù)量進(jìn)行校正。因此，桑葚狀病灶的數(shù)量除以2.5。由2名未知治療的觀察者獨(dú)立對(duì)病灶進(jìn)行計(jì)數(shù)和分類。

桑葚狀病灶和單海綿狀的最大直徑用于統(tǒng)計(jì)學(xué)比較。

siRNA實(shí)驗(yàn)

分別使用針對(duì)鼠VE-鈣粘蛋白的siRNA寡聚體來沉默VE-鈣粘蛋白表達(dá)(Smart pool，熱科學(xué)公司(Thermo Scientific)；靶序列：AGACAGACCCCAAACGUAA(SEQ ID No.15)，GAAAAUGGCUUGUCGAAUU(SEQ ID No.16)；AGGGAAACAUCUAUAACGA(SEQ ID No.17)：CCGCCAACAUCACGGUCAA(SEQ ID No.18))，并且Lipofectamine 2000用于如Lampugnani等，2010所述進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)。

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用非參數(shù)威爾科克森符號(hào)秩檢驗(yàn)來確定體內(nèi)藥物治療后病灶負(fù)荷的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。使用斯氏雙尾未配對(duì)t-檢驗(yàn)來確定體內(nèi)和體外分析中的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。顯著水平設(shè)為p＜0.05。

結(jié)果

在內(nèi)皮細(xì)胞-特異性CCM3-敲除小鼠的內(nèi)皮細(xì)胞中，體內(nèi)增強(qiáng)β-聯(lián)蛋白的轉(zhuǎn)錄活性。

通過CCM3-floxed/floxed小鼠與Cdh5(PAC)-CreERT2小鼠的雜交¹⁴來生成本文所述的體內(nèi)小鼠系統(tǒng)，針對(duì)他莫昔芬誘導(dǎo)的CRE重組酶內(nèi)皮細(xì)胞特異性表達(dá)和CCM3基因重組。這些小鼠然后進(jìn)一步與BAT-gal小鼠雜交¹⁵，其顯示核β-半乳糖苷酶(b-gal)報(bào)告基因的β-聯(lián)蛋白活化表達(dá)。如CCM2的之前報(bào)告⁶，這些具有產(chǎn)后誘導(dǎo)的CCM3基因的內(nèi)皮特異性失活的小鼠(CCM3-ECKO)在腦和視網(wǎng)膜血管中呈現(xiàn)與患者中CCM血管病灶相當(dāng)?shù)娘@著畸形和出血。對(duì)此之前已就相同鼠模型⁶中的CCM2和不同鼠系統(tǒng)⁷中的CCM2和CCM3報(bào)告。由于CCM3ECKO小鼠在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)生血管畸形，該模型提供了測試下述藥物治療的工具。該實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷脑敿?xì)內(nèi)容參見方法和圖15。

在此，與匹配的對(duì)照動(dòng)物相比，核b-gal報(bào)告基因的β-聯(lián)蛋白-依賴性轉(zhuǎn)錄在新生CCM3-ECKO的腦血管的內(nèi)皮細(xì)胞中體內(nèi)增加。如圖1a和1b中的免疫染色所示，通過使用PECAM標(biāo)記內(nèi)皮細(xì)胞的隨機(jī)視場計(jì)數(shù)的定量觀察到來自野生型BAT-gal小鼠的對(duì)照腦內(nèi)皮細(xì)胞的b-gal-陽性核(0.86±0.15陽性核/視場；總共600個(gè)評(píng)分的內(nèi)皮核中7.2％陽性核)在CCM3-ECKO腦內(nèi)皮細(xì)胞中顯著增加4倍(5.0±1.7陽性核/視場；總共700個(gè)評(píng)分的內(nèi)皮核中36％陽性核，p＜0.05；t-檢驗(yàn))(dpn 9同窩鼠仔)。在這些CCM3-ECKO腦內(nèi)皮細(xì)胞中，b-gal-陽性核分布在建立的海綿狀和毛細(xì)血管擴(kuò)張癥中(血管病灶中67％b-gal-陽性內(nèi)皮核)以及假-正常血管中(假性-正?；苤?5％b-gal-陽性內(nèi)皮核)。

與來自對(duì)照野生型BAT-gal小鼠的那些相比，也在CCM3-ECKO小鼠的視網(wǎng)膜的內(nèi)皮細(xì)胞中觀察到b-gal表達(dá)(圖1c)。

從CCM3-floxed/floxed小鼠的腦中分離的內(nèi)皮細(xì)胞(圖2a，WT，原代培養(yǎng))與體外CCM3基因重組之后的那些(CCM3-敲除腦內(nèi)皮細(xì)胞；參見方法)(圖2a，KO，原代培養(yǎng))比較，其顯示核中的活性β-聯(lián)蛋白(即，Ser37和Thr41上去磷酸¹⁶)。這種效果與粘著連接組織的強(qiáng)烈改變平行，其可被視作活性β-聯(lián)蛋白(圖2a)和VE-鈣粘蛋白(圖3c，載劑)從連接處重定位。對(duì)于VE-鈣粘蛋白在體內(nèi)從內(nèi)皮連接處的類似解體，參見圖4b，載劑。

由于對(duì)從腦新鮮分離的內(nèi)皮細(xì)胞的供應(yīng)及其在首次體外傳代后非常有限的有絲分裂指數(shù)的限制，對(duì)其β-聯(lián)蛋白核分布和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的詳細(xì)分析是不可能的。發(fā)明人因此建立了培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞系，其中CCM3在體外如上所述重組¹⁷(CCM3-敲除內(nèi)皮細(xì)胞系)(參見方法)。在這些CCM3-敲除內(nèi)皮細(xì)胞系中，發(fā)明人通過免疫熒光(圖2b)和細(xì)胞分級(jí)分離(圖2c)確認(rèn)β-聯(lián)蛋白的增強(qiáng)核定位。

另外，在Top/FopFlash報(bào)告試驗(yàn)中測量外源性熒光素酶基因的β-聯(lián)蛋白和Tcf/Lef-依賴性轉(zhuǎn)錄。在這些CCM3-敲除內(nèi)皮細(xì)胞系中，與對(duì)照野生型細(xì)胞相比，β-聯(lián)蛋白的轉(zhuǎn)錄活性顯著增加2.7倍(±0.2SD；p＜0.01)(圖16d)。此外，β-聯(lián)蛋白轉(zhuǎn)錄活性的一些典型內(nèi)皮靶標(biāo)的表達(dá)在這些CCM3-敲除內(nèi)皮細(xì)胞系中增加(即，軸蛋白2，Lef1，Ccnd1¹⁸)并且受到編碼顯性陰性Tcf4¹⁷的腺病毒載體的體外感染的抑制(圖2d)。

發(fā)明人也分析了與內(nèi)皮祖細(xì)胞表型¹⁹和內(nèi)皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EndMT)^20，21的獲得/維持都相關(guān)的基因的表達(dá)，因?yàn)橐呀?jīng)顯示β-聯(lián)蛋白轉(zhuǎn)錄信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)其他細(xì)胞類型中的分化和內(nèi)皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的過程^22，23，24。另外，發(fā)現(xiàn)EndMT在內(nèi)皮特異性CCM1敲除鼠模型中的血管病灶發(fā)展中起到關(guān)鍵作用(Maddaluno，L.等，Nature 498(7455)：492，2013)。發(fā)現(xiàn)與對(duì)照細(xì)胞相比，Klf4^25，26，Ly6a^27，28和S100a4^29，20，Id1^30，31，Cdh2²⁰，Acta2²⁰的轉(zhuǎn)錄在CCM3-敲除內(nèi)皮細(xì)胞中顯著增強(qiáng)(圖2e，內(nèi)皮細(xì)胞系和圖3b，原代培養(yǎng))。另外，這些增加取決于β-聯(lián)蛋白轉(zhuǎn)錄活性，因?yàn)樗鼈兪艿斤@性陰性Tcf4¹⁷的抑制，如上所述(圖2e)。這些基因的增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄也對(duì)應(yīng)于其增加的蛋白質(zhì)表達(dá)(參見圖17和19中載劑處理的CCM3-敲除，內(nèi)皮細(xì)胞系，和圖3c，原代內(nèi)皮細(xì)胞系，及其在圖5和圖20中的載劑處理的CCM3-ECKO腦內(nèi)皮細(xì)胞中的體內(nèi)上調(diào))。

因此，內(nèi)皮細(xì)胞中CCM3表達(dá)的消除導(dǎo)致體內(nèi)和體外β-聯(lián)蛋白轉(zhuǎn)錄活性和靶基因表達(dá)增加。根據(jù)這些數(shù)據(jù)，發(fā)明人研究了體內(nèi)抗-β-聯(lián)蛋白試劑對(duì)這些CCM3-ECKO小鼠的腦血管病灶的影響。

舒林酸硫化物降低了來自CCM3-ECKO小鼠的內(nèi)皮細(xì)胞中內(nèi)皮祖細(xì)胞和EndMT標(biāo)志物的表達(dá)和β-聯(lián)蛋白轉(zhuǎn)錄活性。

然后，發(fā)明人在其實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭谐醪襟w外測試了一定范圍的已經(jīng)描述為影響β-聯(lián)蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)³²并且最重要的是已經(jīng)在臨床中使用的試劑：舒林酸硫化物、舒林砜^33，34、水飛薊賓³⁵、姜黃素³⁶和白藜蘆醇^37，38。也包括鹽霉素³⁹，一種報(bào)道的Wnt受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的抑制劑，雖然其使用迄今為止局限于實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?/p>

在這些中，舒林酸硫化物和舒林砜在CCM3-敲除內(nèi)皮細(xì)胞系中抑制β-聯(lián)蛋白轉(zhuǎn)錄活性的內(nèi)源性靶標(biāo)的表達(dá)(參見上述)上是最有效的(圖16a)。另外，舒林酸硫化物降低了β-聯(lián)蛋白轉(zhuǎn)錄活性，如Top/FopFlash報(bào)告試驗(yàn)所測量(圖16d)。

因此，發(fā)明人進(jìn)一步分析了舒林酸硫化物對(duì)CCM3無效表型的影響。在CCM3-敲除腦內(nèi)皮細(xì)胞的原代培養(yǎng)物中，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)舒林酸硫化物有效抑制內(nèi)源性β-聯(lián)蛋白靶基因的表達(dá)(圖3a并且觀察到顯性陰性Tcf4的抑制，如上所述，圖3b)。同樣，舒林酸硫化物強(qiáng)烈抑制活性β-聯(lián)蛋白的核定位，同時(shí)增加其在細(xì)胞-細(xì)胞連接處的濃度(圖3c)。同樣，VE-鈣粘蛋白在這些細(xì)胞(圖3c)和CCM3-敲除內(nèi)皮細(xì)胞系(圖16b)中也更多定位于細(xì)胞-細(xì)胞接觸處。

一致地，通過免疫共沉淀和Western印跡分析，舒林酸硫化物在CCM3-敲除內(nèi)皮細(xì)胞系中恢復(fù)了β-聯(lián)蛋白和VE-鈣粘蛋白之間減少的結(jié)合(減少35％±0.32SD，p＜0.05)(圖16c)。

除了抑制β-聯(lián)蛋白靶基因的轉(zhuǎn)錄以外，舒林酸硫化物還抑制相應(yīng)蛋白質(zhì)在CCM3-敲除內(nèi)皮細(xì)胞中的過表達(dá)(圖3c，原代培養(yǎng)，和圖17，內(nèi)皮細(xì)胞系)。

然后在誘導(dǎo)CCM3-ECKO后的新生小鼠中體內(nèi)研究舒林酸硫化物。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)用舒林酸硫化物治療也抑制了腦血管內(nèi)皮細(xì)胞中核報(bào)告基因b-gal(圖4a)和β-聯(lián)蛋白靶基因(圖5)的表達(dá)。VE-鈣粘蛋白也似乎更好地體內(nèi)定位于用舒林酸硫化物治療的新生CCM3-ECKO小鼠的腦血管中的內(nèi)皮細(xì)胞-細(xì)胞連接處(圖4b)。

舒林酸硫化物降低了CCM3-ECKO小鼠中腦和視網(wǎng)膜中血管病灶的發(fā)展。

本發(fā)明研究的一個(gè)重要方面是舒林酸硫化物對(duì)β-聯(lián)蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的抑制是否也可減少CCM3-ECKO鼠仔中的血管病灶。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，事實(shí)上，舒林酸硫化物治療減少了血管病灶的平均數(shù)和尺寸。如圖6a中的免疫染色和圖6b中的定量所示，載劑處理的CCM3-ECKO鼠仔中每個(gè)腦的血管病灶的平均數(shù)(±SD)為166.8±22，舒林酸硫化物治療的血管病灶為72.6±9(p＜0.005；非參數(shù)威爾科克森符號(hào)秩檢驗(yàn))，并且載劑處理的CCM3-ECKO鼠仔中桑葚狀病灶的平均最大直徑(±SD)為386±56mm而舒林酸硫化物的為244±38mm(p＜0.05；t-檢驗(yàn))。舒林酸硫化物治療并不顯著降低單海綿狀的最大直徑。

舒林酸硫化物治療還抑制CCM3-ECKO小鼠的視網(wǎng)膜中的血管畸形。在這些小鼠中，視網(wǎng)膜顯示在血管網(wǎng)絡(luò)周圍特定濃縮的多內(nèi)腔血管病灶。這類病灶從靜脈發(fā)展，其擴(kuò)大，雖然筆直(比較圖6c和6e中WT和CCM3-ECKO的載劑和圖15的靜脈標(biāo)記物內(nèi)皮粘蛋白)。舒林酸硫化物部分校正了CCM3-ECKO小鼠中的這種異常血管網(wǎng)絡(luò)(圖6c和6d)。另外，在舒林酸硫化物之后抑制了表征這些CCM3-ECKO小鼠視網(wǎng)膜的靜脈最內(nèi)通道的放大(載劑-ECKO中89.5±7.1mm對(duì)比舒林酸硫化物-ECKO中35±7.8mm，WT和KO各自的14個(gè)視網(wǎng)膜的30次測量的平均±SD)(圖6e和圖18a和18b，舒林酸硫化物對(duì)CCM3-ECKO鼠仔的腦中靜脈和血管直徑的影響)。不同的是，動(dòng)脈并沒有顯示出這種異常表型(圖6c和6e)。

上述報(bào)告的數(shù)據(jù)強(qiáng)力表明舒林酸硫化物可能在CCM患者中有治療活性。然而，已經(jīng)報(bào)道這種藥物抑制血小板中的環(huán)氧合酶，可能增加了出血的風(fēng)險(xiǎn)。因此，發(fā)明人測試了舒林砜，其沒有抗-環(huán)氧合酶活性³³并且對(duì)凝血響應(yīng)沒有影響。如舒林酸硫化物治療后所觀察到的那樣，舒林砜也減少了培養(yǎng)的CCM3-敲除內(nèi)皮細(xì)胞系中活性β-聯(lián)蛋白的核積聚并恢復(fù)細(xì)胞-細(xì)胞連接(圖19)。另外，舒林砜抑制了β-聯(lián)蛋白靶基因的表達(dá)(參見，例如，圖19中的Klf4和S100a4)，如舒林酸硫化物那樣(參見上文)。當(dāng)在體內(nèi)測試時(shí)，舒林砜將CCM3-ECKO小鼠的腦中的病灶數(shù)降低至與舒林酸硫化物相當(dāng)?shù)乃?未治療對(duì)照中每個(gè)小鼠腦的平均病灶數(shù)(±SD)為153.5±28并且通過舒林砜治療降低至68.6±10，p＜0.01；非參數(shù)威爾科克森符號(hào)秩檢驗(yàn)；圖20a和20b)。另外，在體內(nèi)，在CCM3-ECKO小鼠的腦血管內(nèi)皮中，舒林砜抑制Klf4和S100a4的表達(dá)(圖20c)。

也獲得了表示舒林砜(依昔舒林)抑制CCM1-ECKO小鼠腦中海綿狀病灶形成的類似結(jié)果。

CCM3-ECKO小鼠的腦海綿狀血管瘤中視網(wǎng)膜細(xì)胞的β-聯(lián)蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的活化動(dòng)力學(xué)。

在原理試驗(yàn)，尤其是測試藥物的抑制活性中，CCM3ECKO鼠模型是首選，因?yàn)槠浒l(fā)展出最嚴(yán)重的也在患者中觀察到的表型。

如圖7所示，β-聯(lián)蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)早期在病灶中強(qiáng)化并且這種活化推動(dòng)了TGF-β/BMP途徑的活化，發(fā)明人已經(jīng)報(bào)道該途徑導(dǎo)致CCM表型的維持(Maddaluno等，2013)。

通過CCM3-floxed/floxed小鼠與Cdh5(PAC)-CreERT2小鼠的雜交來生成使用的體內(nèi)小鼠系統(tǒng)，以獲得他莫昔芬誘導(dǎo)的CRE重組酶內(nèi)皮細(xì)胞特異性表達(dá)和CCM3基因重組(CCM3-ECKO小鼠)。這些小鼠然后與BAT-gal報(bào)告小鼠(16)雜交，其顯示β-聯(lián)蛋白-活化的核β-半乳糖苷酶(β-gal)表達(dá)。

如圖7a(上圖)所示，發(fā)明人可觀察到與匹配的對(duì)照相比，CCM3-ECKO小鼠中內(nèi)皮細(xì)胞的核中明顯更高的β-聯(lián)蛋白轉(zhuǎn)錄信號(hào)。從誘導(dǎo)CCM3重組(1dpn時(shí))后的早期階段(3dpn)開始，可檢測到這種差異。在CCM3-ECKO小鼠的腦切片中，可在假-正常血管和在任意尺寸的海綿狀中發(fā)現(xiàn)具有β-半乳糖苷酶陽性核的內(nèi)皮細(xì)胞(圖8)。相反，在分離切片(圖7a，下圖)和β-gal的共染色(圖7b)中，磷酸-Smad1(p-Smad1)染色并沒有在3dpn鼠仔中的CCM3消除之后增強(qiáng)，但其在9dpn鼠仔中增強(qiáng)(圖7c)。p-Smad3觀察到類似的結(jié)果(未顯示)。P-Smad1僅在中-大尺寸病灶中明顯較高(9dpn鼠仔中最大直徑≥50μm)(圖8)。

這種結(jié)果強(qiáng)烈支持了藥物靶向β-聯(lián)蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制新病灶產(chǎn)生。從頭產(chǎn)生的病灶的外觀是患者中CCM的類似形式的特定特征。圖4和圖19中顯示了使用舒林酸硫化物和舒林砜來抑制β-聯(lián)蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)使突變表型衰退的體外數(shù)據(jù)。

β-聯(lián)蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與EndMT標(biāo)志物之間相關(guān)性分析CCM3-ECKO小鼠的腦海綿狀血管瘤的內(nèi)皮細(xì)胞中兩種過程的體內(nèi)動(dòng)力學(xué)

干細(xì)胞/EndMT標(biāo)志物(Klf4，Ly6a，S100a4和Id1)在3dpn CCM3-ECKO鼠仔中高表達(dá)(圖9a-d和e，單陽性)并且在具有β-gal陽性核的內(nèi)皮細(xì)胞中濃縮(圖9e，共定位)。在9dpn時(shí)，CCM3-ECKO鼠仔內(nèi)皮細(xì)胞中的β-gal表達(dá)降低，同時(shí)干細(xì)胞/EndMT標(biāo)志物仍然很高(圖9e)。β-聯(lián)蛋白在建立的病灶中的作用目前受到關(guān)注，如之前段落中所述。

活化的β-聯(lián)蛋白驅(qū)動(dòng)的轉(zhuǎn)錄的經(jīng)典靶標(biāo)，軸蛋白2，事實(shí)上在融除除CCM3以外的CCM1和CCM2基因之后的培養(yǎng)中的內(nèi)皮細(xì)胞中強(qiáng)化(圖10)，EndMT標(biāo)志物也是這樣。

詳細(xì)分析培養(yǎng)中的CCM1KO內(nèi)皮細(xì)胞，發(fā)明人觀察到活性β-聯(lián)蛋白的核定位(在Ser37和Thr41上去磷酸，并且逃避蛋白體降解，圖11a)，如CCM3-KO內(nèi)皮細(xì)胞中已經(jīng)報(bào)道的那樣(圖2)。另外，這種核β-聯(lián)蛋白有轉(zhuǎn)錄活性，如在Top/FopFlash報(bào)告試驗(yàn)中所測量的外源性熒光素酶的2倍增加的表達(dá)所示(對(duì)β-聯(lián)蛋白/Tcf/Lef-轉(zhuǎn)錄活化的測量，圖11b)。最重要的是，使用舒林砜(依昔舒林)對(duì)β-聯(lián)蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的抑制抑制了培養(yǎng)的CCM1 KO內(nèi)皮細(xì)胞中EndMT標(biāo)志物的表達(dá)(圖11c)。這些數(shù)據(jù)支持了任何CCM基因的突變誘導(dǎo)與獲得去分化表型相關(guān)的β-聯(lián)蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(表達(dá)EndMT標(biāo)志物，圖11)。

另外，舒林砜(依昔舒林)誘導(dǎo)培養(yǎng)中的CCM1 KO內(nèi)皮細(xì)胞中內(nèi)皮細(xì)胞-細(xì)胞接觸處的重組織，如圖3中的CCM3 KO內(nèi)皮細(xì)胞所報(bào)告的那樣。在CCM2 KO模型中也獲得類似結(jié)果。

響應(yīng)內(nèi)皮細(xì)胞中CCM融除活化β-聯(lián)蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的機(jī)制。

CCM3-敲除內(nèi)皮細(xì)胞中β-聯(lián)蛋白介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄的活化是細(xì)胞自主的，因?yàn)椋篴)其在沒有外源性Wnt的情況下觀察到；b)抑制配體產(chǎn)生的porcupine抑制劑IWP2和IWP12(26，27)，以及Dkk1(一種配體-受體相互作用抑制劑，其是Wnt共受體Lrp5/6的競爭物)(26，27)沒有抑制一般β-聯(lián)蛋白的轉(zhuǎn)錄(圖12a-d)；c)Lrp6磷酸化沒有增加(圖12e和f)；d)外源性Wnt3a的刺激沒有誘導(dǎo)干細(xì)胞/EndMT標(biāo)志物的表達(dá)，而β-聯(lián)蛋白的組成型活性形式Lef-ΔβCTA(28)卻誘導(dǎo)表達(dá)(圖12g和h)。

總之，這些數(shù)據(jù)表示在CCM3-敲除內(nèi)皮細(xì)胞中，增強(qiáng)的β-聯(lián)蛋白的轉(zhuǎn)錄活性和核定位并不依賴于經(jīng)典配體-受體相互作用。

發(fā)明人之前報(bào)道了從內(nèi)皮連接拆散或沉默VE-鈣粘蛋白可上調(diào)β-聯(lián)蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(18)。一致地，發(fā)明人在此觀察到通過siRNA沉默VE-鈣粘蛋白除了一般β-聯(lián)蛋白靶標(biāo)(軸蛋白2，Ccnd1和Nkd1，圖12i)以外，激活了EndMT標(biāo)志物(S100a4和Id1)的表達(dá)，并且促進(jìn)了活性β-聯(lián)蛋白的核定位(圖13)。相反，VE-鈣粘蛋白沒有增強(qiáng)Smad1的磷酸化(圖13b)。

這些數(shù)據(jù)表明，在CCM中，β-聯(lián)蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的第一觸發(fā)是VE-鈣粘蛋白連接的拆散，其進(jìn)而導(dǎo)致β-聯(lián)蛋白釋放到胞質(zhì)中和核易位。這種過程推進(jìn)并可能導(dǎo)致了病灶發(fā)展的TGF-β/BMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的活化。

有趣的是，內(nèi)皮細(xì)胞中細(xì)胞-細(xì)胞連接的拆散代表了由任意CCM基因，如CCM1-ECKO，CCM2-ECKO和CCM3-ECKO報(bào)道的融除誘導(dǎo)的腦海綿狀血管瘤的共同特征(圖14)。發(fā)明人之前報(bào)道了CCM1患者的腦海綿狀血管瘤中VE-鈣粘蛋白的解體(Lampugnani等，2010)。因此，連接的VE-鈣粘蛋白的解體似乎是鼠模型和患者中血管海綿狀畸形的內(nèi)皮細(xì)胞系的典型特征。這可能在患者中也伴隨著β-聯(lián)蛋白與VE-鈣粘蛋白的解離和增強(qiáng)的核易位以及增加的β-聯(lián)蛋白驅(qū)動(dòng)的轉(zhuǎn)錄，如實(shí)驗(yàn)鼠模型中的上述報(bào)道。由于檢測人樣品中這種活化的標(biāo)志物中的技術(shù)限制，目前直接證明患者中腦海綿狀血管瘤中β-聯(lián)蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的活化非常難。總之，這些結(jié)果支持了抗-β-聯(lián)蛋白化合物在治療以血管畸形為特征的病理學(xué)中的用途，尤其是在CCM患者中。

在此，發(fā)明人報(bào)道對(duì)CCM3基因的內(nèi)皮細(xì)胞選擇性刪除激活了腦內(nèi)皮細(xì)胞中的體內(nèi)β-聯(lián)蛋白轉(zhuǎn)錄信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。用NSAID舒林酸硫化物和舒林砜對(duì)β-聯(lián)蛋白轉(zhuǎn)錄活性的藥物抑制降低了這種鼠模型中腦和視網(wǎng)膜血管畸形的數(shù)量和尺寸，表明內(nèi)皮細(xì)胞中的β-聯(lián)蛋白轉(zhuǎn)錄信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)導(dǎo)致CCM3-介導(dǎo)的血管病灶的病變。

CCM畸形在患者和小鼠模型中的腦神經(jīng)系統(tǒng)中大幅發(fā)展，雖然不是排他性的^6，8。與CCM病變中內(nèi)皮中下調(diào)的β-聯(lián)蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要作用一致，經(jīng)典Wnt途徑是血腦屏障中內(nèi)皮細(xì)胞表型說明的良好決定因素^11-13。然而，必需在產(chǎn)后消除Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)以避免中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的異常血管增殖和形態(tài)發(fā)生^11-13。在內(nèi)皮特異性β-聯(lián)蛋白功能獲得的鼠模型中，發(fā)明人觀察到與在本文中CCM3-ECKO中觀察到的相當(dāng)?shù)囊暰W(wǎng)膜血管病灶⁴⁰。在腫瘤細(xì)胞中，經(jīng)典Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的持續(xù)誘導(dǎo)與增加的生長和入侵相關(guān)^18，24。具體地，在β-聯(lián)蛋白介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄活化后，癌細(xì)胞從內(nèi)皮切換到間充質(zhì)表型(EMT)^18，24。發(fā)明人在此報(bào)道CCM3-敲除內(nèi)皮細(xì)胞經(jīng)過類似的表型變化，并且上調(diào)一系列的EMT/EndMT經(jīng)典基因²⁰。因此，合理的假設(shè)是，CCM病灶來自失控的動(dòng)力學(xué)和β-聯(lián)蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)在腦血管的內(nèi)皮細(xì)胞中的定位。

最近已經(jīng)報(bào)道在視網(wǎng)膜和腦內(nèi)皮細(xì)胞中，由Norrin/Frizzled4活化經(jīng)典Wnt途徑通過細(xì)胞自主和細(xì)胞非自主信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)誘導(dǎo)了發(fā)育和維持程序⁴¹。這可解釋中樞神經(jīng)系統(tǒng)的不同區(qū)域中的局部血管表型⁴¹。CCM中下調(diào)的β-聯(lián)蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)可得到Wnt/β-聯(lián)蛋白途徑的內(nèi)皮-自主活化或突變的內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)環(huán)境Wnt的異常響應(yīng)，或通過兩者的組合的支持。發(fā)明人的數(shù)據(jù)表明，這些機(jī)制中的至少一種似乎在融除CCM3基因后在培養(yǎng)中的內(nèi)皮細(xì)胞中運(yùn)行。事實(shí)上，一些β-聯(lián)蛋白靶標(biāo)和祖細(xì)胞/EndMT標(biāo)志物在CCM3-敲除內(nèi)皮細(xì)胞中在基礎(chǔ)條件下通過β-聯(lián)蛋白轉(zhuǎn)錄信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)活化，因?yàn)樗鼈兊谋磉_(dá)受到顯性-陰性Tcf4的抑制。Glading和Ginsberg¹⁰報(bào)道了在使用RNA干擾消耗CCM1之后培養(yǎng)的牛主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞和原代人動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞中β-聯(lián)蛋白轉(zhuǎn)錄活性的類似活化。他們也報(bào)道了對(duì)體內(nèi)和體外內(nèi)皮細(xì)胞中CCM1的β-聯(lián)蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的抑制。另外，他們報(bào)道了在Apc^Min/+小鼠中β-聯(lián)蛋白驅(qū)動(dòng)的腸腺瘤的基因表型在CCM1^+/-背景中加重。這暗示了CCM1和可能的CCM3在其他細(xì)胞以及內(nèi)皮細(xì)胞中的β-聯(lián)蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)一般調(diào)節(jié)作用。由于在家族CCM患者中出現(xiàn)腸和其他瘤似乎沒有增加，CCM病變的血管和器官定位特異性表明器官中的內(nèi)皮分化和/或局部因素與Wnt/β-聯(lián)蛋白共同作用來表達(dá)突變的表型⁴²。具體地，就對(duì)CCM3所知，在神經(jīng)細(xì)胞中該基因的突變活化了星形細(xì)胞并且產(chǎn)生了模擬該病變的血管病灶⁹。因此，強(qiáng)化了神經(jīng)血管單元內(nèi)細(xì)胞交互的重要性。

雖然，活性β-聯(lián)蛋白的核積聚似乎是突變基因型的顯著特征，發(fā)明人沒有直接顯示驅(qū)動(dòng)β-聯(lián)蛋白在CCM3-敲除內(nèi)皮細(xì)胞的核中濃縮的過程。一般而言，調(diào)節(jié)β-聯(lián)蛋白的核積聚的分子機(jī)制問題仍然位置(綜述參見18)。然而，與在核中濃縮增加的同時(shí)，發(fā)明人在發(fā)明人的CCM內(nèi)皮細(xì)胞特異性刪除的體外和體內(nèi)模型中都觀察到β-聯(lián)蛋白從細(xì)胞-細(xì)胞連接處解離。連接性β-聯(lián)蛋白大部分與VE-鈣粘蛋白(粘著連接的跨膜組分⁴³)以及β-聯(lián)蛋白破壞復(fù)合物⁴⁴結(jié)合。在CCM3-敲除內(nèi)皮細(xì)胞中，粘著連接解體，如融除CCM1^45，46和CCM2⁶之后所觀察到的那樣。另外，本文中減少了與VE-鈣粘蛋白結(jié)合的β-聯(lián)蛋白如融除CCM1¹⁰后觀察到的那樣。推測這種減少的β-聯(lián)蛋白與VE-鈣粘蛋白的結(jié)合伴隨核中活性β-聯(lián)蛋白的積聚。活性β-聯(lián)蛋白在核中的濃縮表征以下情況：在內(nèi)皮細(xì)胞連接穩(wěn)定性降低，如在稀疏內(nèi)皮細(xì)胞和VE-鈣粘蛋白-敲除內(nèi)皮細(xì)胞¹⁷中觀察到的那樣。在這兩種情況中，β-聯(lián)蛋白的總量降低，甚至降至非常低的水平，雖然殘留的β-聯(lián)蛋白在核中積聚。用活性β-聯(lián)蛋白在核中“被動(dòng)”重分布來抑制蛋白體降解似乎不太可能，因?yàn)榛钚驭?聯(lián)蛋白的總量實(shí)際上降低了。

特別感興趣的是，發(fā)明人已經(jīng)鑒定到了β-聯(lián)蛋白轉(zhuǎn)錄信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的2種抑制劑，舒林酸硫化物和舒林砜，其也抑制CCM3-ECKO小鼠中血管病灶的發(fā)展。這些試劑都是NSAID的，其對(duì)人患者結(jié)腸癌有顯著化學(xué)預(yù)防功效，并且他們正在其他類型癌癥的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭性u(píng)價(jià)^47-52。對(duì)于治療特征為血管畸形如CCM的病變而言，舒林砜比舒林酸硫化物有更多潛在興趣，因?yàn)槠淙鄙倏寡“寤钚浴Ｊ媪炙崃蚧飳?duì)比舒林砜的相對(duì)功效根據(jù)癌癥類型變化^{33，53-56}。因此，用特定藥物工具靶向內(nèi)皮細(xì)胞中的β-聯(lián)蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)代表了減少血管畸形和預(yù)防新血管病灶出現(xiàn)的有效策略，尤其是在CCM患者中。

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序列表

<110> 意大利癌癥研究基金會(huì)分子腫瘤學(xué)研究所(IFOM)（IFOM - Fondazione Istituto FIRC di Oncologia）

米蘭大學(xué)（Universit?degli Studi di Milano）

<120> 用于治療血管畸形的方法和組合物

<130> PCT 126319

<150> EP14164118.3

<151> 2014-04-10

<160> 19

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 探針

<400> 1

gataggaatt attactgccc ttcc 24

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 探針

<400> 2

gacaagaaag cactgttgac c 21

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 探針

<400> 3

gataggaatt attactgccc ttcc 24

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 探針

<400> 4

gctaccaatc agcttcttag ccc 23

<210> 5

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 探針

<400> 5

ccaaaatttg cctgcattac cggtcgatgc 30

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 探針

<400> 6

atccaggtta cggatatagt 20

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 探針

<400> 7

cggtgatggt gctgcgttgg a 21

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 探針

<400> 8

accaccgcac gatagagatt c 21

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 探針

<400> 9

gcgaagagtt tgtcctcaac c 21

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 探針

<400> 10

ggagcgggag aaatggatat g 21

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 探針

<400> 11

aaagtcgctc tgagttgtta t 21

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 正向探針

<400> 12

cgagtccctc cttcgtatgg 20

<210> 13

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反向探針

<400> 13

gctctggccg ctcaatca 18

<210> 14

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 報(bào)告序列探針

<400> 14

ctgatgacgt agaagagtac a 21

<210> 15

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> siRNA寡靶序列

<400> 15

agacagaccc caaacguaa 19

<210> 16

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> siRNA寡靶序列

<400> 16

gaaaauggcu ugucgaauu 19

<210> 17

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> siRNA寡靶序列

<400> 17

agggaaacau cuauaacga 19

<210> 18

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> siRNA寡靶序列

<400> 18

ccgccaacau cacggucaa 19

<210> 19

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽

<220>

<221> misc_feature

<222> (2)..(3)

<223> Xaa可以是任意天然氨基酸

<400> 19

Leu Xaa Xaa Leu Leu

1 5