本發(fā)明在由美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院授予的批準(zhǔn)號(hào)RC1DK086465、RC1DK086402、DK54021和R01DK081037下利用政府支持進(jìn)行。政府享有本發(fā)明中的某些權(quán)利。
背景技術(shù)：
：腎酶(Renalase)(RNLS)是主要在腎臟、心臟、骨骼肌、睪丸和以較小程度在其它組織中產(chǎn)生的蛋白質(zhì)(Xu等，2005JClinInvest.115(5):1275-80和Wang等，2008MolBiolRep.35(4):613-20)。已經(jīng)描述了腎酶的兩個(gè)同種型變體：腎酶-1和腎酶-2。由于最終外顯子的差別剪接，這兩種形式的腎酶不同。腎酶已經(jīng)被描述為新型的含有黃素腺嘌呤二核苷酸的單胺氧化酶，其具有選擇性地使兒茶酚胺類腎上腺素、去甲腎上腺素和多巴胺脫氨基的活性。已經(jīng)描述了與健康個(gè)體相比在患有晚期腎臟疾病的患者的血漿中腎酶缺乏。通過對(duì)心輸出量和血管阻力的作用，兒茶酚胺類在血壓的保持和調(diào)節(jié)中——包括在疾病中——起著主要作用。將重組形式的腎酶輸注入大鼠引起心肌收縮力、心率和血壓的降低?；加心I衰竭的患者具有與高血壓相關(guān)聯(lián)的升高水平的循環(huán)兒茶酚胺類和通過心血管并發(fā)癥的更高死亡率的特征。因此，蛋白質(zhì)腎酶可以在控制和維持兒茶酚胺誘發(fā)的血壓改變中起作用并且在腎臟疾病患者中觀察到的腎酶缺乏對(duì)結(jié)果可能是有害的。已經(jīng)描述了與健康個(gè)體相比在患有晚期腎臟疾病的患者的血漿中腎酶缺乏?；加心I衰竭的患者具有與高血壓相關(guān)聯(lián)的升高水平的循環(huán)兒茶酚胺類和通過心血管并發(fā)癥的更高死亡率的特征。因此，蛋白質(zhì)腎酶可以在控制和維持兒茶酚胺誘發(fā)的血壓改變中起作用并且在腎臟疾病患者中觀察到的腎酶缺乏對(duì)結(jié)果可能是有害的。但是，關(guān)于腎酶在癌癥中的作用知之甚少。癌癥的基本特征是細(xì)胞衰老和死亡的失調(diào)。腎酶(RNLS)是一種分泌型黃素蛋白，其通過發(fā)信號(hào)通過質(zhì)膜鈣腺苷三磷酸酶PMCA4b以激活PI3K/AKT和MAPK途徑來防護(hù)缺血性和毒性細(xì)胞損傷。皮膚癌是一種常見的人惡性腫瘤，并且其發(fā)病率在發(fā)達(dá)國(guó)家中正在增加(Gray-Schopfer等，2007Nature.445:851-7；Lowe等，2014MayoClinicProceedings.89:52-9；Lesinski等，2013Futureoncology.9:925-7)。黑素瘤是最致命形式的皮膚癌，一旦其變得不可切除將具有低存活率(Lowe等，2014MayoClinicProceedings.89:52-9)。其是分子異質(zhì)疾病并且已經(jīng)鑒定參與疾病發(fā)展和進(jìn)展的信號(hào)傳導(dǎo)途徑中的一些關(guān)鍵改變。Ras/Raf/MEK/ERK和PI3K/AKT信號(hào)傳導(dǎo)途徑在黑素瘤的發(fā)病機(jī)理中起著關(guān)鍵作用(Gray-Schopfer等，2007Nature.445:851-7；Lesinski等，2013Futureoncology.9:925-7；Yajima等，2012Dermatologyresearchandpractice.2012:354191)。Ras、Raf、PI3K或PTEN(PI3K抑制劑)中的突變可以導(dǎo)致ERK和AKT的持續(xù)激活，其又促進(jìn)細(xì)胞存活和增殖。Dankort等利用小鼠中BRafV600E的條件性黑素細(xì)胞特異性表達(dá)很好地證明了這一點(diǎn)，沒有一只小鼠發(fā)展為黑素瘤，但是，當(dāng)與Pten腫瘤抑制基因的沉默結(jié)合時(shí)揭示了100％外顯率的黑素瘤發(fā)展(Dankort等，2009Naturegenetics.41:544-52)。這些致病途徑的闡明已經(jīng)促進(jìn)了靶向超活化激酶的特異性抑制劑的開發(fā)。雖然這些藥劑已經(jīng)證明了在患有轉(zhuǎn)移性黑素瘤患者的選擇組的治療中是有效的，但是它們的有益作用常常是短暫的，因此對(duì)于額外的治療靶點(diǎn)的鑒定是急需的。RNLS表達(dá)在黑素瘤腫瘤中顯著地增加，并且特別是在CD163+腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(TAM)中顯著地增加。在患有原發(fā)性黑素瘤的患者的人群(cohort)中，疾病特異性存活與腫瘤塊中RNLS表達(dá)負(fù)相關(guān)，這暗示RNLS的致病作用。使用siRNA、抗RNLS抗體或RNLS衍生的抑制肽抑制RNLS信號(hào)傳導(dǎo)顯著地降低體外黑素瘤細(xì)胞存活。利用單克隆抗體的抗RNLS療法明顯地抑制異種移植小鼠模型中的黑素瘤腫瘤生長(zhǎng)。利用m28-RNLS(也稱為1D-28-4)的治療引起CD163+TAM中內(nèi)源RNLS表達(dá)以及總的和磷酸化的STAT3的顯著降低。腫瘤細(xì)胞中增加的細(xì)胞凋亡與B細(xì)胞淋巴瘤2相關(guān)蛋白Bax的p38MAPK介導(dǎo)的激活時(shí)間相關(guān)。細(xì)胞周期抑制劑p21的表達(dá)增加并且細(xì)胞周期停滯被記錄。這些結(jié)果表明通過CD163+TAM的增加的RNLS產(chǎn)生通過激活STAT3促進(jìn)黑素瘤生長(zhǎng)，并且RNLS信號(hào)傳導(dǎo)的抑制在黑素瘤處理中具有潛在的治療應(yīng)用。體液和組織中腎酶檢測(cè)的改進(jìn)方法可以幫助腎臟疾病、心血管疾病和/或癌癥的診斷和預(yù)后。但是，腎酶作為相關(guān)生物標(biāo)記的確認(rèn)需要高選擇性試劑進(jìn)行其檢測(cè)?；诳贵w的技術(shù)被廣泛地用于生物標(biāo)記的檢測(cè)。迄今為止，僅具有少量的針對(duì)腎酶培養(yǎng)的試劑抗體——不具有表征至具有最低表征。胰腺癌是最致命的瘤之一，在全球引起大約330,000人死亡和在美國(guó)引起40,000人死亡(WorldCancelReport2014.WHOPress:2014)。胰腺癌難以檢測(cè)，并且大多數(shù)病例在晚期被診斷(Nolen等，2014PLoSONE.9(4):e94928)。雖然在該癌癥的化療應(yīng)用中已經(jīng)有了一些進(jìn)展，但是該疾病對(duì)所有藥物療法保持非常大的抗性(Hidalgo等，2010NewEnglandJournalofMedicine.362(17):1605-17)?；加幸认侔┑膫€(gè)體的總體5年存活率<5％(Hidalgo等，2010NewEnglandJournalofMedicine.362(17):1605-17)，并且需要額外的治療靶點(diǎn)。胰腺癌的發(fā)展依靠基因突變的逐步積累(Jones等，2008Science.321(5897):1801-6)，基因突變中的一些引起異常的MAPK、PI3K和JAK-STAT信號(hào)傳導(dǎo)。從最低程度的發(fā)育異常的上皮到發(fā)育異常再到浸潤(rùn)性癌的進(jìn)展反映了激活致癌基因(例如KRAS2)，或使腫瘤抑制基因(例如CDKN2a/INK4a、TP53和DPC4/SMaD4)失活的基因突變的逐步積累(Hidalgo等，2012AnnalsofOncology.23(suppl10):x135-x8)。95、90和75％的胰腺腫瘤分別攜帶KRAS2、CDKN2a和TP53中的突變。這些突變導(dǎo)致表征癌生長(zhǎng)的持續(xù)的和失調(diào)的增殖。胰腺導(dǎo)管腺癌(PDAC)中的突變圖譜(landscape)和核心信號(hào)傳導(dǎo)途徑已經(jīng)通過綜合遺傳分析24例晚期PDAC限定(Jones等，2008Science.321(5897):1801-6)。這些數(shù)據(jù)表明大部分PDAC包含大量主要為點(diǎn)突變的遺傳變化，并且其影響了大約12個(gè)細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)途徑。那項(xiàng)研究還鑒定了在PDAC中過表達(dá)的541種基因——在90％腫瘤中過表達(dá)至少10倍。這包括在腫瘤中或在腫瘤衍生的細(xì)胞系中最近表征的蛋白質(zhì)腎酶(RNLS)的2到4倍增加。RNLS，一種具有NADH氧化酶活性(Farzaneh-Far等，2010PLoSOne.5(10):e13496；Beaupre等，2015Biochemistry.54(3):795–806)的新型分泌型黃素蛋白(Xu等，2005JClinInvest.115(5):1275-80；Desir等，2012JAmHeartAssoc.1(e002634；Desir等，2012JAmSocHypertens.6(6):417-26；Li等，2008Circulation.117(10):1277-82)，通過獨(dú)立于其固有酶活性的受體介導(dǎo)的過程(Wang等，2014JournaloftheAmericanSocietyofNephrology.DOI:10.1681/asn.2013060665)促進(jìn)細(xì)胞和器官存活(Lee等，2013JAmSocNephrol.24(3):445-55)。RNLS迅速激活蛋白激酶B(AKT)、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK)和促分裂原活化蛋白激酶(p38)。ERK或AKT的化學(xué)抑制廢除了RNLS的保護(hù)作用(Wang等，2014JournaloftheAmericanSocietyofNephrology.DOI:10.1681/asn.2013060665)。因此，對(duì)于結(jié)合腎酶用于檢測(cè)、診斷、預(yù)防和治療包括腎臟疾病、心血管疾病和癌癥在內(nèi)的疾病或紊亂的改進(jìn)方法和組合物比如抗體存在需要。本發(fā)明滿足了該需要。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明包括包含腎酶抑制劑的組合物，所述腎酶抑制劑可以是化合物、蛋白質(zhì)、肽、肽模擬(peptidomemetic)、腎酶受體、腎酶受體片段、抗體、抗體片段、抗體模擬、核酶、小分子化合物、短發(fā)夾RNA、反義核酸分子、siRNA、miRNA、編碼反義核酸分子的核酸、編碼蛋白質(zhì)的核酸序列。在一些實(shí)施方式中，腎酶抑制劑是腎酶結(jié)合分子。在一些實(shí)施方式中，腎酶結(jié)合分子是抗體或其結(jié)合部分。在一些實(shí)施方式中，腎酶結(jié)合分子以至少10-6M的親和力特異性地結(jié)合至腎酶。在一些實(shí)施方式，腎酶結(jié)合分子特異性地結(jié)合選自SEQIDNO:1-7的肽序列。在一些實(shí)施方式中，腎酶是人腎酶。在各個(gè)實(shí)施方式中，抗體可以是單克隆抗體、多克隆抗體、單鏈抗體、免疫連接物、去巖藻糖基化抗體(defucosylatedantibody)和雙特異性抗體。在一些實(shí)施方式中，免疫連接物包括治療性藥劑或檢測(cè)部分。在各個(gè)實(shí)施方式中，抗體可以是人源化抗體、嵌合抗體、全人抗體、抗體模擬。在一個(gè)實(shí)施方式中，抗體包括選自如下的至少一種：a)選自SEQIDNO:11和SEQIDNO:19的重鏈CDR1序列；b)選自SEQIDNO:12和SEQIDNO:20的重鏈CDR2序列；c)選自SEQIDNO:13和SEQIDNO:21的重鏈CDR3序列；d)選自SEQIDNO:14和SEQIDNO:22的輕鏈CDR1序列；e)選自SEQIDNO:15和SEQIDNO:23的輕鏈CDR2序列；f)選自SEQIDNO:16和SEQIDNO:24的輕鏈CDR3序列。在一些實(shí)施方式中，抗體特異性地結(jié)合包含SEQIDNO:4的氨基酸序列的多肽。在一些實(shí)施方式中，抗體包括選自如下的至少一種：a)選自SEQIDNO:27和SEQIDNO:35的重鏈CDR1序列；b)選自SEQIDNO:28和SEQIDNO:36的重鏈CDR2序列；c)選自SEQIDNO:29和SEQIDNO:37的重鏈CDR3序列；d)選自SEQIDNO:30和SEQIDNO:38的輕鏈CDR1序列；e)選自SEQIDNO:31和SEQIDNO:39的輕鏈CDR2序列；f)選自SEQIDNO:32和SEQIDNO:40的輕鏈CDR3序列。在一些實(shí)施方式中，抗體特異性地結(jié)合包含SEQIDNO:6的氨基酸序列的多肽。在一些實(shí)施方式中，抗體包括選自如下的至少一種：a)重鏈CDR1序列SEQIDNO:43；b)重鏈CDR2序列SEQIDNO:44；c)重鏈CDR3序列SEQIDNO:45；d)輕鏈CDR1序列SEQIDNO:46；e)輕鏈CDR2序列SEQIDNO:47；f)輕鏈CDR3序列SEQIDNO:48。在一些實(shí)施方式中，抗體特異性地結(jié)合包含SEQIDNO:7的氨基酸序列的多肽。在一些實(shí)施方式中，抗體包括選自SEQIDNO:9、17、25、33和41的重鏈序列。在一些實(shí)施方式中，抗體包括選自SEQIDNO:10、18、26、34和42的輕鏈序列。在實(shí)施方式中，本發(fā)明是包含抗體的組合物，所述抗體結(jié)合至腎酶并與權(quán)利要求3所述的抗體與腎酶的結(jié)合競(jìng)爭(zhēng)。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明是治療或預(yù)防對(duì)象中與腎酶相關(guān)聯(lián)的疾病或紊亂的方法，其包括給對(duì)象施用至少一種腎酶抑制劑的步驟。在一些實(shí)施方式中，腎酶抑制劑與第二治療性藥劑組合施用至對(duì)象。在一些實(shí)施方式中，與腎酶相關(guān)聯(lián)的疾病或紊亂選自腎臟疾病、心血管疾病、癌癥和其任意組合。在一些實(shí)施方式中，當(dāng)疾病或紊亂是癌癥時(shí)，癌癥是胰腺癌或黑素瘤。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明是編碼腎酶結(jié)合分子——比如但不限于抗體——的分離的核酸分子。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明是包含編碼腎酶結(jié)合分子——比如但不限于抗體——的核酸分子的表達(dá)載體。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明是包含編碼腎酶結(jié)合分子——比如但不限于抗體——的核酸分子的宿主細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明是診斷有需要的對(duì)象中的疾病或紊亂的方法，該方法包括如下步驟：測(cè)定對(duì)象的生物學(xué)樣本中腎酶的水平，將對(duì)象的生物學(xué)樣本中腎酶的水平與比較物對(duì)照進(jìn)行比較，并且當(dāng)與比較物對(duì)照的腎酶的水平比較時(shí)對(duì)象的生物學(xué)樣本中腎酶的水平升高時(shí)，診斷對(duì)象患有疾病或紊亂。在一個(gè)實(shí)施方式中，該方法包括給診斷為患有疾病或紊亂的對(duì)象施用治療的額外步驟。在一個(gè)實(shí)施方式中，生物學(xué)樣本中腎酶的水平通過測(cè)量生物學(xué)樣本中腎酶mRNA的水平來測(cè)定。在一個(gè)實(shí)施方式中，生物學(xué)樣本中腎酶的水平通過測(cè)量生物學(xué)樣本中腎酶多肽的水平來測(cè)定。在一個(gè)實(shí)施方式中，生物學(xué)樣本中腎酶多肽的水平使用腎酶結(jié)合分子測(cè)定。在一個(gè)實(shí)施方式中，生物學(xué)樣本中腎酶的水平通過測(cè)量生物學(xué)樣本中腎酶多肽的活性(例如，酶活性、底物結(jié)合活性、受體結(jié)合活性等)來測(cè)定。在一個(gè)實(shí)施方式中，當(dāng)與比較物對(duì)照比較時(shí)腎酶的水平增加至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少100％、至少200％、至少300％、至少400％、至少500％、至少600％、至少700％、至少800％、至少900％、至少1000％時(shí)，生物學(xué)樣本中腎酶的水平被確定為升高。在各個(gè)實(shí)施方式中，比較物對(duì)照是選自如下的至少一種：陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照、歷史對(duì)照、歷史標(biāo)準(zhǔn)或生物學(xué)樣本中參考分子的水平。在一個(gè)實(shí)施方式中，疾病或紊亂為選自腎臟疾病、心血管疾病、癌癥和其任意組合中的至少一種。在一個(gè)實(shí)施方式中，當(dāng)疾病或紊亂是癌癥時(shí)，該癌癥是胰腺癌或黑素瘤。在一個(gè)實(shí)施方式中，對(duì)象是人。附圖描述當(dāng)結(jié)合附圖閱讀時(shí)，前述
發(fā)明內(nèi)容以及本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式的下面的詳細(xì)描述將被更好地理解。出于說明本發(fā)明的目的，附圖中示出了當(dāng)前優(yōu)選的實(shí)施方式。但是，應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明不限于附圖中示出的實(shí)施方式的精確布置和手段。圖1，包括圖1A和1B，是顯示腎酶依賴性細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)的時(shí)間過程的一系列圖像。圖1A顯示了利用腎酶培育的人胚腎細(xì)胞(HK-2)以及通過蛋白質(zhì)印跡分析測(cè)定的蛋白激酶B(AKT)和細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK)的激活；示出了有代表性的印跡(n＝3)；信號(hào)標(biāo)準(zhǔn)化為甘油醛-3-磷酸脫氫酶加樣對(duì)照(n＝3)；對(duì)于ERK和AKT(T308)在1到60分鐘時(shí)以及對(duì)于AKT(S473)僅在30分鐘時(shí)，超過基線的改變是統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的。圖1B示出了腎酶上調(diào)HK-2細(xì)胞和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)中的抗細(xì)胞凋亡分子Bcl-2。圖2是顯示腎酶同種型Ren1–7的圖像：從1到10編號(hào)的外顯子；RP-224，Ren1或Ren2的腎酶肽氨基酸224233；RP-220，氨基酸220–239；RP-H220，組氨酸標(biāo)記的RP-220；RP-Scr220，亂序的(scrambled)RP-220。圖3是顯示ERK或AKT抑制廢除腎酶肽的保護(hù)作用的圖：WT小鼠經(jīng)歷假手術(shù)(shamsurgery)或30分鐘的腎缺血和再灌注；RP-H220或媒介(鹽水)在腎缺血前10分鐘注射。ERK抑制劑PD98059或PI3K/AKT抑制劑渥曼青霉素廢除RP-H220的保護(hù)作用。圖4是顯示表1中肽的序列比對(duì)的圖像，并且其中這些肽對(duì)應(yīng)于腎酶-1或2序列。圖5，包括圖5A到5J，是顯示結(jié)合至腎酶的抗體的序列的一系列圖像；對(duì)互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)加下劃線。圖5A和5B分別顯示了1D‐28‐4重鏈和輕鏈編碼序列的序列。圖5C和5D分別顯示了1D‐37-10重鏈和輕鏈編碼序列的序列。圖5E和5F分別顯示了1F‐26‐1重鏈和輕鏈編碼序列的序列。圖5G和5H分別顯示了1F‐42‐7重鏈和輕鏈編碼序列的序列。圖5I和5J分別顯示了3A-5-2重鏈和輕鏈編碼序列的序列。圖6是顯示癌細(xì)胞系中腎酶表達(dá)的圖：表達(dá)通過定量PCR測(cè)定并標(biāo)準(zhǔn)化為肌動(dòng)蛋白。圖7是顯示黑素細(xì)胞中腎酶表達(dá)的圖像：與正常皮膚相比，痣和黑素瘤中的腎酶表達(dá)顯著增加。圖8是顯示抗腎酶單克隆抑制培養(yǎng)中A375.S2黑素瘤細(xì)胞的圖并顯示了與替莫唑胺(temozolamide)的協(xié)同作用：在處理后72小時(shí)，細(xì)胞活力通過WST-1方法測(cè)量；RenAb-10：腎酶單克隆，10μ/ml；TMZ：替莫唑胺，100或150μg/ml。圖9是顯示抗腎酶單克隆抑制培養(yǎng)中A375.S2黑素瘤細(xì)胞的圖并顯示了與達(dá)卡巴嗪的協(xié)同作用：在處理后72小時(shí)，細(xì)胞活力通過WST-1方法測(cè)量；RNLSMono：腎酶單克隆。圖10是顯示抗腎酶單克隆抑制培養(yǎng)中Sk-Mel-28黑素瘤細(xì)胞的圖并顯示了與替莫唑胺的協(xié)同作用：在處理后72小時(shí)，細(xì)胞活力通過WST-1方法測(cè)量；RenAb-10：腎酶單克隆，10μ/ml；TMZ：替莫唑胺，100μg/ml。圖11是顯示抗腎酶單克隆抑制培養(yǎng)中白血病細(xì)胞系的圖：在培養(yǎng)中利用抗腎酶單克隆抗體處理CCL-119細(xì)胞24小時(shí)；細(xì)胞存活通過WST-1方法測(cè)量(n＝3，*P，0.05)。圖12是顯示抗腎酶單克隆抑制胰腺癌細(xì)胞系MiaPac的圖。圖13是顯示抗腎酶單克隆抑制胰腺癌細(xì)胞系Panc1的圖。圖14是比較具有和不具有腎酶單克隆的培養(yǎng)中的黑素瘤細(xì)胞的顯微照片。腎酶抗體顯著地降低活細(xì)胞的數(shù)目。圖15是證明腎酶單克隆抗體1C-22-1和1D-37-10抑制培養(yǎng)中黑素瘤細(xì)胞的圖。圖16是顯示患有黑素瘤的表達(dá)高腎酶水平的患者中增加的死亡率的一系列圖：在來自患有黑素瘤的263個(gè)患者的活檢試樣中通過AQUA測(cè)量腎酶表達(dá)；使用針對(duì)S-100和gp100的抗體獲得腫瘤掩蔽(tumormask)；在x軸上以月隨訪時(shí)間；％累積存活在Y軸上顯示。圖17，包括圖17A到17D，是顯示黑素瘤中RNLS過表達(dá)和與差的患者結(jié)果相關(guān)聯(lián)的一系列圖像和圖。圖17A是顯示使用抗RNLS-m28對(duì)正常人皮膚(n＝15)、良性痣(n＝295)和惡性黑素瘤(n＝264)的組織微陣列免疫熒光染色檢測(cè)到的RNLS表達(dá)的圖像；對(duì)于每一種顯示代表性的結(jié)果，藍(lán)色：細(xì)胞核，綠色：黑素細(xì)胞，和紅色：RNLS。圖17B是描繪使用AQUAnalysisTM軟件——YaleTMA——定量的熒光強(qiáng)度的圖：正常人皮膚(n＝15)、良性痣(n＝295)和惡性黑素瘤(n＝264)。圖17C是顯示使用AQUAnalysisTM軟件——USBiomaxTMA——定量的熒光強(qiáng)度的圖：正常人皮膚(n＝14)、良性痣(n＝14)、原發(fā)性黑素瘤(n＝35)和轉(zhuǎn)移性黑素瘤(n＝11)，*表示p＝0.009和**表示p<0.001。圖17D描繪了黑素瘤特異性死亡的Kaplan-Meier存活曲線；從1997到2004收集119個(gè)連續(xù)的原發(fā)性黑素瘤，通過中值A(chǔ)QUA得分＝75,764.45將腫瘤分為低和高RNLS表達(dá)，*表示p＝0.008。圖18，包括圖18A和18B，是顯示RNLS過表達(dá)有助于癌細(xì)胞存活的兩個(gè)圖。圖18A是描繪血清饑餓，然后用BSA(30μg/ml)或rRNLS(30μg/ml)處理的A375.S2、MeWo、Skmel5和Skmel28細(xì)胞，和72小時(shí)后使用WST-1分析測(cè)量的細(xì)胞活力的圖；n＝6，*表示p<0.05和**表示p<0.005。圖18B是描繪血清饑餓24小時(shí)，然后不處理或用30μg/ml的牛血清白蛋白(BSA)或rRNLS培育3天的A375.S2細(xì)胞的圖；使用錐蟲藍(lán)和自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)器測(cè)定總細(xì)胞數(shù)目和活細(xì)胞數(shù)目；n＝6，**表示p<0.001。圖19，包括圖19A到19D，是顯示RNLS信號(hào)傳導(dǎo)的抑制對(duì)于體外黑素瘤細(xì)胞具有細(xì)胞毒性的一系列圖像和圖。圖19A是描繪使用RNLS特異性siRNA或非特異性對(duì)照siRNA瞬時(shí)轉(zhuǎn)染黑素瘤細(xì)胞A375.S2和SK-Mel-28之后的相對(duì)細(xì)胞活力的圖，其中72小時(shí)之后使用WST-1分析評(píng)估細(xì)胞活力；n＝6，*表示p＝0.03和**表示p＝0.003。圖19B包括描繪相對(duì)細(xì)胞活力的兩個(gè)圖：左圖：細(xì)胞用指示的抗體處理72小時(shí)并且細(xì)胞活力使用WST-1測(cè)定；m28-RNLS(也稱為1D-28-4)、m37-RNLS(也稱為1D-37-10)：針對(duì)RNLS肽RP220培養(yǎng)的單克隆抗體；右圖：A375.S2細(xì)胞用增加劑量的m28-RNLS處理72小時(shí)并且利用WST-1分析測(cè)定細(xì)胞活力；n＝6，*表示p<0.05和**表示p<0.005。圖19C包括用對(duì)照兔IgG或m28-RNLS培育72小時(shí)后A375.S2、SkMel28和SkMel5的代表性的照片。圖19D是描繪相對(duì)細(xì)胞活力的圖，包括RNLS肽拮抗劑(RP220A)的氨基酸(AA)序列。A375.S2細(xì)胞用指示濃度的BSA或RP220A處理，并且72小時(shí)之后使用WST-1分析測(cè)量細(xì)胞活力；n＝6，**表示p<0.005。圖20，包括圖20A和20B，包括顯示RNLS信號(hào)傳導(dǎo)的抑制阻斷體內(nèi)黑素瘤生長(zhǎng)的圖和兩個(gè)圖像。圖20A是顯示在用A375.S2細(xì)胞異種移植的裸無胸腺小鼠中腫瘤體積增加的圖，用2mg/kg的兔IgG作為陰性對(duì)照或用RNLS單克隆Ab——m28-RNLS——每3天處理之前測(cè)量腫瘤大小；n＝14每組；將每日腫瘤生長(zhǎng)速率計(jì)算為自先前測(cè)量的腫瘤大小的變化；*表示p<0.05。圖20B包括對(duì)來自用m28-RNLS或?qū)φ胀肐gG處理的A375.S2異種移植腫瘤(n＝14每個(gè))的切片的細(xì)胞增殖標(biāo)記Ki67進(jìn)行IHC染色的代表性的圖像；棕色：Ki67陽(yáng)性細(xì)胞。圖21，包括圖21A到21F，是顯示RNLS信號(hào)傳導(dǎo)的抑制阻斷RNLS表達(dá)和STAT3激活并且誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期停滯的一系列圖像和圖。圖21A包括顯示用兔IgG作為陰性對(duì)照或用RNLS單克隆Ab處理的并且通過免疫熒光對(duì)RNLS、磷酸化STAT3和總STAT3探測(cè)的異種移植腫瘤的一系列圖像；磷酸STAT3＝p-Y705-STAT3；對(duì)每一種顯示代表性的結(jié)果，藍(lán)色：細(xì)胞核，綠色：RNLS，和紅色：磷酸STAT3(左圖)或總STAT3(右圖)。圖21B是顯示用兔IgG作為陰性對(duì)照或用RNLS單克隆Ab處理的異種移植腫瘤的圖像，并且通過蛋白質(zhì)印跡探測(cè)腫瘤細(xì)胞溶胞產(chǎn)物的RNLS、磷酸化STAT3、總STAT3和p21；p-Y705-STAT3：酪氨酸705處磷酸化；代表性的研究。圖21C是描繪圖21B中示出的樣本中STAT3蛋白表達(dá)的定量的圖；p-Y705-STAT3信號(hào)標(biāo)準(zhǔn)化為總STAT3，總STAT3信號(hào)標(biāo)準(zhǔn)化為蛋白加樣測(cè)量；n＝3，*表示p<0.05和**表示p<0.005。圖21D是顯示用兔IgG作為陰性對(duì)照或用RNLS單克隆Ab處理的異種移植腫瘤(n＝14每個(gè))并且通過qPCR對(duì)人和小鼠RNLS表達(dá)探測(cè)的圖，*表示p<0.05。圖21E包括對(duì)來自用m28-RNLS或?qū)φ胀肐gG處理的A375.S2異種移植的腫瘤(n＝14每個(gè))的切片IHC染色進(jìn)行TUNEL分析來標(biāo)記凋亡細(xì)胞或細(xì)胞周期抑制劑p21的代表性的圖像；棕色：分別為TUNEL或p21陽(yáng)性細(xì)胞。圖21F是顯示用抗RNLS抗體或?qū)φ丈窖騃gG處理的A375.S2細(xì)胞的圖像；p38磷酸化和Bax表達(dá)的時(shí)間進(jìn)程通過蛋白質(zhì)印跡評(píng)估；p-p38＝磷酸化的p38；Bax＝bcl-2樣蛋白4。圖22，包括圖22A到圖22C，是顯示RNLS在黑素瘤中的CD163+TAM中表達(dá)的一系列圖像和圖。圖22A包括顯示如下的圖像：上圖：通過IF檢查組織微陣列人黑素瘤樣本的RNLS和全巨噬細(xì)胞(pan-macrophage)標(biāo)記CD68的共表達(dá)；藍(lán)色：細(xì)胞核，綠色：RNLS，和紅色：所有巨噬細(xì)胞；DAPI：細(xì)胞核染色，RNLS-CD68：融合的RNLS和CD68染色；中圖：通過IF檢查黑素瘤樣本的RNLS和可選激活的巨噬細(xì)胞(M2)標(biāo)記CD163的共表達(dá)；藍(lán)色：細(xì)胞核，綠色：RNLS，和紅色：M2巨噬細(xì)胞；DAPI：細(xì)胞核染色，RNLS-CD163：融合的RNLS和CD163染色。觀察到RNLS和CD163的顯著的共表達(dá)；下圖：通過IF檢查黑素瘤樣本的RNLS和經(jīng)典激活的巨噬細(xì)胞(M1)標(biāo)記CD86的共表達(dá)；藍(lán)色：細(xì)胞核，綠色：RNLS，和紅色：M1巨噬細(xì)胞；DAPI：細(xì)胞核染色，RNLS-CD163：融合的RNLS和CD86染色；沒有觀察到RNLS和CD186的顯著共表達(dá)。圖22B包括顯示用兔IgG作為陰性對(duì)照或用m28-RNLS處理并且通過免疫熒光對(duì)RNLS和M2TAM(CD163+細(xì)胞)探測(cè)的異種移植腫瘤的兩個(gè)圖像；對(duì)于每一種顯示代表性的結(jié)果：綠色：M2巨噬細(xì)胞，和紅色：RNLS。m28-RNLS處理降低CD163+TAM和RNLS表達(dá)。圖22C描繪了提出的m28-RNLS-TAM的作用機(jī)制：腫瘤相關(guān)的巨噬細(xì)胞，CD163：可選激活的巨噬細(xì)胞(M2)標(biāo)記，CD86：經(jīng)典激活的巨噬細(xì)胞(M1)標(biāo)記，RNLS：腎酶，m28-RNLS：抗腎酶單克隆抗體，t-STAT3：總STAT3，p-STAT3：磷酸化的STAT3。圖23，包括圖23A到23E，是顯示一些癌癥中RNLS表達(dá)和與PDAC中差的患者結(jié)果相關(guān)聯(lián)的一系列圖像和圖。圖23A是顯示cDNA陣列——包含來自15個(gè)不同腫瘤類型的182個(gè)人腫瘤樣本(OriGeneTechnologies)——中通過qPCR測(cè)量的RNLSmRNA水平的圖；*表示p<0.05，**表示p＝0.0001。圖23B是顯示在正常胰腺(n＝6)、胰腺導(dǎo)管腺癌(n＝11)和胰腺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤(n＝23)中通過qPCR測(cè)量的RNLSmRNA水平的圖；*表示p＝0.05；**表示p＝0.00017。圖23C是顯示使用m28-RNLS在正常人胰腺組織(左圖，n＝90)、導(dǎo)管腺癌(1-4級(jí)，n＝20每個(gè))中通過免疫組織化學(xué)檢測(cè)的RNLS蛋白表達(dá)的圖像；對(duì)于每一種顯示代表性的結(jié)果；RNLS蛋白染色為棕色。圖23D顯示使用抗RNL-m28對(duì)正常人胰腺組織(左圖，n＝90)、導(dǎo)管腺癌(中圖，n＝90)的組織微陣列的免疫熒光染色檢測(cè)的RNLS表達(dá)；對(duì)每一種顯示代表性的結(jié)果，藍(lán)色：細(xì)胞核，綠色：細(xì)胞角蛋白，和紅色：RNLS；右圖：使用AQUAnalysisTM軟件定量的熒光強(qiáng)度，正常人胰腺組織(n＝90)、導(dǎo)管癌(n＝90)，***表示p＝0.00013。圖23E顯示用于存活率的Kaplan-Meier存活曲線；69個(gè)PDAC的Biomax人群分為低(n＝35，RNLSAQUA得分<中值)和高(n＝34，RNLSAQUA得分>中值)RNLS表達(dá)，*表示p＝0.0001。圖24，包括圖24A和24D，是顯示RNLS過表達(dá)有助于癌細(xì)胞存活的一系列圖。圖24A顯示PDACC系BxPC3、Panc1和MiaPaCa2被血清饑餓48小時(shí)，然后用30μg/ml的牛血清白蛋白(BSA)或rRNLS培育3天；使用錐蟲藍(lán)和自動(dòng)細(xì)胞技術(shù)器測(cè)定總細(xì)胞數(shù)目和活細(xì)胞數(shù)目；n＝4，**表示p<0.0001。圖24B是描繪相對(duì)于對(duì)照的細(xì)胞活力的圖：MiaPaCa2細(xì)胞被血清饑餓并且然后用BSA(30μg/ml)或rRNLS(30μg/ml)處理——用或不用MEK1抑制劑U0126預(yù)處理，和72小時(shí)之后使用WST-1分析測(cè)量細(xì)胞活力；n＝6，*表示p<0.005。圖24C包括顯示PMCA4b表達(dá)的siRNA介導(dǎo)的抑制阻斷RNLS介導(dǎo)的MAPK信號(hào)傳導(dǎo)的圖像和圖；左圖和中圖：MiaPaCa2細(xì)胞用非靶向或PMCA4bsiRNA轉(zhuǎn)染，維持在無血清培養(yǎng)基中持續(xù)3天并用25μg的BSA或25μg的RNLS肽RP-220處理指示的時(shí)間；通過蛋白質(zhì)印跡評(píng)估的RP-220介導(dǎo)的ERK和STAT3激活，并顯示了代表性的免疫印跡；p-ERK＝磷酸化的ERK，p-Y705-STAT3＝磷酸化的STAT3，p-S727-STAT3＝磷酸化的STAT3，BSA＝牛血清白蛋白，RP-220＝RNLS肽激動(dòng)劑；右圖：磷酸化的ERK(p-ERK)的定量，信號(hào)標(biāo)準(zhǔn)化為甘油醛3-磷酸脫氫酶(GAPDH)加樣對(duì)照；n＝3，*＝P<0.05。圖24D顯示用BSA(30μg/ml)或rRNLS(30μg/ml)處理的MiaPaCa2細(xì)胞的熒光激活細(xì)胞分選(FACS)分析的曲線圖，n＝3。圖25，包括圖25A到25E，是顯示RNLS信號(hào)傳導(dǎo)的抑制在體外和體內(nèi)對(duì)癌細(xì)胞有細(xì)胞毒性的一系列圖和圖像。圖25A是如此圖，其顯示使用RNLS特異性siRNA或非特異性對(duì)照siRNA瞬時(shí)轉(zhuǎn)染Panc1細(xì)胞之后的相對(duì)細(xì)胞活力，和96h之后使用WST-1試劑測(cè)試的細(xì)胞活力；n＝6，**表示p<0.001。圖25B是顯示當(dāng)細(xì)胞用指示的抗體處理72小時(shí)的相對(duì)細(xì)胞活力和使用WST-1測(cè)定的細(xì)胞活力的圖；m28-RNLS和m37-RNLS：針對(duì)RNLS肽RP220培養(yǎng)的單克隆抗體，ab31291：針對(duì)RP-220的部分序列培養(yǎng)的Abcam多克隆抗體；n＝6，*表示p<0.005。圖25C顯示在用m28-RNLS培育3天之后MiaPaCa2細(xì)胞的代表性照片，n＝10。圖25D是顯示在無胸腺裸小鼠接受用RNLSshRNA(sh-RNLS)或?qū)φ?sh-對(duì)照)轉(zhuǎn)導(dǎo)的Panc1細(xì)胞的皮下注射之后腫瘤體積增加的圖；每23天測(cè)量腫瘤體積，持續(xù)多達(dá)30天，n＝6每個(gè)；*表示p<0.05。圖25E是顯示在裸小鼠異種移植有BxPC3之后腫瘤體積增加的圖；在每3-4天用2mg/kg的兔IgG作為陰性對(duì)照或用m28-RNLS處理之前測(cè)量腫瘤體積，n＝10，*表示p<0.05。圖26，包括圖26A到26E，是顯示RNLS信號(hào)傳導(dǎo)的抑制誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期停滯的一系列圖像和圖。圖26A顯示了對(duì)來自用抗m28-RNLS或?qū)φ胀肐gG處理的BxPC3異種移植的腫瘤(n＝14每個(gè))的切片進(jìn)行TUNEL染色的代表性的圖像；箭頭：TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞。圖26B是描繪用m28-RNLS(30μg/ml)或100μM依托泊苷(陽(yáng)性對(duì)照)處理4天的培養(yǎng)中Panc1細(xì)胞的FACS分析的圖；n＝3，*表示p<0.05。圖26C是顯示用多克隆ab31291或用山羊IgG作為陰性對(duì)照處理的Panc1細(xì)胞的圖像，并且通過蛋白質(zhì)印跡探測(cè)細(xì)胞溶胞產(chǎn)物的p38和Bax激活。圖26D顯示對(duì)來自用抗m28-RNLS或?qū)φ胀肐gG處理的BxPC3異種移植的腫瘤(n＝14每個(gè))的切片的細(xì)胞增殖標(biāo)記ki67和細(xì)胞周期抑制劑p21進(jìn)行IHC染色的代表性的圖像。圖26E是顯示由FACS分析測(cè)定的m28-RNLS對(duì)Panc1細(xì)胞的細(xì)胞周期作用的圖；綠色曲線：未處理，紫色曲線：兔IgG，紅色曲線：m28-RNLS30μg/ml。圖27，包括圖27A到27E，是顯示RNLS和STAT3之間的相互作用和通過m28-RNLS的抑制的機(jī)理模型的一系列圖像和圖。圖27A是顯示在Panc1細(xì)胞中通過RNLS激活STAT3的圖像；培養(yǎng)中的Panc1細(xì)胞用BSA或RNLS處理，并且通過蛋白質(zhì)印跡評(píng)估STAT3磷酸化；p-Ser727-STAT3：絲氨酸727處磷酸化，p-Y705-STAT3：酪氨酸705處磷酸化；代表性的研究。圖27B是描繪定量利用RNLS的STAT3磷酸化的圖；信號(hào)標(biāo)準(zhǔn)化為總STAT3；n＝3，*＝P<0.05。圖27C是顯示m28-RNLS抑制STAT3磷酸化的圖像；培養(yǎng)中的Panc1細(xì)胞用兔IgG或抗RNLS單克隆m28-RNLS處理多達(dá)4天，并且通過蛋白質(zhì)印跡評(píng)估STAT3磷酸化；p-Ser727-STAT3：絲氨酸727處磷酸化，p-Y705-STAT3：酪氨酸705處磷酸化；GAPDH加樣對(duì)照；代表性的研究。圖27D是顯示定量利用m28-RNLS的STAT3磷酸化的圖；信號(hào)標(biāo)準(zhǔn)化為GAPDH加樣對(duì)照；n＝3，*＝P<0.05。圖27E描繪了提出的m28-RNLS的抗腫瘤活性的機(jī)理模型。圖28包括描繪RNLS表達(dá)存在于PDAC等級(jí)1-4和主要定位于癌細(xì)胞的圖像。圖29包括顯示胰腺的神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤中的RNLS表達(dá)和顯示RNLS在遍及腫瘤的細(xì)胞中表達(dá)的圖像。圖30是描繪標(biāo)準(zhǔn)化為β-肌動(dòng)蛋白的相對(duì)RNLSmRNA水平的圖，其顯示RNLS基因表達(dá)在具有KRAS突變的胰腺導(dǎo)管腺癌細(xì)胞(PDACC)系(MiaPaCa2和Panc1)中比具有野生型KRAS的那些比如BxPC3中更高。圖31是描繪用β-肌動(dòng)蛋白標(biāo)準(zhǔn)化的相對(duì)RNLSmRNA水平的圖，其顯示了降低RNLS表達(dá)對(duì)體外細(xì)胞活力的作用——由通過siRNA的RNLS敲低評(píng)估；這種處理顯著地降低了PDACC系Panc1和MiaPaCa2的活力。圖32是顯示通過靶向RNLS的shRNA抑制RNLS表達(dá)導(dǎo)致其受體PMCA4b的表達(dá)的顯著降低，這暗示RNLS和PMCA4b表達(dá)被共同調(diào)控。圖33是描繪培養(yǎng)中Panc1細(xì)胞的FACS分析的一系列圖，其確認(rèn)了m28-RNLS引起細(xì)胞凋亡。圖34包括顯示如下的圖像和圖：陽(yáng)性RNLS-STAT3反饋環(huán)通過如下觀察暗示，在用RNLS處理的HK-2細(xì)胞中，在絲氨酸727(p-Ser727-STAT3)和酪氨酸705(p-Y705-STAT3)處的STAT3磷酸化分別增加2和4倍，但是STAT1未受影響。具體實(shí)施方式本發(fā)明涉及使用腎酶的抑制劑抑制腎酶。在各個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及通過給有需要的對(duì)象施用腎酶的抑制劑治療個(gè)體中腎酶相關(guān)病理或腎酶相關(guān)病癥的組合物和方法。在各個(gè)實(shí)施方式中，使用本發(fā)明的組合物和方法可診斷、可預(yù)防和可治療的疾病和紊亂包括急性腎衰竭(即，急性腎小管壞死或ATN——一種腎臟中的缺血性病癥)、心血管疾病和癌癥。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明寬泛地涉及癌癥的治療、預(yù)防和診斷。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及用于癌癥的診斷、治療、抑制、預(yù)防或減輕的方法和組合物。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了用于調(diào)節(jié)腎酶的水平、產(chǎn)生和活性中的一個(gè)或多個(gè)的組合物和方法。在癌癥以及相關(guān)疾病和紊亂的背景下，本發(fā)明提供了用于降低腎酶的水平、產(chǎn)生和活性中的一個(gè)或多個(gè)的組合物和方法。本發(fā)明的一些方面提供用于癌癥轉(zhuǎn)移的治療、預(yù)防、診斷或預(yù)后的方法和組合物。定義除非另有限定，本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的相同含義。雖然與本文描述的那些類似或等價(jià)的任何方法和材料可以用于實(shí)踐或測(cè)試本發(fā)明，但是描述了優(yōu)選的方法和材料。一般而言，本文使用的命名法，細(xì)胞培養(yǎng)、分子遺傳學(xué)、有機(jī)化學(xué)和核酸化學(xué)以及雜交中的實(shí)驗(yàn)室程序是本領(lǐng)域中公知的和通常采用的那些。標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)被用于核酸和肽合成。技術(shù)和程序通常根據(jù)本領(lǐng)域和各種一般參考文獻(xiàn)(例如，Sambrook和Russell，2012,MolecularCloning,ALaboratoryApproach,ColdSpringHarborPress,ColdSpringHarbor,NY，和Ausubel等，2012,CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWiley&Sons,NY)中的常規(guī)方法執(zhí)行，其遍及該文件提供。本文使用的命名法和下面描述的分析化學(xué)和有機(jī)合成中使用的實(shí)驗(yàn)室程序是本領(lǐng)域中公知的和通常采用的那些。標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)和其修改被用于化學(xué)合成和化學(xué)分析。冠詞“一個(gè)”(a，an)在本文中用于指一個(gè)或多于一個(gè)(即，至少一個(gè))該冠詞的語法對(duì)象。舉例而言，“一個(gè)要素”意思是一個(gè)要素或多于一個(gè)要素。如本文所使用，當(dāng)提及可測(cè)量的值比如量、時(shí)間段等時(shí)，“大約”意欲包含自規(guī)定值的±20％、或±10％、或±5％、或±1％、或±0.1％的變化，因?yàn)檫@些變化適合于執(zhí)行本公開的方法。當(dāng)在器官、組織、細(xì)胞或其組分的背景下使用時(shí)，術(shù)語“異?！敝傅氖窃谥辽僖粋€(gè)可觀察的或可檢測(cè)的特征(例如，年齡、治療、現(xiàn)狀等)方面與展示“正?！?預(yù)期的/自身穩(wěn)定的)各自特征的那些器官、組織、細(xì)胞或其組分不同的那些器官、組織、細(xì)胞或其組分。對(duì)于一種細(xì)胞、組織類型或?qū)ο蠖詾檎５幕蝾A(yù)期的特征對(duì)于不同的細(xì)胞或組織類型而言可能是異常的。如本文所使用，術(shù)語“類似物”通常指如此化合物：其通常結(jié)構(gòu)上類似于它們是類似物的化合物或“母體”化合物。一般而言，類似物將保留母體化合物的某些特征，比如生物學(xué)或藥理學(xué)活性。類似物可以缺少其它的較不期望的特征，例如抗原性、蛋白水解不穩(wěn)定性、毒性等。類似物包括如此化合物：其中母體的特定生物學(xué)活性降低，同時(shí)母體的一種或多種有區(qū)別的生物學(xué)活性在“類似物”中不受影響。當(dāng)應(yīng)用至多肽時(shí)，術(shù)語“類似物”可以具有與母體化合物不同范圍的氨基酸序列同一性，例如，母體的或母體的選定部分或結(jié)構(gòu)域的給定氨基酸序列中至少大約70％、更優(yōu)選地至少大約80％-85％或大約86％-89％，和仍然更優(yōu)選地至少大約90％、大約92％、大約94％、大約96％、大約98％或大約99％的氨基酸。當(dāng)應(yīng)用至多肽時(shí)，術(shù)語“類似物”通常指由大約至少3個(gè)氨基酸的區(qū)段組成的多肽，該區(qū)段與結(jié)合結(jié)構(gòu)域融合蛋白的至少一部分具有實(shí)質(zhì)的同一性。類似物通常為至少5個(gè)氨基酸長(zhǎng)、至少20個(gè)氨基酸長(zhǎng)或更長(zhǎng)、至少50個(gè)氨基酸長(zhǎng)或更長(zhǎng)、至少100個(gè)氨基酸長(zhǎng)或更長(zhǎng)、至少150個(gè)氨基酸長(zhǎng)或更長(zhǎng)、至少200個(gè)氨基酸長(zhǎng)或更長(zhǎng)和更通常地至少250個(gè)氨基酸長(zhǎng)或更長(zhǎng)。一些類似物可以缺乏實(shí)質(zhì)的生物學(xué)活性但是仍然可以被采用用于各種用途，比如用于募集(raising)抗體至預(yù)定表位，作為免疫學(xué)試劑以通過親和色譜法檢測(cè)和/或純化反應(yīng)性抗體，或作為結(jié)合結(jié)構(gòu)域融合蛋白功能的競(jìng)爭(zhēng)性或非競(jìng)爭(zhēng)性激動(dòng)劑、拮抗劑或部分激動(dòng)劑。如本文所使用，術(shù)語“抗體”指能夠特異性地結(jié)合至結(jié)合伴侶分子(partnermolecule)的特異性表位的免疫球蛋白分子。抗體可以是衍生自天然來源或來自重組來源的完整免疫球蛋白并且可以是完整免疫球蛋白的免疫反應(yīng)性部分。本發(fā)明中的抗體可以以多種形式存在，包括，例如，多克隆抗體、單克隆抗體、細(xì)胞內(nèi)抗體(“胞內(nèi)抗體”)、Fv、Fab、Fab’、F(ab)2和F(ab’)2，以及單鏈抗體(scFv)、重鏈抗體，比如駱駝科(camelid)抗體和人源化抗體(Harlow等，1999,UsingAntibodies:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratoryPress,NY；Harlow等，1989,Antibodies:ALaboratoryManual,ColdSpringHarbor,NewYork；Houston等，1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:5879-5883；Bird等，1988,Science242:423-426)。術(shù)語“抗體片段”指完整抗體的至少一部分并且指完整抗體的抗原決定可變區(qū)?？贵w片段的實(shí)例包括但不限于Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段、線性抗體、sdAb(VL或VH)、駱駝科VHH結(jié)構(gòu)域、scFv抗體和由抗體片段形成的多特異性抗體。術(shù)語“scFv”指融合蛋白，其包括包含輕鏈的可變區(qū)的至少一個(gè)抗體片段和包含重鏈的可變區(qū)的至少一個(gè)抗體片段，其中輕鏈和重鏈可變區(qū)經(jīng)由短的柔性多肽連接體鄰近地連接，并且能夠被表達(dá)為單鏈多肽，并且其中scFv保留了scFv衍生自其的完整抗體的特異性。除非另有規(guī)定，如本文所使用，scFv可以具有任意順序——例如相對(duì)于多肽的N末端和C末端——的VL和VH可變區(qū)，scFv可以包括VL-連接體-VH或者可以包括VH-連接體-VL。如本文所使用，“抗體重鏈”指以它們天然存在的構(gòu)象的抗體分子中存在的兩種類型的多肽鏈中的較大者，并且其正常地決定抗體所屬的類別。如本文所使用，“抗體輕鏈”指以它們天然存在的構(gòu)象的抗體分子中存在的兩種類型的多肽鏈中的較小者。κ和λ輕鏈指兩種主要的抗體輕鏈同種型。如本文所使用，術(shù)語“合成抗體”意思是使用重組DNA技術(shù)生成的抗體，比如，例如，如本文所描述的通過噬菌體表達(dá)的抗體。該術(shù)語還應(yīng)當(dāng)被解釋為意思是已經(jīng)通過合成編碼抗體的DNA分子——并且該DNA分子表達(dá)抗體蛋白或規(guī)定抗體的氨基酸序列——生成的抗體，其中DNA或氨基酸序列已經(jīng)使用本領(lǐng)域中可利用的和公知的合成DNA或氨基酸序列技術(shù)獲得?！扒逗峡贵w”指工程化抗體類型，其包含衍生自供體抗體的天然存在的可變區(qū)(輕鏈和重鏈)聯(lián)合衍生自受體抗體的輕鏈和重鏈恒定區(qū)?！叭嗽椿贵w”指如此工程化抗體的類型，其CDR衍生自非人供體免疫球蛋白，分子的剩余免疫球蛋白衍生部分衍生自一種(或多種)人免疫球蛋白(一種或多種)。此外，框架支撐殘基(supportresidue)可以被改變以保持結(jié)合親和力(參見，例如，1989,Queen等，Proc.Natl.AcadSciUSA,86:10029-10032；1991,Hodgson等，Bio/Technology,9:421)。適合的人受體抗體可以是通過與供體抗體的核苷酸和氨基酸序列同源選自常規(guī)數(shù)據(jù)庫(kù)，例如，KABAT數(shù)據(jù)庫(kù)、LosAlamos數(shù)據(jù)庫(kù)和SwissProtein數(shù)據(jù)庫(kù)的人受體抗體。通過與供體抗體的框架區(qū)同源(基于氨基酸)表征的人抗體可以適合于提供重鏈恒定區(qū)和/或重鏈可變框架區(qū)用于插入供體CDR。能夠供給輕鏈恒定區(qū)或可變框架區(qū)的適合的受體抗體可以以類似的方式選擇。應(yīng)當(dāng)注意，受體抗體重鏈和輕鏈不要求起源于相同的受體抗體?，F(xiàn)有技術(shù)描述了產(chǎn)生這種人源化抗體的數(shù)種途徑(參見例如EP-A-0239400和EP-A-054951)。術(shù)語“供體抗體”指如此抗體(單克隆和/或重組)，其向第一免疫球蛋白伴侶貢獻(xiàn)其可變區(qū)、CDR、或其它功能片段或其類似物的氨基酸序列，從而給改變的免疫球蛋白編碼區(qū)以及得到的表達(dá)的改變的抗體提供供體抗體的結(jié)合特異性和中和活性特征。術(shù)語“受體抗體”指與供體抗體異源的抗體(單克隆和/或重組)，其向第一免疫球蛋白伴侶貢獻(xiàn)編碼其重和/或輕鏈框架區(qū)和/或其重和/或輕鏈恒定區(qū)的所有(或任意部分，但是在一些實(shí)施方式中為所有)氨基酸序列。在某些實(shí)施方式中，人抗體是受體抗體?！癈DR”被限定為抗體的互補(bǔ)決定區(qū)氨基酸序列，其是免疫球蛋白重和輕鏈的高變區(qū)。參見，例如，Kabat等，SequencesofProteinsofImmunologicalInterest，第四版，U.S.DepartmentofHealthandHumanServices,NationalInstitutesofHealth(1987)。在免疫球蛋白的可變部分中存在三種重鏈和三種輕鏈CDR(或CDR區(qū))。因此，如本文所使用的“CDR”指所有三種重鏈CDR，或所有三種輕鏈CDR(或所有重和所有輕鏈CDR二者，如果適合的話)?？贵w的結(jié)構(gòu)和蛋白折疊可以意思是其它殘基被視為結(jié)合區(qū)的部分并且將被本領(lǐng)域技術(shù)人員理解為如此。參見例如Chothia等，(1989)Conformationsofimmunoglobulinhypervariableregions；Nature342,p877-883。術(shù)語“框架”或“框架序列”指可變區(qū)減去CDR的剩余序列。因?yàn)镃DR序列的精確限定可以由不同的系統(tǒng)決定，因此框架序列的含義相應(yīng)地經(jīng)歷不同的解釋。六種CDR(輕鏈的CDR-L1、-L2和-L3，和重鏈的CDR-H1、-H2和-H3)也將輕鏈和重鏈上的框架區(qū)分為每個(gè)鏈上的子區(qū)(FR1、FR2、FR3和FR4)，其中CDR1位于FR1和FR2之間，CDR2位于FR2和FR3之間，和CDR3位于FR3和FR4之間。在不指定具體的子區(qū)為FR1、FR2、FR3或FR4的情況下，框架區(qū)，如被其它提及的，代表單一天然存在的免疫球蛋白鏈的可變區(qū)內(nèi)的組合的FR's。FR代表四個(gè)子區(qū)中的一個(gè)，并且FRs代表組成框架區(qū)的四個(gè)子區(qū)中的兩個(gè)或更多個(gè)。如本文所使用，“免疫分析”指使用能夠特異性地結(jié)合至靶分子的抗體來檢測(cè)和定量靶分子的任何結(jié)合分析。術(shù)語“特異性地結(jié)合”，如本文中關(guān)于抗體所使用的，意思是識(shí)別特異性結(jié)合伴侶分子，但是基本上不識(shí)別或結(jié)合樣本中的其它分子的抗體。例如，特異性結(jié)合至來自一個(gè)物種的結(jié)合伴侶分子的抗體還可以結(jié)合至來自一個(gè)或多個(gè)物種的該結(jié)合伴侶分子。但是，這種跨種反應(yīng)性自身不改變抗體的類別為特異性的。在另一個(gè)實(shí)例中，特異性地結(jié)合至結(jié)合伴侶分子的抗體還可以結(jié)合至結(jié)合伴侶分子的不同等位形式。但是這種交叉反應(yīng)性自身不改變抗體的類別為特異性的。在一些情況下，術(shù)語“特異性結(jié)合”或“特異性地結(jié)合”可以被用于指抗體、蛋白質(zhì)或肽與第二結(jié)合伴侶分子的相互作用，意思是該相互作用依賴于結(jié)合伴侶分子上特定結(jié)構(gòu)(例如，抗原決定簇或表位)的存在；例如，抗體識(shí)別和結(jié)合至特定的蛋白結(jié)構(gòu)而不是通常地結(jié)合至蛋白質(zhì)。如果抗體對(duì)于表位“A”是特異性的，則在包含標(biāo)記的“A”和抗體的反應(yīng)中包含表位A(或自由的、未標(biāo)記的A)的分子的存在將降低與抗體結(jié)合的標(biāo)記的A的量。在一些情況下，術(shù)語“特異性結(jié)合”和“特異性地結(jié)合”指選擇性結(jié)合，其中抗體識(shí)別對(duì)于增強(qiáng)與伴侶分子結(jié)合的親和力重要的序列或構(gòu)象表位。如本文所使用，術(shù)語“中和”指當(dāng)結(jié)合蛋白特異性地結(jié)合腎酶時(shí)，中和腎酶的生物學(xué)活性。優(yōu)選地，中和結(jié)合蛋白是中和抗體，其與腎酶的結(jié)合導(dǎo)致抑制腎酶的生物學(xué)活性。優(yōu)選地，中和結(jié)合蛋白結(jié)合腎酶并降低腎酶的生物學(xué)活性至少大約20％、40％、60％、80％、85％或更多。在一些實(shí)施方式中，腎酶是人腎酶。術(shù)語“表位”具有由抗體或其結(jié)合部分或其它結(jié)合分子——比如例如scFv——識(shí)別的結(jié)合伴侶分子上的位點(diǎn)的其通常意義。表位可以是氨基酸的分子或區(qū)段，包括代表完整蛋白質(zhì)或多肽的小部分的區(qū)段。表位可以是構(gòu)象的(即不連續(xù)的)。即，它們可以由被一級(jí)序列的非鄰接部分——其已經(jīng)通過蛋白折疊而并列——編碼的氨基酸形成。如本文所使用，短語“生物學(xué)樣本”意欲包括包含細(xì)胞、組織或體液——其中核酸或多肽的表達(dá)可以被檢測(cè)——的任何樣本。這樣的生物學(xué)樣本的實(shí)例包括但不限于血液、淋巴、骨髓、活體組織切片(biopsy)和涂片。本質(zhì)上為液體的樣本在本文中稱為“體液”。生物學(xué)樣本可以通過多種技術(shù)自患者獲得，包括，例如通過刮擦或擦拭區(qū)域或通過使用針來獲得體液。用于收集不同身體樣本的方法在本領(lǐng)域中是公知的。如本文所使用，術(shù)語“癌癥”被限定為由畸變細(xì)胞的異常生長(zhǎng)表征的疾病。癌細(xì)胞可以局部地傳播或通過血流和淋巴系統(tǒng)傳播至身體的其它部分。不同癌癥的實(shí)例包括但不限于乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、宮頸癌、皮膚癌(例如，黑素瘤)、胰腺癌、結(jié)腸直腸癌、腎癌、肝癌、腦癌、淋巴瘤、白血病、肺癌、肉瘤等。如本文所使用，“綴合”指一個(gè)分子共價(jià)附接至第二分子?；虻摹熬幋a區(qū)”由基因的編碼鏈的核苷酸殘基和基因的非編碼鏈的核苷酸——其分別與由基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的mRNA分子的編碼區(qū)同源或互補(bǔ)——組成。mNRA分子的“編碼區(qū)”也由mRNA分子的核苷酸殘基組成，該核苷酸殘基在mRNA分子的翻譯期間與轉(zhuǎn)移RNA分子的反密碼子區(qū)匹配或者編碼終止密碼子。編碼區(qū)可以因而包括如此核苷酸殘基，其包含在由mRNA分子編碼的成熟蛋白質(zhì)中(例如，蛋白輸出信號(hào)序列中的氨基酸殘基)不存在的氨基酸殘基的密碼子。如本文所使用，涉及核酸的“互補(bǔ)”指的是兩個(gè)核酸鏈的區(qū)之間或者同一核酸鏈的兩個(gè)區(qū)之間的序列互補(bǔ)性的寬泛概念。已知的是如果殘基是胸腺嘧啶或尿嘧啶，則第一核酸區(qū)的腺嘌呤殘基能夠與第二核酸區(qū)——其與第一區(qū)反平行——的殘基形成特定的氫鍵(“堿基配對(duì)”)。類似地，已知的是如果殘基是鳥嘌呤，則第一核酸鏈的胞嘧啶殘基能夠與第二核酸鏈——其與第一鏈反平行——的殘基堿基配對(duì)。如果當(dāng)兩個(gè)區(qū)以反平行方式排列時(shí)，第一區(qū)的至少一個(gè)核酸殘基能夠與第二區(qū)的殘基堿基配對(duì)，則核酸的第一區(qū)與相同或不同核酸的第二區(qū)互補(bǔ)。優(yōu)選地，第一區(qū)包括第一部分和第二區(qū)包括第二部分，借此，當(dāng)?shù)谝缓偷诙糠忠苑雌叫蟹绞脚帕袝r(shí)，第一部分的核苷酸殘基的至少大約50％，和優(yōu)選地至少大約75％、至少大約90％或至少大約95％能夠與第二部分中的核苷酸殘基堿基配對(duì)。更優(yōu)選地，第一部分的所有核苷酸殘基均能夠與第二部分中的核苷酸殘基堿基配對(duì)。如本文所使用，術(shù)語“衍生物”包括多肽、多核苷酸或其它分子的化學(xué)修飾。在本發(fā)明的背景下，“衍生物多肽”，例如，通過糖基化、聚乙二醇化或任意類似的方法修飾的衍生物多肽保留結(jié)合活性。例如，術(shù)語結(jié)合結(jié)構(gòu)域的“衍生物”包括如，例如，已經(jīng)通過添加一種或多種聚乙二醇分子、糖類、磷酸鹽和/或其它這樣的分子化學(xué)修飾的結(jié)合結(jié)構(gòu)域融合蛋白、變體或片段，其中該一種或多種分子不天然地附接至野生型結(jié)合結(jié)構(gòu)域融合蛋白。多肽的“衍生物”進(jìn)一步包括通過相對(duì)于參考多肽氨基酸具有置換、缺失或插入而“衍生”自參考多肽的那些多肽。因此，多肽可以“衍生”自野生型多肽或自任何其它多肽。如本文所使用，化合物，包括多肽，還可以“衍生”自特定的來源，例如，自特定有機(jī)體、組織類型，或自特定多肽、核酸或存在于特定有機(jī)體或特定組織類型中的其它化合物。如本文所使用，術(shù)語“DNA”被限定為脫氧核糖核酸。“編碼”指的是多核苷酸——比如基因、cDNA或mRNA——中核苷酸的特異性序列在生物學(xué)過程中充當(dāng)用于合成具有限定序列的核苷酸(即，rRNA、tRNA和mRNA)或限定序列的核酸和由其得到的生物學(xué)性質(zhì)的其它聚合物和大分子的模板的固有性質(zhì)。因此，如果與基因?qū)?yīng)的mRNA的轉(zhuǎn)錄和翻譯在細(xì)胞或其它生物學(xué)系統(tǒng)中產(chǎn)生蛋白質(zhì)，則該基因編碼蛋白質(zhì)。編碼鏈——其核苷酸序列與mRNA序列相同并且通常在序列表中提供——和非編碼鏈——其被用作基因或cDNA的轉(zhuǎn)錄的模板——二者可以被稱為編碼該基因或cDNA的蛋白質(zhì)或其它產(chǎn)物。除非另有說明，“編碼氨基酸序列的核苷酸序列”包括為彼此的簡(jiǎn)并版本并且編碼相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。短語核苷酸序列——其編碼蛋白質(zhì)或RNA——還可以包括內(nèi)含子，在這種意義上，編碼蛋白質(zhì)的核苷酸序列可以在一些版本中包含內(nèi)含子(一個(gè)或多個(gè))。“疾病”是動(dòng)物的健康狀況，其中動(dòng)物不能維持體內(nèi)平衡，并且其中如果疾病得不到改善，則動(dòng)物的健康繼續(xù)惡化。相比之下，動(dòng)物中的“紊亂”是如此健康狀況：其中動(dòng)物能夠維持體內(nèi)平衡，但是其中動(dòng)物的健康狀況與其不存在紊亂時(shí)相比是較不利的。不經(jīng)過治療，紊亂不一定使得動(dòng)物健康狀況進(jìn)一步降低。如果疾病或紊亂的征兆或癥狀的嚴(yán)重性、患者經(jīng)歷這種征兆或癥狀的頻率、或二者降低，則疾病或紊亂“減輕”?；衔锏摹坝行Я俊被颉爸委熡行Я俊笔亲阋詾槭┯迷摶衔锏膶?duì)象提供有益效果的化合物的那個(gè)量。本文描述的用于結(jié)合結(jié)構(gòu)域多肽的術(shù)語“高親和力”指至少大約10-6M、優(yōu)選地至少大約10-7M、更優(yōu)選地至少大約10-8M或更強(qiáng)、更優(yōu)選地至少大約10-9M或更強(qiáng)、更優(yōu)選地至少大約10-10M或更強(qiáng)，例如，多達(dá)10-12M或更強(qiáng)的解離常數(shù)(Kd)。但是對(duì)于其它結(jié)合結(jié)構(gòu)域多肽，“高親和力”結(jié)合可以改變。如本文所使用，術(shù)語“抑制”意思是抑制或阻斷活性或功能，例如，相對(duì)于對(duì)照值的大約10％。優(yōu)選地，與對(duì)照值相比活性被抑制或阻斷50％，更優(yōu)選地75％，和甚至更優(yōu)選地95％。如本文所使用，“抑制”還意思是降低分子、反應(yīng)、相互作用、基因、mRNA、和/或蛋白質(zhì)的表達(dá)、穩(wěn)定性、功能或活性的水平可測(cè)量的量或使其完全阻止。抑制劑是化合物，例如拮抗劑，例如，其結(jié)合至，部分地或全部地阻斷活性，降低、阻止、延遲激活，滅活，脫敏，或下調(diào)蛋白質(zhì)、基因和mRNA穩(wěn)定性、表達(dá)、功能和活性。如本文中以其不同形式使用的術(shù)語感興趣分子的“調(diào)節(jié)劑”和“調(diào)節(jié)”意欲包含與感興趣的蛋白酶相關(guān)聯(lián)的活性的拮抗作用、激動(dòng)作用(agonism)、部分拮抗作用或部分激動(dòng)作用。在各個(gè)實(shí)施方式中，“調(diào)節(jié)劑”可以抑制或刺激蛋白酶表達(dá)或活性。這樣的調(diào)節(jié)劑包括蛋白酶分子的小分子激動(dòng)劑和拮抗劑、反義分子、核酶、三鏈體分子(triplexmolecule)和RNAi多核苷酸，等。如本文所使用，“指導(dǎo)性材料”包括出版物、記錄、圖表或任何其它表達(dá)介質(zhì)，其可以被用于在用于實(shí)現(xiàn)本文敘述的各種疾病或紊亂的減輕的試劑盒中傳達(dá)本發(fā)明的化合物、組合物、載體或遞送系統(tǒng)的有用性。任選地或可選地，指導(dǎo)性材料可以描述減輕哺乳動(dòng)物細(xì)胞或組織中的疾病或紊亂的一種或多種方法。例如，本發(fā)明的試劑盒的指導(dǎo)性材料可以貼附至包含本發(fā)明的鑒定的化合物、組合物、載體或遞送系統(tǒng)的容器，或者可以與包含鑒定的化合物、組合物、載體或遞送系統(tǒng)的容器一起運(yùn)送?？蛇x地，指導(dǎo)性材料可以與容器分開運(yùn)送，目的是指導(dǎo)性材料和化合物被接受者合作地使用?！胺蛛x的(isolated)”意思是由天然狀態(tài)改變或移出。例如，在活體動(dòng)物中以其正常情況天然存在的核酸或肽不是“分離的”，但是與其天然情況的共存物質(zhì)部分或完全分開的相同核酸或肽是“分離的”。分離的核酸或蛋白質(zhì)可以以基本上純化的形式存在，或者可以存在于非原生環(huán)境比如宿主細(xì)胞中?！胺蛛x的核酸”指已經(jīng)與天然存在狀態(tài)下位于其側(cè)面的序列分開的核酸區(qū)段或片段，即，已經(jīng)從正常地鄰近該片段的序列——即在天然存在的基因組中鄰近該片段的序列——移出的DNA片段。該術(shù)語還應(yīng)用于已經(jīng)從天然伴隨核酸——即在細(xì)胞中天然地伴隨核酸的RNA或DNA或蛋白質(zhì)——的其它組分基本上純化的核酸。因此，該術(shù)語包括，例如，重組DNA，其被并入載體，并入自主復(fù)制的質(zhì)粒或病毒，或并入原核生物或真核生物的基因組DNA，或者其作為獨(dú)立于其它序列的單獨(dú)分子(即，作為通過PCR或限制性內(nèi)切酶消化產(chǎn)生的cDNA或基因組或cDNA片段)存在。其還包括為編碼另外的多肽序列的雜合基因的一部分的重組DNA。在本發(fā)明的背景下，通常出現(xiàn)的核酸堿基使用下列縮寫?！癆”指腺苷，“C”指胞嘧啶，“G”指鳥苷，“T”指胸苷和“U”指尿苷。如本文所使用，術(shù)語“多核苷酸”被限定為核苷酸的鏈。而且，核酸是核苷酸的聚合物。因此，如本文所使用的核酸和多核苷酸是可互換的。本領(lǐng)域技術(shù)人員具有核酸是多核苷酸——其可以被水解為單體“核苷酸”——的一般知識(shí)。單體核苷酸可以被水解為核苷。如本文所使用，多核苷酸包括但不限于通過本領(lǐng)域中可利用的任何手段——其非限制性地包括重組手段，即，使用普通克隆技術(shù)和PCR等從重組文庫(kù)或細(xì)胞基因組克隆核酸序列——和通過合成手段獲得的所有核酸序列。如本文所使用，術(shù)語“肽”、“多肽”和“蛋白質(zhì)”可互換地使用，并且指由通過肽鍵共價(jià)連接的氨基酸殘基組成的化合物。蛋白質(zhì)或肽必須包含至少兩個(gè)氨基酸，并且在可以構(gòu)成蛋白質(zhì)的或肽的序列的氨基酸的最大數(shù)目方面沒有限制。多肽包括含有通過肽鍵彼此連接的兩個(gè)或更多個(gè)氨基酸的任何肽或蛋白質(zhì)。如本文所使用，該術(shù)語指的是短鏈和較長(zhǎng)鏈二者，短鏈在本領(lǐng)域中還通常被稱為例如肽、寡肽和寡聚物，較長(zhǎng)鏈在本領(lǐng)域中通常被稱為存在許多類型的蛋白質(zhì)?！岸嚯摹卑ɡ缟锘钚云?、基本上同源的多肽、寡肽、同型二聚體、異二聚體、多肽的變體、修飾的多肽、衍生物、類似物、融合蛋白等。多肽包括天然肽、重組肽、合成肽或其組合。術(shù)語“保守置換”，當(dāng)描述多肽時(shí)，指的是不實(shí)質(zhì)上改變多肽活性的多肽的氨基酸組成的改變，即，氨基酸置換為具有類似性質(zhì)的其它氨基酸。提供功能上類似的氨基酸的保守置換表在本領(lǐng)域中是公知的。下面的六組每個(gè)包含通常理解為代表彼此的保守置換的氨基酸：(1)丙氨酸(A)、絲氨酸(S)、蘇氨酸(T)；(2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；(3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；(4)精氨酸(R)、賴氨酸(K)；(5)異亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、纈氨酸(V)；和(6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)(還參見，Creighton,1984,Proteins,W.H.FreemanandCompany)。除了上面限定的保守置換之外，氨基酸殘基的其它修飾也可導(dǎo)致“保守修飾的變體”。例如，可以看待所有帶電荷的氨基酸為彼此的置換，不管它們是正的還是負(fù)的。此外，保守修飾的變體也可以來源于在編碼的序列中改變、添加或缺失單個(gè)氨基酸或小百分比——例如通常小于5％——的氨基酸的個(gè)別置換、缺失或添加。進(jìn)一步，保守修飾的變體可以通過將由天然或野生型基因采用的氨基酸的密碼子置換為相同氨基酸的不同密碼子由重組多肽制備。如本文所使用，術(shù)語“RNA”被限定為核糖核酸。如本文所使用，術(shù)語“重組DNA”被限定為通過連接來自不同來源的DNA片產(chǎn)生的DNA。如本文所使用，術(shù)語“重組多肽”被限定為通過使用重組DNA方法產(chǎn)生的多肽。“藥學(xué)上可接受的”意思是，例如，載體、稀釋劑或賦形劑與制劑的其它成分是相容的并且對(duì)于施用給其接受者通常是安全的。如本文所使用，“藥學(xué)上可接受的載體”包括任何物質(zhì)，當(dāng)與綴合物結(jié)合時(shí)其保留綴合物的活性并且與對(duì)象的免疫系統(tǒng)是不反應(yīng)性的。實(shí)例包括但不限于任何標(biāo)準(zhǔn)藥物載體比如磷酸鹽緩沖鹽水溶液、水、乳液比如油/水乳液、和各種類型的潤(rùn)濕劑。其它載體也可以包括無菌溶液、包括包衣片劑在內(nèi)的片劑和膠囊。通常地，這些載體包含賦形劑，比如淀粉、牛奶、糖、某些類型的粘土、明膠、硬脂酸或其鹽——硬脂酸鎂或鈣、滑石、植物脂肪或油類、樹膠、乙二醇或其它已知的賦形劑。這些載體還可以包括調(diào)味或著色添加劑或其它成分。包含這些載體的組合物通過公知的常規(guī)方法配制。術(shù)語“患者”、“對(duì)象”、“個(gè)體”等在本文中可互換地使用，并且指的是具有補(bǔ)體系統(tǒng)的任何動(dòng)物，優(yōu)選地哺乳動(dòng)物，并且最優(yōu)選地人，包括對(duì)于病癥或其后遺癥需要療法的人，或者易受病癥或其后遺癥影響的人。因而，個(gè)體可以包括，例如，狗、貓、豬、牛、綿羊、山羊、馬、大鼠、猴子、以及小鼠和人。短語“百分比(％)同一性”指在兩個(gè)或更多個(gè)氨基酸序列的比較中發(fā)現(xiàn)的序列相似性的百分比。百分比同一性可以使用任何適合的軟件電子地測(cè)定。同樣，兩個(gè)多肽(或者它們中的任一個(gè)或二者的一個(gè)或多個(gè)部分)之間的“相似性”通過將一個(gè)多肽的氨基酸序列與第二多肽的氨基酸序列進(jìn)行比較來測(cè)定。對(duì)于這樣的比較有用的任何適合的算法可以適合于在本發(fā)明的背景下應(yīng)用?！爸委熜浴碧幚硎浅鲇跍p弱或消除病理征兆的目的給表現(xiàn)病理征兆的對(duì)象施用的治療。“治療有效量”是當(dāng)施用給患者時(shí)，改善疾病的癥狀的本發(fā)明的化合物的量。組成“治療有效量”的本發(fā)明的化合物的量將根據(jù)化合物、疾病狀態(tài)和其嚴(yán)重性、待治療的患者的年齡等改變。治療有效量可以由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員根據(jù)其自身知識(shí)和本公開內(nèi)容常規(guī)地測(cè)定。術(shù)語“治療(處理，treat，treating和treatment)”指的是本文描述的治療性或預(yù)防性措施?！爸委煛钡姆椒ú捎媒o需要這種治療的對(duì)象——例如，受疾病或紊亂折磨的對(duì)象，或者最終可能患有這種疾病或紊亂的對(duì)象——施用本發(fā)明的組合物，以便預(yù)防、治愈、延遲、降低嚴(yán)重性、或減輕紊亂或復(fù)發(fā)性紊亂的一種或多種癥狀，或者以便延長(zhǎng)對(duì)象的存活超過不存在這種治療的情況下所預(yù)期的。如本文所使用，術(shù)語“變體”是在序列方面分別與參考核酸序列或肽序列不同，但是保留了參考分子的基本生物學(xué)性質(zhì)的核酸序列或肽序列。核酸變體的序列的變化可以不改變由參考核酸編碼的肽的氨基酸序列，或者可以導(dǎo)致氨基酸置換、添加、缺失、融合和截短。肽變體的序列的變化通常是限制性的或保守的，使得參考肽和變體的序列總的來說是密切相似的，并且在一些區(qū)域中是相同的。變體和參考肽可以通過以任意組合的一種或多種置換、添加、缺失而在氨基酸序列方面不同。核酸或肽的變體可以是天然發(fā)生的，比如等位變體，或者可以是不已知為天然發(fā)生的變體。核酸和肽的非天然發(fā)生的變體可以通過誘變技術(shù)或通過直接合成來制備。范圍：遍及本公開內(nèi)容，本發(fā)明的各個(gè)方面可以以范圍形式呈現(xiàn)。應(yīng)當(dāng)理解，以范圍形式的描述僅僅是出于便利和簡(jiǎn)單的目的，并且不應(yīng)當(dāng)被解釋為對(duì)本發(fā)明范圍的僵化限制。因此，范圍的描述應(yīng)當(dāng)被視為已經(jīng)具體地公開了所有可能的子范圍以及所述范圍內(nèi)的單個(gè)數(shù)值。例如，范圍比如1到6的描述應(yīng)當(dāng)被視為已經(jīng)具體地公開了子范圍，比如1到3、1到4、1到5、2到4、2到6、3到6等，以及所述范圍內(nèi)的單個(gè)數(shù)字，例如1、2、2.7、3、4、5、5.3和6。不管范圍的寬度如何，這都適用。描述本發(fā)明涉及涉及使用腎酶的抑制劑抑制腎酶。在各個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及通過給有需要的對(duì)象施用腎酶的抑制劑治療個(gè)體中腎酶相關(guān)疾病或紊亂的組合物和方法。在一些實(shí)施方式中，腎酶抑制劑是腎酶結(jié)合分子。在一些實(shí)施方式中，腎酶結(jié)合分子是抗體。在各個(gè)實(shí)施方式中，使用本發(fā)明的組合物和方法可診斷、可預(yù)防和可治療的疾病和紊亂包括急性腎衰竭(即，急性腎小管壞死或ATN——一種腎臟中的缺血性病癥)、心血管疾病和癌癥。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明寬泛地涉及癌癥的治療、預(yù)防和診斷。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及用于癌癥的診斷、分級(jí)、治療、抑制、預(yù)防或減輕的方法和組合物。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了用于調(diào)節(jié)腎酶的水平、產(chǎn)生和活性中的一個(gè)或多個(gè)的組合物和方法。在癌癥以及相關(guān)疾病和紊亂的背景下，本發(fā)明提供了用于降低腎酶的水平、產(chǎn)生和活性中的一個(gè)或多個(gè)的組合物和方法。本發(fā)明的一些方面提供用于癌癥轉(zhuǎn)移的治療、預(yù)防、診斷或預(yù)后的方法和組合物。治療性抑制劑組合物和使用方法在各個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明包括治療或預(yù)防疾病或紊亂的腎酶抑制劑組合物和方法，其中腎酶的降低水平或活性是期望的?？梢岳帽景l(fā)明的組合物和方法治療或預(yù)防的疾病或紊亂的一個(gè)非限制性的實(shí)例包括癌癥，在該實(shí)例中腎酶的降低水平或活性是期望的。在各個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的治療或預(yù)防的腎酶抑制劑組合物和方法減少腎酶多肽的量、腎酶肽片段的量、腎酶mRNA的量、腎酶酶活性的量、腎酶底物結(jié)合活性的量、腎酶受體結(jié)合活性的量或其組合?；诒疚奶峁┑墓_內(nèi)容，本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解腎酶水平的降低包括腎酶表達(dá)——包括轉(zhuǎn)錄、翻譯或二者——的降低，并且還包括促進(jìn)腎酶的降解，包括在RNA水平(例如，RNAi、shRNA等)下和蛋白質(zhì)水平(例如，泛素化等)下。一旦武裝有本發(fā)明的教導(dǎo)，本領(lǐng)域技術(shù)人員還將領(lǐng)會(huì)腎酶水平的降低包括腎酶活性(例如，酶活性、底物結(jié)合活性、受體結(jié)合活性等)的降低。因此，降低腎酶的水平或活性包括但不限于降低編碼腎酶的核酸的轉(zhuǎn)錄、翻譯或二者；并且其還包括降低腎酶多肽或其肽片段等的任何活性。本發(fā)明的腎酶抑制劑組合物和方法可以選擇性地抑制腎酶，或者可以抑制腎酶和另一種分子二者。腎酶的抑制可以使用多種方法評(píng)估，包括本文描述的那些，以及本領(lǐng)域中已知的或者在未來將被研發(fā)的方法。即，基于本文提供的公開內(nèi)容，墨守成規(guī)者(routiner)將領(lǐng)會(huì)，降低腎酶的水平或活性可以容易地使用評(píng)估生物學(xué)樣本中存在的編碼腎酶的核酸(例如，mRNA)的水平、腎酶多肽或其肽片段的水平、腎酶活性(例如，酶活性、底物結(jié)合活性、受體結(jié)合活性等)的水平或其組合的方法進(jìn)行評(píng)估。基于本文提供的公開內(nèi)容，本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解本發(fā)明在有需要的對(duì)象中治療或預(yù)防是有用的，不管該對(duì)象是否正在利用其它藥物或療法治療。進(jìn)一步，基于本文提供的教導(dǎo)，本領(lǐng)域技術(shù)人員將領(lǐng)會(huì)可以由本文描述的組合物和方法治療的疾病或紊亂包括任何疾病或紊亂，其中腎酶發(fā)揮作用并且其中降低的腎酶水平或活性將促進(jìn)積極的治療結(jié)果。在各個(gè)實(shí)施方式中，使用本公開內(nèi)容的化合物和方法可治療或可預(yù)防的疾病或紊亂包括急性腎衰竭(即，急性腎小管壞死或ATN——一種腎臟中的缺血性病癥)、心血管疾病或紊亂(例如，高血壓、肺動(dòng)脈高血壓、收縮期高血壓、糖尿病高血壓、無癥狀性左心室功能紊亂、慢性充血性心力衰竭、心肌梗死、心律失常、動(dòng)脈粥樣硬化等)、癌癥、心臟疾病或紊亂、腎臟疾病或紊亂、胃腸道疾病或紊亂、肝臟疾病或紊亂、肺疾病或紊亂、胰腺疾病或紊亂(例如，胰腺炎)、精神疾病或紊亂(例如，抑郁、焦慮等)或神經(jīng)學(xué)疾病或紊亂。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的腎酶抑制劑可以被施用至正在利用外源腎酶、重組腎酶、腎酶片段和/或腎酶激活劑治療的患者，以便控制、逐步增加(titrate)、減少或穩(wěn)定患者中內(nèi)源和/或外源腎酶的水平或活性。降低腎酶或腎酶片段的水平或活性(例如，酶活性、底物結(jié)合活性、受體結(jié)合活性等)的本發(fā)明的腎酶抑制劑組合物和方法包括，但是不應(yīng)當(dāng)被解釋為限于，化合物、蛋白質(zhì)、肽、肽模擬、抗體、抗體片段、抗體模擬、核酶、小分子化合物、短發(fā)夾RNA、RNAi、反義核酸分子(例如siRNA、miRNA等)、編碼反義核酸分子的核酸、編碼蛋白質(zhì)的核酸序列、腎酶受體、腎酶受體片段或其組合。在一些實(shí)施方式中，抑制劑是變構(gòu)抑制劑?；诒疚奶峁┑墓_內(nèi)容，本領(lǐng)域技術(shù)人員將容易領(lǐng)會(huì)腎酶抑制劑組合物包括降低腎酶或其片段的水平或活性的任何化合物。另外，腎酶抑制劑組合物包括化學(xué)修飾的化合物和衍生物，如化學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)人員公知的。降低腎酶或腎酶片段的水平或活性(例如，酶活性、底物結(jié)合活性、受體結(jié)合活性等)的本發(fā)明的腎酶抑制劑組合物和方法包括抗體和其片段。本發(fā)明的抗體包括多種形式的抗體，其包括，例如，多克隆抗體、單克隆抗體、細(xì)胞內(nèi)抗體(“胞內(nèi)抗體”)、Fv、Fab和F(ab)2、單鏈抗體(scFv)、重鏈抗體(比如駱駝科抗體)、合成抗體、嵌合抗體和人源化抗體。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的抗體是特異性地結(jié)合至腎酶的抗體。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明的抗體是雙特異性抗體，其中第一特異性針對(duì)腎酶和第二特異性針對(duì)細(xì)胞或組織上的靶分子以引導(dǎo)該雙特異性抗體至解剖學(xué)位置，在該解剖學(xué)位置中存在靶分子并且在該解剖學(xué)位置中腎酶結(jié)合是期望的。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明的抗體是雙特異性抗體，其中第一特異性針對(duì)腎酶和第二特異性針對(duì)第二結(jié)合伴侶分子(即，有效負(fù)載)，其由抗體第二特異性攜帶并且被部署至腎酶結(jié)合期望的解剖學(xué)位置。在一些實(shí)施方式中，給對(duì)象施用本發(fā)明的腎酶抑制劑(例如，腎酶結(jié)合分子)治療癌癥有助于通過對(duì)象的抗癌癥的免疫系統(tǒng)而引發(fā)和/或補(bǔ)充免疫應(yīng)答。對(duì)象的抗癌癥的免疫應(yīng)答可以是任何宿主防御或應(yīng)答，包括先天性免疫應(yīng)答、體液免疫應(yīng)答、細(xì)胞介導(dǎo)免疫應(yīng)答或其組合。進(jìn)一步，當(dāng)配備有本公開內(nèi)容和本文示例的方法時(shí)，本領(lǐng)域技術(shù)人員將領(lǐng)會(huì)腎酶抑制劑組合物包括如在未來發(fā)現(xiàn)的這類抑制劑，如可以通過藥理學(xué)領(lǐng)域中的公知標(biāo)準(zhǔn)確定的，比如如本文中詳細(xì)描述的和/或如本領(lǐng)域中已知的抑制腎酶的生理學(xué)結(jié)果。因此，本發(fā)明絕不限于如本文中示例的或公開的任何具體的腎酶抑制劑組合物；而是，本發(fā)明包括將由墨守成規(guī)者理解為有用的那些抑制劑組合物，如在本領(lǐng)域中已知的和如在將來發(fā)現(xiàn)的。鑒定和生產(chǎn)腎酶抑制劑組合物的進(jìn)一步的方法對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員是公知的，其包括但不限于，從天然來源(例如，鏈霉菌屬某種(Streptomycessp.)、假單胞菌屬某種(Pseudomonassp.)、Stylotellaaurantium等)獲得抑制劑。可選地，腎酶抑制劑可以化學(xué)合成。進(jìn)一步，基于本文提供的教導(dǎo)，墨守成規(guī)者將領(lǐng)會(huì)腎酶抑制劑組合物可以從重組有機(jī)體獲得。用于化學(xué)合成腎酶抑制劑和用于從天然來源獲得它們的組合物和方法在本領(lǐng)域中是公知的并且在本領(lǐng)域中描述。本領(lǐng)域技術(shù)人員將領(lǐng)會(huì)抑制劑可以作為化合物、蛋白質(zhì)、肽、肽模擬、抗體、抗體片段、抗體模擬、核酶、小分子化合物、短發(fā)夾RNA、RNAi、反義核酸分子(例如siRNA、miRNA等)、編碼反義核酸分子的核酸、編碼蛋白質(zhì)的核酸序列、腎酶受體、腎酶受體片段、或其組合施用。用于施用蛋白質(zhì)或編碼蛋白質(zhì)的核酸構(gòu)建體至細(xì)胞或組織的眾多載體和其它組合物和方法是公知的。因此，本發(fā)明包括施用為腎酶抑制劑的蛋白質(zhì)或編碼為腎酶抑制劑的蛋白質(zhì)的核酸的方法。(Sambrook等，2012,MolecularCloning:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratory,NewYork；Ausubel等，1997,CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWiley&Sons,NewYork)。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到降低分子的量或活性——該分子自身增加腎酶的水平或活性——可以在本發(fā)明的組合物和方法中用以降低腎酶的水平或活性。反義寡核苷酸是與RNA分子的一些部分互補(bǔ)的DNA或RNA分子。當(dāng)存在于細(xì)胞中時(shí)，反義寡核苷酸與存在的RNA分子雜交并且抑制翻譯為基因產(chǎn)物。使用反義寡核苷酸抑制基因的表達(dá)是本領(lǐng)域中公知的(Marcus-Sekura,1988,Anal.Biochem.172:289)，如在細(xì)胞中表達(dá)反義寡核苷酸的方法(Inoue，美國(guó)專利號(hào)5,190,931)。本發(fā)明的方法包括使用反義寡核苷酸來降低腎酶的量，或者降低引起腎酶的量或活性增加的分子的量，從而降低腎酶的量或活性。本發(fā)明考慮的是通過本領(lǐng)域普通技術(shù)人員公知的方法合成和提供至細(xì)胞的反義寡核苷酸。作為實(shí)例，反義寡核苷酸可以被合成為在大約10和大約100個(gè)核苷酸長(zhǎng)之間，更優(yōu)選地大約15和大約50個(gè)核苷酸長(zhǎng)之間。核酸分子的合成在本領(lǐng)域中是公知的，如與未修飾的反義寡核苷酸相比改善生物活性的修飾的反義寡核苷酸的合成(Tullis，1991，美國(guó)專利號(hào)5,023,243)。類似地，基因的表達(dá)可以通過反義分子與基因的啟動(dòng)子或其它調(diào)控元件的雜交從而影響基因的轉(zhuǎn)錄來抑制。用于鑒定與感興趣基因相互作用的啟動(dòng)子或其它調(diào)控元件的方法在本領(lǐng)域中是公知的，并且包括如此方法，比如酵母雙雜交體系(Bartel和Fields,eds.,In:TheYeastTwoHybridSystem,OxfordUniversityPress,Cary,N.C.)。可選地，抑制表達(dá)腎酶的基因或抑制表達(dá)增加腎酶水平或活性的蛋白質(zhì)的基因可以通過使用核酶完成。使用抑制基因表達(dá)的核酶對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員是公知的(參見例如,Cech等，1992,J.Biol.Chem.267:17479；Hampel等，1989,Biochemistry28:4929；Altman等，美國(guó)專利號(hào)5,168,053)。核酶是具有切割其它單鏈RNA分子能力的催化性RNA分子。已知核酶是序列特異性的，并且因此可以被修飾為識(shí)別特異性核苷酸序列(Cech,1988,J.Amer.Med.Assn.260:3030)，使得對(duì)特異性mRNA分子的選擇性切割。在提供本公開內(nèi)容和并入本文的參考文獻(xiàn)的情況下，給出分子的核苷酸序列，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以合成反義寡核苷酸或核酶而不需要過度實(shí)驗(yàn)。可選地，抑制表達(dá)腎酶的基因或抑制表達(dá)增加腎酶水平或活性的蛋白質(zhì)的基因可以通過使用短發(fā)夾RNA或反義RNA——包括siRNA、miRNA和RNAi——完成。在提供本公開內(nèi)容和并入本文的參考文獻(xiàn)的情況下，給出分子的核苷酸序列，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以合成這樣的短發(fā)夾RNA或反義RNA而不需要過度實(shí)驗(yàn)。本領(lǐng)域技術(shù)人員將領(lǐng)會(huì)腎酶或腎酶片段的抑制劑可以快速地(例如，在短時(shí)間段內(nèi)，比如一天、一周或一個(gè)月)或長(zhǎng)期地(例如在長(zhǎng)時(shí)間段內(nèi)，比如幾個(gè)月或一年或更長(zhǎng))施用。本領(lǐng)域技術(shù)人員將領(lǐng)會(huì)腎酶的抑制劑可以單獨(dú)施用或者以與其它藥劑的任意組合施用。進(jìn)一步，腎酶抑制劑可以單獨(dú)施用或者以時(shí)間意義的任意組合施用，因?yàn)樗鼈兛梢酝瑫r(shí)地、或在彼此之前和/或之后施用。基于本文提供的公開內(nèi)容，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將領(lǐng)會(huì)腎酶抑制劑組合物可以被用于治療或預(yù)防有需要的對(duì)象中的疾病或紊亂，和抑制劑組合物可以單獨(dú)使用或以與另一種抑制劑的任意組合使用以實(shí)現(xiàn)治療結(jié)果。在各個(gè)實(shí)施方式中，本文描述的本發(fā)明的腎酶或腎酶片段的任何抑制劑可以單獨(dú)施用或以與癌癥相關(guān)聯(lián)的其它分子的其它抑制劑組合施用。當(dāng)武裝有包含本文詳述的方法的本公開內(nèi)容時(shí)，本領(lǐng)域技術(shù)人員將領(lǐng)會(huì)本發(fā)明不限于治療已經(jīng)建立的疾病或紊亂，比如癌癥。具體而言，疾病或紊亂不需要已經(jīng)表現(xiàn)為到達(dá)損害對(duì)象的點(diǎn)；事實(shí)上，在施用治療之前，疾病或紊亂不需要在對(duì)象中被檢測(cè)到。即，在本發(fā)明可以提供益處之前，顯著的疾病或紊亂不必須發(fā)生。因此，本發(fā)明包括用于預(yù)防對(duì)象中的疾病或紊亂的方法，因?yàn)槟I酶抑制劑組合物，如本文前面在別處討論的，可以在疾病或紊亂的發(fā)病之前施用給對(duì)象，從而預(yù)防疾病或紊亂發(fā)展。本文描述的預(yù)防性方法也包括治療處于緩解的對(duì)象，用于預(yù)防疾病或紊亂復(fù)發(fā)。當(dāng)武裝有本文的公開內(nèi)容時(shí)，本領(lǐng)域技術(shù)人員將領(lǐng)會(huì)疾病或紊亂的預(yù)防包括給對(duì)象施用腎酶抑制劑組合物作為抗疾病或紊亂——包括癌癥——的預(yù)防性措施。如本文別處更充分討論的，降低腎酶的水平或活性的方法包括不僅用于降低腎酶活性，而且用于降低編碼腎酶的核酸的表達(dá)——包括轉(zhuǎn)錄的降低、翻譯的降低、或二者——的許多技術(shù)。另外，如本文別處公開的，一旦武裝有本文提供的教導(dǎo)，本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解本發(fā)明包括預(yù)防多種疾病、紊亂和病理的方法，其中腎酶的表達(dá)和/或活性的降低調(diào)節(jié)、治療或預(yù)防疾病、紊亂和病理。用于評(píng)估疾病是否涉及腎酶的水平或活性的方法在本領(lǐng)域中是已知的。進(jìn)一步，本發(fā)明包括治療或預(yù)防在未來發(fā)現(xiàn)的這類疾病。本發(fā)明包括施用腎酶的抑制劑以實(shí)踐本發(fā)明的方法；基于本文提供的公開內(nèi)容，本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解如何配制適合的腎酶抑制劑并將其施用給對(duì)象。但是，本發(fā)明不限于任何具體的施用方法或治療方案。本發(fā)明提供了結(jié)合至腎酶的組合物。在一個(gè)實(shí)施方式中，腎酶結(jié)合劑抑制腎酶水平或活性。因而，在其中腎酶活性的降低將有益的疾病和病癥中，這樣的抑制性腎酶結(jié)合劑可以潛在地用作治療劑。在一些情況下，除了其潛在的治療作用之外，腎酶還可以被用作疾病或紊亂的診斷標(biāo)記，所述疾病或紊亂包括但不限于急性腎衰竭(即，急性腎小管壞死或ATN——一種腎臟中的缺血性病癥)、心血管疾病和癌癥。不具有正常行使腎臟功能的患者具有低腎酶水平。因此，本發(fā)明也包括基于使用本發(fā)明的腎酶結(jié)合劑檢測(cè)和/或定量腎酶來診斷對(duì)心血管、心臟、腎臟、胃腸道、肝臟、肺、胰腺以及精神和神經(jīng)學(xué)相關(guān)病癥、紊亂和疾病——包括癌癥——的易感性的方法。例如，通過測(cè)定腎酶水平，比如腎酶蛋白水平，可以診斷、評(píng)價(jià)和監(jiān)測(cè)心血管病癥、紊亂和疾病，比如高血壓、無癥狀性左心室功能紊亂、慢性充血性心力衰竭、心肌梗死、心律失常和動(dòng)脈粥樣硬化；精神病癥、紊亂和疾病，比如抑郁和焦慮；和心臟病癥、紊亂和疾病，比如肺動(dòng)脈高血壓。例如，腎酶蛋白的降低水平將是與增加的交感輸出相關(guān)聯(lián)的紊亂的診斷標(biāo)記。本發(fā)明的組合物和方法可以被用于治療、預(yù)防、減輕或改善高血壓，包括收縮期高血壓、單純收縮期高血壓和糖尿病高血壓。而且，對(duì)于更罕見的高血壓疾病——肺動(dòng)脈高血壓——以及胰腺炎，相同的益處被預(yù)期。肺動(dòng)脈高血壓是肺的罕見的血管紊亂，其中肺動(dòng)脈(由心臟通至肺的血管)中的血壓上升至正常水平之上并且可能變得威脅生命。肺床中升高的血壓的發(fā)展與糖尿病高血壓中和單純收縮期高血壓中全身血壓的增加的相似性暗示涉及了類似的機(jī)制。降低腎酶的水平或活性(例如，酶活性、底物結(jié)合活性、受體結(jié)合活性等)的本發(fā)明的腎酶抑制劑組合物包括但不應(yīng)當(dāng)被解釋為限制于化合物、蛋白質(zhì)、肽、肽模擬、抗體、抗體片段、抗體模擬、核酶、小分子化合物、短發(fā)夾RNA、RNAi、反義核酸分子(例如，siRNA、miRNA等)、編碼反義核酸分子的核酸、編碼蛋白質(zhì)的核酸序列、腎酶受體、腎酶受體片段或其組合。在一些實(shí)施方式中，抑制劑是變構(gòu)抑制劑?；诒疚奶峁┑墓_內(nèi)容，本領(lǐng)域技術(shù)人員將容易領(lǐng)會(huì)腎酶抑制劑組合物包括降低腎酶的水平或活性的化合物。另外，腎酶抑制劑組合物包括化學(xué)修飾的化合物，和衍生物，如化學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)人員公知的。降低腎酶的水平或活性(例如，酶活性、底物結(jié)合活性、受體結(jié)合活性等)的本發(fā)明的腎酶抑制劑組合物包括抗體和其片段。本發(fā)明的抗體包括多種形式的抗體，其包括例如，多克隆抗體、單克隆抗體、細(xì)胞內(nèi)抗體(“胞內(nèi)抗體”)、Fv、Fab和F(ab)2、單鏈抗體(scFv)、重鏈抗體(比如駱駝科抗體)、合成抗體、嵌合抗體和人源化抗體。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的抗體是特異性地結(jié)合至腎酶的抗體。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明的抗體是雙特異性抗體，其中第一特異性針對(duì)腎酶和第二特異性針對(duì)靶分子以引導(dǎo)該雙特異性抗體至腎酶結(jié)合期望的解剖學(xué)位置。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明的抗體是雙特異性抗體，其中第一特異性針對(duì)腎酶和第二特異性針對(duì)第二結(jié)合伴侶分子，其被攜帶并且被部署至其中腎酶結(jié)合期望的解剖學(xué)位置。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明的抗體——包括其腎酶結(jié)合片段——包括由任意適合的多核苷酸編碼的本文公開的抗體氨基酸序列，或任何分離的或配制的抗體。進(jìn)一步，本公開內(nèi)容的抗體包括具有本文描述的抗腎酶抗體的結(jié)構(gòu)和/或功能特征的抗體。在一個(gè)實(shí)施方式中，抗腎酶抗體結(jié)合腎酶，并由此部分地或基本上改變腎酶的至少一種生物學(xué)活性(例如，酶活性、底物結(jié)合活性、受體結(jié)合活性等)。在一些實(shí)施方式中，腎酶是人腎酶。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的抗腎酶抗體免疫特異性地結(jié)合對(duì)腎酶蛋白、肽、亞基、片段、蛋白質(zhì)或其任意組合特異的至少一種指定的表位并且不特異性地結(jié)合至其它多肽，除了來自其它物種的腎酶之外。至少一種表位可以包括包含腎酶蛋白的至少一部分的至少一個(gè)抗體結(jié)合區(qū)。如本文所使用，術(shù)語“表位”指能夠結(jié)合至抗體的蛋白決定簇。表位通常由化學(xué)活性表面分組(grouping)的分子比如氨基酸或糖側(cè)鏈組成并且通常具有特定的三維結(jié)構(gòu)特性，以及特定的電荷特性。構(gòu)象和非構(gòu)象表位是有區(qū)別的，因?yàn)樵谧冃匀軇┑拇嬖谙?，失去?duì)前者而不是后者的結(jié)合。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明包括包含特異性地結(jié)合至腎酶的抗體(例如，抗體的結(jié)合部分)的組合物。在一個(gè)實(shí)施方式中，抗腎酶抗體是多克隆抗體。在另一個(gè)實(shí)施方式中，抗腎酶抗體是單克隆抗體。在一些實(shí)施方式中，抗腎酶抗體是嵌合抗體。在進(jìn)一步實(shí)施方式中，抗腎酶抗體是人源化抗體。在一些實(shí)施方式中，腎酶是人腎酶。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明的抗體特異性地結(jié)合至SEQIDNO:1-7、8、50、92、94和其片段中的至少一種?？贵w的結(jié)合部分包括保留特異性地結(jié)合至結(jié)合伴侶分子(例如，腎酶)的能力的抗體的一個(gè)或多個(gè)片段。已經(jīng)顯示了抗體的結(jié)合功能可以由全長(zhǎng)抗體的片段執(zhí)行。在術(shù)語抗體的“結(jié)合部分”內(nèi)包含的結(jié)合片段的實(shí)例包括(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH1結(jié)構(gòu)域組成的單價(jià)片段；(ii)F(ab')2片段，包括在鉸鏈區(qū)處由二硫鍵連接的兩個(gè)Fab片段的二價(jià)片段；(iii)Fd片段，其由VH和CH1結(jié)構(gòu)域組成；(iv)Fv片段，其由抗體的單臂的VL和VH結(jié)構(gòu)域組成，(v)dAb片段(Ward等，(1989)Nature341:544-546)，其由VH結(jié)構(gòu)域組成；和(vi)分離的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)。而且，雖然Fv片段的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域VL和VH由單獨(dú)的基因編碼，但是它們可以使用重組方法通過能夠使得它們制備為單一蛋白鏈的合成連接體接合，在該單一蛋白鏈中VL和VH區(qū)配對(duì)以形成單價(jià)分子(稱為單鏈Fv(scFv)；參見例如，Bird等(1988)Science242:423-426；和Huston等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:5879-5883)。這樣的單鏈抗體也意欲包含在術(shù)語抗體的“結(jié)合部分”內(nèi)。這些抗體片段使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)技術(shù)獲得，并且以與完整抗體相同的方式針對(duì)實(shí)用性篩選片段。結(jié)合部分可以通過重組DNA技術(shù)，或通過完整免疫球蛋白的酶促或化學(xué)切割產(chǎn)生。結(jié)合至本發(fā)明的腎酶的抗體是在體外、原位和/或在體內(nèi)抑制、阻斷或干擾至少一種腎酶活性(例如，酶活性、底物結(jié)合活性、受體結(jié)合活性等)的抗體。適合的抗腎酶抗體、指定的部分或變體還可以任選地影響至少一種腎酶活性或功能，比如但不限于RNA、DNA或蛋白質(zhì)合成、蛋白質(zhì)釋放、腎酶信號(hào)傳導(dǎo)、腎酶切割、腎酶活性、腎酶受體結(jié)合、腎酶產(chǎn)生和/或合成。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的抗體結(jié)合腎酶。在一個(gè)實(shí)施方式中，抗體特異性地結(jié)合至腎酶-1。在另一個(gè)實(shí)施方式中，抗體特異性地結(jié)合至腎酶-2。在又另一實(shí)施方式中，抗體特異性地結(jié)合至腎酶-1和腎酶-2二者。此外，已經(jīng)生成了表位特異性抗體。本發(fā)明的優(yōu)選的抗體包括單克隆抗體1C-22-1、1D-28-4、1D-37-10、1F-26-1、1F42-7和3A-5-2。雙重特異性抗體的實(shí)例——例如識(shí)別腎酶-1和腎酶-2的抗體——包括抗體1C-22-1、1D-28-4、1D-37-10和如表1中描述的多克隆抗體。腎酶類型特異性抗體的實(shí)例包括1F-26-1、1F42-7，其對(duì)于腎酶-1是特異性的。3A-5-2對(duì)于腎酶-2是特異性的。編碼抗腎酶單克隆抗體的序列在圖5中提出。單克隆抗體1D-28-4的重鏈編碼序列的核酸(SEQIDNO:52)和氨基酸序列(SEQIDNO:9)在圖5中可見。單克隆抗體1D-28-4的輕鏈編碼序列的核酸(SEQIDNO:53)和氨基酸序列(SEQIDNO:10)在圖5中可見。單克隆抗體1D-37-10的重鏈編碼序列的核酸(SEQIDNO:60)和氨基酸序列(SEQIDNO:17)在圖5中可見。單克隆抗體1D-37-10的輕鏈編碼序列的核酸(SEQIDNO:61)和氨基酸序列(SEQIDNO:18)在圖5中可見。單克隆抗體1F-26-1的重鏈編碼序列的核酸(SEQIDNO:68)和氨基酸序列(SEQIDNO:25)在圖5中可見。單克隆抗體1F-26-1的輕鏈編碼序列的核酸(SEQIDNO:69)和氨基酸序列(SEQIDNO:26)在圖5中可見。單克隆抗體1F-42-7的重鏈編碼序列的核酸(SEQIDNO:76)和氨基酸序列(SEQIDNO:33)在圖5中可見。單克隆抗體1F-42-7的輕鏈編碼序列的核酸(SEQIDNO:77)和氨基酸序列(SEQIDNO:34)在圖5中可見。單克隆抗體3A-5-2的重鏈編碼序列的核酸(SEQIDNO:84)和氨基酸序列(SEQIDNO:41)在圖5中可見。單克隆抗體3A-5-2的輕鏈編碼序列的核酸(SEQIDNO:85)和氨基酸序列(SEQIDNO:42)在圖5中可見。序列的每個(gè)中帶下劃線的序列并入重鏈和輕鏈的每個(gè)的CDR1、CDR2和CDR3序列。考慮到單克隆抗體中的某些可以結(jié)合至腎酶蛋白，VH和VL序列可以“混合并匹配”以創(chuàng)建本公開內(nèi)容的其它抗腎酶結(jié)合分子。這樣的“混合并匹配”抗體的腎酶結(jié)合可以使用上面和實(shí)施例中描述的結(jié)合分析進(jìn)行測(cè)試(例如，免疫印跡、Bia-Core等)。優(yōu)選地，當(dāng)VH和VL鏈混合并匹配時(shí)，來自特定VH/VL配對(duì)的VH序列被結(jié)構(gòu)相似的VH序列替換。同樣，優(yōu)選地，來自特定VH/VL配對(duì)的VL序列被結(jié)構(gòu)相似的VL序列替換。因此，在一方面，本公開內(nèi)容提供了分離的單克隆抗體，或其結(jié)合部分，其包括：(a)重鏈可變區(qū)，其包括選自SEQIDNO:9、17、25、33和41的氨基酸序列；和(b)輕鏈可變區(qū)，其包括選自SEQIDNO:10、18、26、34和42的氨基酸序列，其中抗體特異性地結(jié)合腎酶蛋白。優(yōu)選的重和輕鏈組合包括：(a)包括SEQIDNO:9的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)和包括SEQIDNO:10的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)；或(b)包括SEQIDNO:17的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)和包括SEQIDNO:18的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)；或(c)包括SEQIDNO:25的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)和包括SEQIDNO:26的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)；或(d)包括SEQIDNO:33的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)和包括SEQIDNO:34的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)；或(e)包括SEQIDNO:41的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)和包括SEQIDNO:42的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。在另一方面，本公開內(nèi)容提供了包括1D-28-4、1D-37-10、1F-26-1、1F42-7或3A-5-2的重鏈和輕鏈CDR1、CDR2和CDR3，或其組合的抗體。1D-28-4、1D-37-10、1F-26-1、1F42-7和3A-5-2的VHCDR1的氨基酸序列分別并入SEQIDNO:11、19、27、35和43中示出的序列。1D-28-4、1D-37-10、1F-26-1、1F42-7或3A-5-2的VHCDR2的氨基酸序列分別并入SEQIDNO:12、20、28、36和44中示出的序列。1D-28-4、1D-37-10、1F-26-1、1F42-7或3A-5-2的VHCDR3的氨基酸序列分別并入SEQIDNO:13、21、29、37和45中示出的序列。1D-28-4、1D-37-10、1F-26-1、1F42-7或3A-5-2的VKCDR1的氨基酸序列分別并入SEQIDNO:14、22、30、38和46中示出的序列。1D-28-4、1D-37-10、1F-26-1、1F42-7或3A-5-2的VKCDR2的氨基酸序列分別并入SEQIDNO:15、23、31、39和47中示出的序列。1D-28-4、1D-37-10、1F-26-1、1F42-7或3A-5-2的VκCDR3的氨基酸序列分別并入SEQIDNO:16、24、32、40和48中示出的序列。CDR區(qū)使用Kabat系統(tǒng)描繪(Kabat,E.A.等(1991)SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,FifthEdition,U.S.DepartmentofHealthandHumanServices,NIHPublicationNo.91-3242)?？紤]到這些抗體中的每種可以結(jié)合至腎酶家族成員和結(jié)合特異性主要地由CDR1、CDR2和CDR3區(qū)提供，VHCDR1、CDR2和CDR3序列以及VLCDR1、CDR2和CDR3序列可以“混合并匹配”(即，來自不同抗體的CDR可以混合并匹配，但是每種抗體必須包含VHCDR1、CDR2和CDR3以及VLCDR1、CDR2和CDR3)以創(chuàng)建本公開內(nèi)容的其它抗腎酶結(jié)合分子。這樣的“混合并匹配”抗體的腎酶結(jié)合可以使用上面和實(shí)施例中描述的結(jié)合分析進(jìn)行測(cè)試(例如，免疫印跡、分析等)。優(yōu)選地，當(dāng)VHCDR序列混合并匹配時(shí)，來自特定VH序列的CDR1、CDR2和/或CDR3序列被結(jié)構(gòu)相似的CDR序列(一種或多種)替換。同樣，當(dāng)VLCDR序列混合并匹配時(shí)，來自特定VL序列的CDR1、CDR2和/或CDR3序列優(yōu)選地被結(jié)構(gòu)相似的CDR序列(一種或多種)替換。對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員還將容易顯而易見的是，可以通過將一個(gè)或多個(gè)VH和/或VLCDR區(qū)序列置換為與來自本文公開的單克隆抗體1D-28-4、1D-37-10、1F-26-1、1F42-7或3A-5-2的CDR序列的結(jié)構(gòu)相似的序列來創(chuàng)建新型VH和VL序列。因此，在一方面，本發(fā)明提供了分離的單克隆抗體，或其結(jié)合部分，其包括選自如下的至少一種：(a)重鏈可變區(qū)CDR1，其包括選自SEQIDNO:11、19、27、35和43的氨基酸序列；(b)重鏈可變區(qū)CDR2，其包括選自SEQIDNO:12、20、28、36和44的氨基酸序列；(c)重鏈可變區(qū)CDR3，其包括選自SEQIDNO:13、21、29、37和45的氨基酸序列；(d)輕鏈可變區(qū)CDR1，其包括選自SEQIDNO:14、22、30、38和46的氨基酸序列；(e)輕鏈可變區(qū)CDR2，其包括選自SEQIDNO:15、23、31、39和47的氨基酸序列；和(f)輕鏈可變區(qū)CDR3，其包括選自SEQIDNO:16、24、32、40和48的氨基酸序列；其中抗體特異性地結(jié)合腎酶。在另一個(gè)實(shí)施方式中，抗體包括選自下列的CDR中的至少一種：(a)包括SEQIDNO:11的重鏈可變區(qū)CDR1；(b)包括SEQIDNO:12的重鏈可變區(qū)CDR2；(c)包括SEQIDNO:13的重鏈可變區(qū)CDR3；(d)包括SEQIDNO:14的輕鏈可變區(qū)CDR1；(e)包括SEQIDNO:15的輕鏈可變區(qū)CDR2；和(f)包括SEQIDNO:16的輕鏈可變區(qū)CDR3。在另一個(gè)實(shí)施方式中，抗體包括選自下列的CDR中的至少一種：(a)包括SEQIDNO:19的重鏈可變區(qū)CDR1；(b)包括SEQIDNO:20的重鏈可變區(qū)CDR2；(c)包括SEQIDNO:21的重鏈可變區(qū)CDR3；(d)包括SEQIDNO:22的輕鏈可變區(qū)CDR1；(e)包括SEQIDNO:23的輕鏈可變區(qū)CDR2；和(f)包括SEQIDNO:24的輕鏈可變區(qū)CDR3。在另一個(gè)實(shí)施方式中，抗體包括選自下列的CDR中的至少一種：(a)包括SEQIDNO:27的重鏈可變區(qū)CDR1；(b)包括SEQIDNO:28的重鏈可變區(qū)CDR2；(c)包括SEQIDNO:29的重鏈可變區(qū)CDR3；(d)包括SEQIDNO:30的輕鏈可變區(qū)CDR1；(e)包括SEQIDNO:31的輕鏈可變區(qū)CDR2；和(f)包括SEQIDNO:32的輕鏈可變區(qū)CDR3。在另一個(gè)其它實(shí)施方式中，抗體包括選自下列的CDR中的至少一種：(a)包括SEQIDNO:35的重鏈可變區(qū)CDR1；(b)包括SEQIDNO:36的重鏈可變區(qū)CDR2；(c)包括SEQIDNO:37的重鏈可變區(qū)CDR3；(d)包括SEQIDNO:38的輕鏈可變區(qū)CDR1；(e)包括SEQIDNO:39的輕鏈可變區(qū)CDR2；和(f)包括SEQIDNO:40的輕鏈可變區(qū)CDR3。在另一個(gè)實(shí)施方式中，抗體包括選自下列的CDR中的至少一種：(a)包括SEQIDNO:43的重鏈可變區(qū)CDR1；(b)包括SEQIDNO:44的重鏈可變區(qū)CDR2；(c)包括SEQIDNO:45的重鏈可變區(qū)CDR3；(d)包括SEQIDNO:46的輕鏈可變區(qū)CDR1；(e)包括SEQIDNO:47的輕鏈可變區(qū)CDR2；和(f)包括SEQIDNO:48的輕鏈可變區(qū)CDR3。上述的分離的抗腎酶抗體CDR序列建立腎酶結(jié)合蛋白的新家族，其根據(jù)本發(fā)明分離，并且包括包含列舉的CDR序列的多核苷酸。為了生成和選擇具有腎酶結(jié)合和/或腎酶檢測(cè)和/或腎酶中和活性的本發(fā)明的CDR's，可以使用用于生成本發(fā)明的結(jié)合蛋白和評(píng)估那些結(jié)合蛋白的腎酶和/或腎酶結(jié)合和/或檢測(cè)和/或中性特性的本領(lǐng)域中已知的標(biāo)準(zhǔn)方法，其包括但不限于本文具體描述的那些。優(yōu)選地，本發(fā)明的腎酶結(jié)合分子(例如，抗體等)表現(xiàn)了在鹽、化合物和其它多肽的復(fù)雜混合物中檢測(cè)和結(jié)合腎酶的高能力，例如，如通過本領(lǐng)域中已知的數(shù)種體外和體內(nèi)分析中的任一種評(píng)估的。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解本文描述的在診斷、治療和預(yù)防疾病中有用的腎酶結(jié)合分子(例如，抗體等)也在本發(fā)明的程序和方法中有用，其包括但不限于免疫色譜分析、免疫斑點(diǎn)分析、Luminex分析、ELISA分析、ELISPOT分析、蛋白微陣列分析、蛋白質(zhì)印跡分析、質(zhì)譜分光光度分析、放射免疫分析(RIA)、放射免疫擴(kuò)散分析、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析、烏赫特朗尼式免疫擴(kuò)散分析、反相蛋白微陣列、火箭免疫電泳分析、免疫組織染色分析、免疫沉淀分析、補(bǔ)體結(jié)合分析、FACS、蛋白芯片分析、分離和純化過程、和親和色譜法(還參見2007,VanEmon,ImmunoassayandOtherBioanalyticalTechniques,CRCPress；2005,Wild,ImmunoassayHandbook,GulfProfessionalPublishing；1996,DiamandisandChristopoulos,Immunoassay,AcademicPress；2005,Joos,MicroarraysinClinicalDiagnosis,HumanaPress；2005,HamdanandRighetti,ProteomicsToday,JohnWileyandSons；2007)。更優(yōu)選地，本發(fā)明的腎酶結(jié)合分子(例如，抗體等)表現(xiàn)了降低或中和腎酶活性(例如，酶活性、底物結(jié)合活性、受體結(jié)合活性等)的高能力，如通過本領(lǐng)域中已知的數(shù)種體外和體內(nèi)分析中的任一種評(píng)估的。例如，這些腎酶結(jié)合分子(例如，抗體等)中和腎酶相關(guān)或腎酶介導(dǎo)的疾病或紊亂。優(yōu)選地，本發(fā)明的腎酶結(jié)合分子(例如，抗體等)還表現(xiàn)降低或中和腎酶活性的高能力。在一些實(shí)施方式中，腎酶是人腎酶。如本文所使用，“特異性地結(jié)合至腎酶蛋白”的腎酶結(jié)合分子(例如，抗體等)意欲指結(jié)合至任何動(dòng)物的腎酶蛋白的腎酶結(jié)合分子(例如，抗體等)。在一些實(shí)施方式中，那種抗體結(jié)合至人腎酶。優(yōu)選地，腎酶結(jié)合分子(例如，抗體等)以1×10-6M或更小、更優(yōu)選地1×10-7M或更小、更優(yōu)選地1×10-8M或更小、更優(yōu)選地5×10-9M或更小、更優(yōu)選地1×10-9M或更小或甚至更優(yōu)選地3×10-10M或更小的KD結(jié)合至腎酶蛋白。術(shù)語“基本上不結(jié)合”至蛋白質(zhì)或細(xì)胞，如本文所使用的，意思是不結(jié)合至蛋白質(zhì)或細(xì)胞或者不以高親和力結(jié)合至蛋白質(zhì)或細(xì)胞，即，以大于1×106M或更大、更優(yōu)選地1×105M或更大、更優(yōu)選地1×104M或更大、更優(yōu)選地1×103M或更大、甚至更優(yōu)選地1×102M或更大的KD結(jié)合至蛋白質(zhì)或細(xì)胞。術(shù)語“KD”，如本文所使用，意欲指解離常數(shù)，其獲得自Kd與Ka的比(即，Kd/Ka)并表達(dá)為摩爾濃度(M)。腎酶結(jié)合分子(例如，抗體等)的KD值可以使用本領(lǐng)域中很好地建立的方法測(cè)定。用于測(cè)定結(jié)合分子(例如，抗體等)的KD的優(yōu)選方法通過使用表面等離子體共振，優(yōu)選地使用生物傳感器系統(tǒng)比如系統(tǒng)進(jìn)行。如本文所使用，術(shù)語對(duì)IgG抗體的“高親和力”指的是抗體對(duì)目標(biāo)結(jié)合伴侶分子具有1×10-7M或更小、更優(yōu)選地5×10-8M或更小、甚至更優(yōu)選地1×10-8M或更小、甚至更優(yōu)選地5×10-9M或更小和甚至更優(yōu)選地1×10-9M或更小的KD。但是，“高親和力”結(jié)合對(duì)于其它抗體同種型可以改變。例如，對(duì)IgM同種型的“高親和力”結(jié)合指的是抗體具有10-6M或更小、更優(yōu)選地10-7M或更小、甚至更優(yōu)選地10-8M或更小的KD。在某些實(shí)施方式中，抗體包括重鏈恒定區(qū)，比如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恒定區(qū)。優(yōu)選地，重鏈恒定區(qū)是IgG1重鏈恒定區(qū)或IgG4重鏈恒定區(qū)。而且，抗體可以包括輕鏈恒定區(qū)，κ輕鏈恒定區(qū)或λ輕鏈恒定區(qū)。優(yōu)選地，抗體包括κ輕鏈恒定區(qū)?？蛇x地，抗體蛋白可以是，例如Fab片段或單鏈Fv片段。抗腎酶抗體的生成本發(fā)明提供了結(jié)合至腎酶的組合物。本文公開的腎酶分子是一類分子，其包括與本文公開的其它多肽具有高和/或顯著序列同一性的那些分子。更具體地，推定的腎酶將與具有序列SEQIDNO:49或51的核酸共享至少大約40％序列同一性。更優(yōu)選地，編碼腎酶的核酸與本文公開的SEQIDNO:49或51具有至少大約45％同一性、或至少大約50％同一性、或至少大約55％同一性,、或至少大約60％同一性、或至少大約65％同一性、或至少大約70％同一性、或至少大約75％同一性、或至少大約80％同一性、或至少大約85％同一性、或至少大約90％同一性、或至少大約95％同一性、或至少大約98％、或至少大約99％序列同一性。甚至更優(yōu)選地，核酸是SEQIDNO:49或51或93或95。術(shù)語“腎酶”還包括腎酶同種型。腎酶基因包括在人基因組的10號(hào)染色體中橫跨310188bp的9個(gè)外顯子。本文公開的腎酶克隆(SEQIDNO:49，GenBank登錄號(hào)：BC005364)是包含外顯子1、2、3、4、5、6、8的基因。存在至少兩種額外可選-剪接形式的腎酶蛋白，如人基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中所示的。一種可選剪接形式包含外顯子1、2、3、4、5、6、9，在人基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中通過克隆鑒定GenBank登錄號(hào)AK002080和NMJ)18363，其序列通過引用明確地并入本文。其它可選剪接形式包含外顯子5、6、7、8，在人基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中通過克隆鑒定為GenBank登錄號(hào)BX648154，其序列通過引用明確地并入本文。除非另有說明，“腎酶”包括所有已知的腎酶(例如，大鼠腎酶和人腎酶)，和待發(fā)現(xiàn)的腎酶，包括但不限于人腎酶和黑猩猩腎酶，其具有本文公開的腎酶的特性和/或物理特征。另外，推定的腎酶與具有序列SEQIDNO:8或50的多肽共享至少大約60％序列同一性。更優(yōu)選地，腎酶與本文公開的SEQIDNO:8或50具有至少大約45％同一性、或至少大約50％同一性、或至少大約55％同一性、或至少大約60％同一性、或至少大約65％同一性、或至少大約70％同一性、或至少大約75％同一性、或至少大約80％同一性、或至少大約85％同一性、或至少大約90％同一性、或至少大約95％同一性、或至少大約98％、或至少大約99％序列同一性。甚至更優(yōu)選地，腎酶多肽具有SEQIDNO:8或50或92或94的氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的抗體可以通過使用衍生自腎酶序列的肽生成以免疫動(dòng)物，由此動(dòng)物產(chǎn)生針對(duì)免疫原的抗體。示例性的免疫原包括衍生自腎酶的肽。即，具有腎酶序列的片段的肽可以在本發(fā)明中使用。肽可以以多種方式——包括作為重組肽表達(dá)、作為更大的多肽表達(dá)——產(chǎn)生并且被酶促地或化學(xué)地切割?？蛇x地，它們可以合成地產(chǎn)生，如本領(lǐng)域中已知的。如用于生成本發(fā)明的親和試劑的優(yōu)選的肽在表1(SEQIDNO:1-7)中可見。本發(fā)明的抗腎酶抗體可以任選地通過多種技術(shù)產(chǎn)生，包括Kohler和Milstein(1975)Nature256:495的標(biāo)準(zhǔn)體細(xì)胞雜交技術(shù)(雜交瘤方法)。在雜交瘤方法中，小鼠或其它適合的宿主動(dòng)物，比如倉(cāng)鼠或獼猴，如本文描述的進(jìn)行免疫以引起產(chǎn)生或者能夠產(chǎn)生抗體的淋巴細(xì)胞，所述抗體將特異性地結(jié)合至用于免疫的蛋白質(zhì)?？蛇x地，淋巴細(xì)胞可以在體外被免疫。然后，使用適合的融合劑比如聚乙二醇將淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合以形成雜交瘤細(xì)胞(Goding,MonoclonalAntibodies:PrinciplesandPractice,pp.59-103(AcademicPress,1986))。使用雜交瘤技術(shù)產(chǎn)生和篩選特異性抗體的方法在本領(lǐng)域中是常規(guī)的和公知的。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了生成單克隆抗體的方法以及通過該方法——其包括培養(yǎng)分泌本發(fā)明的抗體的雜交瘤細(xì)胞——產(chǎn)生的抗體，其中，優(yōu)選地，雜交瘤通過如下過程生成：將從利用本發(fā)明的多肽或肽免疫的小鼠或兔或其它物種分離的脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合，然后篩選由融合產(chǎn)生的雜交瘤找出分泌能夠結(jié)合本發(fā)明的多肽的抗體的雜交瘤克隆。簡(jiǎn)言之，小鼠可以利用腎酶多肽或其肽免疫。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，腎酶多肽或其肽與佐劑一起施用以刺激免疫應(yīng)答。這樣的佐劑包括完全或不完全弗氏佐劑、RIBI(胞壁酰二肽)或ISCOM(免疫刺激復(fù)合物)。這樣的佐劑可以通過將多肽隔絕在局部沉積物(deposit)中而防止多肽快速處置，或者它們可以包含刺激宿主分泌對(duì)于免疫系統(tǒng)的巨噬細(xì)胞和其它成分具有趨化性的因子的物質(zhì)。優(yōu)選地，如果多肽正被施用，則免疫安排將包括在數(shù)周內(nèi)分散地兩次或多次施用多肽?？蛇x地，兔可以利用腎酶多肽或其肽免疫。在該實(shí)施方式中，全長(zhǎng)腎酶蛋白或衍生自腎酶的肽可以被用作免疫原。在本發(fā)明中使用的腎酶可以采用多種形式。例如，它們可以包括純化的腎酶蛋白或其片段、重組產(chǎn)生的腎酶或其片段。在一些實(shí)施方式中，腎酶是人腎酶。當(dāng)使用重組腎酶時(shí)，其可以在真核或原核細(xì)胞中產(chǎn)生，如本領(lǐng)域中已知的。另外的免疫原包括衍生自腎酶的肽。即，具有腎酶序列的片段的肽可以在本發(fā)明中使用。肽可以以多種方式——包括作為重組肽表達(dá)、作為更大的多肽表達(dá)——產(chǎn)生并且被酶促地或化學(xué)地切割。可選地，它們可以合成地產(chǎn)生，如本領(lǐng)域中已知的。如用于生成本發(fā)明的親合試劑的優(yōu)選的肽在表1(SEQIDNO:1-7)中可見。人腎酶的全長(zhǎng)氨基酸序列在SEQIDNO:8中描繪，其中已知的多態(tài)性是可能的，如所指示的(與SEQIDNO.92比較)。腎酶-2的氨基酸序列在SEQIDNO:50中可見，再次，其中已知的多態(tài)性是可能的，如所指示的(與SEQIDNO.94比較)。應(yīng)當(dāng)領(lǐng)會(huì)存在其它多態(tài)性。這些也包括在腎酶的定義中。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明的腎酶結(jié)合分子特異性地結(jié)合至SEQIDNO:1-7、8、50、92、94和其片段中的至少一個(gè)?？鼓I酶抗體還可以任選地通過免疫能夠產(chǎn)生人抗體的所有組成成分的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物(例如，小鼠、大鼠、倉(cāng)鼠、非人靈長(zhǎng)類等)生成，如本文描述的和/或本領(lǐng)域中已知的。產(chǎn)生人抗腎酶抗體的細(xì)胞可以使用適合的方法比如本文描述的方法從這樣的動(dòng)物分離并無限增殖。可選地，抗體編碼序列可以通過本文教導(dǎo)的方法和本領(lǐng)域中已知的那些方法進(jìn)行克隆，引入適合的載體并用于轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞用于抗體的表達(dá)和分離。使用在它們的種系構(gòu)型中攜帶人免疫球蛋白(Ig)基因座的轉(zhuǎn)基因小鼠提供了針對(duì)多種目標(biāo)的高親和力全人單克隆抗體的分離，這些目標(biāo)包括正常人免疫系統(tǒng)對(duì)其能耐受的人自身抗原。(Lonberg,N.等，美國(guó)專利號(hào)5,569,825，美國(guó)專利號(hào)6,300,129和1994，Nature368:856-9；Green等，1994,NatureGenet.7:13-21；Green,L.&Jakobovits,1998,Exp.Med.188:483-95；Lonberg,N.andHuszar,D.,1995,Int.Rev.Immunol.13:65-93；Kucherlapati等，美國(guó)專利號(hào)6,713,610；Bruggemann,M.等，1991,Eur.J.Immunol.21:1323-1326；Fishwild,D.等，1996,Nat.Biotechnol.14:845-851；Mendez,M.等，1997,Nat.Genet.15:146-156；Green,L.,1999,J.Immunol.Methods231:11-23；Yang,X.等，1999,CancerRes.59:1236-1243；Bruggemann,M.andTaussig,MJ.,Curr.Opin.Biotechnol.8:455-458，1997；Tomizuka等WO02043478)。在這樣的小鼠中的內(nèi)源免疫球蛋白基因座可以被破壞或缺失以消除動(dòng)物產(chǎn)生由內(nèi)源基因編碼的抗體的能力。另外，公司比如Abgenix,Inc.(Freemont,Calif.)和Medarex(SanJose,Calif.)可以使用如本文別處描述的技術(shù)參與提供針對(duì)選定靶結(jié)合伴侶分子(例如，抗原等)的人抗體。在另一個(gè)實(shí)施方式中，人抗體選自噬菌體文庫(kù)，其中所述噬菌體包括人免疫球蛋白基因并且該文庫(kù)表達(dá)人抗體結(jié)合結(jié)構(gòu)域，如，例如，單鏈抗體(scFv)，如Fab，或一些其它表現(xiàn)成對(duì)或未成對(duì)抗體可變區(qū)的構(gòu)建體(Vaughan等NatureBiotechnology14:309-314(1996):Sheets等PITAS(USA)95:6157-6162(1998))；HoogenboomandWinter,J.Mol.Biol.,227:381(1991)；Marks等J.Mol.Biol.,222:581(1991))。本發(fā)明的人單克隆抗體還可以使用用于篩選人免疫球蛋白基因的文庫(kù)的噬菌體展示方法制備。這樣的用于分離人抗體的噬菌體展示方法在本領(lǐng)域中是建立的。參見例如：Ladner等的美國(guó)專利號(hào)5,223,409；5,403,484；和5,571,698；Dower等的美國(guó)專利號(hào)5,427,908和5,580,717；McCafferty等的美國(guó)專利號(hào)5,969,108和6,172,197；和Griffiths等的美國(guó)專利號(hào)5,885,793；6,521,404；6,544,731；6,555,313；6,582,915和6,593,081。免疫原性抗原的制備和單克隆抗體生產(chǎn)可以使用任何適合的技術(shù)比如重組蛋白生產(chǎn)執(zhí)行。免疫原性抗原可以以純化蛋白或包括全細(xì)胞或細(xì)胞或組織提取物的蛋白混合物的形式施用至動(dòng)物，或者抗原可以在動(dòng)物的身體中從編碼所述抗原或其部分的核酸從頭(denovo)形成。本發(fā)明的分離的核酸可以使用(a)重組方法，(b)合成技術(shù)，(c)純化技術(shù)，或其組合制備，如本領(lǐng)域中公知的。編碼單克隆抗體的DNA容易使用本領(lǐng)域中已知的方法分離和測(cè)序(例如，通過使用能夠特異性地結(jié)合至編碼鼠科抗體的重鏈和輕鏈的基因的寡核苷酸探針)。在產(chǎn)生雜交瘤時(shí)，這樣的細(xì)胞可以充當(dāng)這樣的DNA的來源?？蛇x地，使用其中編碼序列和翻譯產(chǎn)物被連接的展示技術(shù)，比如噬菌體或核糖體展示文庫(kù)，簡(jiǎn)化黏合劑和核酸的選擇。在噬菌體選擇之后，來自噬菌體的抗體編碼區(qū)可以被分離并用于生成完整抗體，包括人抗體，或任何其它期望的結(jié)合片段，并在任何期望的宿主中表達(dá)，所述宿主包括哺乳動(dòng)物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、植物細(xì)胞、酵母和細(xì)菌。人源化抗體本發(fā)明進(jìn)一步提供了結(jié)合人腎酶的人源化免疫球蛋白(或抗體)。免疫球蛋白的人源化形式具有基本上來自人免疫球蛋白(稱為受體免疫球蛋白)的可變框架區(qū)(一個(gè)或多個(gè))和基本上來自特異性地結(jié)合腎酶的非人mAb的CDR。恒定區(qū)(一個(gè)或多個(gè))——如果存在的話，也基本上來自人免疫球蛋白。人源化抗體表現(xiàn)對(duì)腎酶的至少大約10-6M(1μM)、大約10-7M(100nM)或更小的KD。人源化抗體的結(jié)合親和力與它們被衍生自的小鼠抗體的結(jié)合親和力相比更大或更小。為了影響親和力的改變，改善人源化抗體對(duì)腎酶的親和力，可以在CDR殘基或人殘基中進(jìn)行置換。產(chǎn)生結(jié)合至腎酶的人源化抗體的來源優(yōu)選地是1D-28-4、1D-37-10、1F-26-1、1F42-7或3A-5-2小鼠抗體，其生成、分離和表征在本文中提供的實(shí)施例中描述，但是也可以使用其它小鼠抗體，其與1D-28-4、1D-37-10、1F-26-1、1F42-7或3A-5-2小鼠抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合至腎酶。序列表中提出的鑒定的CDR可以是人源化過程的起始點(diǎn)。例如，下面的氨基酸序列(和其相應(yīng)的核酸序列)中的任一個(gè)或多個(gè)可以是人源化過程的起始點(diǎn)：(a)重鏈可變區(qū)CDR1，其包括選自SEQIDNO:11、19、27、35和43的氨基酸序列；(b)重鏈可變區(qū)CDR2，其包括選自SEQIDNO:12、20、28、36和44的氨基酸序列；(c)重鏈可變區(qū)CDR3，其包括選自SEQIDNO:13、21、29、37和45的氨基酸序列；(d)輕鏈可變區(qū)CDR1，其包括選自SEQIDNO:14、22、30、38和46的氨基酸序列；(e)輕鏈可變區(qū)CDR2，其包括選自SEQIDNO:15、23、31、39和47的氨基酸序列；和(f)輕鏈可變區(qū)CDR3，其包括選自SEQIDNO:16、24、32、40和48的氨基酸序列。如果人可變結(jié)構(gòu)域框架采用與CDR來源自的小鼠可變框架相同或相似構(gòu)象，則小鼠CDR置換入人可變結(jié)構(gòu)域框架內(nèi)最可能導(dǎo)致它們正確的空間定向的保留。這通過從人抗體獲得人可變結(jié)構(gòu)域?qū)崿F(xiàn)，所述人抗體的框架序列表現(xiàn)與CDR衍生自的鼠科可變框架結(jié)構(gòu)域高度的序列同一性。重鏈和輕鏈可變框架區(qū)可以衍生自相同或不同的人抗體序列。人抗體序列可以是天然發(fā)生的人抗體的序列，衍生自人種系免疫球蛋白序列，或者可以是數(shù)種人抗體和/或種系序列的共有序列。適合的人抗體序列通過小鼠可變區(qū)的氨基酸序列與已知的人抗體序列的計(jì)算機(jī)比較鑒定。該比較對(duì)于重鏈和輕鏈單獨(dú)地執(zhí)行，但是每一種的原理是相似的。在一個(gè)實(shí)例中，抗腎酶mAb的氨基酸序列被用于詢問從公眾抗體序列數(shù)據(jù)庫(kù)匯編的人抗體數(shù)據(jù)庫(kù)。重鏈可變區(qū)可以被用于發(fā)現(xiàn)具有最高序列同一性的人可變區(qū)。輕鏈的可變區(qū)可以類似地被用于發(fā)現(xiàn)具有最高序列同一性的人可變區(qū)。對(duì)每個(gè)鼠科可變區(qū)，制備替換人可變區(qū)的CDR的DNA構(gòu)建體，在該DNA構(gòu)建體中編碼來自鼠科mAb供體的重鏈可變區(qū)之一的CDR的區(qū)被轉(zhuǎn)移至選擇的人重鏈可變序列。鼠科CDR區(qū)與人可變框架區(qū)的非天然的并列可以導(dǎo)致非天然的構(gòu)象限制，除非通過置換某些氨基酸殘基進(jìn)行糾正，否則其導(dǎo)致結(jié)合親和力的損失。如上文所注意的，本發(fā)明的人源化抗體包括基本上來自人免疫球蛋白的可變框架區(qū)(一個(gè)或多個(gè))和基本上來自小鼠免疫球蛋白的CDR。已經(jīng)鑒定了小鼠抗體的CDR和適合的人受體免疫球蛋白序列，下一步是確定來自這些成分的那些殘基——如果有的話——是否應(yīng)當(dāng)被置換以優(yōu)化得到的人源化抗體的特性。一般而言，人氨基酸殘基置換為鼠科應(yīng)當(dāng)被最小化，因?yàn)槭罂茪埢囊朐黾恿丝贵w引發(fā)人中HAMA應(yīng)答的風(fēng)險(xiǎn)?；谒鼈儗?duì)CDR構(gòu)象和/或結(jié)合至靶結(jié)合伴侶分子的可能的影響，選擇用于置換的氨基酸。這種可能的影響的研究可以通過建模——特定位置處的氨基酸特征的檢查，或特定氨基酸的置換或誘變效果的經(jīng)驗(yàn)觀察——進(jìn)行。關(guān)于經(jīng)驗(yàn)方法，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)特別便利于創(chuàng)建可以對(duì)期望的活性、結(jié)合親和力或特異性進(jìn)行篩選的變體序列的文庫(kù)。用于創(chuàng)建這樣的變體文庫(kù)的一種形式是噬菌體展示載體。可選地，可以使用其它方法變異(varigation)編碼可變結(jié)構(gòu)域內(nèi)目標(biāo)殘基的核苷酸序列來生成變體。確定是否需要進(jìn)一步置換和選擇用于置換的氨基酸殘基的另一種方法可以使用計(jì)算機(jī)建模完成。用于產(chǎn)生免疫球蛋白分子的三維圖像的計(jì)算機(jī)硬件和軟件是廣泛地可獲得的。一般而言，從免疫球蛋白鏈或其結(jié)構(gòu)域的解構(gòu)的結(jié)構(gòu)開始產(chǎn)生分子模型。將要被建模的鏈與解構(gòu)的三維結(jié)構(gòu)的鏈或結(jié)構(gòu)域進(jìn)行氨基酸序列相似性比較，并且顯示最大序列相似性的鏈或結(jié)構(gòu)域被選擇作為構(gòu)建分子模型的起始點(diǎn)。解構(gòu)的起始結(jié)構(gòu)被修改以考慮正被建模的免疫球蛋白鏈或結(jié)構(gòu)域中的實(shí)際氨基酸與起始結(jié)構(gòu)中那些之間的區(qū)別。修改的結(jié)構(gòu)然后被裝配入復(fù)合免疫球蛋白。最終，模型通過能量最小化和通過驗(yàn)證所有原子位于距離彼此適合的距離內(nèi)和驗(yàn)證鍵長(zhǎng)和鍵角在化學(xué)可接受限制內(nèi)來改善。通常，在人源化抗體中的CDR區(qū)是基本上相同的，和更通常地，與它們衍生自的小鼠抗體中相應(yīng)的CDR區(qū)基本上相同。雖然不是通常期望的，但是有時(shí)可能進(jìn)行CDR殘基的一種或更多種保守氨基酸置換而不明顯地影響得到的人源化免疫球蛋白的結(jié)合親和力。偶爾，CDR區(qū)的置換可以增強(qiáng)結(jié)合親和力。除了上面討論的特定氨基酸置換之外，人源化免疫球蛋白的框架區(qū)通常與它們衍生自的人抗體的框架區(qū)基本上相同，并且更通常地與其相同。當(dāng)然，框架區(qū)中的許多氨基酸對(duì)于抗體的特異性或親和力很少或沒有直接貢獻(xiàn)。因此，框架殘基的許多個(gè)別保守置換在所得到的人源化免疫球蛋白的特異性或親和力沒有顯著改變的情況下可以被容忍。由于密碼的簡(jiǎn)并性，多個(gè)氨基酸序列將編碼每個(gè)免疫球蛋白氨基酸序列。期望的核酸序列可以通過從頭(denova)固相DNA合成或者通過期望的多核苷酸的更早制備的變體的PCR誘變產(chǎn)生。編碼在本申請(qǐng)中描述的編碼抗體的所有核酸明確地包含在本發(fā)明中。如上文描述產(chǎn)生的人源化抗體的可變區(qū)段通常連接至人免疫球蛋白恒定區(qū)的至少一部分?？贵w將包含輕鏈和重鏈恒定區(qū)二者。重鏈恒定區(qū)通常包括CH1、鉸鏈、CH2、CH3，和有時(shí)CH4結(jié)構(gòu)域。人源化抗體可以包括來自任何種類抗體——包括IgM、IgG、IgD、IgA和IgE——和任何子類(同種型)——包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4——的任何類型的恒定結(jié)構(gòu)域。當(dāng)人源化抗體表現(xiàn)細(xì)胞毒活性是期望的時(shí)，恒定結(jié)構(gòu)域通常是補(bǔ)體結(jié)合恒定結(jié)構(gòu)域和該種類通常是IgG1。當(dāng)這樣的細(xì)胞毒活性不期望時(shí)，恒定結(jié)構(gòu)域可以具有IgG2種類。人源化抗體可以包括來自多于一個(gè)種類或同種型的序列。編碼人源化輕和重鏈可變區(qū)——其任選地連接至恒定區(qū)——的核酸被插入表達(dá)載體。輕和重鏈可以在相同或不同的表達(dá)載體中克隆。編碼免疫球蛋白鏈的DNA區(qū)段可操作地連接至表達(dá)載體(一種或多種)中確保免疫球蛋白多肽表達(dá)的控制序列。這種控制序列包括信號(hào)序列、啟動(dòng)子、增強(qiáng)子和轉(zhuǎn)錄終止序列(參見Queen等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA86,10029(1989)；WO90/07861；Co等，J.Immunol.148,1149(1992)，其出于所有目的通過引用以其全部被并入本文)。使用腎酶結(jié)合分子的方法考慮到本發(fā)明的腎酶結(jié)合分子(例如，抗體等)的性質(zhì)，腎酶結(jié)合分子適合作為診斷、治療和預(yù)防藥劑用于診斷、治療或預(yù)防人和動(dòng)物中腎酶相關(guān)病癥。一般而言，使用包括施用治療或預(yù)防有效量的本發(fā)明的一種或多種單克隆抗體或結(jié)合片段至易感對(duì)象或表現(xiàn)病癥的對(duì)象，已知所述病癥中腎酶活性為具有病理性后遺癥，比如腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。任何活性形式的腎酶結(jié)合分子可以被施用，包括抗體Fab和F(ab')2片段。優(yōu)選地，使用的腎酶結(jié)合分子與接受者物種相容，使得對(duì)腎酶結(jié)合分子的免疫應(yīng)答不導(dǎo)致不能接受短的循環(huán)半衰期或誘導(dǎo)對(duì)象中對(duì)腎酶結(jié)合分子的免疫應(yīng)答。優(yōu)選地，施用的腎酶結(jié)合分子表現(xiàn)一些次級(jí)功能比如結(jié)合至對(duì)象的Fc受體和ADCC機(jī)制的激活。個(gè)體的治療可以包括施用治療有效量的本發(fā)明的腎酶結(jié)合分子。腎酶結(jié)合分子可以在如下文描述的試劑盒中提供。腎酶結(jié)合分子可以作為混合物被使用或施用，例如以等量，或者單獨(dú)地，順序提供，或者一次全部施用。在給患者提供腎酶結(jié)合分子中，施用的藥劑的劑量將根據(jù)這些因素比如患者的年齡、體重、身高、性別、一般身體狀況、既往病史等改變。一般而言，如果施用全身劑量的腎酶結(jié)合分子，給接受者提供如下范圍中的腎酶結(jié)合分子的劑量是期望的：大約1ng/kg-100ng/kg、100ng/kg-500ng/kg、500ng/kg-1μg/kg、1μg/kg-100μg/kg、100μg/kg-500μg/kg、500μg/kg-1mg/kg、1mg/kg-50mg/kg、50mg/kg-100mg/kg、100mg/kg-500mg/kg(接受者的體重)，但是更低或更高劑量可以被施用。低至大約1.0mg/kg的劑量可以被預(yù)期顯示一些效力。優(yōu)選地，大約5mg/kg是可接受的劑量，但是多至大約50mg/kg的劑量水平對(duì)于治療用途而言也是尤其優(yōu)選的。可選地，可以給出具體量的腎酶結(jié)合分子的施用，其不基于患者的體重，比如1μg-100μg、1mg-100mg或1gm-100gm的范圍中的量。例如，位點(diǎn)特異性施用可以至體室或體腔，比如關(guān)節(jié)內(nèi)(intrarticular)、支氣管內(nèi)、腹內(nèi)、囊內(nèi)、軟骨內(nèi)、腔內(nèi)、體腔內(nèi)、小腦內(nèi)(intracelebellar)、腦室內(nèi)、結(jié)腸內(nèi)、頸管內(nèi)、胃內(nèi)、肝內(nèi)、心肌內(nèi)、骨骼內(nèi)(intraosteal)、骨盆內(nèi)、心包內(nèi)(intrapericardiac)、腹膜內(nèi)、胸膜內(nèi)、前列腺內(nèi)、肺內(nèi)、直腸內(nèi)、腎內(nèi)、視網(wǎng)膜內(nèi)、脊柱內(nèi)、滑膜內(nèi)、胸廓內(nèi)、子宮內(nèi)、膀胱內(nèi)、病灶內(nèi)(intralesional)、陰道、直腸、口腔、舌下、鼻內(nèi)、眼科或經(jīng)皮方式。腎酶結(jié)合分子組合物可以具體地以液體溶液或懸浮液的形式制備用于腸胃外(皮下、肌肉內(nèi)或靜脈內(nèi))或任何其它施用；具體地以半固體形式比如，但不限于，乳劑和栓劑制備用于陰道或直腸施用；比如，但不限于，以片劑或膠囊劑的形式制備用于口腔或舌下施用；或鼻內(nèi)，比如，但不限于，粉末、滴鼻劑或氣溶膠或某些劑的形式；或眼(ophthalmically)，比如，但不限于滴眼劑；或用于治療牙科疾病；或經(jīng)皮(transdermally)，比如，但不限于，凝膠、藥膏、洗滌劑、懸浮液或貼劑遞送系統(tǒng)，其具有化學(xué)增強(qiáng)劑比如二甲基亞砜以修飾皮膚結(jié)構(gòu)或增加在經(jīng)皮貼劑中藥物濃度，或者具有氧化劑，該氧化劑能夠施用包含蛋白質(zhì)和肽的制劑至皮膚上(WO98/53847)，或者施用電場(chǎng)以創(chuàng)建瞬時(shí)傳輸途徑比如電穿孔，或以增加帶電藥物通過皮膚的移動(dòng)性比如離子電滲療法，或者施用超聲波比如超聲促滲(美國(guó)專利號(hào)4,309,989和4,767,402)。以類似途徑，本發(fā)明的腎酶結(jié)合分子的另一種治療用途是使用針對(duì)本單克隆抗體之一培養(yǎng)的抗獨(dú)特型抗體主動(dòng)免疫患者。利用模擬表位結(jié)構(gòu)的抗獨(dú)特型進(jìn)行免疫可以引起主動(dòng)抗腎酶應(yīng)答(Linthicum,D.S和Farid,N.R.,Anti-Idiotypes,Receptors,andMolecularMimicry(1988),pp1-5和285-300)。本發(fā)明的腎酶結(jié)合分子可以根據(jù)已知方法配制以制備藥學(xué)上有用的組合物，由此這些材料或它們的功能性衍生物與具有藥學(xué)上可接受的載體媒介的混合物結(jié)合。例如，在Remington'sPharmaceuticalSciences(16thed.,Osol,A.ed.,MackEastonPa.(1980))中描述了適合的媒介或其它制劑，包括其它人蛋白，例如，人血清白蛋白。為了形成適合于有效施用的藥學(xué)上可接受的組合物，這樣的組合物將包含有效量的上述化合物以及適合量的載體媒介。另外的制藥方法可以被采用以控制作用的持續(xù)時(shí)間?？蒯屩破房梢酝ㄟ^使用聚合物以復(fù)合(complex)或吸收化合物來實(shí)現(xiàn)。通過控釋制品控制作用的持續(xù)時(shí)間的另一種可能的方法是將本發(fā)明的化合物摻入聚合物材料的顆粒，比如聚酯、聚氨基酸、水凝膠、聚(乳酸)或乙烯醋酸乙烯酯共聚物?？蛇x地，代替將這些藥劑摻入聚合物顆粒，可能的是截留這些材料在例如界面聚合制備的微囊劑中，例如，分別地羥甲基纖維素或明膠微囊劑和聚(甲基丙烯酸甲酯)微囊劑，或者在膠體藥物遞送系統(tǒng)中，例如，脂質(zhì)體、白蛋白微球體、微乳劑、納米顆粒和納米膠囊或在微乳劑中。治療可以以單次劑量安排，或者優(yōu)選地多次劑量安排進(jìn)行，其中初次療程可以具有1-10個(gè)單獨(dú)的劑量，然后在維持和/或加強(qiáng)應(yīng)答需要的隨后時(shí)間間隔下給予其它劑量，例如，在1-4個(gè)月時(shí)給予第二劑量，并且如果需要，在幾個(gè)月之后給予隨后的劑量(一個(gè)或多個(gè))。適合的治療安排的實(shí)例包括：(i)0、1個(gè)月和6個(gè)月，(ii)0、7天和1個(gè)月，(iii)0和1個(gè)月，(iv)0和6個(gè)月，或者足以引起預(yù)期為降低疾病癥狀或降低疾病的嚴(yán)重性的期望應(yīng)答的其它安排。本發(fā)明還提供了對(duì)于實(shí)行本發(fā)明有用的試劑盒。本試劑盒包括含有上述抗體或者與上述抗體聯(lián)合包裝的第一容器。該試劑盒還包括另一種容器，其含有對(duì)于實(shí)行本發(fā)明必需的或者便于實(shí)施本發(fā)明的溶液或者與該溶液聯(lián)合包裝。該容器可以由玻璃、塑料或者箔制成，并且可以是管形瓶、瓶、小藥袋、管、袋等。該試劑盒還包含書面信息，比如用于實(shí)行本發(fā)明的程序或者分析信息，比如包含在第一容器工具中的試劑的量。容器還可以連同書面信息在另一種容器裝置例如盒或袋中。本發(fā)明的又另一方面是用于檢測(cè)生物學(xué)樣本中的腎酶的試劑盒。該試劑盒包括持有結(jié)合腎酶的表位的一種或多種腎酶結(jié)合分子的容器和出于結(jié)合至腎酶以形成復(fù)合物并檢測(cè)該復(fù)合物的信息使得該復(fù)合物的存在或不存在與樣本中腎酶的存在或不存在相關(guān)聯(lián)的使用腎酶結(jié)合分子的說明書。容器的實(shí)例包括允許對(duì)多個(gè)樣本中的腎酶同時(shí)檢測(cè)的多孔板。組合療法本發(fā)明的腎酶結(jié)合分子組合物可以與另一種治療性處理或藥劑組合使用以治療疾病或紊亂。例如，本發(fā)明的腎酶結(jié)合分子可以被單獨(dú)施用，或者與一種或多種治療有效的藥劑或者處理組合施用。其它治療有效的藥劑可以綴合至本發(fā)明的腎酶結(jié)合分子，摻入本發(fā)明的腎酶結(jié)合分子的同一組合物，或者可以作為單獨(dú)的組合物施用。其它治療性藥劑或處理可以在施用本發(fā)明的抗體或者相關(guān)化合物之前、期間和/或之后施用。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明的腎酶結(jié)合分子與一種或多種其它治療性藥劑或處理共同施用。在其它實(shí)施方式中，本發(fā)明的腎酶結(jié)合分子獨(dú)立于施用一種或多種其它治療性藥劑或處理進(jìn)行施用。例如，本發(fā)明的腎酶結(jié)合分子首先施用，然后施用一種或多種其它治療性藥劑或處理?？蛇x地，一種或多種其它治療性藥劑首先施用，然后施用本發(fā)明的腎酶結(jié)合分子。作為另一個(gè)實(shí)例，處理(例如，外科手術(shù)、放射等)首先實(shí)行，然后施用本發(fā)明的腎酶結(jié)合分子。其它治療有效的藥劑/處理包括外科手術(shù)、抗瘤劑(包括化療劑和放射)、抗血管生成劑、針對(duì)其它靶標(biāo)的抗體、小分子、光動(dòng)力學(xué)療法、免疫療法、免疫力增強(qiáng)療法、細(xì)胞毒素劑、細(xì)胞因子、趨化因子、生長(zhǎng)抑制劑、抗激素劑、激酶抑制劑、保心藥(cardioprotectant)、免疫刺激劑、免疫抑制劑、和促進(jìn)血液細(xì)胞增殖的藥劑。在一個(gè)實(shí)施方式中，如本文所使用，“另一種治療性藥劑”是第二、有區(qū)別的治療性藥劑或者抗癌藥，即，“除了”本發(fā)明的腎酶結(jié)合分子之外的治療性藥劑或者抗癌藥。任何二次治療性藥劑可以與本發(fā)明的療法組合使用。而且，二次治療性藥劑或者“第二抗癌藥”可以以實(shí)現(xiàn)累加效應(yīng)、或大于累加效應(yīng)和潛在的協(xié)同效應(yīng)的觀點(diǎn)根據(jù)下面的指導(dǎo)進(jìn)行選擇。為了實(shí)踐組合的抗腫瘤療法，將本發(fā)明的腎酶結(jié)合分子與另一種即第二、有區(qū)別的抗癌藥組合，以在動(dòng)物或患者內(nèi)有效產(chǎn)生它們的組合抗腫瘤作用的方式施用給動(dòng)物或患者。該藥劑將因此以有效的量和有效的時(shí)間段進(jìn)行提供，以導(dǎo)致在腫瘤或腫瘤脈管系統(tǒng)內(nèi)它們的組合的或同時(shí)的存在和在腫瘤環(huán)境中它們的組合作用。為了實(shí)現(xiàn)該目標(biāo)，本發(fā)明的腎酶結(jié)合分子和第二、有區(qū)別的抗癌藥可以基本上同時(shí)地、以單一組合物或者作為使用不同施用途徑的兩個(gè)有區(qū)別的組合物施用至動(dòng)物?？蛇x地，本發(fā)明的腎酶結(jié)合分子可以領(lǐng)先或落后第二、有區(qū)別的抗癌藥達(dá)例如范圍在數(shù)分鐘至數(shù)周的間隔。在其中本發(fā)明的腎酶結(jié)合分子和第二、有區(qū)別的抗癌藥被單獨(dú)地應(yīng)用至動(dòng)物的某些實(shí)施方式中，將確保顯著的時(shí)間段在每次遞送的時(shí)間期間不過期，使得每種藥劑將仍然能夠?qū)δ[瘤發(fā)揮有利組合作用。在這樣的例子中，預(yù)期腫瘤將與兩種藥物在彼此之間大約5分鐘至大約一周之內(nèi)，并且更優(yōu)選地，在彼此之間大約12-72小時(shí)內(nèi)接觸，僅大約12-48小時(shí)的延遲時(shí)間為最優(yōu)選的。用于單獨(dú)定時(shí)組合療法的二次治療性藥劑可以基于某些標(biāo)準(zhǔn)選擇，包括本文別處討論的那些。但是，如果需要，用于選擇之前或隨后施用的一種或多種第二、有區(qū)別的抗癌藥的偏好不排除其以基本上同時(shí)施用的應(yīng)用。第二、有區(qū)別的抗癌藥選擇在本發(fā)明的初次治療性藥劑“之前”施用，并設(shè)計(jì)來實(shí)現(xiàn)增加的和潛在的協(xié)同效應(yīng)。選擇在本發(fā)明的初次治療性藥劑“之后”施用并設(shè)計(jì)來實(shí)現(xiàn)增加的和潛在的協(xié)同效應(yīng)的第二、有區(qū)別的抗癌藥包括受益于初次治療性藥劑的作用的藥劑。因此，用于隨后施用的有效的第二、有區(qū)別的抗癌藥包括抗血管生成劑，其抑制轉(zhuǎn)移；靶向壞死腫瘤細(xì)胞的藥劑，比如對(duì)細(xì)胞內(nèi)結(jié)合伴侶分子——其變得體內(nèi)惡性腫瘤細(xì)胞可接近——特異的抗體(美國(guó)專利號(hào)5,019,368、4,861,581和5,882,626，每個(gè)通過引用明確地并入本文)；化療劑；和抗腫瘤細(xì)胞免疫連接物，其攻擊任何腫瘤細(xì)胞。本發(fā)明的腎酶結(jié)合分子還可以與癌癥免疫療法組合施用。癌癥免疫療法可以是如此療法，其被設(shè)計(jì)以引起針對(duì)對(duì)象癌細(xì)胞的體液免疫應(yīng)答，或者針對(duì)對(duì)象癌細(xì)胞的細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，或者針對(duì)對(duì)象癌細(xì)胞的體液應(yīng)答和細(xì)胞介導(dǎo)的應(yīng)答的組合。在與本發(fā)明的腎酶結(jié)合分子的組合中有用的癌癥免疫療法的非限制性實(shí)例包括癌癥疫苗、DNA癌癥疫苗、繼承性細(xì)胞療法、繼承性免疫療法、CART細(xì)胞療法、抗體、免疫力增強(qiáng)化合物、細(xì)胞因子、白細(xì)胞介素(例如，IL-2等)、干擾素(IFN-α等)和限制點(diǎn)抑制劑(例如，PD-1抑制劑、CTLA-4抑制劑等)。在一些情況下，可以期望的是顯著地延長(zhǎng)治療的時(shí)期，其中在各自的施用期間過去(lapse)數(shù)天(2、3、4、5、6或7)、數(shù)周(1、2、3、4、5、6、7或8)或甚至數(shù)月(1、2、3、4、5、6、7或8)。這在如下情況下將是有利的，其中一種治療意欲基本上破壞腫瘤，比如本發(fā)明的初次治療性藥劑，和另一種治療意欲阻止微轉(zhuǎn)移或腫瘤再生長(zhǎng)，比如抗血管生成劑的施用。但是，為了允許有效的傷口愈合，抗血管生成劑應(yīng)當(dāng)在外科手術(shù)之后謹(jǐn)慎的時(shí)間(carefultime)時(shí)施用?？寡苌蓜┤缓罂梢员皇┯贸掷m(xù)患者終生。還設(shè)想將利用本發(fā)明的腎酶結(jié)合分子或第二、有區(qū)別的抗癌藥的多于一個(gè)施用。本發(fā)明的腎酶結(jié)合分子和第二、有區(qū)別的抗癌藥可以可交換地施用，在交替的天或周時(shí)施用；或者可以給予一系列一種藥劑治療，然后給予一系列另一種治療。在任何事件中，為了實(shí)現(xiàn)使用組合療法腫瘤消退，需要的所有是以發(fā)揮抗腫瘤作用有效的組合量遞送兩種藥劑，而不考慮施用次數(shù)?；熕幬锟梢耘c本發(fā)明的腎酶抑制劑組合使用?；熕幬锟梢詺⑺勒鲋车哪[瘤細(xì)胞，增強(qiáng)由總體治療造成的壞死區(qū)域。本發(fā)明的一方面提供了使用本發(fā)明的腎酶抑制劑治療或預(yù)防癌癥的方法。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解治療或預(yù)防患者中的癌癥非限制性包括殺死和破壞癌細(xì)胞，以及降低癌細(xì)胞的增殖或細(xì)胞分裂速率。本領(lǐng)域技術(shù)人員還將理解癌細(xì)胞可以非限制性是原發(fā)性癌細(xì)胞、癌癥干細(xì)胞、轉(zhuǎn)移性癌細(xì)胞。下面是可以由公開的方法和組合物治療的癌癥的非限制性實(shí)例：急性成淋巴細(xì)胞性白血??；急性髓性白血?。荒I上腺皮質(zhì)癌；腎上腺皮質(zhì)癌，兒童；闌尾癌(AppendixCancer)；基底細(xì)胞癌；膽管癌，肝外的；膀胱癌；骨癌；骨肉瘤和惡性纖維組織細(xì)胞瘤；腦干神經(jīng)膠質(zhì)瘤，兒童；腦瘤，成年人；腦瘤，腦干神經(jīng)膠質(zhì)瘤，兒童；腦瘤，中樞神經(jīng)系統(tǒng)非典型畸胎/橫紋肌樣瘤，兒童；中樞神經(jīng)系統(tǒng)胚胎瘤；小腦星形細(xì)胞瘤；大腦星形細(xì)胞瘤/惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤；顱咽管瘤；室管膜母細(xì)胞瘤；室管膜瘤；成神經(jīng)管細(xì)胞瘤；髓上皮瘤；中度分化松果體實(shí)質(zhì)腫瘤(PinealParenchymalTumorsofintermediateDifferentiation)；幕上原始神經(jīng)外胚層腫瘤(SupratentorialPrimitiveNeuroectodermalTumor)和松果體母細(xì)胞瘤；視通路和下丘腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤；腦和脊髓瘤；乳腺癌；支氣管腫瘤；伯基特淋巴瘤；類癌瘤；類癌瘤，胃腸道；中樞神經(jīng)系統(tǒng)非典型畸胎/橫紋肌樣瘤；中樞神經(jīng)系統(tǒng)胚胎瘤；中樞神經(jīng)系統(tǒng)淋巴瘤；小腦星形細(xì)胞瘤大腦星形細(xì)胞瘤/惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤，兒童；宮頸癌；脊索瘤，兒童；慢性淋巴細(xì)胞白血??；慢性粒細(xì)胞白血病；慢性骨髓增生性疾??；結(jié)腸癌；結(jié)腸直腸癌；顱咽管瘤；皮膚T細(xì)胞淋巴瘤；食道癌；尤因氏家族腫瘤(EwingFamilyofTumor)；性腺外生殖細(xì)胞瘤；肝外膽管癌；眼癌，眼內(nèi)黑素瘤；眼癌，視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤；膽囊癌；胃部(胃)癌；胃腸道類癌瘤；胃腸道間質(zhì)瘤(GIST)；生殖細(xì)胞瘤，顱外；生殖細(xì)胞瘤，性腺外；生殖細(xì)胞瘤，卵巢；妊娠滋養(yǎng)層腫瘤；神經(jīng)膠質(zhì)瘤；神經(jīng)膠質(zhì)瘤，兒童腦干；神經(jīng)膠質(zhì)瘤，兒童大腦星形細(xì)胞瘤；神經(jīng)膠質(zhì)瘤，兒童視通路和下丘腦；毛細(xì)胞白血?。活^頸癌；肝細(xì)胞(肝)癌；組織細(xì)胞增多癥，朗格罕細(xì)胞；何杰金淋巴瘤；下咽癌；下丘腦和視通路神經(jīng)膠質(zhì)瘤；眼內(nèi)黑素瘤；胰島細(xì)胞瘤；腎(腎細(xì)胞)癌；郎格罕細(xì)胞組織細(xì)胞增多癥；喉癌；白血病，急性成淋巴細(xì)胞性；白血病，急性髓性；白血病，慢性淋巴細(xì)胞性；白血病，慢性粒細(xì)胞性；白血病，毛細(xì)胞；嘴唇和口腔癌；肝癌；肺癌，非小細(xì)胞；肺癌，小細(xì)胞；淋巴瘤，AIDS相關(guān)的；淋巴瘤，伯基特；淋巴瘤，皮膚T細(xì)胞；淋巴瘤，何杰金；淋巴瘤，非何杰金；淋巴瘤，原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)；巨球蛋白血癥，瓦爾登斯特倫病(Waldenstrom)；骨骼的惡性纖維組織細(xì)胞瘤(Histiocvtoma)和骨肉瘤；成神經(jīng)管細(xì)胞瘤；黑素瘤；黑素瘤，眼內(nèi)(眼)；梅克爾細(xì)胞癌；間皮瘤；具有隱性原發(fā)性的轉(zhuǎn)移性鱗狀頸部癌(MetastaticSquamousNeckcancerwithOccultPrimary)；嘴癌(mouthcancer)；多發(fā)性內(nèi)分泌腺瘤形成綜合征，(兒童)；多發(fā)性骨髓瘤/漿細(xì)胞瘤；真菌病；蕈樣病(Fungoide)；骨髓發(fā)育不良綜合征；骨髓發(fā)育不良/骨髓增生性疾病；粒細(xì)胞性白血病，慢性；髓細(xì)胞性白血病，成年人急性；髓細(xì)胞性白血病，兒童急性；骨髓瘤，多發(fā)性；骨髓增生性疾病，慢性；鼻腔和副鼻竇癌(NasalCavityandParanasalSinusCancer)；鼻咽癌；成神經(jīng)細(xì)胞瘤；非小細(xì)胞肺癌；口癌(oralcancer)；口腔癌；口咽癌；骨肉瘤和骨骼的惡性纖維組織細(xì)胞瘤；卵巢癌；卵巢上皮癌；卵巢生殖細(xì)胞腫瘤；卵巢低度潛在惡性腫瘤(OvarianLowMalignantPotentialTumor)；胰腺癌；胰腺癌，胰島細(xì)胞腫瘤；乳頭狀瘤??；甲狀旁腺癌；陰莖癌；咽喉癌；嗜鉻細(xì)胞瘤；副神經(jīng)節(jié)瘤；中度分化的松果體實(shí)質(zhì)腫瘤；松果體母細(xì)胞瘤和幕上原始神經(jīng)外胚層腫瘤；垂體瘤；漿細(xì)胞瘤(PlasmaCeltNeoplasm)/多發(fā)性骨髓瘤；胸膜肺胚細(xì)胞瘤；原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)淋巴瘤；前列腺癌；直腸癌；腎細(xì)胞(腎)癌；腎盂及輸尿管移行細(xì)胞癌；涉及15號(hào)染色體上的NUT基因的呼吸道癌；視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤；橫紋肌肉瘤；唾腺癌；肉瘤，尤因氏家族腫瘤；肉瘤，卡波西；肉瘤，軟組織；肉瘤，子宮；賽塞利綜合征；皮膚癌(非黑素瘤)；皮膚癌(黑素瘤)；皮癌(SkinCarcinoma)，梅克爾細(xì)胞；小細(xì)胞肺癌；小腸癌；軟組織肉瘤；鱗狀細(xì)胞癌，具有隱性原發(fā)性的鱗狀頸部癌，轉(zhuǎn)移性；胃(胃部)癌；幕上原始神經(jīng)外胚層腫瘤；T細(xì)胞淋巴瘤，表皮的；睪丸癌；喉癌；胸腺瘤和胸腺癌；甲狀腺癌；腎盂和輸尿管的移行細(xì)胞癌；滋養(yǎng)層腫瘤，妊娠期；尿道癌；子宮癌，子宮內(nèi)膜；子宮肉瘤；陰道癌；外陰癌；瓦爾登斯特倫病巨球蛋白血癥；和維爾姆斯腫瘤。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了治療癌癥的方法，其包括在施用本發(fā)明的腎酶結(jié)合分子之前、同時(shí)或之后用癌癥的補(bǔ)充療法，比如外科手術(shù)、化療、化療劑、放射療法、或激素療法或其組合，治療對(duì)象?；焺┌?xì)胞毒素劑(例如，5-氟尿嘧啶、順鉑、卡鉑、氨甲喋呤、柔紅霉素、阿霉素、長(zhǎng)春新堿、長(zhǎng)春花堿、oxorubicin、卡莫司汀(BCNU)、環(huán)己亞硝脲(CCNU)、阿糖胞苷USP、環(huán)磷酰胺、雌莫司汀磷酸鈉(estramucinephosphatesodium)、六甲蜜胺、羥基脲、異環(huán)磷酰胺、甲基芐肼、絲裂霉素、白消安、環(huán)磷酰胺、米托蒽醌、卡鉑、順鉑、干擾素α-2a重組體、紫杉醇、替尼泊苷和鏈脲菌素(streptozoci))，細(xì)胞毒素烷化劑(例如，白消安、瘤可寧、環(huán)磷酰胺、美法侖或乙磺酸(ethylesulfonicacid))，烷化劑(例如，亮氨酸溶肉瘤素(asaley)、AZQ、BCNU、白消安、bisulphan、羧基鄰苯二甲酰鉑(carboxyphthalateplatinum)、CBDCA、CCNU、CHIP、瘤可寧、氯脲霉素、順鉑、氯乙礬、氰基嗎啉基阿霉素(cyanomorpholinodoxorubicin)、cyclodisone、環(huán)磷酰胺、環(huán)氧乳醇、氟多潘、hepsulfam、羥胺硫蒽酮、異環(huán)磷酰胺、美法侖、甲基CCNU、絲裂霉素C、米托唑胺(mitozolamide)、氮芥、PCNU、哌嗪、哌嗪二酮、哌泊溴烷、甲基絲裂霉素、螺乙內(nèi)酰脲芥(spirohydantoinmustard)、鏈脲酶素、替羅昔隆、四鉑、噻替派、三乙撐蜜胺、尿嘧啶氮芥和Yoshi-864)，抗有絲分裂劑(例如，別秋水仙堿(allocolchicine)、軟海綿素M、秋水仙堿、秋水仙堿衍生物、尾海兔素(dolastatin)10、美登素、根霉素(rhizoxin)、紫杉醇衍生物、紫杉醇、硫代秋水仙堿、三苯甲基半胱氨酸、硫酸長(zhǎng)春花堿和硫酸長(zhǎng)春新堿)，植物生物堿(例如，放線菌素D、博萊霉素、L-天冬酰胺酶、伊達(dá)比星、硫酸長(zhǎng)春花堿、硫酸長(zhǎng)春新堿、光輝霉素(mitramycin)、絲裂霉素、柔紅霉素、VP-16-213、VM-26、長(zhǎng)春瑞濱和泰素帝)，生物制品(例如，α干擾素、BCG、G-CSF、GM-CSF和白細(xì)胞介素-2)，I型拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑(例如，喜樹堿、喜樹堿衍生物和嗎啉基阿霉素)，II型拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑(例如，米托蒽醌(mitoxantron)、氨萘非特、m-AMSA、蒽吡唑衍生物、甲氧基吡唑啉吖啶(pyrazoloacridine)、HCL雙蒽生、柔紅霉素、脫氧阿霉素、美諾立爾、N,N-二芐基柔紅霉素、oxanthrazole、柔紅霉素苯腙(rubidazone)、VM-26和VP-16)，和合成類(例如，羥基脲、甲基芐肼、o,p'-DDD、達(dá)卡巴嗪、CCNU、BCNU、順二氨二氯鉑(cis-diamminedichloroplatimun)、米托蒽醌、CBDCA、左旋咪唑、六甲蜜胺、全反式視黃酸、卡氮芥(gliadel)和卟吩姆鈉)。抗增殖劑是降低細(xì)胞增殖的化合物。抗增殖劑包括烷化劑、抗代謝物、酶類、生物反應(yīng)調(diào)節(jié)物、混雜藥劑(miscellaneousagent)、激素和拮抗劑、雄性激素抑制劑(例如，氟他胺和亮丙瑞林醋酸鹽)、抗雌激素(例如，它莫西芬檸檬酸鹽和其類似物、托瑞米芬、屈洛昔芬和洛昔芬(roloxifene))，具體的抗增殖劑的另外的實(shí)例包括，但不限于左旋咪唑、硝酸鎵、格雷西隆、沙格司亭鍶(sargramostimstrontium)-89氯化物、非格司亭、匹魯卡品、右旋亞胺和昂丹司瓊。本發(fā)明的腎酶結(jié)合分子可以單獨(dú)或與其它抗腫瘤藥劑——包括細(xì)胞毒素/抗腫瘤劑和抗血管生成劑——組合施用。細(xì)胞毒素/抗腫瘤劑被定義為攻擊和殺死癌細(xì)胞的藥劑。一些細(xì)胞毒素/抗腫瘤劑是烷化劑，其使腫瘤細(xì)胞中的遺傳物質(zhì)烷基化，例如，順鉑、環(huán)磷酰胺、氮芥、三亞甲基硫代磷酰胺、卡莫絲汀、白消安、瘤可寧、布魯司汀(belustine)、尿嘧啶芥、丙氯拉嗪(chlomaphazin)和達(dá)卡巴嗪(dacabazine)。其它細(xì)胞毒素/抗腫瘤劑是腫瘤細(xì)胞的抗代謝物，例如，胞嘧啶阿糖胞苷、氟尿嘧啶、氨甲喋呤、巰基嘌呤(mercaptopuirine)、咪唑硫嘌呤(azathioprime)和甲基芐肼。其它細(xì)胞毒素/抗腫瘤劑是抗生素，例如，阿霉素、博萊霉素、放線菌素D、正定霉素、光神霉素、絲裂霉素、絲裂霉素C和柔紅霉素。存在許多商業(yè)可得的這些化合物的脂質(zhì)體制劑。仍其它細(xì)胞毒素/抗腫瘤劑是有絲分裂抑制劑(長(zhǎng)春花生物堿)。這些包括長(zhǎng)春新堿、長(zhǎng)春花堿和依托泊苷?；祀s細(xì)胞毒素/抗腫瘤劑包括紫杉醇和其衍生物、L-天冬酰胺酶、抗腫瘤抗體、達(dá)卡巴嗪、氮胞苷、氨吖啶、美法侖、VM-26、異環(huán)磷酰胺、米托蒽醌和長(zhǎng)春地辛?？寡苌蓜?duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是熟知的。用于本公開內(nèi)容的方法和組合物的適合的抗血管生成劑包括抗VEGF抗體——其包括人源化和嵌合抗體、抗VEGF適配體和反義寡核苷酸。血管生成的其它已知的抑制劑包括制管張素、內(nèi)皮抑制素、干擾素、白細(xì)胞介素1(包括α和β)、白細(xì)胞介素12、視黃酸和金屬蛋白酶-1和-2的組織抑制劑(TIMP-1和-2)。也可以使用小分子，包括拓?fù)洚悩?gòu)酶比如雷佐生，一種具有抗血管生成活性的II型拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑?？梢耘c公開的化合物組合使用的其它抗癌藥包括，但不限于：阿西維辛；阿柔比星；鹽酸阿考達(dá)唑(acodazole)；阿克羅寧；阿多來新(adozelesin)；阿地白介素；六甲蜜胺；二霉素；醋酸阿美蒽醌；氨魯米特；氨吖啶；阿那曲唑；氨茴霉素；天冬酰胺酶；曲林菌素；阿扎胞苷；阿扎替派；含氮霉素；巴馬司他；芐替哌；比卡魯胺；鹽酸雙蒽生；二甲磺酸雙奈法德(bisnafidedimesylate)；比折來新；硫酸博萊霉素；布喹那鈉；溴匹立明；白消安；放線菌素C；卡普睪酮；卡醋胺；卡貝替姆；卡鉑；卡莫司汀；鹽酸卡柔比星；卡折來新；西地芬戈；瘤可寧；西羅霉素；順鉑；克拉屈濱；甲磺酸克雷斯托(crisnatolmesylate)；環(huán)磷酰胺；阿糖胞苷；達(dá)卡巴嗪；放線菌素D；鹽酸正定霉素；地西他濱；右奧馬鉑；地扎胍寧；甲磺酸地扎胍寧；亞絲醌；多西紫杉醇；阿霉素；鹽酸阿霉素；屈洛昔芬；檸檬酸屈洛昔芬；丙酸甲雄烷酮；偶氮霉素；依達(dá)曲沙；鹽酸依氟鳥氨酸；依沙蘆星；恩洛鉑；恩普氨酯；依匹哌啶；鹽酸表柔比星；厄布洛唑；鹽酸依索比星；雌莫司??；雌莫司汀磷酸鈉；依他硝唑；依托泊苷；磷酸依托泊苷；氯苯乙嘧胺；鹽酸法倔唑；法扎拉濱；芬維A胺；氟尿苷；磷酸氟達(dá)拉濱；氟尿嘧啶；氟卡培他濱(fluorocitabine)；磷喹酮；福司曲星鈉(fostriecinsodium)；吉西他濱；鹽酸吉西他濱；羥基脲；鹽酸伊達(dá)比星；異環(huán)磷酰胺；伊莫福新；白細(xì)胞介素II(包括重組白細(xì)胞介素II，或rIL2)；干擾素α-2a；干擾素α-2b；干擾素α-n1；干擾素α-n3；干擾素β-Ia；干擾素γ-Ib；異丙鉑；鹽酸伊立替康；醋酸蘭瑞肽；來曲唑；醋酸亮丙瑞林；鹽酸利阿唑；洛美曲索鈉(lometrexolsodium)；環(huán)己亞硝脲；鹽酸洛索蒽醌；馬索羅酚；美登素；鹽酸氮芥；醋酸甲地孕酮；醋酸美侖孕酮；美法侖；美諾立爾；巰嘌呤；氨甲喋呤；氨甲喋呤鈉；氯苯氨啶；美妥替哌；米丁度胺；米托卡星；絲裂紅素；米托菌素；米托馬星；絲裂霉素；絲裂帕菌素；米托坦；鹽酸米托蒽醌；霉酚酸；諾考達(dá)唑；諾加霉素；奧馬鉑；奧昔舒侖；紫杉醇；白蛋白結(jié)合型紫杉醇(albumin-boundpaclitaxel)；培門冬酶；培利霉素；戊氮芥(pentamustine)；硫酸培洛霉素；培磷酰胺；哌泊溴烷；嗪消安；鹽酸吡羅蒽醌；普卡霉素；普洛美坦；卟菲爾鈉；甲基絲裂霉素；潑尼莫司??；鹽酸甲基芐肼；嘌呤霉素；鹽酸嘌呤霉素；吡唑呋喃菌素；利波腺苷；羅谷亞胺；沙芬戈；鹽酸沙芬戈；司莫司??；辛曲秦；頭孢菌素鈉(sparfosatesodium)；司帕霉素；鹽酸螺鍺；螺莫司汀；螺鉑；鏈黑菌素；鏈脲菌素；磺氯苯脲(sulofenur)；他利霉素；替可加蘭鈉(tecogalansodium)；喃氟啶；鹽酸替洛蒽醌；替莫泊芬；替尼泊苷；替尼昔隆(teroxirone)；睪內(nèi)酯；硫咪嘌呤；巰鳥嘌呤；塞替派；噻唑羧胺核苷(tiazofurin)；替拉扎明；檸檬酸托瑞米芬；醋酸曲托龍；磷酸曲西瑞賓；三甲曲沙；三甲曲沙葡萄糖醛酸酯；曲普瑞林；鹽酸妥布氯唑；尿嘧啶芥；烏瑞替派；伐普肽；維替泊芬；硫酸長(zhǎng)春花堿；硫酸長(zhǎng)春新堿；長(zhǎng)春地辛；硫酸長(zhǎng)春地辛；硫酸長(zhǎng)春匹定；硫酸長(zhǎng)春甘酯；硫酸長(zhǎng)春羅新；長(zhǎng)春瑞濱；酒石酸長(zhǎng)春瑞濱；硫酸長(zhǎng)春羅定；硫酸長(zhǎng)春利定；伏羅唑；折尼鉑；凈司他丁；鹽酸佐柔比星。其它抗癌癥藥物包括但不限于：20-表(epi)-1,25二羥維生素D3；5-乙炔基尿嘧啶；阿比特龍；阿柔比星；?；幌?；腺環(huán)戊醇；阿多來新；阿地白介素；ALL-TK拮抗劑；六甲蜜胺；氨莫司?。幻郎惩?amidox)；氨磷??；氨基乙酰丙酸；氨柔比星；氨吖啶；阿那格雷；阿那曲唑；穿心蓮內(nèi)酯；血管生成抑制劑；拮抗劑D；拮抗劑G；安雷利克斯(antarelix)；抗背側(cè)化形態(tài)發(fā)生蛋白-1；抗雄激素，前列腺癌；抗雌激素；抗瘤酮；反義寡核苷酸；甘氨酸阿非迪霉素；細(xì)胞凋亡基因調(diào)節(jié)劑；細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)劑；無嘌呤酸；阿拉伯糖(ara)-CDP-DL-PTBA；精氨酸脫氨酶；asulacrine；阿他美坦；阿莫司??；axinastatin1；axinastatin2；axinastatin3；阿扎司瓊；阿扎毒素(azatoxin)；重氮酪氨酸；漿果赤霉素III衍生物；balanol；巴馬司他；BCR/ABL拮抗劑；苯并二氫卟酚(benzochlorins)；苯甲?；宙邏A(benzoylstaurosporine)；β內(nèi)酰胺衍生物；β-alethine；betaclamycinB；樺木酸；bFGF抑制劑；比卡魯胺；雙蒽生；雙吖丙啶基精胺；雙萘法德；bistrateneA；比折來新；breflate；溴匹立明；布朵替坦；丁胱亞磺酰亞胺；鈣泊三醇；卡弗他丁C；喜樹堿衍生物；金絲雀痘IL-2；卡培他濱；甲酰胺-氨基-三唑；羧胺三唑；CaRestM3；CARN700；軟骨衍生抑制劑；卡折來新；酪蛋白激酶抑制劑(ICOS)；栗精胺；殺菌肽B；西曲瑞克；二氫卟吩；氯代喹喔啉磺胺(chloroquinoxalinesulfonamide)；西卡前列素；順卟啉；克拉屈濱；氯米芬類似物；克霉唑；collismycinA；collismycinB；康普瑞汀A4；康普瑞汀類似物；conagenin；crambescidin816；克雷斯托；念珠藻素8；念珠藻素A衍生物；curacinA；環(huán)戊烷蒽醌類(cyclopentanthraquinones)；cycloplatam；cypemycin；阿糖胞苷十八烷基磷酸鈉；溶細(xì)胞因子；細(xì)胞抑制劑；達(dá)昔單抗；地西他濱；脫氫膜海鞘素B；地洛瑞林；地塞米松；右異環(huán)磷酰胺(dexifosfamide)；右雷佐生；右維拉帕米；地吖醌；膜海鞘素B；didox；二乙基去靜胺(diethylnorspermine)；二氫-5-氮雜胞苷；二氫紫杉醇，9-；二氧霉素(dioxamycin)；二苯基螺莫司??；多西紫杉醇；二十二醇；多拉司瓊；去氧氟尿苷；屈洛昔芬；屈大麻酚；多卡米星(duocarmycin)SA；依布硒啉；依考莫司??；依地福新；依決洛單抗；依氟鳥氨酸；欖香烯；乙嘧替氟；表柔比星；愛普列特；雌莫司汀類似物；雌激素激動(dòng)劑；雌激素拮抗劑；依他硝唑；磷酸依托泊苷；依西美坦；法倔唑；法扎拉濱；芬維A胺；非格司亭；非那雄胺；夫拉平度；氟卓斯??；fluasterone；氟達(dá)拉濱；鹽酸氟代正定霉素(fluorodaunorunicinhydrochloride)；福酚美克；福美司坦；福司曲星；福莫司??；釓特沙弗林(gadoliniumtexaphyrin)；硝酸鎵；加洛他濱；加尼瑞克；明膠酶抑制劑；吉西他濱；谷胱甘肽抑制劑；hepsulfam；調(diào)蛋白；六亞甲基二乙酰胺；金絲桃素；伊班膦酸；去甲氧基柔紅霉素；吲哚昔酚；伊決孟酮；伊莫福新；伊洛馬司他；咪唑并吖啶酮；咪喹莫特；免疫刺激肽；胰島素樣生長(zhǎng)因子-1受體抑制劑；干擾素激動(dòng)劑；干擾素；白細(xì)胞介素；碘芐胍；碘阿霉素(iododoxorubicin)；甘薯苦醇，4-；伊羅普拉；伊索拉定；isobengazole；isohomohalicondrinB；伊他司瓊；jasplakinolide；kahalalideF；三醋酸片螺素-N；蘭瑞肽；leinamycin；來格司亭；硫酸香菇多糖；leptolstatin；來曲唑；白血病抑制因子；白細(xì)胞α干擾素；亮丙瑞林+雌激素+孕酮；亮丙瑞林；左旋咪唑；利阿唑；線性聚胺類似物；親脂性二糖肽；親脂性鉑化合物；lissoclinamide7；洛鉑；蚯吲磷脂；洛美曲索；氯尼達(dá)明；洛索蒽醌；洛伐他??；洛索立賓；勒托替康；lutetiumtexaphyrin；lysofylline；裂解性肽；美坦辛；制甘糖酶素A(mannostatinA)；馬馬司他；馬司莫單抗；乳腺絲抑蛋白；基質(zhì)溶解因子抑制劑；基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑；美諾立爾；麥爾巴隆(merbarone)；美替瑞林；甲硫氨酸酶；甲氧氯普胺；MIF抑制劑；米非司酮；米替福新；米立司亭；錯(cuò)配的雙鏈RNA；米托胍腙；二溴衛(wèi)矛醇；絲裂霉素類似物；米托萘胺；邁托毒素(mitotoxin)纖維母細(xì)胞生長(zhǎng)因子-皂草素；米托蒽醌；莫法羅??；莫拉司亭；單克隆抗體，人絨膜促性腺激素；單磷酰酯A+分枝桿菌細(xì)胞壁SK；莫哌達(dá)醇；多重耐藥基因抑制劑；多腫瘤抑制基因1-基療法；芥子抗癌藥(mustardanticanceragent)；印度洋海綿B(mycaperoxideB)；分枝桿菌細(xì)胞壁提取物；myriaporone；N-乙?；啬橇郑籒-取代的苯甲酰胺；那法瑞林；nagrestip；納洛酮+噴他佐辛；napavin；naphterpin；那托司亭；奈達(dá)鉑；奈莫柔比星；奈立膦酸；中性肽鏈內(nèi)切酶；尼魯米特；nisamycin；氧化氮調(diào)節(jié)劑；硝基氧抗氧化劑；nitrullyn；O6-芐基鳥嘌呤；奧曲肽；okicenone；寡核苷酸；奧那司酮；昂丹司瓊；昂丹司瓊；oracin；口服細(xì)胞因子誘導(dǎo)物；奧馬鉑；奧沙特隆；奧沙利鉑；Oxaunomycin；太平洋紫杉醇；太平洋紫杉醇類似物；太平洋紫杉醇衍生物；派勞胺(palauamine)；棕櫚酰根霉素(palmitoylrhizoxin)；帕米磷酸；人參三醇；帕諾米芬；parabactin；帕折普?。慌嚅T冬酶；培得星(peldesine)；戊聚糖聚硫酸鈉；噴司他??；pentrozole；全氟溴烷；培磷酰胺；紫蘇子醇；吩嗪霉素(phenazinomycin)；乙酸苯酯；磷酸抑制劑；溶鏈菌制劑；鹽酸毛果蕓香堿；吡柔比星；吡曲克辛；placetinA；placetinB；纖溶酶原激活藥抑制劑；鉑復(fù)合物；鉑化合物；鉑-三胺復(fù)合物；卟吩姆鈉；泊非霉素；強(qiáng)的松；丙基二吖啶酮；前列腺素J2；蛋白酶體抑制劑；基于蛋白A的免疫調(diào)節(jié)物；蛋白激酶C抑制劑；蛋白激酶C抑制劑，微藻；蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸抑制劑；嘌呤核苷磷酸化酶抑制劑；紅紫素；吡唑啉吖啶；吡哆基化的血紅素聚氧乙烯綴合物；Raf拮抗劑；雷替曲塞；雷莫司瓊；Ras法尼基蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移酶抑制劑；Ras抑制劑；Ras-GAP抑制劑；去甲基化瑞替普汀；錸Re186依替膦酸鹽；根霉素；核酶；RII維甲酰胺；羅谷亞胺；羅希吐堿；羅莫肽；羅喹美克；rubiginoneB1；ruboxyl；沙芬戈；saintopin；SarCNU；肌肉葉綠醇A；沙格司亭；Sdi1模擬物；司莫司?。凰ダ涎苌囊种苿?；有義寡核苷酸；信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑；信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)子；單鏈抗原結(jié)合蛋白質(zhì)；西佐喃(sizofuran)；索布佐生；硼卡鈉；苯基乙酸鈉；solverol；生長(zhǎng)調(diào)節(jié)素結(jié)合蛋白質(zhì)；索鈉明；斯帕磷酸；spicamycinD；螺莫司??；斯耐潘定；海綿抑制素1；角鯊胺；干細(xì)胞抑制劑；干細(xì)胞分裂抑制劑；密擠青霉酰胺(stipiamide)；溶基質(zhì)素抑制劑；sulfinosine；超活性血管活性腸肽拮抗劑；suradista；蘇拉明；苦馬豆堿；合成的糖胺聚糖；他莫司汀；它莫西芬甲碘化物；牛碘莫司汀；他扎羅?。惶婵杉犹m鈉；替加氟；tellurapyrylium；端粒酶抑制劑；替莫泊芬；替莫唑胺；替尼泊苷；四氯癸氧化物(tetrachlorodecaoxide)；tetrazomine；thaliblastine；硫代珊瑚精(thiocoraline)；血栓形成素；血栓形成素模擬物；胸腺法新；促胸腺生成素受體激動(dòng)劑；胸腺曲南；甲狀腺刺激激素；錫乙基初紅紫素(etiopurpurin)；替拉扎明；環(huán)戊二烯鈦二氯化物；topsentin；托瑞米芬；全能干細(xì)胞因子；翻譯抑制劑；維A酸；三乙酰尿苷；曲西立濱；三甲曲沙；曲普瑞林；托烷司瓊；妥羅雄脲；酪氨酸激酶抑制劑；tyrphostins；UBC抑制劑；烏苯美司；尿生殖竇衍生的生長(zhǎng)抑制因子；尿激酶受體拮抗劑；伐普肽；variolinB；載體系統(tǒng)，紅血球基因療法；維拉雷鎖；veramine；verdins；維替泊芬；長(zhǎng)春瑞賓；vinxaltine；vitaxin；伏氯唑；扎諾特??；折尼鉑；亞芐維C；imilimumab；米氮平；BrUOG278；BrUOG292；RAD0001；CT-011；folfirinox；替吡法尼；R115777；LDE225；骨化三醇；AZD6244；AMG655；AMG479；BKM120；mFOLFOX6；NC-6004；西妥昔單抗；IM-C225；LGX818；MEK162；BBI608；MEDI4736；威羅非尼；易普利姆瑪；ivolumab；nivolumab；帕比司他；來氟米特；CEP-32496；阿侖單抗；貝伐單抗；奧法木單抗；帕尼單抗；派姆單抗；利妥昔單抗；曲妥單抗；STAT3抑制劑(例如，STA-21、LLL-3、LLL12、XZH-5、S31-201、SF-1066、SF-1087、STX-0119、隱丹參酮、姜黃色素、二阿魏酰甲烷(diferuloylmethane)、FLLL11、FLLL12、FLLL32、FLLL62、C3、C30、C188、C188-9、LY5、OPB-31121、乙嘧啶、OPB-51602、AZD9150等)；缺氧誘導(dǎo)因子1(HIF-1)抑制劑(例如，LW6、地高辛、laurenditerpenol、PX-478、RX-0047、牡荊黃素、KC7F2、YC-1等)和凈司他丁斯酯。在一個(gè)實(shí)施方式中，抗癌癥藥物是5-氟尿嘧啶、紫杉醇或亞葉酸。診斷方法在一些實(shí)施方式中，與比較物相比，對(duì)象的細(xì)胞、組織或體液中腎酶或腎酶片段的水平的增加在本發(fā)明的方法中被用作診斷疾病或紊亂、評(píng)估疾病或紊亂的嚴(yán)重性和用于監(jiān)測(cè)疾病或紊亂的治療效果或效力的標(biāo)記。在各個(gè)實(shí)施方式中，疾病或紊亂是急性腎衰竭(即，急性腎小管壞死或ATN——一種腎臟中的缺血性病癥)、心血管疾病或紊亂(例如，高血壓、肺動(dòng)脈高血壓、收縮期高血壓、糖尿病高血壓、無癥狀性左心室功能紊亂、慢性充血性心力衰竭、心肌梗死、心律失常、動(dòng)脈粥樣硬化等)、癌癥、心臟疾病或紊亂、腎臟疾病或紊亂、胃腸道疾病或紊亂、肝臟疾病或紊亂、肺疾病或紊亂、胰腺疾病或紊亂(例如，胰腺炎)、精神疾病或紊亂(例如，抑郁、焦慮等)或神經(jīng)學(xué)疾病或紊亂。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明是通過評(píng)估對(duì)象的生物學(xué)樣本中的腎酶或腎酶片段的水平來診斷對(duì)象的疾病或紊亂的方法。在一個(gè)實(shí)施方式中，對(duì)象的生物學(xué)樣本是細(xì)胞、組織或體液。其中腎酶或腎酶片段的水平可被評(píng)估的體液的非限制性實(shí)例包括但不限于血液、血清、血漿和尿。在各個(gè)實(shí)施方式中，將對(duì)象的生物學(xué)樣本中的腎酶或腎酶片段的水平與比較物中腎酶或腎酶片段水平進(jìn)行比較。比較物的非限制性實(shí)例包括但不限于陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照、對(duì)象的預(yù)期的正常背景值、對(duì)象的歷史正常背景值、對(duì)象為其成員的群體的預(yù)期正常背景值或?qū)ο鬄槠涑蓡T的群體的歷史正常背景值。在各個(gè)實(shí)施方式中，疾病或紊亂是急性腎衰竭(即，急性腎小管壞死或ATN——一種腎臟中的缺血性病癥)、心血管疾病或紊亂(例如，高血壓、肺動(dòng)脈高血壓、收縮期高血壓、糖尿病高血壓、無癥狀性左心室功能紊亂、慢性充血性心力衰竭、心肌梗死、心律失常、動(dòng)脈粥樣硬化等)、癌癥、心臟疾病或紊亂、腎臟疾病或紊亂、胃腸道疾病或紊亂、肝臟疾病或紊亂、肺疾病或紊亂、胰腺疾病或紊亂(例如，胰腺炎)、精神疾病或紊亂(例如，抑郁、焦慮等)或神經(jīng)學(xué)疾病或紊亂。在一些實(shí)施方式中，診斷方法包括治療患者的診斷的疾病或紊亂的進(jìn)一步步驟。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明是通過評(píng)估對(duì)象的生物學(xué)樣本中的腎酶或腎酶片段的水平來評(píng)估對(duì)象的疾病或紊亂的嚴(yán)重性的方法。在一個(gè)實(shí)施方式中，對(duì)象的生物學(xué)樣本是細(xì)胞、組織或體液。其中腎酶或腎酶片段的水平可被評(píng)估的體液的非限制性實(shí)例包括但不限于血液、血清、血漿和尿。在各個(gè)實(shí)施方式中，將對(duì)象的生物學(xué)樣本中的腎酶或腎酶片段的水平與比較物中腎酶或腎酶片段水平進(jìn)行比較。比較物的非限制性實(shí)例包括但不限于陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照、對(duì)象的預(yù)期的正常背景值、對(duì)象的歷史正常背景值、對(duì)象為其成員的群體的預(yù)期正常背景值或?qū)ο鬄槠涑蓡T的群體的歷史正常背景值。在各個(gè)實(shí)施方式中，疾病或紊亂是急性腎衰竭(即，急性腎小管壞死或ATN——一種腎臟中的缺血性病癥)、心血管疾病或紊亂(例如，高血壓、肺動(dòng)脈高血壓、收縮期高血壓、糖尿病高血壓、無癥狀性左心室功能紊亂、慢性充血性心力衰竭、心肌梗死、心律失常、動(dòng)脈粥樣硬化等)、癌癥、心臟疾病或紊亂、腎臟疾病或紊亂、胃腸道疾病或紊亂、肝臟疾病或紊亂、肺疾病或紊亂、胰腺疾病或紊亂(例如，胰腺炎)、精神疾病或紊亂(例如，抑郁、焦慮等)或神經(jīng)學(xué)疾病或紊亂。在一些實(shí)施方式中，評(píng)估嚴(yán)重性的方法包括治療患者的疾病或紊亂的進(jìn)一步步驟。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明是通過評(píng)估對(duì)象的生物學(xué)樣本中的腎酶或腎酶片段的水平來監(jiān)測(cè)對(duì)象的疾病或紊亂的治療效果的方法。在一個(gè)實(shí)施方式中，對(duì)象的生物學(xué)樣本是細(xì)胞、組織或體液。其中腎酶或腎酶片段的水平可被評(píng)估的體液的非限制性實(shí)例包括但不限于血液、血清、血漿和尿。在各個(gè)實(shí)施方式中，將對(duì)象的生物學(xué)樣本中的腎酶或腎酶片段的水平與比較物中腎酶或腎酶片段水平進(jìn)行比較。比較物的非限制性實(shí)例包括但不限于陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照、對(duì)象的預(yù)期的正常背景值、對(duì)象的歷史正常背景值、對(duì)象為其成員的群體的預(yù)期正常背景值或?qū)ο鬄槠涑蓡T的群體的歷史正常背景值。在各個(gè)實(shí)施方式中，疾病或紊亂是急性腎衰竭(即，急性腎小管壞死或ATN——一種腎臟中的缺血性病癥)、心血管疾病或紊亂(例如，高血壓、肺動(dòng)脈高血壓、收縮期高血壓、糖尿病高血壓、無癥狀性左心室功能紊亂、慢性充血性心力衰竭、心肌梗死、心律失常、動(dòng)脈粥樣硬化等)、癌癥、心臟疾病或紊亂、腎臟疾病或紊亂、胃腸道疾病或紊亂、肝臟疾病或紊亂、肺疾病或紊亂、胰腺疾病或紊亂(例如，胰腺炎)、精神疾病或紊亂(例如，抑郁、焦慮等)或神經(jīng)學(xué)疾病或紊亂。在一些實(shí)施方式中，監(jiān)測(cè)治療效果的方法包括治療患者的疾病或紊亂的進(jìn)一步步驟。在各個(gè)實(shí)施方式中，對(duì)象是人對(duì)象，并且可以具有任何種族、性別和年齡。代表性的對(duì)象包括被懷疑已經(jīng)經(jīng)歷疾病或紊亂的那些患者，已經(jīng)被診斷為已經(jīng)經(jīng)歷疾病或紊亂的那些患者，已經(jīng)被診斷為患有疾病或紊亂的那些患者，和處于發(fā)展疾病或紊亂的風(fēng)險(xiǎn)下的那些患者。自本文描述的發(fā)明的方法獲得的信息可以單獨(dú)使用，或者與來自對(duì)象或來自從對(duì)象獲得的生物學(xué)樣本的其它信息(例如，疾病狀態(tài)、疾病史、生命征兆、血液化學(xué)等)組合使用。在本發(fā)明的診斷方法中，評(píng)估從對(duì)象獲得的生物學(xué)樣本的包含在其中的腎酶或腎酶片段的水平。在一個(gè)實(shí)施方式中，生物學(xué)樣本是至少包含在本文描述的方法中有用的腎酶多肽的片段的樣本。在本發(fā)明的方法的其它各個(gè)實(shí)施方式中，當(dāng)與比較物對(duì)照比較時(shí)，腎酶或腎酶片段的水平增加至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少100％、至少200％、至少300％、至少400％、至少500％、至少600％、至少700％、至少800％、至少900％、至少1000％時(shí)，腎酶的水平被確定為增加。在各個(gè)實(shí)施方式中，腎酶或腎酶片段的增加水平指示疾病或紊亂。在各個(gè)實(shí)施方式中，疾病或紊亂是急性腎衰竭(即，急性腎小管壞死或ATN——一種腎臟中的缺血性病癥)、心血管疾病和癌癥。在本發(fā)明的方法中，評(píng)估來自對(duì)象的生物學(xué)樣本：從患者獲得的生物學(xué)樣本中腎酶或腎酶片段的水平。生物學(xué)樣本中腎酶或腎酶片段的水平可以通過評(píng)估生物學(xué)樣本中的腎酶多肽或片段的量、生物學(xué)樣本中腎酶mRNA或片段的量、生物學(xué)樣本中腎酶活性(例如，酶活性、底物結(jié)合活性、受體結(jié)合活性等)的量或其組合測(cè)定。在一些實(shí)施方式中，生物學(xué)樣本中的腎酶的水平在使用本文別處描述的本發(fā)明的腎酶結(jié)合分子中的至少一種的分析中測(cè)定。在本發(fā)明的方法的各個(gè)實(shí)施方式中，測(cè)量從患者獲得的生物學(xué)樣本中腎酶水平的方法包括但不限于免疫色譜分析、免疫斑點(diǎn)分析、Luminex分析、ELISA分析、ELISPOT分析、蛋白微陣列分析、蛋白質(zhì)印跡分析、質(zhì)譜分光光度分析、放射免疫分析(RIA)、放射免疫擴(kuò)散分析、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析、烏赫特朗尼式免疫擴(kuò)散分析、反相蛋白微陣列、火箭免疫電泳分析、免疫組織染色分析、免疫沉淀分析、補(bǔ)體結(jié)合分析、FACS、酶-底物結(jié)合分析、酶法分析、采用可檢測(cè)分子——比如發(fā)色團(tuán)、熒光團(tuán)或放射性底物——的酶法分析、采用這樣底物的底物結(jié)合分析、采用這樣底物的底物替代分析(substratedisplacementassay)和蛋白芯片分析(還參見2007,VanEmon,ImmunoassayandOtherBioanalyticalTechniques,CRCPress；2005,Wild,ImmunoassayHandbook,GulfProfessionalPublishing；1996,DiamandisandChristopoulos,Immunoassay,AcademicPress；2005,Joos,MicroarraysinClinicalDiagnosis,HumanaPress；2005,HamdanandRighetti,ProteomicsToday,JohnWileyandSons；2007)。在一些實(shí)施方式中，生物學(xué)樣本中腎酶的水平利用如此分析來測(cè)量：該分析使用本文別處描述的本發(fā)明的腎酶結(jié)合分子中的至少一種。試劑盒本發(fā)明還包括試劑盒，其包括本發(fā)明的腎酶結(jié)合分子(例如，抗體等)或其組合，和指導(dǎo)材料，其描述例如將腎酶結(jié)合分子或其組合施用至個(gè)體，作為如本文別處描述的治療性處理或非治療用途。在實(shí)施方式中，該試劑盒進(jìn)一步包括適合于溶解或懸浮本發(fā)明的治療性組合物——其包括腎酶結(jié)合分子或其組合——的(優(yōu)選地?zé)o菌的)藥學(xué)上可接受的載體，例如，然后將本發(fā)明的腎酶結(jié)合分子施用至個(gè)體。任選地，試劑盒包括用于施用該腎酶結(jié)合分子的施加器。實(shí)驗(yàn)實(shí)施例現(xiàn)在參照下面的實(shí)施例描述本發(fā)明。這些實(shí)施例僅出于說明的目的提供并且本發(fā)明決不應(yīng)當(dāng)被解釋為限于這些實(shí)施例，而是應(yīng)當(dāng)被解釋為包含由于本文提供的教導(dǎo)而變得顯而易見的任何和所有變體。在沒有進(jìn)一步描述的情況下，據(jù)信，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以使用在前的描述和下面的說明性實(shí)施例制備和利用本發(fā)明的化合物并實(shí)踐要求保護(hù)的方法。下面的工作實(shí)施例因此具體地指出了本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方式，并且不被解釋為以任何方式限制本公開內(nèi)容的其余部分。實(shí)施例1：腎酶抗體的開發(fā)肽被用作免疫原。生成的肽范圍在9到21個(gè)氨基酸并且對(duì)應(yīng)于腎酶-1和腎酶-2蛋白的區(qū)域。所有的肽具有N或C末端半胱氨酸殘基。肽的序列可見于表1并且這些肽對(duì)應(yīng)于腎酶-1或2序列的位置在圖4的序列比對(duì)中圖解。可見，腎酶-1特異性肽被標(biāo)記1A-F和腎酶-2特異性肽被標(biāo)記3A5。每種肽經(jīng)由半胱氨酸被綴合至佐劑KLH并且被用于免疫6只兔子。自每只動(dòng)物收集的抗血清使用相關(guān)肽(BSA-綴合物)或全長(zhǎng)腎酶-1或2二者通過ELISA分析篩選抗腎酶抗體效價(jià)。還通過蛋白質(zhì)印跡測(cè)試抗血清檢測(cè)組織溶胞產(chǎn)物中內(nèi)源腎酶的能力。使用這些篩選標(biāo)準(zhǔn)，選擇產(chǎn)生具有優(yōu)選特征的抗體的動(dòng)物。在一些實(shí)施例中和對(duì)于一些肽，數(shù)只動(dòng)物產(chǎn)生具有需要特異性的抗體。在這些情況下，一只動(dòng)物最終抗血清出血，用于多克隆抗體生產(chǎn)，并且一只或在一些實(shí)施例中其它兩只動(dòng)物被用于收獲脾淋巴細(xì)胞。在其它實(shí)施例中，單只動(dòng)物最終出血(terminalbleed)并進(jìn)行脾切除術(shù)。針對(duì)所有肽培養(yǎng)的多克隆抗體通過如下步驟生成：通過G蛋白色譜法純化來自最終出血的總IgG，然后使用肽親和色譜法進(jìn)一步純化。進(jìn)一步和使用標(biāo)準(zhǔn)程序，來自選擇的動(dòng)物的脾臟的淋巴細(xì)胞被融合至骨髓瘤細(xì)胞用于雜交瘤生成。雜交瘤上清液被篩選用于結(jié)合至其培養(yǎng)所針對(duì)的肽和針對(duì)整個(gè)腎酶蛋白二次篩選的肽二者。選擇的雜交瘤被亞克隆和擴(kuò)展用于抗體純化。通過A蛋白親和色譜法從條件雜交瘤培養(yǎng)上清液純化單克隆抗體。表1-用于生成抗腎酶抗體的腎酶肽的序列由Biocore測(cè)定的抗體親和力結(jié)合研究使用BiacoreT100執(zhí)行。結(jié)合研究在25℃下使用25mMTrispH8、150mMNaCl、1mMEDTA、10％甘油、0.005％吐溫-20和0.1mg/mLBSA作為電泳緩沖液進(jìn)行。生物素化抗體在如下面示出的個(gè)體鏈酶親和素傳感器芯片流動(dòng)池上捕獲。由于該研究采用兩個(gè)傳感器芯片，因此在第二傳感器芯片上mAb中兩個(gè)的分析被重復(fù)以收集更多數(shù)據(jù)。以3倍稀釋系列，在50nM作為最高濃度下測(cè)試腎酶-1。5個(gè)濃度中的每個(gè)一式二份測(cè)試。利用1/1000磷酸的短脈沖再生結(jié)合的復(fù)合物。數(shù)據(jù)集被整體擬合以提取在表2中總結(jié)的結(jié)合常數(shù)的估計(jì)值。表2-如通過Biocore測(cè)定的腎酶單克隆的親和力lgGka(M-1s-1)kd(s-1)KD(nM)Bio-1D28-46.467(4)e42.04(3)e-50.316(5)Bio-1F42-73.928(5)e49.47(6)e-52.41(2)Bio-1D37-101.749(5)e44.67(4)e-52.67(3)Bio-1F26-14.526(8)e41.020(9)e-42.25(2)1D28-4具有最高親和力并且在抑制研究中使用。抗腎酶抗體的核苷酸和氨基酸序列篩選單克隆抗體1D-28-4、1D-37-10、1F-26-1、1F-42-7和3A-5-2的腎酶結(jié)合特異性和高親和力。使用標(biāo)準(zhǔn)聚合酶鏈反應(yīng)過程和簡(jiǎn)并引物集，自亞克隆的雜交瘤擴(kuò)增這些抗體的抗體重和輕鏈可變區(qū)的cDNA。1D-28-4的可變區(qū)核苷酸和氨基酸序列(RP-220)在圖5中示出。以這種方式，示例了具有優(yōu)選特征的抗體的組合物。通過抗體抑制腎酶信號(hào)傳導(dǎo)降低癌細(xì)胞的存活由于腎酶表達(dá)在數(shù)種癌細(xì)胞系(圖6)中被上調(diào)，因此進(jìn)行實(shí)驗(yàn)以確定腎酶是否對(duì)癌細(xì)胞提供存活優(yōu)勢(shì)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)與正常皮膚相比，腎酶表達(dá)在痣和轉(zhuǎn)移性黑素瘤中顯著地增加(圖7)，這暗示腎酶對(duì)黑素細(xì)胞提供存活優(yōu)勢(shì)。此外，RenMonoAb1(針對(duì)RP-220培養(yǎng)的單克隆)在降低A375.S2(具有突變B-Raf(V600E)的黑素瘤細(xì)胞系)的活力中是高效的，并展示了與對(duì)黑素瘤有效的兩種烷化劑的協(xié)同作用：替莫唑胺(圖8)和達(dá)卡巴嗪(圖9)。RenMonoAb1在降低黑素瘤細(xì)胞系Sk-Mel-28(表達(dá)突變B-Raf(V600E)和野生型N-Ras)的活力中也是有效的并且顯示了與替莫唑胺的協(xié)同作用(圖10)。然后，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)以確定RenMonoAb1的抑制作用對(duì)黑素瘤是否是特異性的，或者它是否影響更寬范圍的腫瘤細(xì)胞。CCL-119細(xì)胞(CCF-MEC，急性成淋巴細(xì)胞性白血病細(xì)胞系；美國(guó)模式培養(yǎng)物保藏所)快速分裂并且表達(dá)高水平的腎酶，在組成NCI-60板的細(xì)胞中超過平均值(來自BioGPS.org的微陣列數(shù)據(jù))大約3.8倍。RenMonoAb1顯著降低了培養(yǎng)中CCL-119細(xì)胞的活力(圖11)。類似地，RenMonoAb1還抑制兩種胰腺癌細(xì)胞系MiaPac和Panc1的生長(zhǎng)(圖12-13)。圖14是描繪腎酶單克隆抗體對(duì)黑素瘤細(xì)胞數(shù)目和形態(tài)的影響的顯微照片。觀察到腎酶單克隆(例如，1D-28-4)抑制培養(yǎng)中的黑素瘤細(xì)胞。圖15顯示了兩種另外的1C-22-1和D-37-10腎酶單克隆抗體也抑制黑素瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。這些數(shù)據(jù)表明腎酶抑制可以在數(shù)種癌癥中是有用的治療選擇。與黑素瘤患者中的不良結(jié)果相關(guān)聯(lián)的腎酶過表達(dá)檢查從Yale發(fā)現(xiàn)和轉(zhuǎn)移性系列(隨訪263名患者長(zhǎng)達(dá)30年)獲得的原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性腫瘤樣本中腎酶的表達(dá)。使用自動(dòng)定量分析(AQUA)技術(shù)(Gould等，2009JournalofClinicalOncology,27:5772-5780)——其為在通過用抗S-100和抗gp100二者標(biāo)記限定的隔室內(nèi)測(cè)定目標(biāo)抗原表達(dá)的方法——進(jìn)行基于熒光的免疫組織化學(xué)染色。發(fā)現(xiàn)黑素瘤組織中升高的腎酶表達(dá)與疾病特異性死亡率的顯著增加相關(guān)聯(lián)(圖16)，這暗示腎酶作用的抑制在該疾病中可以是有用的治療選擇。實(shí)施例2：通過可選激活的腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞的腎酶表達(dá)通過STAT3介導(dǎo)的機(jī)制促進(jìn)黑素瘤生長(zhǎng)由于RNLS起參與MAPK和PI3K途徑的存活因子的功能，并因?yàn)槠浔磉_(dá)受STAT3調(diào)節(jié)(Sonawane等，2014Biochemistry.53(44):6878–6892)，因此問題是RNLS表達(dá)和信號(hào)傳導(dǎo)是否對(duì)癌細(xì)胞提供存活優(yōu)勢(shì)。焦點(diǎn)在黑素瘤上，黑素瘤是如此疾?。涸谠摷膊≈蠱APK、PI3K和JAK/STAT途徑被異常調(diào)節(jié)，和對(duì)于該疾病另外的治療靶標(biāo)將是期望的。RNLS表達(dá)在黑素瘤細(xì)胞系和腫瘤樣本中顯著增加。在患有轉(zhuǎn)移性黑素瘤的患者中，RNLS表達(dá)與疾病特異性存活負(fù)相關(guān)。RNLS在黑素瘤中的表達(dá)模式的檢查暗示上調(diào)主要發(fā)生在腫瘤相關(guān)基質(zhì)的細(xì)胞成分中，具體地在CD163+巨噬細(xì)胞中。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明募集進(jìn)入腫瘤的可選激活的巨噬細(xì)胞(M2樣，CD163+)抑制針對(duì)腫瘤的免疫應(yīng)答，增加血管生成和促進(jìn)腫瘤細(xì)胞遷移、入侵和傳播(Ruhrberg等，2010NatMed.16:861-2；Pollard等，2004NatRevCancer.4:71-8；Hao等，2012ClinicalandDevelopmentalImmunology.2012:11)。TAM占人黑素瘤中和在該工作中描述的異種移植模型中腫瘤質(zhì)量的顯著百分比。RNLS優(yōu)選地在CD162+TAM中表達(dá)，這暗示M2樣TAM可以通過分泌RNLS促進(jìn)腫瘤進(jìn)展。圖22C圖解了并入關(guān)鍵機(jī)制的工作模型，該機(jī)制是利用抑制RNLS信號(hào)傳導(dǎo)觀察到的抗腫瘤作用的基礎(chǔ)。通過RNLS單克隆m28-RNLS抑制RNLS信號(hào)傳導(dǎo)增加了CD86+與CD163+TAM的比率，并降低了通過CD163+TAM的RNLS分泌。此外，m28-RNLS抑制黑素瘤細(xì)胞中RNLS信號(hào)傳導(dǎo)。凈結(jié)果是總的和磷酸化的STAT3的急劇下降，這導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。調(diào)節(jié)RNLS基因表達(dá)的調(diào)節(jié)啟動(dòng)子元件和轉(zhuǎn)錄因子已經(jīng)在最近被研究(Sonawane等，2014Biochemistry.53(44):6878–6892)并且這些數(shù)據(jù)表明STAT3的關(guān)鍵作用。結(jié)果暗示RNLS和STAT3之間的前饋環(huán)的存在，其中上調(diào)STAT3的信號(hào)增加RNLS基因表達(dá)，其又增加STAT3活性。RNLS和STAT3之間的這樣的相互作用的存在對(duì)于RNLS信號(hào)傳導(dǎo)在癌癥發(fā)病機(jī)制中的作用具有重要啟示。的確，存在大量數(shù)據(jù)表明在促進(jìn)惡性轉(zhuǎn)化和癌癥進(jìn)展的炎性微環(huán)境的誘發(fā)和維持中，STAT家族蛋白質(zhì)尤其是STAT3的關(guān)鍵作用(Yu等，2009NatRevCancer.9:798-809)。STAT3信號(hào)傳導(dǎo)通常在惡性細(xì)胞中持久地激活，并且這樣的激活不僅驅(qū)動(dòng)腫瘤細(xì)胞增殖，而且增加支撐腫瘤微環(huán)境中炎癥的大量基因的產(chǎn)生。癌細(xì)胞與非轉(zhuǎn)化的和基質(zhì)細(xì)胞之間的STAT3前饋環(huán)已經(jīng)在癌癥中證明(Catlett-Falcone等，1999Immunity.10:105-15；Yu等，2007NatRevImmunol.7:41-51；Ara等，2009CancerRes.69:329-37)。例如，STAT3在多發(fā)性骨髓瘤患者中組成性地激活。在IL-6依賴性人骨髓瘤細(xì)胞系U266中，IL-6通過詹納斯激酶發(fā)信號(hào)以激活STAT3，其又上調(diào)抗細(xì)胞凋亡因子，并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的存活(Catlett-Falcone等，1999Immunity.10:105-15)。通過各種機(jī)制，STAT3也已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)為在大多數(shù)黑素瘤中組成性地激活，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞存活、增殖、轉(zhuǎn)移、血管生成的增加，和腫瘤免疫應(yīng)答的降低(Lesinski等，2013Futureoncology.9:925-7；Kortylewski等，2005Cancermetastasisreviews.24:315-27；Emeagi等，2013Genetherapy.20:1085-92；Yang等，2010Internationaljournalofinterferon,cytokineandmediatorresearch:IJIM.2010:1-7)。通過增加抗細(xì)胞凋亡因子Bcl2和阻止效應(yīng)物胱天蛋白酶的激活，RNLS介導(dǎo)細(xì)胞保護(hù)作用(Wang等，2014JournaloftheAmericanSocietyofNephrologyDOI:10.1681/asn.2013060665)。A375.S2細(xì)胞中RNLS信號(hào)傳導(dǎo)的抑制與p38MAPK的持續(xù)激活，然后細(xì)胞凋亡因子Bax的激活，和細(xì)胞凋亡相關(guān)聯(lián)。MAPKp38是已經(jīng)牽連于炎癥、細(xì)胞分化、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)和細(xì)胞凋亡的應(yīng)激激活蛋白激酶(Ono等，2000CellularSignalling.12:1-13)。例如，顯示神經(jīng)生長(zhǎng)因子停藥(withdrawal)引起在JNK和p38的持續(xù)激活和ERK的下調(diào)之后的細(xì)胞凋亡(Xia等，1995Science.270:1326-31)。但是，由于在某些條件下p38的抑制可以阻斷細(xì)胞凋亡(Ono等，2000CellularSignalling.12:1-130)，因此p38在細(xì)胞凋亡中的作用明確地是環(huán)境依賴性的(contextdependent)。這些數(shù)據(jù)暗示在A375.S2細(xì)胞中，p38的RNLS依賴性激活引起細(xì)胞凋亡。RNLS信號(hào)傳導(dǎo)的抑制顯著地降低了Ki-67在黑素瘤的異種移植(xenograph)中的表達(dá)。由于Ki-67是已經(jīng)被廣泛用于評(píng)估腫瘤的增殖能力的細(xì)胞增殖的明確定義的標(biāo)記，因此數(shù)據(jù)被解釋為表明RNLS信號(hào)傳導(dǎo)是腫瘤增殖的關(guān)鍵驅(qū)動(dòng)因素(driver)，并且RNLS抑制降低腫瘤的增殖速率。確定細(xì)胞周期進(jìn)程的許多關(guān)鍵因素已經(jīng)被鑒定，并且包括一組細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(CDK)以及兩類CDK抑制劑，即細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶4的抑制劑(INK4)和CDK互作蛋白(interactingprotein)/激酶抑制劑蛋白(CIP/KIP)家族(Jung等，2010CellularSignalling.22:1003-12)。p21——其為屬于CIP/KIP家族的CDK抑制劑——的表達(dá)通過RNLS信號(hào)傳導(dǎo)調(diào)節(jié)。RNLS信號(hào)傳導(dǎo)的抑制與p21表達(dá)的明顯增加相關(guān)聯(lián)。p21是細(xì)胞周期的負(fù)調(diào)節(jié)物，其可以維持細(xì)胞在G0，阻斷G1/S轉(zhuǎn)變，和引起G1或S相間(inter-Sphase)停滯(Jung等，2010CellularSignalling.22:1003-12)。因此，p21表達(dá)的增加可以解釋在用抗RNLS抗體治療的腫瘤中觀察到的細(xì)胞增殖的降低。此外，還已經(jīng)顯示p38影響細(xì)胞周期進(jìn)展(Ono等，2000CellularSignalling.12:1-13)，和通過抗RNLS治療的p38的激活還可以促進(jìn)細(xì)胞周期停滯。這些發(fā)現(xiàn)確認(rèn)了RNLS為可以促進(jìn)癌細(xì)胞的存活和生長(zhǎng)的分泌蛋白，并提供了進(jìn)一步研究抗RNLS療法單獨(dú)或與其它TAM-或黑素瘤-抑制藥物比如CSF-1R抑制劑或MAPK途徑抑制劑分別聯(lián)合用于治療惡性黑素瘤的用途的框架。因?yàn)榇嬖谟糜谡{(diào)節(jié)MAPK和PI3K和JAK/STAT3的多種機(jī)制和由于存在途徑之間的串?dāng)_，因此細(xì)胞命運(yùn)取決于多種信號(hào)的動(dòng)態(tài)平衡和整合，并且該數(shù)據(jù)暗示了RNLS抑制將朝向癌細(xì)胞死亡的平衡傾斜?，F(xiàn)在描述在該實(shí)施例中使用的材料和方法。試劑人黑素瘤細(xì)胞系A(chǔ)375.S2、SkMel28、SkMel5、MeWo和WM266-4獲得自美國(guó)模式培養(yǎng)物保藏所并按照推薦保持。重組人RNLS如所描述的表達(dá)、純化、濃縮和針對(duì)PBS透析(Desir等，JournaloftheAmericanHeartAssociation.2012；1:e002634)。RNLS肽RP220和突變的肽RP220A在UnitedPeptide下合成。兔抗RNLS單克隆抗體(AB178700)、山羊多克隆抗RNLS抗體(AB31291)、山羊IgG和兔IgG購(gòu)買自Abcam。合成抗RNLS單克隆抗體m28-RNLS(也稱為1D-28-4)、m37-RNLS(也稱為1D-37-10)RNLS肽RP-220被綴合至KLH和被用于免疫6只兔子，并且來自選擇的動(dòng)物的脾臟的淋巴細(xì)胞被融合至骨髓瘤細(xì)胞用于雜交瘤生成。雜交瘤上清液針對(duì)rRNLS篩選并且選擇的雜交瘤被克隆和擴(kuò)展用于抗體純化。單克隆抗體從條件性雜交瘤培養(yǎng)物上清液通過A蛋白親和色譜法純化。兩種克隆m28-RNLS(也稱為1D-28-4)、m37-RNLS(也稱為1D-37-10)基于使用BiacoreT100系統(tǒng)測(cè)定的它們的高結(jié)合親和力(分別為0.316和2.67nM的KD)選擇。m28-RNLS的核苷酸序列通過PCR測(cè)定，合成并克隆入哺乳動(dòng)物表達(dá)載體。m28-RNLS，其通過在293-F細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)而合成，通過A蛋白色譜法純化。組織試樣人黑素瘤cDNA陣列I和II獲得自O(shè)riGeneTechnologies(Rockville,MD,USA)。相關(guān)病理學(xué)報(bào)告是線上可獲得的：http://www.origene.com/assets/documents/TissueScan。自USBiomax(Rockville,MD,USA)獲得的人黑素瘤和正常皮膚組織樣本被用于免疫組織化學(xué)或免疫熒光。定量RT-PCR各種基因的相對(duì)表達(dá)水平通過qRT-PCR評(píng)估，如先前描述的(Lee等，2013JAmSocNephrol.24:445-55)。RNLS、2′-5′-寡腺苷酸合成酶1(OAS1)、β-肌動(dòng)蛋白和18srRNA的mRNA水平使用TaqMan基因表達(dá)實(shí)時(shí)PCR分析評(píng)估(AppliedBiosystems,Carlsbad,CA,USA)。結(jié)果表達(dá)為循環(huán)閾值(Ct)。標(biāo)準(zhǔn)化為內(nèi)源對(duì)照18srRNA或β-肌動(dòng)蛋白的目標(biāo)轉(zhuǎn)錄物的相對(duì)定量通過比較Ct方法(ΔCt)測(cè)定并且2-ΔΔCt方法被用于根據(jù)制造商的方案(UserBulletinNo.2,AppliedBiosystems)分析測(cè)試的細(xì)胞系之間基因表達(dá)的相對(duì)改變。免疫組織化學(xué)染色和蛋白質(zhì)印跡分析免疫組織化學(xué)如先前描述的執(zhí)行(Guo等，2012Cancerscience.103:1474-80)。簡(jiǎn)言之，腫瘤組織被福爾馬林固定、石蠟包埋和在載玻片上切成5-μm切片。將載玻片脫蠟并水化合，然后在包含10mM檸檬酸鈉，pH6緩沖液的高壓鍋中抗原修復(fù)。切片在3％的過氧化氫中封閉30min和在PBS/0.1％吐溫20中的2.5％正常馬血清中封閉1h，然后在4℃下用一次抗體和同種型對(duì)照IgG培育過夜。在該研究中使用下列抗體：500ng/ml的m28-RNLS；250ng/ml的山羊多克隆抗RNLS(Abcam,ab31291)；兔單克隆抗CD68(BDBioscience,1:100)；兔單克隆抗CD163(AbDSerotec,1:100)；兔單克隆抗CD86(Abcam,1:100)；兔單克隆抗Ki67(VectorLab,VP-RM04,1:100)；兔單克隆抗p21，磷酸-Tyr705-Stat3，和總Stat3(CellSignalingTechnologies，分別地#2947，1:100，#9145，1:400，和#4904，1:400)。ImmPRESS過氧化物酶-抗兔IgG(VectorLaboratories,Burlingame,CA,USA)被用于檢測(cè)一次抗體。使用VectorDAB底物試劑盒顯色并且用蘇木精(VectorLaboratories)復(fù)染。使用OlympusBX41顯微鏡和照相機(jī)(OlympusAmericaInc,CenterValley,PA,USA)觀察和拍攝載玻片。蛋白質(zhì)印跡分析如先前描述的進(jìn)行(Wang等，2014JournaloftheAmericanSocietyofNephrologyDOI:10.1681/asn.2013060665)。組織微陣列黑素瘤組織微陣列購(gòu)買自USBioMax,Inc.和耶魯組織病理學(xué)服務(wù)中心(Yaletissuepathologyservices)。該研究被耶魯大學(xué)醫(yī)學(xué)院的人類調(diào)查委員會(huì)批準(zhǔn)(HIC協(xié)議號(hào)1003006479)。耶魯黑素瘤組織微陣列如先前描述的構(gòu)建(Berger等，2003Cancerresearch.63:8103-7；Rimm等，2001Cancerjournal.7:24-31)。代表542個(gè)總計(jì)黑素瘤病例的總計(jì)570個(gè)組織核心(tissuecore)和測(cè)量0.6mm的一小系列對(duì)照在單個(gè)載玻片上隔開0.8mm距離。人群從由耶魯大學(xué)醫(yī)學(xué)院的病理學(xué)系的檔案獲得的福爾馬林固定的、石蠟包埋的組織塊構(gòu)建。病理學(xué)家檢查每個(gè)病例以選擇組織微陣列中包含的區(qū)域。將來自試樣的核心活檢放置在具有TissueMicorarrayer(BeecherInstruments,SunPrairie,WI)的組織微陣列上。組織微陣列然后被切成5-μm切片并放置在具有利用UV交聯(lián)的膠帶轉(zhuǎn)移系統(tǒng)(adhesivetapetransfersystem)(Instumedics,Inc.,Hackensack,NJ)的載玻片上。試樣都取材自在1959和1994之間切除的腫瘤的檔案，隨訪范圍為2個(gè)月至38年(中值隨訪時(shí)間，60個(gè)月)。人群特征在先前描述(Berger等，2004Cancerresearch.64:8767-72)。組織微陣列載玻片如先前描述的染色(Berger等，2004Cancerresearch.64:8767-72；Nicholson等，2014JournaloftheAmericanCollegeofSurgeons.219:977-87)。以與對(duì)上面描述的免疫組織化學(xué)處理的相同方式將載玻片脫蠟、再水化、暴露(unmasked)和阻斷。黑素瘤組織陣列在4℃下用在BSA/TBS中稀釋的m28-RNLS加抗S100小鼠單克隆(1:100,Millipore,Temecula,CA,USA)和抗HMB45小鼠單克隆(1:100,ThermoScientific,Fremont,CA,USA)的混合物染色過夜。在BSA/TBS中稀釋的二次抗體Alexa488-綴合的山羊抗小鼠(1:100,MolecularProbes,Eugene,OR)加Envision抗兔(DAKO)在室溫下應(yīng)用1小時(shí)。將載玻片用TBST清洗(三次，每次5分鐘)，然后用Cy5-酪胺(tyramide)(Perkin-ElmerLifeScienceProducts,Boston,MA)培育并通過辣根過氧化物酶激活，導(dǎo)致直接鄰近辣根過氧化物酶-綴合的二次抗體的許多共價(jià)關(guān)聯(lián)的Cy5染料的沉積。使用Cy5是因?yàn)槠浒l(fā)射峰(紅色)充分地在組織自體熒光的綠色-橙色光譜之外。載玻片利用蓋玻片——具有包含4′,6-聯(lián)脒-2-苯基吲哚的ProlongGold抗褪色試劑——密封以顯現(xiàn)細(xì)胞核。細(xì)胞活力分析活細(xì)胞的總細(xì)胞數(shù)和百分比通過錐蟲藍(lán)排除評(píng)估，并且使用BioRadTC10自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)細(xì)胞。對(duì)于另外的研究，細(xì)胞活力根據(jù)制造商的指導(dǎo)使用WST-1試劑(RocheDiagnostics,Indianapolis,IN,USA)測(cè)定。吸光度使用酶標(biāo)儀(microplatereader)(PowerWavesXS,BioTekInstruments,Winooski,VT,USA)讀取。RNA干擾靶向RNLS的四個(gè)單獨(dú)的siRNA和siRNASMART庫(kù)購(gòu)買自Dharmacon(Lafayette,CO,USA)。使用如由制造商指示的DharmaFECT4試劑(Dharmacon)利用RNLSsiRNA或者通用陰性對(duì)照小干擾RNA(對(duì)照siRNA，Dharmacon)轉(zhuǎn)染細(xì)胞。敲低效率通過qPCR測(cè)定。小鼠腫瘤模型雌性無胸腺18–20g裸小鼠(nu/nu)獲得自CharlesRiver(Willimantic,CT)并安置在微型分離器籠中——其具有在無特異性病原體的設(shè)施中高壓蒸汽處理的寢具，12-h白天/黑夜循環(huán)。動(dòng)物任意地接受水和食物，并根據(jù)由VACHSIACUC批準(zhǔn)的研究方案觀察腫瘤生長(zhǎng)、活動(dòng)、進(jìn)食和疼痛的跡象。異種移植腫瘤通過皮下注射A375.S2細(xì)胞(在100μl的PBS，pH7.6中2×106個(gè))建立。當(dāng)腫瘤達(dá)到50–100mm3的體積時(shí)，將小鼠分為對(duì)照組(n＝14，用兔IgG治療，每周一次腹膜內(nèi)注射(IP)40μg，和每3天在腫瘤位點(diǎn)周圍皮下(SQ)40ug)，和實(shí)驗(yàn)組(n＝14)，其接受m28-RNLS(40μgIP，每周一次，和40μgSQ，每3天)。腫瘤大小利用數(shù)顯卡尺測(cè)量并且體積根據(jù)公式(長(zhǎng)度×寬度2)×π/2計(jì)算。在研究結(jié)束時(shí)，處死小鼠，切除腫瘤并立即在液氮中迅速冷凍，并在-80℃下儲(chǔ)存。細(xì)胞凋亡使用TUNEL分析(RocheinsituApoptosisDetectionSystem)根據(jù)制造商的指導(dǎo)檢查。切片通過光學(xué)顯微鏡檢查和細(xì)胞凋亡指數(shù)通過在10個(gè)隨機(jī)選擇的高倍視野(×200放大倍數(shù))中計(jì)數(shù)≥1000個(gè)細(xì)胞測(cè)定。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析Wilcoxon秩和檢驗(yàn)和Mann-WhitneyU檢驗(yàn)分別被用于成對(duì)和未成對(duì)數(shù)據(jù)。當(dāng)適合于非參數(shù)重復(fù)測(cè)量時(shí)，ANOVA(Friedman檢驗(yàn))被用于評(píng)估統(tǒng)計(jì)顯著性。當(dāng)Friedman檢驗(yàn)揭示統(tǒng)計(jì)顯著性時(shí)，Dunn檢驗(yàn)被用于成對(duì)比較。也實(shí)行Kaplan-Meier存活分析和多變量Cox回歸分析。所有的數(shù)據(jù)是平均值±平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差(平均值±SEM)，并且P<0.05的值被接受為統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的差別。組織陣列數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析使用軟件，版本21.0(SPSSInc.,Chicago,IL,USA)進(jìn)行?，F(xiàn)在描述該實(shí)施例的結(jié)果。黑素瘤中的RNLS過表達(dá)為了確定RNLS表達(dá)在正常人皮膚和惡性黑素瘤之間是否有區(qū)別，檢查跨越正常皮膚進(jìn)展至良性痣至原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性黑素瘤的組織微陣列(TMAs；YaleTissueMicroarrayFacilityandUSBiomax,Inc.)。耶魯TMA包含福爾馬林固定的、石蠟包埋的試樣，其獲得自在1959到1994之間收集的192個(gè)原發(fā)性黑素瘤的人群、自1997到2004收集的246個(gè)連續(xù)的原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性黑素瘤的人群、具有良性痣的295個(gè)患者的人群和來自15個(gè)患者的匹配的正常皮膚試樣。這些組織微陣列的人口統(tǒng)計(jì)資料和臨肺特征已經(jīng)在先前描述(GouldRothberg等，2009Journalofclinicaloncology:officialjournaloftheAmericanSocietyofClinicalOncology.27:5772-80)。USBiomax陣列包含74個(gè)試樣，其包括35個(gè)原發(fā)性黑素瘤、11個(gè)轉(zhuǎn)移性病灶、14個(gè)良性痣和14個(gè)正常樣本。使用定量、自動(dòng)的免疫熒光(IF)顯微鏡檢查系統(tǒng)(AQUA)檢查RNLS蛋白表達(dá)的大約600個(gè)組織斑點(diǎn)(histospot)揭示從正常皮膚至良性痣至原發(fā)性惡性黑素瘤至轉(zhuǎn)移性黑素瘤的進(jìn)展通過RNLS表達(dá)的顯著增加完成(圖17A-C分別地p＝0.009，p＝0.0003，和p<0.001)。問題是失調(diào)的RNLS表達(dá)和信號(hào)傳導(dǎo)是否可以促進(jìn)黑素瘤生長(zhǎng)，并且因此，充當(dāng)預(yù)后標(biāo)記。檢查來自從1997到2004收集的246個(gè)連續(xù)的原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性樣本的人群的每個(gè)原發(fā)性黑素瘤。一百一十九個(gè)患者具有適合于通過AQUA技術(shù)評(píng)估的組織斑點(diǎn)。在該組中，將其腫瘤表達(dá)高RNLS水平(RNLSAQUA得分>中值A(chǔ)QUA得分75,764.45)的患者的結(jié)果與具有低RNLS表達(dá)的那些結(jié)果進(jìn)行比較。高RNLS表達(dá)與增加的黑素瘤特異性死亡相關(guān)聯(lián)：5年和10年疾病特異性存活率分別為55％對(duì)69％和39.7％對(duì)58.5％，p＝0.008(圖17D)。在該人群的多變量分析之后，發(fā)現(xiàn)RNLS水平獨(dú)立地預(yù)測(cè)黑素瘤中的存活率(p＝0.004，HR＝3.130)。也發(fā)現(xiàn)診斷時(shí)的疾病階段(p＝0.05，HR＝3.940)、克拉克水平(p＝0.015，HR＝1.687)和原發(fā)性腫瘤的潰瘍(p＝0.001,HR＝2.54)獨(dú)立地預(yù)測(cè)黑素瘤細(xì)胞中的存活率。這些發(fā)現(xiàn)暗示RNLS表達(dá)可以充當(dāng)黑素瘤中的有用預(yù)后標(biāo)記，并且可以幫助鑒定具有更加侵略性表型的患者子集。RNLS過表達(dá)有利于癌細(xì)胞存活RNLS介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)是抗細(xì)胞凋亡的，并且保護(hù)暴露于毒性應(yīng)激的正常細(xì)胞免于細(xì)胞凋亡死亡(Wang等，2014JAmSocNephrol.；Lee等，2013JAmSocNephrol.24:445-55)。為了探索RNLS信號(hào)傳導(dǎo)是否有利于癌細(xì)胞的存活，將重組RNLS(rRNLS)或牛血清白蛋白(BSA)加入至培養(yǎng)中的血清-饑餓的黑素瘤細(xì)胞(A375.S2，MeWo，SkMel5，和SkMel28)，并測(cè)定細(xì)胞活力。與BSA相比，RNLS顯著地增加血清-饑餓細(xì)胞的存活，并引起如通過WST-1分析測(cè)量的增殖速率的明顯增加(n＝6，p<0.05，圖18A)。利用RNLS治療的那些的活細(xì)胞的總細(xì)胞數(shù)和百分比被計(jì)數(shù)以確定增殖速率的明顯增加是由于細(xì)胞增殖的增加還是由于細(xì)胞凋亡速率的降低。如圖18B中所示，用RNLS治療顯示了與利用BSA治療的那些相比增加的細(xì)胞計(jì)數(shù)，和增加的活細(xì)胞百分比，這暗示RNLS起抗細(xì)胞凋亡的存活因子的功能。RNLS信號(hào)傳導(dǎo)的抑制在體外對(duì)黑素瘤細(xì)胞具有細(xì)胞毒性使用三種途徑來確定抑制黑素瘤中RNLS表達(dá)和信號(hào)傳導(dǎo)的功能后果。首先，評(píng)價(jià)降低RNLS表達(dá)對(duì)細(xì)胞活力的作用。通過siRNA的RNLS敲低顯著降低了黑素瘤細(xì)胞系A(chǔ)375.S2和SkMel28的活力(分別地，p＝0.03和p＝0.003，圖19A)。第二，由于RNLS肽RP-220模擬rRNLS的保護(hù)性作用和信號(hào)傳導(dǎo)特性，因此已經(jīng)推斷它可能與胞外RNLS的受體的關(guān)鍵區(qū)相互作用并且針對(duì)它定向的抗體可以具有抑制特性。因此，針對(duì)RP-220的一組單克隆抗體被開發(fā)，并且它們對(duì)癌細(xì)胞存活的作用被測(cè)試。兩種單克隆抗體針對(duì)RNLS生成，[克隆#28-4(m28-RNLS)、37-10(m37-RNLS)]降低了測(cè)試的所有(總共5個(gè))黑素瘤細(xì)胞系的活力，并且代表性的實(shí)例在圖19B-C中示出。m28-RNLS表明了增加的細(xì)胞毒性水平與增加的治療濃度相關(guān)聯(lián)(p<0.05，圖19B)。第三，肽拮抗劑(RP-220A)通過降低RP-220的凈電荷生成(3個(gè)賴氨酸/精氨酸改變?yōu)楸彼?，圖19D)。RP220A不介導(dǎo)RNLS依賴性信號(hào)傳導(dǎo)，而是結(jié)合至PMCA4b并拮抗內(nèi)源RNLS的作用(Wang等，2015PLoSONE.10:e0122932)。RP-220A證明為在增加劑量中對(duì)培養(yǎng)中的黑素瘤細(xì)胞具有細(xì)胞毒性(p<0.005，圖19D)。RNLS信號(hào)傳導(dǎo)的抑制阻斷體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)A375.S2(人黑素瘤)細(xì)胞被皮下注入無胸腺裸小鼠以生成腫瘤。一旦腫瘤達(dá)到約50mm3的體積，則用對(duì)照兔IgG或RNLS中和單克隆抗體m28-RNLS治療動(dòng)物，因?yàn)樨灤┭芯烤S持總體動(dòng)物健康和活動(dòng)，因此抗體治療似乎不是毒性的。每隔一天測(cè)量腫瘤大小，并且利用m28-RNLS的治療在所有的測(cè)試點(diǎn)處減小了腫瘤體積(p<0.05，圖20A)。由于在一些動(dòng)物中的總體腫瘤大小和潰瘍，在第11天時(shí)處死動(dòng)物。來自具有細(xì)胞增殖標(biāo)記Ki67的異種移植的腫瘤的切片的IHC染色揭示了在用抗RNLS抗體治療的腫瘤內(nèi)的細(xì)胞增殖對(duì)用兔IgG治療的那些的顯著降低：對(duì)照組中35.1±2.3個(gè)陽(yáng)性細(xì)胞/高倍視野對(duì)在RNLSAb治療的組中13.4±3.0個(gè)，n＝14，p＝0.0004(圖20B)。RNLS信號(hào)傳導(dǎo)的抑制阻斷內(nèi)源RNLS表達(dá)和STAT3激活并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期停滯已知STAT3結(jié)合至RNLS基因的啟動(dòng)子區(qū)并增加其表達(dá)，并且陽(yáng)性RNLS-STAT3反饋環(huán)已經(jīng)被暗示(Sonawane等，2014Biochemistry.53(44):6878–6892)。這種關(guān)系通過免疫熒光組織染色和對(duì)來自用對(duì)照IgG和m28-RNLS治療的異種移植腫瘤的細(xì)胞溶胞產(chǎn)物的研究進(jìn)一步調(diào)查。在腫瘤樣本中注意到RNLS與磷酸化和總STAT3的顯著共表達(dá)(圖21A)，如通過IF評(píng)估的。用m28-RNLS的治療引起RNLS蛋白表達(dá)，以及總的和磷酸化的STAT3二者的大幅度減少(圖21A)。蛋白表達(dá)的改變通過如圖21B-C中示出的蛋白質(zhì)印跡證實(shí)。在用m28-RNLS治療的腫瘤中，在酪氨酸705處的STAT3磷酸化(p-Y705-STAT3)和總STAT3顯著降低(n＝8，p<0.005，圖21B-C)。為了測(cè)試RNLS表達(dá)的顯著降低是否主要發(fā)生在黑素瘤細(xì)胞中，人和小鼠特異性引物被用于擴(kuò)增腫瘤塊中的腫瘤(人)和內(nèi)源(小鼠)RNLS。如在圖21D中描繪的，用m28-RNLS的治療引起小鼠RNLS表達(dá)的顯著降低，而不影響人(腫瘤)表達(dá)，這暗示腫瘤浸潤(rùn)細(xì)胞在RNLS產(chǎn)生和分泌中起關(guān)鍵作用。此外，注意到細(xì)胞周期抑制劑p21的增加的表達(dá)?？贵w治療顯著地增加了腫瘤樣本中細(xì)胞周期調(diào)節(jié)物p21的表達(dá)：抗體治療的組中24.2±2.4個(gè)陽(yáng)性細(xì)胞對(duì)比對(duì)照組中12.2±1.0個(gè)，n＝14，p＝0.009(圖21E)。末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶dUTP切口末端標(biāo)記(TUNEL)染色揭示了與對(duì)照組相比在抗體治療的腫瘤中經(jīng)歷細(xì)胞凋亡的細(xì)胞的平均數(shù)目的顯著增加，平均值為13.3±0.6個(gè)陽(yáng)性細(xì)胞對(duì)4.3±0.2個(gè)，n＝14，p<0.001，(圖21E)。細(xì)胞凋亡的增加與p38MAPK的磷酸化，和B細(xì)胞淋巴瘤2相關(guān)蛋白Bax的后續(xù)激活時(shí)間上相關(guān)(圖21F)。這些數(shù)據(jù)表明用抗RNLS抗體治療引起總的和磷酸化的STAT3的顯著降低，降低細(xì)胞增殖，和增加腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞凋亡。RNLS信號(hào)傳導(dǎo)的抑制增加CD86+與CD163+TAM的比率黑素細(xì)胞似乎不是黑素瘤組織斑點(diǎn)中RNLS的主要來源，因?yàn)樵赗NLS和黑素細(xì)胞染色之間注意到存在最小重疊(圖17A)。黑素瘤常常具有包括巨噬細(xì)胞在內(nèi)的免疫細(xì)胞的顯著浸潤(rùn)。浸潤(rùn)性巨噬細(xì)胞似乎促進(jìn)大多數(shù)腫瘤樣RNLS作為在與全巨噬細(xì)胞標(biāo)記CD68顯著重疊的每個(gè)組織斑點(diǎn)中注意到的RNLS染色的實(shí)質(zhì)成分(圖22A上圖)。在進(jìn)一步研究之后，確定了RNLS主要地與CD163+(M2樣)TAM共表達(dá)(圖22A中圖)。RNLS與CD86+(M1樣)巨噬細(xì)胞的共表達(dá)是最小的(圖22A，下圖)。M2樣(CD163+)巨噬細(xì)胞與免疫逃逸相關(guān)聯(lián)并顯示為促進(jìn)癌癥發(fā)展和傳播，而M1樣(CD86+)巨噬細(xì)胞通常為促炎的，并且抑制腫瘤生長(zhǎng)(Biswas等，2010NatImmunol.11:889-96；Mantovani等，TrendsinImmunology.23:549-55)。用m28-RNLS抗體治療異種移植體導(dǎo)致CD163+TMA的數(shù)目的相當(dāng)大的降低，并且剩余的細(xì)胞不表達(dá)可檢測(cè)水平的RNLS(圖22B)。實(shí)施例3：通過質(zhì)膜鈣ATPasePMCA4b的持續(xù)腎酶信號(hào)傳導(dǎo)促進(jìn)胰腺癌生長(zhǎng)由于RNLS起參與在胰腺癌中失調(diào)的MAPK和PI3K途徑的存活因子的作用，并且因?yàn)槠浔磉_(dá)受信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)物和轉(zhuǎn)錄激活因子STAT3調(diào)節(jié)(Sonawane等，2014Biochemistry.53(44):6878–6892)，因此已經(jīng)假定了RNLS表達(dá)和信號(hào)傳導(dǎo)的異常調(diào)節(jié)可以對(duì)癌細(xì)胞提供存活優(yōu)勢(shì)，并促進(jìn)腫瘤形成(Guo等，2014CurrOpinNephrolHypertens.23(5):513-8)。本文顯示了RNLS表達(dá)在數(shù)種類型的癌癥中和在患有胰腺導(dǎo)管腺癌(PDAC)的患者的人群中增加，總存活與腫瘤中RNLS表達(dá)負(fù)相關(guān)，這暗示RNLS的致病作用。使用siRNA抑制RNLS表達(dá)或抑制性RNLS抗體降低了培養(yǎng)的PDAC細(xì)胞活力。在異種移植小鼠模型中，RNLS單克隆抗體m28-RNLS通過下調(diào)STAT3以及上調(diào)p21和p38抑制PDAC生長(zhǎng)，并引起細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期停滯。腫瘤細(xì)胞中RNLS表達(dá)的下調(diào)導(dǎo)致PMCA4b(RNLS受體)表達(dá)的等量降低并導(dǎo)致腫瘤大小的減小，這與利用抑制性RNLS抗體觀察到的類似。這些結(jié)果揭示了癌癥中RNLS途徑的先前未認(rèn)知的促存活功能，顯示了RNLS表達(dá)可以充當(dāng)預(yù)后標(biāo)記，并鑒定胰腺癌處理的新型治療靶點(diǎn)。對(duì)于在PDAC中增加的RNLS表達(dá)的致病作用，和對(duì)于抑制RNLS信號(hào)傳導(dǎo)的治療實(shí)用性，在此提供了證據(jù)。此外，介導(dǎo)RNLS信號(hào)傳導(dǎo)的抑制劑的觀察到的抗腫瘤活性的分子機(jī)制正在被探索。共同考慮，這些發(fā)現(xiàn)表明了上調(diào)的RNLS介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)在PDAC中起致病作用。此處示出了高RNLS腫瘤表達(dá)與總體3年死亡率的兩倍增加相關(guān)聯(lián)，這支持使用RNLS作為診斷或預(yù)后標(biāo)記。而且，由于RNLS是分泌蛋白，因此其可以被用作腫瘤的初次診斷的生物標(biāo)記，或者被用作治療應(yīng)答或復(fù)發(fā)的替代標(biāo)記。RNLS介導(dǎo)的細(xì)胞保護(hù)作用的主要機(jī)制似乎是其激活A(yù)KT、ERK和STAT，增加抗細(xì)胞凋亡因子Bcl2，和阻止效應(yīng)物胱天蛋白酶的激活的能力(Wang等，2014JournaloftheAmericanSocietyofNephrology.DOI:10.1681/asn.2013060665)。Panc1細(xì)胞中RNLS信號(hào)傳導(dǎo)的抑制與p38MAPK的持續(xù)激活和細(xì)胞凋亡相關(guān)聯(lián)。p38是已經(jīng)牽連于炎癥、細(xì)胞分化、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)和細(xì)胞凋亡的應(yīng)激激活激酶(Ono等，2000CellularSignalling.12(1):1-13)。例如，神經(jīng)生長(zhǎng)因子停藥引起細(xì)胞凋亡以及JNK和p38的持續(xù)激活，和ERK的下調(diào)(Xia等，1995Science.270(5240):1326-31)。但是，由于在某些條件下，p38的抑制可以阻斷細(xì)胞凋亡(Ono等，2000CellularSignalling.12(1):1-13)，因此p38在細(xì)胞凋亡過程中的作用明確地是環(huán)境依賴性的。本文描述的數(shù)據(jù)與如下解釋一致：在Panc1細(xì)胞中，p38的m28-RNLS依賴性激活與細(xì)胞凋亡相關(guān)聯(lián)。RNLS信號(hào)傳導(dǎo)的抑制明顯降低了胰腺癌的異種移植體中Ki-67的表達(dá)。由于Ki-67被用于評(píng)估細(xì)胞分裂的水平，因此數(shù)據(jù)與如下解釋一致：RNLS抑制降低腫瘤的增殖速率。確定細(xì)胞周期進(jìn)展的許多關(guān)鍵因素已經(jīng)被鑒定，并且包括細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(CDK)和兩類內(nèi)源CKD抑制劑，即細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶4的抑制劑(INK4)和CDK互作蛋白/激酶抑制劑(CIP/KIP)蛋白家族(Jung等，2010CellularSignalling.22(7):1003-12)。數(shù)據(jù)揭示p21——其為屬于IP/KIP家族的CDK抑制劑——的表達(dá)受RNLS信號(hào)傳導(dǎo)的調(diào)節(jié)。RNLS信號(hào)傳導(dǎo)的抑制與p21表達(dá)的明顯增加相關(guān)聯(lián)。由于p21是細(xì)胞周期的負(fù)調(diào)節(jié)物，其可以維持細(xì)胞在G0，阻斷G1/S轉(zhuǎn)變和引起G1或s相間停滯(Jung等，2010CellularSignalling.22(7):1003-12)，因此其上調(diào)可以解釋在用m28-RNLS治療的腫瘤中觀察到的細(xì)胞增殖的降低。此外，也已經(jīng)顯示p38影響細(xì)胞周期進(jìn)展(Ono等，2000CellularSignalling.12(1):1-13)，和其通過抗RNLS治療的激活也可以促進(jìn)細(xì)胞周期停滯。調(diào)節(jié)RNLS基因表達(dá)的調(diào)節(jié)性啟動(dòng)子元件和轉(zhuǎn)錄因子已經(jīng)在近來被研究(Sonawane等，2014Biochemistry.53(44):6878–6892)，并且這些數(shù)據(jù)指出STAT3的關(guān)鍵作用。結(jié)果暗示RNLS和STAT3之間的前饋環(huán)：上調(diào)STAT3的信號(hào)增加RNLS基因表達(dá)，并且RNLS又增加STAT3活性。RNLS和STAT3之間的這樣的相互作用對(duì)于RNLS信號(hào)傳導(dǎo)在癌癥的發(fā)病機(jī)理中的作用具有重要的啟示。STAT家族蛋白，特別是STAT3，牢固地牽連于促進(jìn)惡性轉(zhuǎn)化和癌癥進(jìn)展的炎性微環(huán)境的誘發(fā)和維持(Yu等，2009NatRevCancer.9(11):798-809)。STAT3信號(hào)傳導(dǎo)通常在癌細(xì)胞中持久地激活，并且這樣的激活不僅驅(qū)動(dòng)腫瘤細(xì)胞增殖，而且增加在腫瘤微環(huán)境中支撐炎癥的大量基因的產(chǎn)生。癌細(xì)胞與非轉(zhuǎn)化和基質(zhì)細(xì)胞之間的STAT3前饋環(huán)已經(jīng)在癌癥中證明(Catlett-Falcone等，1999Immunity.10(1):105-15；Yu等，2007NatRevImmunol.7(1):41-51；Ara等，2009CancerRes.69(1):329-37)。例如，STAT3在多發(fā)性骨髓瘤患者中組成性地激活。在IL-6依賴性人骨髓瘤細(xì)胞系U266中，IL-6發(fā)信號(hào)通過詹納斯激酶以激活STAT3，其又上調(diào)抗細(xì)胞凋亡因子，并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的存活(Catlett-Falcone等，1999Immunity.10(1):105-15)。同樣，STAT3在大多數(shù)胰腺導(dǎo)管腺癌中組成性地激活，并且對(duì)于KRAS誘導(dǎo)的胰腺腫瘤發(fā)生的開始和進(jìn)展似乎是需要的(Corcoran等，2011CancerRes.71(14):5020-9)。STAT3途徑和RNLS在PDAC發(fā)展中也可以具有促進(jìn)最普遍和重要的環(huán)境因素——吸煙——的作用(Muscat等，1997Cancerepidemiology,biomarkers&prevention:apublicationoftheAmericanAssociationforCancerResearch,cosponsoredbytheAmericanSocietyofPreventiveOncology.6(1):15-9；Boyle等，1996InternationaljournalofCancerJournalinternationalducancer.67(1):63-71；Fuchs等，1996Archivesofinternalmedicine.156(19):2255-60)。尼古丁——香煙的一種關(guān)鍵成分，已經(jīng)顯示為加強(qiáng)癌癥中的增殖和血管生成的速率(Heeschen等，2002JClinInvest.110(4):527-36；Heeschen等，2001NatMed.7(7):833-9)。尼古丁的腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的作用被認(rèn)為通過其與乙酰膽堿受體α-7nACHR的相互作用介導(dǎo)，導(dǎo)致JAK-STAT3和MEK-ERK1-2下游的信號(hào)傳導(dǎo)級(jí)聯(lián)(Momi等，2013Oncogene.32(11):1384-95)。在這個(gè)背景下，尼古丁通過Sp1和STAT3的協(xié)同作用增加RNLS啟動(dòng)子活性(Sonawane等，2014Biochemistry.53(44):6878–6892)。PMCA4b先前已經(jīng)被表征為在細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)、心臟肥厚和癌癥中涉及的質(zhì)膜ATPase(Cartwright等，2007AnnalsoftheNewYorkAcademyofSciences.1099(1):247-53；Pinton等，2001EMBOJ.20(11):2690–2701；Oceandy等，2011BiochimicaetBiophysicaActa(BBA)-MolecularCellResearch.1813(5):974-8)。其將Ca2+從細(xì)胞溶膠運(yùn)輸至外環(huán)境，并且似乎調(diào)節(jié)局部鈣濃度。除了其在調(diào)節(jié)細(xì)胞質(zhì)的Ca2+中的作用之外，PMCA4b也是可以發(fā)信號(hào)通過Ras和MAPK的大分子復(fù)合物的中心(Ara等，2009CancerRes.69(1):329-37；Corcoran等，2011CancerRes.71(14):5020-9；Muscat等，1997Cancerepidemiology,biomarkers&prevention:apublicationoftheAmericanAssociationforCancerResearch,cosponsoredbytheAmericanSocietyofPreventiveOncology.6(1):15-9)。例如，PMCA4b通過其與腫瘤抑制因子RASSF1的相互作用調(diào)節(jié)Ras信號(hào)傳導(dǎo)和ERK激活(Armesilla等，2004JournalofBiologicalChemistry.279(30):31318-28)。數(shù)據(jù)表明RNLS發(fā)信號(hào)通過PMCA4b，PMCA4b表達(dá)的下調(diào)或其酶功能的抑制對(duì)胰腺癌細(xì)胞具有細(xì)胞毒性。這些發(fā)現(xiàn)暗示PMCA4b在PDAC的處理中代表治療靶點(diǎn)?？傊?，這些發(fā)現(xiàn)證明RNLS是可以促進(jìn)PDAC的存活和生長(zhǎng)的分泌蛋白。這提供了進(jìn)一步研究抑制RNLS的療法用于治療癌癥的應(yīng)用的框架。在這個(gè)背景下，RNLS調(diào)節(jié)介導(dǎo)在癌癥中活躍的MAPK、PI3K和JAK-STAT3的多種相互關(guān)聯(lián)的信號(hào)，該分子可能是特別有吸引力的治療靶點(diǎn)(圖27E)?，F(xiàn)在描述在該實(shí)施例中使用的材料和方法試劑人導(dǎo)管胰腺腺癌細(xì)胞系BxPC-3、Panc1和MiaPaCa-2獲得自美國(guó)模式培養(yǎng)物保藏所(ATCC)(Manassas,VA,USA)和按照推薦保持。p38和STAT3阻斷劑SB203580和Stattic購(gòu)買自Abcam(Cambridge,UK)。JNK抑制劑SP600125和ERK抑制劑U0126分別獲得自SigmaAldrich(St.Louis,MO,USA)和CellSignalingTechnologies(BeverlyMA,USA)。重組人RNLS(rRNLS)表達(dá)、純化、濃縮和針對(duì)PBS透析，如先前所述的(Desir等，2012JAmHeartAssoc.1(4):e002634)。兔抗RNLS單克隆(AB178700)、山羊多克隆抗RNLS(AB31291)、山羊IgG和兔IgG購(gòu)買自Abcam。合成抗RNLS單克隆抗體m28-RNLS(也稱為1D-28-4)、m37-RNLS(也稱為1D-37-10)RNLS肽RP-220被綴合至KLH和被用于免疫6只兔子，并且來自選擇的動(dòng)物的脾臟的淋巴細(xì)胞被融合至骨髓瘤細(xì)胞用于雜交瘤生成。雜交瘤上清液針對(duì)rRNLS篩選并且選擇的雜交瘤被克隆和擴(kuò)展用于抗體純化。單克隆抗體從條件性雜交瘤培養(yǎng)物上清液通過A蛋白親和色譜法純化。兩種克隆m28-RNLS、m37-RNLS基于使用BiacoreT100系統(tǒng)測(cè)定的它們的高結(jié)合親和力(分別為0.316和2.67nM的KD)選擇。m28-RNLS的核苷酸序列通過PCR測(cè)定，合成并克隆入哺乳動(dòng)物表達(dá)載體。m28-RNLS，其通過在293-F細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)而合成，通過A蛋白色譜法純化。組織試樣人癌癥cDNA陣列(篩選cDNA陣列I和II，胰腺癌cDNA陣列)獲得自O(shè)riGeneTechnologies(Rockville,MD,USA)。相關(guān)病理學(xué)報(bào)告是線上可獲得的：www.origene.com/assets/documents/TissueScan。自USBiomax(Rockville,MD,USA)獲得的人胰腺癌和正常組織樣本被用于免疫組織化學(xué)或免疫熒光。定量PCR各種基因的相對(duì)表達(dá)水平通過qPCR評(píng)估。RNLS、2′-5′-寡腺苷酸合成酶1(OAS1)、β-肌動(dòng)蛋白和18srRNA的mRNA水平使用TaqMan基因表達(dá)實(shí)時(shí)PCR分析評(píng)估(AppliedBiosystems,Carlsbad,CA,USA)。結(jié)果表達(dá)為循環(huán)閾值(Ct)。標(biāo)準(zhǔn)化為內(nèi)源對(duì)照18srRNA或β-肌動(dòng)蛋白的目標(biāo)轉(zhuǎn)錄物的相對(duì)定量通過比較Ct方法(ΔCt)測(cè)定并且2-ΔΔCt方法被用于根據(jù)制造商的方案(UserBulletinNo.2,AppliedBiosystems)分析測(cè)試的細(xì)胞系之間基因表達(dá)的相對(duì)改變。免疫組織化學(xué)染色和蛋白質(zhì)印跡分析免疫組織化學(xué)如先前描述的執(zhí)行(Guo等，2012Cancerscience.103:1474-80)。簡(jiǎn)言之，腫瘤組織被福爾馬林固定、石蠟包埋和在載玻片上切成5-μm切片。將載玻片脫蠟并水化合，然后在包含10mM檸檬酸鈉，pH6緩沖液的高壓鍋中抗原修復(fù)。切片在3％的過氧化氫中封閉30min和在PBS/0.1％吐溫20中的2.5％正常馬血清中封閉1h，然后在4℃下用一次抗體和同種型對(duì)照IgG培育過夜。在該研究中使用下列抗體：500ng/ml的m28-RNLS；250ng/ml的山羊多克隆抗RNLS(Abcam,ab31291)；兔單克隆抗Ki67(VectorLab,VP-RM04,1:100)；兔單克隆抗p21和磷酸-Tyr705-Stat3(CellSignalingTechnologies，分別地#2947，1:100和#9145，1:400)。ImmPRESS過氧化物酶-抗兔IgG(VectorLaboratories,Burlingame,CA,USA)被用于檢測(cè)一次抗體。使用VectorDAB底物試劑盒顯色并且用蘇木精(VectorLaboratories)復(fù)染。使用OlympusBX41顯微鏡和照相機(jī)(OlympusAmericaInc,CenterValley,PA,USA)觀察和拍攝載玻片。蛋白質(zhì)印跡分析如先前描述的進(jìn)行(Wang等，2014JournaloftheAmericanSocietyofNephrology.DOI:10.1681/asn.2013060665)。組織微陣列胰腺組織微陣列購(gòu)買自USBioMax。組織微陣列載玻片如先前描述的染色(Nicholson等，2014JournaloftheAmericanCollegeofSurgeons.219:977-87)。簡(jiǎn)言之，試樣用m28-RNLS和小鼠單克隆全細(xì)胞角蛋白抗體(1:100,DAKOM3515)在4℃下共染色過夜。二次抗體Alexa488-綴合的山羊抗小鼠(1:100,MolecularProbes,Eugene,OR)和Envision抗兔(DAKO)在室溫下應(yīng)用1小時(shí)。將載玻片用Tris緩沖鹽水清洗(三次，每次5分鐘)，和用Cy5-酪胺(Perkin-ElmerLifeScienceProducts,Boston,MA)培育并通過辣根過氧化物酶激活。使用Cy5是因?yàn)槠浒l(fā)射峰(紅色)在組織自體熒光的綠色-橙色光譜之外。載玻片利用蓋玻片——具有包含4′,6-聯(lián)脒-2-苯基吲哚的ProlongGold抗褪色試劑——密封以促進(jìn)顯現(xiàn)細(xì)胞核。細(xì)胞活力分析細(xì)胞活力通過錐蟲藍(lán)排除評(píng)估，并且使用BioRadTC10自動(dòng)計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)細(xì)胞。對(duì)于一些研究，細(xì)胞活力如先前所述的(Wang等，2014JournaloftheAmericanSocietyofNephrology.DOI:10.1681/asn.2013060665)使用WST-1試劑(RocheDiagnostics,Indianapolis,IN,USA)測(cè)定。細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期分析對(duì)于細(xì)胞周期分析，培養(yǎng)的細(xì)胞使用10mMEDTA解離，用冰冷的70％乙醇固定，用RNAseA消化，并用碘化丙錠染色。碘化丙錠(Propidium)染色使用BDFACSCalibur流式細(xì)胞儀(BDBiosciences,SanJose,CA,USA)檢測(cè)，并使用CellQuest軟件分析。細(xì)胞凋亡根據(jù)先前的檢測(cè)和定量(Guo等，2012CancerScience.103(8):1474-80)。簡(jiǎn)言之，細(xì)胞用FITC標(biāo)記的膜聯(lián)蛋白-V和碘化丙錠根據(jù)制造商的指導(dǎo)(BenderMedSystems,Burlingame,CA,USA)染色。至少20,000個(gè)事件在BDFACSCalibur流式細(xì)胞儀(BDBiosciences,SanJose,CA,USA)上收集并使用CellQuest軟件分析。RNA干擾靶向RNLS的四個(gè)單獨(dú)的siRNA和siRNASMART庫(kù)購(gòu)買自Dharmacon(Lafayette,CO,USA)。使用如由制造商指示的DharmaFECT4試劑(Dharmacon)利用RNLSsiRNA或者通用陰性對(duì)照siRNA(對(duì)照siRNA，Dharmacon)轉(zhuǎn)染細(xì)胞。為了生成穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的Panc1細(xì)胞系，利用攜帶RNLSshRNA(sh-RNLS)或?qū)φ誷hRNA(sh-對(duì)照)的慢病毒(SantaCruz)根據(jù)制造商的方案轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞。細(xì)胞被轉(zhuǎn)導(dǎo)兩次以增加shRNA拷貝數(shù)目并且在80μg/ml嘌呤霉素中選擇10天之后，建立穩(wěn)定的克隆。敲低效率通過qPCR測(cè)定。小鼠異種移植腫瘤模型雌性無胸腺18–20g裸小鼠(nu/nu)獲得自CharlesRiver(Willimantic,CT)并安置在微型分離器籠中——其具有在無特異性病原體的設(shè)施中高壓蒸汽處理的寢具，12-h白天/黑夜循環(huán)。動(dòng)物任意地接受水和食物，并根據(jù)由VACHSIACUC批準(zhǔn)的研究方案觀察腫瘤生長(zhǎng)、活動(dòng)、進(jìn)食和疼痛的跡象。異種移植腫瘤通過皮下注射BxPC3細(xì)胞(在100μl，pH7.6的PBS中2×106個(gè))建立。當(dāng)腫瘤達(dá)到50–100mm3的體積時(shí)，將小鼠分為對(duì)照組(n＝14，用兔IgG治療，腹膜內(nèi)注射(IP)40μg)，和實(shí)驗(yàn)組(n＝14)，其接受m28-RNLS(40μgIP，每3天)。腫瘤大小利用數(shù)顯卡尺測(cè)量并且體積根據(jù)公式(長(zhǎng)度×寬度2)×π/2計(jì)算。在另一組動(dòng)物(n＝6每組)中，sh-RNLS或sh-對(duì)照Panc1細(xì)胞(在100μl，pH7.6的PBS中2×106個(gè))被皮下注射。這些動(dòng)物不接受進(jìn)一步治療，并且腫瘤大小和體積被測(cè)量持續(xù)多達(dá)30天。在研究結(jié)束時(shí)，處死小鼠，切除腫瘤并立即在液氮中迅速冷凍，并在-80℃下儲(chǔ)存。細(xì)胞凋亡使用TUNEL分析(RocheinsituApoptosisDetectionSystem)根據(jù)制造商的指導(dǎo)檢查。切片通過光學(xué)顯微鏡檢查和細(xì)胞凋亡指數(shù)通過在5個(gè)隨機(jī)選擇的高倍視野(×200放大倍數(shù))中計(jì)數(shù)≥1000個(gè)細(xì)胞測(cè)定。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析Wilcoxon秩和檢驗(yàn)和Mann-WhitneyU檢驗(yàn)分別被用于成對(duì)和未成對(duì)數(shù)據(jù)。當(dāng)適合時(shí)，非參數(shù)重復(fù)測(cè)量ANOVA(Friedman檢驗(yàn))被用于評(píng)估統(tǒng)計(jì)顯著性。當(dāng)Friedman檢驗(yàn)揭示統(tǒng)計(jì)顯著性時(shí)，Dunn檢驗(yàn)被用于成對(duì)比較。所有的數(shù)據(jù)是平均值±平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差(平均值±SEM)，并且P<0.05的值被接受為統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的差別。組織陣列數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析使用軟件，版本21.0(SPSSInc.,Chicago,IL,USA)進(jìn)行?，F(xiàn)在描述該實(shí)施例的結(jié)果。PDAC中的RNLS過表達(dá)和與降低的存活的關(guān)聯(lián)性為了確定RNLS表達(dá)在正常和癌癥組織中是否有區(qū)別，通過使用定量PCR(qPCR)篩選商業(yè)可得的人組織cDNA陣列檢查15種不同類型的癌癥。RNLS表達(dá)在胰腺癌、膀胱癌和乳腺癌中，以及在黑素瘤中顯著的增加(圖23A)。由于它們的特別差的存活和有限的治療選擇，因此焦點(diǎn)在胰腺癌上。RNLS表達(dá)在PDAC(～3倍)和胰腺神經(jīng)內(nèi)分泌(8倍)腫瘤二者中升高(圖23B)。使用抗RNLS單克隆m28-RNLS的免疫細(xì)胞化學(xué)研究顯示了RNLS表達(dá)在PDAC等級(jí)1-4中存在并且主要地定位至癌細(xì)胞，如圖23C和28中所示的。大部分RNLS似乎在癌細(xì)胞中具有細(xì)胞質(zhì)分布；它存在于所有腫瘤等級(jí)中，但是在更加分化的癌癥(等級(jí)I-III)中是最明顯的。在胰腺的神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤中，RNLS遍及腫瘤在細(xì)胞中表達(dá)(圖29)。RNLS基因表達(dá)在具有KRAS突變的胰腺導(dǎo)管腺癌(PDACC)細(xì)胞系(MiaPaCa2和Panc1)中比具有野生型KRAS的那些比如BxPC3中更大(圖30)?；加蠵DAC的69個(gè)患者中的RNLS表達(dá)使用組織微陣列(TMA)表征，該微陣列由福爾馬林固定的、石蠟包埋的腫瘤核心以及匹配的鄰近正常組織組成。從其獲得樣本的個(gè)體的人口統(tǒng)計(jì)資料和臨肺特征在表3中示出。使用無偏差的、定量的、自動(dòng)的免疫顯微鏡檢查系統(tǒng)(AQUA)(GouldRothberg等，2009JournalofClinicalOncology.27(34):5772-80)檢查來自成對(duì)的PDAC腫瘤和它們的非腫瘤鄰近組織的138個(gè)組織斑點(diǎn)的RNLS蛋白表達(dá)，顯示了總RNLS水平在PDAC腫瘤中比在它們鄰近的非腫瘤胰腺組織中大2倍(p<0.001，圖23D)。表3：患有PDAC的患者人群的特征為了確定加強(qiáng)的RNLS表達(dá)是否可以影響PDAC的臨肺行為，表達(dá)水平是否影響預(yù)后的問題被詢問。其腫瘤表達(dá)高RNLS水平(n＝34，RNLSAQUA得分>中值)的個(gè)體具有大大降低的3年存活率(24％對(duì)49％，p＝0.024，圖23E)。這些發(fā)現(xiàn)表明RNLS表達(dá)的腫瘤水平在PADC中可以是有用的預(yù)后標(biāo)記，并且?guī)椭b定具有更有侵略性表型的患者子集。RNLS發(fā)信號(hào)通過PMCA4b和起胰腺癌細(xì)胞的存活因子的功能RNLS介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)保護(hù)暴露于毒性應(yīng)激的HK-2細(xì)胞免于細(xì)胞凋亡(Lee等，2013JAmSocNephrol.24(3):445-55；Wang等，2014JournaloftheAmericanSocietyofNephrology.DOI:10.1681/asn.2013060665)。為了探索RNLS信號(hào)傳導(dǎo)是否對(duì)暴露于應(yīng)激的胰腺導(dǎo)管腺癌細(xì)胞(PDACC)提供存活優(yōu)勢(shì)，從培養(yǎng)的BxPC3、Panc1和MiaPaCa2細(xì)胞撤回血清持續(xù)48小時(shí)，并將重組RNLS(rRNLS)或牛血清白蛋白(BSA)加入至培養(yǎng)基持續(xù)另外的72小時(shí)；總的和活的(錐蟲藍(lán)排除)細(xì)胞計(jì)數(shù)被測(cè)定。與BSA相比，rRNLS增加PDACC存活率2到5倍(圖24A)。已經(jīng)顯示了通過將rRNLS添加至暴露于過氧化氫或順鉑損害(injury)的HK-2細(xì)胞賦予的細(xì)胞保護(hù)作用取決于ERK激活(Lee等，2013JAmSocNephrol.24(3):445-55；Wang等，2014JournaloftheAmericanSocietyofNephrology.DOI:10.1681/asn.2013060665)。圖24B中示出的結(jié)果表明rRNLS還以ERK依賴性方式提高PDACC存活，這是因?yàn)槔肬0126——MAPK激酶MEK1的抑制劑——的預(yù)治療廢除了rRNLS的保護(hù)作用。關(guān)于PMCA4b在胰腺癌中RNLS依賴性信號(hào)傳導(dǎo)中的作用的證據(jù)通過使用siRNA特異性地下調(diào)PMCA4b表達(dá)獲得。在對(duì)照研究中，非靶向siRNA既不影響PMCA4b基因表達(dá)也不影響RNLS介導(dǎo)的ERK磷酸化(圖24C)。相比之下，PMCA4b靶向的siRNA降低基因表達(dá)超過90％，并降低RNLS依賴性ERK磷酸化約70％(圖24C)。PMCA4b抑制對(duì)RNLS介導(dǎo)的STAT3磷酸化沒有可辨別的作用，這暗示存在另外的RNLS受體(一種或多種)。在rRNLS的存在下觀察到的PDAC細(xì)胞數(shù)目的增加與阻止細(xì)胞死亡和/或增加細(xì)胞增殖的RNLS信號(hào)傳導(dǎo)一致。RNLS對(duì)細(xì)胞周期的作用通過熒光活化細(xì)胞分選(FACS)分析檢查以確定PDACC活力的明顯增加是由于增加的細(xì)胞增殖還是由于死亡細(xì)胞率的降低。如圖24D中所示，與利用BSA的治療相比，rRNLS對(duì)細(xì)胞周期進(jìn)展沒有作用，這表明RNLS不影響增殖過程，而是阻止細(xì)胞死亡，并起存活因子的功能。RNLS信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的抑制劑阻斷胰腺癌生長(zhǎng)為了確定抑制胰腺癌細(xì)胞中的RNLS表達(dá)和信號(hào)傳導(dǎo)的功能后果，通過siRNA的RNLS敲低來評(píng)價(jià)降低RNLS表達(dá)對(duì)體外細(xì)胞活力的作用。這種治療顯著地降低了PDACC系Panc1和MiaPaCa2的活力(圖25A和31)。由于RNLS肽RP-220模擬rRNLS的保護(hù)性作用和信號(hào)傳導(dǎo)特性，因此已經(jīng)推斷它可能與胞外RNLS的受體的關(guān)鍵區(qū)相互作用，并且針對(duì)它生成的抗體可以是抑制性的。從針對(duì)RP-220在兔中生成的一組單克隆抗體中，兩種克隆m28-RNLS、m37-RN基于它們的高結(jié)合親和力(KD分別為0.316和2.67nM)選擇。m28-RNLS、m37-RNLS和商業(yè)可得的多克隆(針對(duì)RP-220的部分序列)對(duì)PDACC生長(zhǎng)的抑制作用由在圖25B和25C中描繪的代表性的實(shí)例示出。在培養(yǎng)的細(xì)胞中的這些研究暗示RNLS可以通過自分泌/旁分泌途徑起作用以刺激PDACC生長(zhǎng)。為了確定RNLS信號(hào)傳導(dǎo)的抑制是否影響體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)，shRNA被用于生成兩種穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的Panc1細(xì)胞系：一種包含非靶向的shRNA(sh-對(duì)照)，和另一種具有RNLS-靶向的shRNA(sh-RNLS)。sh-RNLS細(xì)胞中的RNLS表達(dá)降低超過90％，如通過qPCR評(píng)估的(圖31)。出人意料地，通過RNLS-靶向的shRNA抑制RNLS表達(dá)導(dǎo)致其受體PMCA4b的表達(dá)的明顯降低，這暗示RNLS和PMCA4b表達(dá)被共同調(diào)節(jié)(圖32)。轉(zhuǎn)染的細(xì)胞被皮下注入無胸腺裸小鼠并且腫瘤大小在30天時(shí)期內(nèi)評(píng)估。從第8天到第30天，當(dāng)動(dòng)物被處死時(shí)，通過sh-RNLS生成的腫瘤體積與sh-對(duì)照細(xì)胞的腫瘤體積相比顯著更小(圖25D)。由于通過宿主小鼠的RNLS產(chǎn)生和分泌不受影響，因此這些結(jié)果表明sh-RNLS腫瘤細(xì)胞對(duì)于循環(huán)RNLS是無反應(yīng)的，這是由于RNLS受體PMCA4b的伴隨抑制。為了評(píng)價(jià)抑制性抗體的治療潛力，將BxPC3細(xì)胞皮下注入用對(duì)照兔IgG或m28-RNLS治療的無胸腺裸小鼠，并且測(cè)量腫瘤體積持續(xù)上至3周。如在圖25E中所示出，與兔IgG相比，m28-RNLS治療引起腫瘤體積的顯著減小。在培養(yǎng)的PDACC細(xì)胞和在PDACC的體內(nèi)模型中的這些研究一起提供了引人注目的證據(jù)：RNLS途徑調(diào)節(jié)胰腺癌生長(zhǎng)并且可以充當(dāng)治療靶點(diǎn)。通過m28-RNLS誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期停滯來自用兔IgG或m28-RNLS治療以降低RNLS水平的小鼠的BxPC3異種移植腫瘤的切片揭示了抗體治療的腫瘤中細(xì)胞凋亡的～2倍增加(TUNEL染色)(圖26A)：m28-RNLS對(duì)IgG；28.4±3.3個(gè)陽(yáng)性細(xì)胞/高倍視野對(duì)IgG-14.8±2.3個(gè)，n＝14，p＝0.002。對(duì)培養(yǎng)中的Panc1細(xì)胞的FACS分析確認(rèn)了m28-RNLS引起細(xì)胞凋亡(圖26B和33)。用m28-RNLS抗體治療引起了p38MAPK的持續(xù)磷酸化，其在治療后第1天時(shí)開始(圖26C)。BxPC3腫瘤的m28-RNLS治療還導(dǎo)致細(xì)胞增殖標(biāo)記Ki67的表達(dá)的2.5倍降低(m28-RNLS對(duì)IgG：IgG，137.1±14.9個(gè)對(duì)340.2±11.9個(gè)陽(yáng)性細(xì)胞/高倍視野，n＝14，p＝1.4x10-8)(圖26D，上圖)，和細(xì)胞周期調(diào)節(jié)物p21表達(dá)的約4倍增加(m28-RNLS對(duì)IgG：IgG，178.1±11.4個(gè)對(duì)42.2±4.7.6個(gè)陽(yáng)性細(xì)胞/高倍視野，n＝14，p＝1.6x10-10)(圖26D，下圖)。進(jìn)行Panc1細(xì)胞的FACS分析以檢查RNLS信號(hào)傳導(dǎo)抑制對(duì)細(xì)胞周期的作用。圖26E中示出的數(shù)據(jù)確定了RNLS抑制引起細(xì)胞凋亡，如通過大的前-G1峰的出現(xiàn)證明的。它們還揭示了G2中的明顯降低，這表明通過m28-RNLS抑制RNLS信號(hào)傳導(dǎo)引起前-G1細(xì)胞周期停滯。陽(yáng)性RNLS-STAT3反饋環(huán)的存在和其被m28-RNLS中斷STAT3結(jié)合至RNLS基因的啟動(dòng)子區(qū)并增加其表達(dá)(Sonawane等，2014Biochemistry.53(44):6878–6892)。陽(yáng)性RNLS-STAT3反饋環(huán)通過如下觀察暗示：在用RNLS治療的HK-2細(xì)胞中，在絲氨酸727(p-Ser727-STAT3)和酪氨酸705(p-Y705-STAT3)處的STAT3磷酸化分別增加2和4倍，但是STAT1不受影響(圖34)。如圖27A-B中描繪的，將RNLS添加至PDACC系Panc1引起了磷酸化的STAT3(p-Ser727-STAT3和p-Y705-STAT3)的快速增加。對(duì)RNLS-STAT3反饋環(huán)的另外的支持由如下發(fā)現(xiàn)提供：通過m28-RNLS抑制Panc1中的RNLS信號(hào)傳導(dǎo)導(dǎo)致p-Y705-STAT3的持久的和持續(xù)的降低(圖27C-D)。序列<SEQIDNO:1-抗原序列1a；PRT；智人>AVWDKADDSGGRMTTAC<SEQIDNO:2-抗原序列1b；PRT；智人>AVWDKAEDSGGRMTTAC<SEQIDNO:3-抗原序列1c；PRT；智人>CTPHYAKKHQRFYDEL<SEQIDNO:4-抗原序列1d；PRT；智人>CIRFVSIDNKKRNIESSEIGP<SEQIDNO:5-抗原序列1e；PRT；智人>PGQMTLHHKPFLAC<SEQIDNO:6-抗原序列1f；PRT；智人>CVLEALKNYI<SEQIDNO:7-抗原序列3a；PRT；智人>PSAGVILGC<SEQIDNO:8-人腎酶-1蛋白(在位置37處導(dǎo)致谷氨酸氨基酸的多態(tài)性)；PRT；智人>MAQVLIVGAGMTGSLCAALLRRQTSGPLYLAVWDKAEDSGGRMTTACSPHNPQCTADLGAQYITCTPHYAKKHQRFYDELLAYGVLRPLSSPIEGMVMKEGDCNFVAPQGISSIIKHYLKESGAEVYFRHRVTQINLRDDKWEVSKQTGSPEQFDLIVLTMPVPEILQLQGDITTLISECQRQQLEAVSYSSRYALGLFYEAGTKIDVPWAGQYITSNPCIRFVSIDNKKRNIESSEIGPSLVIHTTVPFGVTYLEHSIEDVQELVFQQLENILPGLPQPIATKCQKWRHSQVTNAAANCPGQMTLHHKPFLACGGDGFTQSNFDGCITSALCVLEALKNYI<SEQIDNO:9-1D-28-4全長(zhǎng)重鏈氨基酸；PRT；家兔>METGLRWLLLVAVLKGVQCQSVEESGGRLVTPGTPLTLTCTVSGFSLSSFAVGWVRQAPGKGLEYIGIISSVGITRYASWAAGRFTISKTSTTVDLKITSPTTEDTATYFCARYGYSGDVNRLDLWGQGTLVTVSSGQPKAPSVFPLAPCCGDTPSSTVT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