適合神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療的HGF制劑的制作方法

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本發(fā)明涉及含有肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(Hepatocyte Growth Factor，以下在本說(shuō)明書中有時(shí)簡(jiǎn)稱為“HGF”)蛋白的制劑。更詳細(xì)而言，本發(fā)明涉及含有HGF蛋白的冷凍干燥制劑、注射液等制劑。另外，本發(fā)明還涉及含有HGF蛋白的適合中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療的冷凍干燥制劑、注射液等制劑。

背景技術(shù)：

HGF是作為對(duì)成熟肝細(xì)胞具有生長(zhǎng)促進(jìn)活性的生理活性蛋白被發(fā)現(xiàn)的(例如參考非專利文獻(xiàn)1)。通過(guò)之后的研究獲知，HGF蛋白不僅作用于肝細(xì)胞，還作用于很多上皮系細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等，參與組織和器官的損傷的修復(fù)與再生(參考非專利文獻(xiàn)2)。HGF蛋白可利用生物工程的方法以重組蛋白的形式大量生產(chǎn)(例如參考非專利文獻(xiàn)3)，重組HGF蛋白不僅作為對(duì)肝炎和肝硬化的治療藥應(yīng)用，而且還可以期待作為對(duì)腎病、創(chuàng)傷等的治療藥應(yīng)用(參考非專利文獻(xiàn)2)。

另一方面，通過(guò)近年來(lái)的包括基因敲除/敲入小鼠的方法在內(nèi)的基因表達(dá)和功能解析中的諸多研究還表明，HGF蛋白還具有促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的存活和神經(jīng)突起的伸長(zhǎng)的作用，也是作為神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的重要因子(參考非專利文獻(xiàn)4和5)。

HGF蛋白對(duì)海馬神經(jīng)元、多巴胺能神經(jīng)元、小腦顆粒細(xì)胞、感覺(jué)神經(jīng)元和運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元等神經(jīng)細(xì)胞顯示出神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子活性(參考非專利文獻(xiàn)6)。尤其是，HGF蛋白對(duì)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元顯示出強(qiáng)力的存活促進(jìn)作用(參考非專利文獻(xiàn)7)，其活性可與已知對(duì)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元具有最強(qiáng)的存活促進(jìn)作用的、來(lái)自膠質(zhì)細(xì)胞株的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(GDNF)的活性相匹敵。

基于這樣的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)活性，有報(bào)道稱HGF蛋白可用作針對(duì)以肌萎縮側(cè)索硬化(ALS)和脊髄損傷為代表的各種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療藥(參考專利文獻(xiàn)1～3、非專利文獻(xiàn)5、8和9)。

蛋白質(zhì)藥品通常注射到靜脈內(nèi)、皮下或肌肉內(nèi)。但是，已知通過(guò)這些給藥途徑進(jìn)行給藥的蛋白質(zhì)由于位于腦組織與血管之間的血腦屏障的存在而極難轉(zhuǎn)移至中樞神經(jīng)組織中。因此，為了將HGF蛋白用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療，為了直接將HGF蛋白送達(dá)中樞神經(jīng)組織，認(rèn)為有效的是鞘內(nèi)給藥或腦室內(nèi)給藥而非為了常規(guī)的器官疾病的治療而進(jìn)行的靜脈內(nèi)注射、皮下或肌肉內(nèi)注射這樣的給藥途徑(參考非專利文獻(xiàn)8和9)。鞘內(nèi)給藥和腦室內(nèi)給藥是在針對(duì)腦腫瘤的抗癌劑治療中也使用的給藥途徑。另外，出于治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的的目的，也考慮將HGF蛋白直接給藥至腦實(shí)質(zhì)內(nèi)或脊髄實(shí)質(zhì)內(nèi)。

在HGF蛋白的藥品化方面，需要開(kāi)發(fā)穩(wěn)定化的HGF蛋白制劑。作為HGF蛋白制劑，專利文獻(xiàn)4中公開(kāi)了在HGF蛋白(也稱為TCF-II)中含有白蛋白、人血清、明膠、山梨醇、甘露醇和木糖醇等作為穩(wěn)定劑的水溶液制劑(參考專利文獻(xiàn)4)。但是，該HGF水溶液制劑具有在保存中發(fā)生HGF蛋白凝集、白濁、凝膠化的難題，并且存在會(huì)形成HGF蛋白的聚合物(HGF聚合物)等物理化學(xué)穩(wěn)定性低、生物活性降低的問(wèn)題。

為了抑制這種聚合物形成，例如，專利文獻(xiàn)5中公開(kāi)了在HGF中含有精氨酸、賴氨酸、組氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、谷氨酸、天冬氨酸等作為穩(wěn)定劑的冷凍干燥HGF制劑(參考專利文獻(xiàn)5)。另外，專利文獻(xiàn)6中公開(kāi)了在HGF中含有甘氨酸、丙氨酸、山梨醇、甘露醇和硫酸葡聚糖等作為穩(wěn)定劑的冷凍干燥HGF制劑(參考專利文獻(xiàn)6)。此外，專利文獻(xiàn)7中公開(kāi)了在HGF中添加有精制蔗糖和丙氨酸等的冷凍干燥HGF制劑(參考專利文獻(xiàn)7)。

由這樣的制劑制備的注射液對(duì)于為了通常的器官疾病的治療而進(jìn)行的靜脈內(nèi)注射、皮下或肌肉內(nèi)注射而言認(rèn)為是安全的，但是，例如，在鞘內(nèi)給藥和腦室內(nèi)給藥的情況下，將HGF蛋白直接給藥至中樞神經(jīng)系統(tǒng)，需要充分確認(rèn)包括制劑中所添加的各種成分在內(nèi)的制劑成分對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的安全性。在以往公開(kāi)的HGF制劑中，尚未已知在用于鞘內(nèi)給藥或腦室內(nèi)給藥、或者脊髄實(shí)質(zhì)內(nèi)給藥或腦實(shí)質(zhì)內(nèi)給藥時(shí)也確認(rèn)為安全的制劑。

期望一種能夠用于為了治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病而進(jìn)行鞘內(nèi)給藥或腦室內(nèi)給藥、或者脊髄實(shí)質(zhì)內(nèi)給藥或腦實(shí)質(zhì)內(nèi)給藥的、安全性高的HGF制劑。

現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)

專利文獻(xiàn)

專利文獻(xiàn)1：國(guó)際公開(kāi)第2002/22162號(hào)(對(duì)應(yīng)美國(guó)公開(kāi)號(hào)US 2003/0176347)

專利文獻(xiàn)2：國(guó)際公開(kāi)第2007/122976號(hào)(對(duì)應(yīng)美國(guó)專利號(hào)US 8575099)

專利文獻(xiàn)3：國(guó)際公開(kāi)第2008/105507號(hào)(對(duì)應(yīng)美國(guó)專利號(hào)US 8518880)

專利文獻(xiàn)4：國(guó)際公開(kāi)第90/10651號(hào)(對(duì)應(yīng)歐洲專利號(hào)EP 0462277)

專利文獻(xiàn)5：國(guó)際公開(kāi)第00/72873號(hào)(對(duì)應(yīng)歐洲專利號(hào)EP 1180368)

專利文獻(xiàn)6：日本特開(kāi)平9-25241號(hào)公報(bào)(對(duì)應(yīng)美國(guó)專利號(hào)US 7173008)

專利文獻(xiàn)7：國(guó)際公開(kāi)第2008/102849號(hào)(對(duì)應(yīng)美國(guó)專利號(hào)US8461112)

非專利文獻(xiàn)

非專利文獻(xiàn)1：T.Nakamura等、Biochem.Biophys.Res.Commun.,第122卷,第1450頁(yè),1984年

非專利文獻(xiàn)2：T.Nakamura等、J.Gastroenterol.Hepatol.,第26卷,Suppl.1、第188-202頁(yè)(2011年)

非專利文獻(xiàn)3：Jeong Soo Park等、Protein Expr.Purif.,第70卷,第231-235頁(yè)(2010年)

非專利文獻(xiàn)4：Flavio Maina等、Nat.Neurosci.,第2卷,第213-217頁(yè)(1999年)

非專利文獻(xiàn)5：Funakoshi H等、Current Signal Transduction Therapy第6卷,第156-167頁(yè)(2011年)

非專利文獻(xiàn)6：Honda,S.等、Brain Res.Mol.Brain Res.第32卷,第197-210頁(yè)(1995年)

非專利文獻(xiàn)7：Allen Ebens等、Neuron、第17卷,第1157-1172頁(yè)(1996年)

非專利文獻(xiàn)8：Ishigaki A等、J Neuropathol Exp Neurol.,第66卷,第1037-1044頁(yè)(2007年)

非專利文獻(xiàn)9：Kitamura K等、PLoS One.,第6卷:e27706(2011年)

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

發(fā)明所要解決的問(wèn)題

本發(fā)明的課題在于提供一種能夠用于鞘內(nèi)給藥或腦室內(nèi)給藥、或者脊髄實(shí)質(zhì)內(nèi)給藥或腦實(shí)質(zhì)內(nèi)給藥來(lái)治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的、對(duì)中樞神經(jīng)的安全性高的注射液等HGF制劑。為了能夠作為實(shí)用的藥物使用，HGF制劑通常需要穩(wěn)定性也優(yōu)良。另外，本發(fā)明的課題還在于提供穩(wěn)定性優(yōu)良的注射液、冷凍干燥制劑等HGF制劑。

用于解決問(wèn)題的手段

本發(fā)明人們?yōu)榱私鉀Q上述課題反復(fù)進(jìn)行了深入研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，通過(guò)在HGF蛋白中添加乳糖、甘氨酸、氯化鈉、pH緩沖劑和表面活性劑，可抑制HGF蛋白的聚合物生成，并且發(fā)現(xiàn)，含有這些成分的HGF溶液能夠作為穩(wěn)定的HGF注射液使用，以及，通過(guò)將該HGF溶液冷凍干燥，能夠得到穩(wěn)定的HGF冷凍干燥制劑。此外還發(fā)現(xiàn)，含有這些成分的HGF注射液對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的毒性極小，對(duì)中樞神經(jīng)等神經(jīng)系統(tǒng)的安全性高。

本發(fā)明人們基于這些見(jiàn)解進(jìn)一步進(jìn)行了研究，從而完成了本發(fā)明。本發(fā)明的HGF制劑在作為藥品使用的方面具有充分的穩(wěn)定性，例如，本發(fā)明的HGF注射液可以為了治療ALS、脊髄損傷等各種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病而安全地給藥至鞘內(nèi)或腦室內(nèi)、或者脊髄實(shí)質(zhì)內(nèi)或腦實(shí)質(zhì)內(nèi)。

即，本發(fā)明提供以下的HGF制劑。

(1)一種HGF制劑，其特征在于，以肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)蛋白作為有效成分，進(jìn)一步含有乳糖、甘氨酸、氯化鈉、pH緩沖劑和表面活性劑。

(2)如上述(1)所述的HGF制劑，其為冷凍干燥制劑。

(3)如上述(2)所述的HGF制劑，其為將含有肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)蛋白、乳糖、甘氨酸、氯化鈉、pH緩沖劑和表面活性劑的水溶液冷凍干燥而得到的冷凍干燥制劑。

(4)如上述(1)～(3)中任一項(xiàng)所述的HGF制劑，其中，乳糖的含量相對(duì)于HGF 1重量份為0.1～50重量份。

(5)如上述(3)所述的HGF制劑，其中，水溶液中的乳糖的濃度為0.1～100mg/mL。

(6)如上述(3)所述的HGF制劑，其中，水溶液中的甘氨酸的濃度為0.05～50mg/mL。

(7)如上述(3)所述的HGF制劑，其中，水溶液中的HGF蛋白濃度為0.05～40mg/mL。

(8)如上述(1)所述的HGF制劑，其中，pH緩沖劑為檸檬酸或其水合物與檸檬酸的鹽的組合。

(9)如上述(1)所述的HGF制劑，其中，表面活性劑為聚山梨酯。

(10)如上述(1)所述的HGF制劑，其為注射液。

(11)如上述(10)所述的HGF制劑，其中，注射液是將上述(2)所述的冷凍干燥制劑溶解于藥學(xué)上可接受的溶劑而得到的水溶液。

(12)如上述(1)所述的HGF制劑，其用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療。

(13)如上述(12)所述的HGF制劑，其中，中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病為肌萎縮側(cè)索硬化(ALS)、阿爾茨海默病、帕金森病、亨廷頓氏舞蹈癥、脊髓小腦變性癥、脊髄損傷、腦梗塞、腦缺血和多發(fā)性硬化中的任一種。

(14)如上述(1)所述的HGF制劑，其特征在于，其為給藥至鞘內(nèi)、腦室內(nèi)、脊髄實(shí)質(zhì)內(nèi)或腦實(shí)質(zhì)內(nèi)的制劑。

(15)如上述(10)所述的HGF制劑，其中，注射液中的乳糖的濃度為0.1～100mg/mL。

(16)如上述(10)所述的HGF制劑，其中，注射液中的甘氨酸的濃度為0.05～50mg/mL。

(17)如上述(10)所述的HGF制劑，其中，注射液中的HGF蛋白濃度為0.05～40mg/mL。

(18)如上述(1)所述的HGF制劑，其中，HGF蛋白為來(lái)源于人的HGF蛋白。

(19)如上述(18)所述的HGF制劑，其中，HGF蛋白為由序列編號(hào)5或序列編號(hào)6所表示的氨基酸序列構(gòu)成的蛋白質(zhì)。

(20)如上述(1)所述的HGF制劑，其中，HGF蛋白為與序列編號(hào)5所表示的氨基酸序列具有80％以上的序列同一性的蛋白質(zhì)，且為具有作為HGF的生物活性的蛋白質(zhì)。

另外，本發(fā)明涉及利用乳糖、甘氨酸、氯化鈉、pH緩沖劑和表面活性劑使HGF水溶液或HGF冷凍干燥制劑中的HGF穩(wěn)定的方法，更詳細(xì)而言，涉及抑制HGF蛋白的聚合物生成的方法。

此外，本發(fā)明涉及將上述(1)所述的HGF制劑給藥至罹患中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的患者的鞘內(nèi)、腦室內(nèi)、脊髄實(shí)質(zhì)內(nèi)或腦實(shí)質(zhì)內(nèi)而治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的方法。

發(fā)明效果

本發(fā)明的HGF制劑作為制劑是穩(wěn)定的，且能夠安全地對(duì)中樞神經(jīng)使用。例如，本發(fā)明的HGF注射液對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的安全性高，可以為了治療ALS、脊髄損傷等各種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病而給藥至鞘內(nèi)或腦室內(nèi)、或者脊髄實(shí)質(zhì)內(nèi)或腦實(shí)質(zhì)內(nèi)。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明的HGF制劑以HGF蛋白作為有效成分，進(jìn)一步含有乳糖、甘氨酸、氯化鈉、pH緩沖劑和表面活性劑。

本發(fā)明的HGF制劑可以含有HGF蛋白以外的有效成分(藥效成分)，但優(yōu)選不含有HGF蛋白以外的有效成分。

本發(fā)明的HGF制劑的劑型沒(méi)有特別限定，優(yōu)選例如冷凍干燥制劑、注射液等非經(jīng)口給藥的劑型等。冷凍干燥制劑優(yōu)選為注射用冷凍干燥制劑。

注射液是指能夠直接注射到生物體內(nèi)的液態(tài)組合物。在本發(fā)明的HGF制劑為注射液的情況下，有時(shí)僅簡(jiǎn)稱為“HGF注射液”。

另外，冷凍干燥制劑是指其成分以冷凍干燥體的固體狀態(tài)提供的制劑。在本發(fā)明的HGF制劑為冷凍干燥制劑的情況下，有時(shí)僅簡(jiǎn)稱為“HGF冷凍干燥制劑”。冷凍干燥制劑通常在用時(shí)使用適當(dāng)?shù)娜軇?溶解液)進(jìn)行溶解，將其溶液直接作為注射液，或者根據(jù)期望進(jìn)一步稀釋至適當(dāng)?shù)娜軇┑戎兄笞鳛樽⑸湟哼M(jìn)行給藥。即，可以說(shuō)在冷凍干燥制劑中添加任意的溶劑將其溶解而得到的溶液與注射液實(shí)質(zhì)上是同等的。

本發(fā)明的HGF制劑優(yōu)選為以HGF蛋白作為有效成分、進(jìn)一步含有乳糖、甘氨酸、氯化鈉、pH緩沖劑和表面活性劑的冷凍干燥制劑。另外，以HGF蛋白作為有效成分、進(jìn)一步含有乳糖、甘氨酸、氯化鈉、pH緩沖劑和表面活性劑的HGF注射液也是本發(fā)明的HGF制劑的優(yōu)選實(shí)施方式之一。

本發(fā)明的HGF制劑對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的安全性高。本發(fā)明的HGF注射液等HGF制劑對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的毒性極低，因此例如可以給藥至鞘內(nèi)或腦室內(nèi)、或者脊髄實(shí)質(zhì)內(nèi)或腦實(shí)質(zhì)內(nèi)，能夠適合用于各種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療等。

作為本發(fā)明中的HGF蛋白，種沒(méi)有特別限定，可以適當(dāng)使用各種動(dòng)物來(lái)源的HGF蛋白(天然型HGF蛋白或利用基因工程技術(shù)制造的重組蛋白)等。本發(fā)明中，例如，優(yōu)選使用來(lái)源于應(yīng)用本發(fā)明的HGF制劑的動(dòng)物的HGF蛋白。例如，作為在本發(fā)明中使用的HGF蛋白，在將本發(fā)明的制劑應(yīng)用于人的情況下，優(yōu)選使用來(lái)源于人的HGF蛋白(以下有時(shí)也稱為人HGF蛋白)。更優(yōu)選為重組人HGF蛋白。在將本發(fā)明的HGF制劑對(duì)人以外的哺乳動(dòng)物使用的情況下，優(yōu)選使用來(lái)源于這些動(dòng)物種的HGF，例如，可以使用來(lái)源于猴、牛、馬、豬、山羊、犬、貓、大叔、小鼠、兔、倉(cāng)鼠、豚鼠、黑猩猩等的HGF蛋白。另外，本發(fā)明中使用的HGF蛋白可以是缺失了5個(gè)氨基酸殘基的缺失型(dHGF)。

人HGF蛋白例如優(yōu)選由序列編號(hào)1或序列編號(hào)2所表示的堿基序列構(gòu)成的DNA所編碼的蛋白質(zhì)等。更具體而言，優(yōu)選由序列編號(hào)3所表示的氨基酸序列構(gòu)成的蛋白質(zhì)、由序列編號(hào)4所表示的氨基酸序列構(gòu)成的蛋白質(zhì)、由序列編號(hào)5所表示的氨基酸序列構(gòu)成的蛋白質(zhì)、由序列編號(hào)6所表示的氨基酸序列構(gòu)成的蛋白質(zhì)等。其中，作為人HGF蛋白，優(yōu)選具有序列編號(hào)5或序列編號(hào)6所表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，更優(yōu)選由序列編號(hào)5或序列編號(hào)6所表示的氨基酸序列構(gòu)成的蛋白質(zhì)。例如，由序列編號(hào)6所表示的氨基酸序列構(gòu)成的HGF蛋白是序列編號(hào)5所表示的氨基酸序列的第131～135位的5個(gè)氨基酸殘基發(fā)生缺失的5氨基酸缺失型HGF蛋白(dHGF)。具有序列編號(hào)5或序列編號(hào)6所表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)這兩者均為人體內(nèi)天然存在的HGF蛋白(天然型HGF蛋白)，具有作為HGF的促細(xì)胞分裂(mitogen)活性、促細(xì)胞運(yùn)動(dòng)(motogen)活性等。

本發(fā)明中使用的HGF蛋白還包含與各種動(dòng)物來(lái)源的HGF蛋白(天然型HGF蛋白)的氨基酸序列具有至少約80％以上的序列同一性、優(yōu)選具有約90％以上的序列同一性、更優(yōu)選具有約95％以上的序列同一性、且具有作為HGF的生物活性(促細(xì)胞分裂活性和促細(xì)胞運(yùn)動(dòng)活性)的蛋白質(zhì)。關(guān)于氨基酸序列的“序列同一性”，是指將蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較時(shí)序列之間的構(gòu)成各個(gè)序列的氨基酸殘基的一致性，“％以上”是指其一致的程度。

HGF蛋白具有上述促細(xì)胞分裂活性和促細(xì)胞運(yùn)動(dòng)活性例如可以通過(guò)J.Biol.Chem.273,22913-22920,1998中記載的方法來(lái)確認(rèn)。優(yōu)選使用按照上述J.Biol.Chem.273,22913-22920,1998測(cè)定的促細(xì)胞分裂活性和促細(xì)胞運(yùn)動(dòng)活性與天然型HGF蛋白相比較通常為約50％以上、優(yōu)選為約70％以上、更優(yōu)選為約80％以上、進(jìn)一步優(yōu)選為約90％以上的蛋白質(zhì)。

作為與HGF蛋白具有上述序列同一性的蛋白質(zhì)，可以列舉例如包含序列編號(hào)5或6所表示的氨基酸序列中置換、缺失和/或插入1個(gè)～幾個(gè)氨基酸殘基而得到的氨基酸序列、或者對(duì)1個(gè)～幾個(gè)氨基酸殘基進(jìn)行修飾而得到的氨基酸序列等、且具有作為HGF的生物活性的蛋白質(zhì)。

“幾個(gè)”通常是指1個(gè)～8個(gè)(1、2、3、4、5、6、7、8個(gè))，通常為8個(gè)、優(yōu)選為6個(gè)、更優(yōu)選為5個(gè)、進(jìn)一步優(yōu)選為3個(gè)、特別優(yōu)選為2個(gè)。插入的氨基酸或置換的氨基酸優(yōu)選天然氨基酸，但也可以為由基因編碼的20種氨基酸以外的非天然氨基酸。非天然氨基酸只要具有氨基和羧基，則可以為任何化合物，可以列舉例如γ-氨基丁酸等。

對(duì)氨基酸殘基進(jìn)行置換是將多肽中的氨基酸殘基用其他氨基酸殘基置換，優(yōu)選為保守性置換。“保守性置換”是指以實(shí)質(zhì)上不改變多肽活性的方式將1個(gè)～幾個(gè)氨基酸殘基利用其他的化學(xué)性質(zhì)類似的氨基酸殘基進(jìn)行置換。可以列舉例如將某一疏水性氨基酸殘基利用其他疏水性氨基酸殘基進(jìn)行置換的情況、將某一極性氨基酸殘基利用具有相同電荷的其他極性氨基酸殘基進(jìn)行置換的情況等。能夠進(jìn)行這種置換的功能上類似的氨基酸對(duì)于每種氨基酸而言是該技術(shù)領(lǐng)域中公知的。作為具有非極性(疏水性)側(cè)鏈的氨基酸，可以列舉甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、脯氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸等。作為具有極性側(cè)鏈的氨基酸中的中性氨基酸，可以列舉絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、半胱氨酸等。作為具有正電荷(堿性)的氨基酸，可以列舉精氨酸、組氨酸、賴氨酸等。另外，作為具有負(fù)電荷(酸性)的氨基酸，可以列舉天冬氨酸、谷氨酸等。

本發(fā)明的制劑中含有的HGF蛋白可以僅為一種，也可以為兩種以上的上述HGF蛋白。

本發(fā)明的制劑中使用的HGF蛋白只要為純化至能夠作為藥物使用的程度的HGF蛋白，則可以使用利用各種方法制備的HGF蛋白。作為HGF蛋白的制備方法，已知有各種方法，例如可以從大鼠、牛、馬、山羊等哺乳動(dòng)物的肝臟、脾臟、肺臟、骨髄、腦、腎臟、胎盤等器官、血小板、白細(xì)胞等血液細(xì)胞、或者血漿、血清等中提取和純化而得到。

作為從上述生物體組織等中提取純化HGF蛋白的方法，例如，可以對(duì)大鼠進(jìn)行四氯化碳腹腔內(nèi)給藥，摘取形成肝炎狀態(tài)的大鼠的肝臟并粉碎，通過(guò)利用S-瓊脂糖凝膠、肝素瓊脂糖凝膠等的柱色譜、HPLC等通常的蛋白質(zhì)純化法進(jìn)行純化。

另外，也可以對(duì)產(chǎn)生HGF蛋白的原代培養(yǎng)細(xì)胞或細(xì)胞系進(jìn)行培養(yǎng)，從培養(yǎng)物(培養(yǎng)上清、培養(yǎng)細(xì)胞等)中分離純化而得到HGF蛋白?；蛘撸梢岳没蚬こ痰姆椒▽⒕幋aHGF蛋白的基因(優(yōu)選由序列編號(hào)1或2所表示的堿基序列構(gòu)成的DNA)組入適當(dāng)?shù)妮d體中，將其插入到適當(dāng)?shù)乃拗髦羞M(jìn)行轉(zhuǎn)化，從該轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)物得到作為目標(biāo)的重組HGF蛋白(例如參考Biochem.Biophys.Res.Commun.180:1151-1158,1991；J.Clin.Invest.87:1853-1857,1991；Protein Expr.Purif.70:231-235,2010等)。上述宿主細(xì)胞沒(méi)有特別限定，可以使用以往在基因工程的方法中使用的各種宿主細(xì)胞，例如大腸桿菌、枯草桿菌、酵母、絲狀菌、植物或動(dòng)物細(xì)胞等。例如，在使用動(dòng)物細(xì)胞作為宿主細(xì)胞的情況下，可以利用組入有編碼人HGF蛋白的氨基酸序列的cDNA的表達(dá)載體對(duì)動(dòng)物細(xì)胞、例如中國(guó)倉(cāng)鼠卵巣(CHO)細(xì)胞、小鼠C127細(xì)胞、猴COS細(xì)胞等進(jìn)行轉(zhuǎn)化，分離其培養(yǎng)上清，通過(guò)上述柱色譜等進(jìn)行純化，從而得到HGF蛋白。

如此得到的HGF蛋白只要具有作為HGF的生物活性，也可以為天然型HGF蛋白的氨基酸序列中的1個(gè)或多個(gè)[例如1個(gè)～幾個(gè)(“幾個(gè)”為與上述相同的含義，例如為1～8個(gè)、優(yōu)選為1～6個(gè)、更優(yōu)選為1～5個(gè)、進(jìn)一步優(yōu)選為1～3個(gè)、特別優(yōu)選為1～2個(gè)；以下同樣)]氨基酸被置換、缺失和/或插入而得到的氨基酸序列。置換優(yōu)選為保守性置換。另外，同樣地，可以在HGF蛋白上進(jìn)行糖鏈的置換、缺失或插入。在此，關(guān)于氨基酸序列中的“1個(gè)或多個(gè)氨基酸缺失、置換和/或插入”是指，利用基因工程的方法、定點(diǎn)誘變法等公知的技術(shù)性方法、或者天然可產(chǎn)生的程度的數(shù)量(通常為1個(gè)～幾個(gè))的氨基酸發(fā)生了缺失、置換和/或插入等。進(jìn)行了糖鏈的置換、缺失或插入的HGF蛋白是指例如將天然型HGF蛋白上附加的糖鏈利用酶等進(jìn)行處理而使糖鏈缺失的HGF蛋白、對(duì)天然型HGF蛋白中糖鏈附加部位的氨基酸序列實(shí)施了突變從而不附加糖鏈的HGF蛋白、或者對(duì)氨基酸序列實(shí)施了突變使得在與天然的糖鏈附加部位不同的部位附加糖鏈的HGF蛋白等。

本發(fā)明的HGF制劑中使用的乳糖、甘氨酸、氯化鈉、pH緩沖劑和表面活性劑可以優(yōu)選使用各國(guó)藥典(例如，日本藥典、美國(guó)藥典、歐洲藥典等)收錄品，在使用未收錄在藥典中的成分的情況下，優(yōu)選藥學(xué)上可接受的成分。“藥學(xué)上可接受的”是指，通常安全且毒性低，在生物學(xué)上和其他方面都沒(méi)有問(wèn)題，且在作為動(dòng)物藥物和人的藥物可被批準(zhǔn)的制劑的制備中有用。

本發(fā)明的HGF制劑中使用的乳糖可以優(yōu)選使用各國(guó)藥典(例如，日本藥典、美國(guó)藥典、歐洲藥典等)中收錄的乳糖。乳糖的添加量相對(duì)于HGF蛋白1重量份優(yōu)選為約0.1重量份～約50重量份，更優(yōu)選為約0.5重量份～約10重量份，進(jìn)一步優(yōu)選為約1重量份～約5重量份(包括1～2重量份、1～3重量份、1～4重量份、1～5重量份、2～3重量份、2～4重量份、2～5重量份、3～4重量份、3～5重量份、4～5重量份)。

本發(fā)明的HGF制劑中使用的甘氨酸可以優(yōu)選使用各國(guó)藥典(例如，日本藥典等)中收錄的甘氨酸。甘氨酸的添加量相對(duì)于HGF蛋白1重量份優(yōu)選為約0.01重量份～約1重量份，更優(yōu)選為約0.05重量份～約1重量份，進(jìn)一步優(yōu)選為約0.1重量份～約0.5重量份(包括0.1～0.2重量份、0.1～0.3重量份、0.1～0.4重量份、0.1～0.5重量份、0.2～0.3重量份、0.2～0.4重量份、0.2～0.5重量份、0.3～0.4重量份、0.3～0.5重量份、0.4～0.5重量份)。

本發(fā)明的HGF制劑中使用的pH緩沖劑是指，在溶解于水等溶劑中時(shí)能夠形成具有將溶液的pH保持在一定范圍內(nèi)的作用的緩沖液的試劑，通?？梢粤信e弱酸與其鹽的組合等。作為優(yōu)選的pH緩沖劑，可以列舉在溶解時(shí)能夠形成例如磷酸緩沖液、檸檬酸緩沖液或硼酸緩沖液的例如磷酸、檸檬酸或硼酸與它們的鹽的組合等，更優(yōu)選能夠形成檸檬酸緩沖液的檸檬酸與其鹽的組合。這些弱酸和它們的鹽可以為溶劑化物，溶劑化物例如優(yōu)選水合物。將pH緩沖劑溶解而得到的溶液為緩沖液，具有調(diào)節(jié)HGF水溶液的pH、保持HGF蛋白的溶解性和穩(wěn)定性的作用。作為本發(fā)明中的HGF水溶液，可以列舉例如HGF注射液、在制造后述的冷凍干燥制劑時(shí)制備的冷凍干燥前的水溶液、將該冷凍干燥制劑再溶解于溶劑后的水溶液等。例如HGF制劑若為冷凍干燥制劑，則pH緩沖劑優(yōu)選使HGF制劑再溶解后的水溶液的pH為約4.5～約8.0的pH緩沖劑。另外，若為HGF注射液，則優(yōu)選使該注射液的pH為約4.5～約8.0的pH緩沖劑。具體而言，例如，本發(fā)明中的pH緩沖劑在HGF注射液、HGF冷凍干燥制劑等任一種HGF制劑中均優(yōu)選檸檬酸或其溶劑化物與檸檬酸鹽或其溶劑化物的組合，均更優(yōu)選檸檬酸或其水合物與檸檬酸的鹽的組合，均進(jìn)一步優(yōu)選檸檬酸水合物與檸檬酸鈉(優(yōu)選檸檬酸三鈉二水合物、或檸檬酸三鈉(無(wú)水))的組合。檸檬酸緩沖液使HGF水溶液中的HGF蛋白穩(wěn)定的作用優(yōu)良，能夠有助于HGF注射液、制備HGF冷凍干燥制劑前的HGF水溶液和HGF冷凍干燥制劑再溶解后的水溶液中的HGF的蛋白質(zhì)的穩(wěn)定化。關(guān)于pH緩沖劑的添加量，例如若為HGF注射液，作為注射液中的濃度，優(yōu)選以達(dá)到約1mM～約100mM、更優(yōu)選約1mM～約20mM的范圍的方式添加。若為冷凍干燥制劑，作為制造后述的冷凍干燥制劑時(shí)的冷凍干燥前的水溶液中的濃度，優(yōu)選以達(dá)到優(yōu)選約1mM～約100mM、更優(yōu)選約1mM～20mM的范圍的方式添加。

作為本發(fā)明的HGF制劑中使用的表面活性劑，可以列舉例如聚山梨酯(例如，聚山梨酯20(聚氧乙烯山梨醇酐單月桂酸酯)、聚山梨酯80(聚氧乙烯山梨醇酐單油酸酯)等)、Pluronic(注冊(cè)商標(biāo))F-68(GIBCO公司)、聚乙二醇等，可以并用2種以上。作為表面活性劑，優(yōu)選聚山梨酯，特別優(yōu)選聚山梨酯80。由于HGF蛋白容易吸附在作為容器材質(zhì)的玻璃、樹(shù)脂等上，因此，通過(guò)添加這樣的表面活性劑，能夠在HGF制劑的制造過(guò)程中防止HGF蛋白吸附到容器上。另外，通過(guò)添加表面活性劑，能夠防止HGF注射液和HGF制劑再溶解后的HGF水溶液中的HGF蛋白吸附到容器上。關(guān)于表面活性劑的添加量，若為HGF注射液，作為注射液中的濃度，例如優(yōu)選為約0.001重量％～約2.0重量％的范圍，更優(yōu)選約0.005重量％～約1.0重量％的范圍。另外，若為冷凍干燥制劑，例如以制造后述的冷凍干燥制劑時(shí)的冷凍干燥前的水溶液中的濃度計(jì)，表面活性劑的添加量?jī)?yōu)選為約0.001重量％～約2.0重量％的范圍，更優(yōu)選約0.005重量％～約1.0重量％的范圍。

本發(fā)明的HGF制劑中使用的氯化鈉具有保持HGF蛋白的溶解性的作用。即，通過(guò)氯化鈉的添加，HGF蛋白的溶解度提高，特別是氯化鈉為約150mM以上時(shí)，溶解性提高。另外，通過(guò)添加氯化鈉，能夠使HGF水溶液的滲透壓接近于體液的滲透壓。氯化鈉的添加量根據(jù)目標(biāo)滲透壓比適當(dāng)調(diào)節(jié)即可，以生理鹽溶液為基準(zhǔn)(滲透壓比為1)，優(yōu)選使作為醫(yī)療用或動(dòng)物藥用注射劑的滲透壓比可接受的滲透壓比為約1～3的量。例如若為HGF注射液，以氯化鈉濃度計(jì)優(yōu)選約150mM～約1000mM，更優(yōu)選約150mM～約300mM。若為冷凍干燥制劑，例如，以制造后述的冷凍干燥制劑時(shí)的HGF水溶液中的濃度計(jì)，優(yōu)選約150mM～約1000mM，更優(yōu)選約150mM～約300mM。

本發(fā)明的HGF制劑的制造方法沒(méi)有特別限定，例如若為冷凍干燥制劑，可以通過(guò)將含有HGF蛋白、乳糖、甘氨酸、氯化鈉、pH緩沖劑和表面活性劑的水溶液進(jìn)行冷凍干燥來(lái)制造。如此得到的冷凍干燥制劑為本發(fā)明的HGF制劑的優(yōu)選實(shí)施方式之一。冷凍干燥制劑的制造中使用的上述水溶液只要是含有HGF蛋白、乳糖、甘氨酸、氯化鈉、pH緩沖劑和表面活性劑的水溶液即可，其制備方法沒(méi)有特別限定。上述水溶液例如可以通過(guò)在純化的HGF蛋白溶液(通常含有pH緩沖液、氯化鈉和表面活性劑)中分別添加乳糖、甘氨酸和根據(jù)需要的藥學(xué)上可接受的溶劑(例如，滅菌水、注射用蒸餾水、純水、緩沖液、生理鹽溶液等)來(lái)制造。優(yōu)選以HGF蛋白在水溶液中優(yōu)選為約0.05mg/mL～約40mg/mL的濃度、更優(yōu)選為約0.1mg/mL～約40mg/mL的濃度、進(jìn)一步優(yōu)選為約0.1mg/mL～約20mg/mL的濃度的方式制備。乳糖以在水溶液中為約0.1mg/mL～約100mg/mL、更優(yōu)選為約0.5mg/mL～約50mg/mL、進(jìn)一步優(yōu)選為約1mg/mL～約20mg/mL的方式添加。甘氨酸以在水溶液中優(yōu)選為約0.05mg/mL～約50mg/mL、更優(yōu)選為約0.05mg/mL～約20mg/mL、進(jìn)一步優(yōu)選為約0.1mg/mL～約10mg/mL的方式添加。在該HGF水溶液中也可以進(jìn)一步根據(jù)需要添加助溶劑、抗氧化劑、無(wú)痛劑或等滲劑等添加物。HGF水溶液優(yōu)選利用過(guò)濾器等過(guò)濾滅菌并注入小瓶或安瓿中進(jìn)行冷凍干燥。過(guò)濾器優(yōu)選使用例如孔徑約0.22μm以下的滅菌用過(guò)濾器。作為滅菌用過(guò)濾器，可以優(yōu)選列舉例如デュラポア(注冊(cè)商標(biāo)、默克株式會(huì)社制)或ザルトポア2(注冊(cè)商標(biāo)、ザルトリウス株式會(huì)社制)等。

將上述水溶液進(jìn)行冷凍干燥的方法沒(méi)有特別限定，可以采用通常的冷凍干燥方法。作為冷凍干燥方法，可以列舉例如由在常壓下進(jìn)行冷卻冷凍的冷凍過(guò)程、在減壓下將不受溶質(zhì)約束的自由水升華干燥的一次干燥過(guò)程、將溶質(zhì)固有的吸附水和結(jié)晶水除去的二次干燥過(guò)程這三個(gè)工序構(gòu)成的干燥方法。冷凍過(guò)程的冷卻溫度優(yōu)選約-60℃～約-40℃，一次干燥過(guò)程的溫度優(yōu)選約-50℃～約0℃，進(jìn)一步二次干燥過(guò)程的溫度優(yōu)選約4℃～約40℃。真空壓力優(yōu)選約0.1Pa～約1.5Pa，特別優(yōu)選約0.5Pa～約1.2Pa。對(duì)冷凍干燥后的干燥箱內(nèi)進(jìn)行復(fù)壓。作為復(fù)壓的方法，優(yōu)選如下方法：將無(wú)菌的空氣或不活潑氣體(例如無(wú)菌氮?dú)?、無(wú)菌氦氣等)送入箱內(nèi)，一次復(fù)壓至優(yōu)選約70kPa～約100kPa、更優(yōu)選約80kPa～約95kPa，接著復(fù)壓(二次復(fù)壓)至大氣壓。小瓶的落塞(打栓)優(yōu)選在一次復(fù)壓后進(jìn)行，落塞了的小瓶?jī)?yōu)選在二次復(fù)壓后迅速用蓋子封閉。安瓿的情況下，優(yōu)選在干燥結(jié)束后利用熱(通常為氣體燃燒器)將安瓿末端熔融密封。

HGF冷凍干燥制劑優(yōu)選水分含量為約2重量％以下。

本發(fā)明的HGF冷凍干燥制劑在保存中的HGF蛋白聚合物形成得到抑制，穩(wěn)定性優(yōu)良。在此，“蛋白質(zhì)聚合物”是指多個(gè)蛋白質(zhì)單體結(jié)合成例如鏈狀或網(wǎng)狀而生成的物質(zhì)，在本發(fā)明中包括HGF蛋白的二聚體、三聚體或四聚體。

本發(fā)明的HGF冷凍干燥制劑在使用時(shí)通常溶解于藥學(xué)上可接受的溶劑，以水溶液的形態(tài)使用?！八帉W(xué)上可接受的”為與上述相同的含義。作為藥學(xué)上可接受的溶劑，可以優(yōu)選列舉例如注射用蒸餾水、生理鹽溶液、各種輸液(例如，5％葡萄糖液、林格氏液等)或人工腦脊液等。溶劑更優(yōu)選為注射用蒸餾水或生理鹽溶液。在優(yōu)選的方式中，將本發(fā)明的HGF冷凍干燥制劑以HGF蛋白的濃度優(yōu)選為約0.05mg/mL～約40mg/mL、更優(yōu)選為約0.1mg/mL～約40mg/mL、進(jìn)一步優(yōu)選為約0.1mg/mL～約20mg/mL的方式溶解在例如注射用蒸餾水等藥學(xué)上可接受的溶劑中，可以作為注射液適當(dāng)使用。

本發(fā)明的HGF冷凍干燥制劑也可以與上述藥學(xué)上可接受的溶劑一起以試劑盒的形式進(jìn)行包裝、制造。

本發(fā)明的HGF注射液優(yōu)選為含有HGF蛋白、乳糖、甘氨酸、氯化鈉、pH緩沖劑和表面活性劑的水溶液。乳糖、甘氨酸、氯化鈉、pH緩沖劑和表面活性劑以及其優(yōu)選方式等如上所述。

本發(fā)明的HGF注射液的制造方法沒(méi)有特別限定，例如，可以將上述HGF冷凍干燥制劑溶解在藥學(xué)上可接受的溶劑中而得到。作為藥學(xué)上可接受的溶劑，可以優(yōu)選列舉例如注射用蒸餾水、生理鹽溶液、各種輸液(例如，5％葡萄糖液、林格氏液等)或人工腦脊液等。溶劑更優(yōu)選為注射用蒸餾水或生理鹽溶液。另外，本發(fā)明的HGF注射液也可以在約0.1mg/mL～約40mg/mL的濃度的純化HGF蛋白水溶液(通常含有pH緩沖液、氯化鈉和表面活性劑)中添加乳糖、甘氨酸和根據(jù)需要的藥學(xué)上可接受的溶劑(例如，滅菌水、注射用蒸餾水、純水、緩沖液、生理鹽溶液等)來(lái)制備。例如，也可以將上述冷凍干燥制劑的制造中使用的含有HGF蛋白、乳糖、甘氨酸、氯化鈉、pH緩沖劑和表面活性劑的水溶液作為HGF注射液使用。

本發(fā)明的HGF注射液中的HGF蛋白濃度優(yōu)選為約0.05mg/mL～約40mg/mL，更優(yōu)選為約0.1mg/mL～約40mg/mL，進(jìn)一步優(yōu)選為約0.1mg/mL～約20mg/mL。

本發(fā)明的HGF注射液中的乳糖的濃度優(yōu)選約0.1mg/mL～約100mg/mL，更優(yōu)選約0.5mg/mL～約50mg/mL的范圍，進(jìn)一步優(yōu)選為約1mg/mL～約20mg/mL。

本發(fā)明的HGF注射液中的甘氨酸的濃度優(yōu)選為約0.05mg/mL～約50mg/mL，更優(yōu)選為約0.05mg/mL～約20mg/mL的范圍，進(jìn)一步優(yōu)選為約0.1mg/mL～10mg/mL。

本發(fā)明的HGF注射液的pH優(yōu)選為約4.5～約8.0。

在本發(fā)明的HGF注射液中，也可以進(jìn)一步根據(jù)需要添加助溶劑、抗氧化劑、無(wú)痛劑或等滲劑等添加物。

本發(fā)明的HGF注射液通常為澄清的溶液。本發(fā)明的HGF注射液雖然為溶液的狀態(tài)，但可抑制保存中的HGF聚合物形成，穩(wěn)定性優(yōu)良。

本發(fā)明的HGF制劑的用途沒(méi)有特別限定，優(yōu)選作為用于治療或預(yù)防中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病、例如肌萎縮側(cè)索硬化(ALS)、阿爾茨海默病、帕金森病、亨廷頓氏舞蹈癥、脊髓小腦變性癥、脊髄損傷、腦梗塞、腦缺血、多發(fā)性硬化等的藥物組合物使用。其中，本發(fā)明的HGF制劑優(yōu)選用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療。

本發(fā)明的HGF注射液、HGF冷凍干燥制劑等HGF制劑例如可以給藥至腦室內(nèi)或鞘內(nèi)。例如本發(fā)明的HGF注射液適合作為腦室內(nèi)給藥用或鞘內(nèi)給藥用的制劑。可給藥本發(fā)明的HGF注射液的脊髓腔是脊髄周圍的被腦脊液充滿的空間，該空間由蛛網(wǎng)膜和硬膜這兩層膜包圍。脊髓腔是存在于周圍這兩層膜中位于內(nèi)側(cè)的蛛網(wǎng)膜的內(nèi)部的空間，鞘內(nèi)給藥即表示蛛網(wǎng)膜下腔內(nèi)給藥。腦和脊髄的周圍均被腦脊液所充滿，腦內(nèi)部的腦室也被腦脊液充滿。腦室、腦周圍和脊髓腔形成相連的空間，腦脊液在該空間內(nèi)循環(huán)。因此，腦室內(nèi)給藥和鞘內(nèi)給藥均是將藥劑給藥至腦脊液中，通常，腦室內(nèi)給藥和鞘內(nèi)給藥實(shí)質(zhì)上為相同的給藥途徑。另外，本發(fā)明的HGF注射液等HGF制劑也可以給藥至腦實(shí)質(zhì)內(nèi)或脊髄實(shí)質(zhì)內(nèi)。在腦室內(nèi)給藥或鞘內(nèi)給藥、或者腦實(shí)質(zhì)內(nèi)給藥或脊髄實(shí)質(zhì)內(nèi)給藥時(shí)，可以將注射液靜脈推注給藥，也可以使用注射泵等持續(xù)注入。

需要說(shuō)明的是，本發(fā)明的HGF制劑的使用用途并不僅限于中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療。本發(fā)明的HGF制劑作為藥物具有充分的穩(wěn)定性，并且安全性也優(yōu)良，因此，也可以用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病以外的疾病的治療。該情況下，給藥途徑可以采用靜脈內(nèi)注射、皮下注射、肌肉內(nèi)注射、局部給藥等適合所應(yīng)用的疾病的治療的給藥途徑。

本發(fā)明的HGF制劑的給藥量根據(jù)對(duì)象疾病的種類、病情等適當(dāng)設(shè)定即可。例如，在為了中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療而使用HGF注射液的情況下，成人每1天以HGF蛋白計(jì)優(yōu)選給藥約0.01mg～約50mg、更優(yōu)選給藥約0.1mg～約10mg。另外，優(yōu)選將HGF注射液進(jìn)行腦室內(nèi)給藥或鞘內(nèi)給藥。另外，本發(fā)明的HGF注射液等HGF制劑在給藥時(shí)可以用藥學(xué)上可接受的適當(dāng)?shù)娜軇┻m當(dāng)稀釋來(lái)使用。作為藥學(xué)上可接受的溶劑，例如為注射用蒸餾水、生理鹽溶液、各種輸液(例如，5％葡萄糖液、林格氏液等)或人工腦脊液等，更優(yōu)選列舉注射用蒸餾水或生理鹽溶液。

本發(fā)明還包含將以HGF蛋白作為有效成分、進(jìn)一步含有乳糖、甘氨酸、氯化鈉、pH緩沖劑和表面活性劑的HGF制劑給藥至中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的患者的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療方法。

本發(fā)明還包含用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療的、以HGF蛋白作為有效成分、進(jìn)一步含有乳糖、甘氨酸、氯化鈉、pH緩沖劑和表面活性劑的HGF制劑。

HGF制劑優(yōu)選為冷凍干燥制劑(HGF冷凍干燥制劑)或注射液(HGF注射液)，更優(yōu)選為注射液。

HGF制劑、HGF冷凍干燥制劑和HGF注射液以及它們的優(yōu)選方式等如上所述。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療中，HGF制劑優(yōu)選給藥至鞘內(nèi)或腦室內(nèi)、或者脊髄實(shí)質(zhì)內(nèi)或腦實(shí)質(zhì)內(nèi)。

本發(fā)明還包含一種水溶液中的HGF聚合物生成抑制方法，其為抑制含有HGF蛋白的水溶液中的HGF聚合物(HGF蛋白的聚合物)生成的方法，其特征在于，在該水溶液中配合乳糖、甘氨酸、氯化鈉、pH緩沖劑和表面活性劑。水溶液中的HGF蛋白、乳糖、甘氨酸、氯化鈉、pH緩沖劑和表面活性劑、以及它們的優(yōu)選添加量等與上述HGF注射液中的情況同樣。

本發(fā)明還包含一種冷凍干燥制劑中的HGF聚合物生成抑制方法，其為抑制含有HGF蛋白的冷凍干燥制劑中的HGF聚合物(HGF蛋白的聚合物)的生成的方法，其特征在于，在該冷凍干燥制劑中配合乳糖、甘氨酸、氯化鈉、pH緩沖劑和表面活性劑。HGF蛋白、乳糖、甘氨酸、氯化鈉、pH緩沖劑和表面活性劑、以及它們的優(yōu)選添加量等與上述HGF冷凍干燥制劑中的情況同樣。

實(shí)施例

以下，利用實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)地對(duì)本發(fā)明進(jìn)行說(shuō)明，但本發(fā)明不受這些實(shí)施例的限定。

以下，在由序列編號(hào)6所表示的氨基酸序列構(gòu)成的重組人HGF蛋白(以下，僅表示為HGF)中添加各種添加物，對(duì)穩(wěn)定性和安全性進(jìn)行研究。需要說(shuō)明的是，在以下的實(shí)施例中，只要沒(méi)有特殊聲明，則％表示質(zhì)量％。所使用的HGF依據(jù)Biochem.Biophys.Res.Commun.180:1151-1158,1991中記載的方法利用CHO細(xì)胞進(jìn)行制造。

[實(shí)施例1]

在含有5mM檸檬酸緩沖液(pH6.0)和0.375M氯化鈉、0.005％聚山梨酯80的HGF溶液中溶解乳糖和甘氨酸，分別按照下述表1所示的濃度進(jìn)行制備。

[表1]

將所得到的上述溶液各1mL無(wú)菌分裝到小瓶(φ23×43mm)中。用橡膠蓋半落塞在小瓶上，整齊排列在托盤中，放入冷凍干燥機(jī)(トリオマスター；共和真空技術(shù)株式會(huì)社制)中，在-50℃進(jìn)行預(yù)冷凍后，經(jīng)過(guò)一次干燥(-50℃→-20℃/4小時(shí)、-20℃/24小時(shí)以上、0.01～0.1托)和二次干燥(-20℃→20～30℃/8～10小時(shí)、20～30℃/10小時(shí)以上、0.01～0.1托)，得到冷凍干燥制劑。冷凍干燥結(jié)束后，向トリオマスター箱內(nèi)鼓入無(wú)菌氮?dú)膺M(jìn)行復(fù)壓(箱內(nèi)壓力：88.0kPa；一次復(fù)壓)，將橡膠蓋全落塞后用無(wú)菌氮?dú)馐攻去辚蕙攻咯`箱內(nèi)恢復(fù)至大氣壓(二次復(fù)壓)，取出小瓶后，迅速將小瓶用蓋子封閉。如此，得到本發(fā)明的HGF冷凍干燥制劑。

[實(shí)施例2]

除了使乳糖的添加濃度為7.5mg/mL以外，與實(shí)施例1同樣地操作，得到HGF冷凍干燥制劑。

[實(shí)施例3]

除了使乳糖的添加濃度為10mg/mL以外，與實(shí)施例1同樣地操作，得到HGF冷凍干燥制劑。

[實(shí)施例4]

在含有2mM檸檬酸緩沖液(pH6.0)和0.15M氯化鈉、0.002％聚山梨酯80的HGF溶液中以分別達(dá)到下述表2所示濃度的方式溶解乳糖和甘氨酸，得到HGF注射液。另外，也可以將實(shí)施例2中得到的HGF冷凍干燥制劑用注射用蒸餾水2.5mL溶解而得到表2的組成的HGF注射液。

[表2]

實(shí)驗(yàn)例1

以10mg/mL HGF、10mM檸檬酸緩沖液(pH6.0)、0.3M氯化鈉和0.03％聚山梨酯80作為基本成分，在該基本成分中添加表3的各添加物，制備配方1～3的HGF溶液(2mL)，將其在小瓶中與實(shí)施例1同樣地進(jìn)行冷凍干燥，制作各冷凍干燥制劑。將各冷凍干燥制劑在作為使其強(qiáng)制劣化的條件的50℃下保存1周，測(cè)定保存前后的聚合物含量。將結(jié)果示于表4。

[表3]

關(guān)于HGF制劑的聚合物含量，將各冷凍干燥制劑用2mL的注射用蒸餾水溶解，利用高效液相色譜(HPLC)在下述條件下對(duì)所得到的HGF溶液進(jìn)行分析，利用下述式1以所得到的面積百分率(％)(以下稱為聚合物含量(％))的形式求出HGF制劑的聚合物含量。

式1中，A_M表示HGF峰面積、A_A表示聚合物峰面積。

(HPLC條件)

柱：凝膠過(guò)濾柱(商品名：Superdex 200 10/300、GE healthcare公司制)

流動(dòng)相：將氯化鈉58.44g、檸檬酸三鈉二水合物2.94g和聚山梨酯80 0.1g溶解于純水，用純水調(diào)節(jié)為1L，將所得到的溶液作為A液。將氯化鈉58.44g、檸檬酸一水合物2.10g和聚山梨酯80 0.1g溶解于純水，調(diào)節(jié)為1L，將所得到的溶液作為B液。在A液中加入B液，調(diào)節(jié)pH至6.0后，使用0.45μm的過(guò)濾器(商品名：Millicup-HV、孔徑0.45μm、默克公司制)進(jìn)行過(guò)濾，在使用前進(jìn)行脫氣。在室溫下保存，2周以內(nèi)使用。

柱溫：25℃

流速：0.5mL/分鐘

檢測(cè)液注入量：25μL

檢測(cè)波長(zhǎng)：280nm

[表4]

在利用僅由基本成分構(gòu)成的配方1的HGF溶液制作的冷凍干燥制劑的情況下，在苛酷條件下保存時(shí)，確認(rèn)到顯著的聚合物生成。另一方面，在由配方2和3的HGF溶液制作的冷凍干燥制劑的情況下，即使在苛酷條件下也抑制了聚合物的生成，如以往所知的那樣，確認(rèn)到在精制蔗糖或L-丙氨酸中穩(wěn)定地維持HGF冷凍干燥制劑的效果。

實(shí)驗(yàn)例2

以2.5mg/mL HGF、5mM檸檬酸緩沖液(pH6.0)和0.375M氯化鈉、0.005％聚山梨酯80作為基本成分，在該基本成分中添加表5的各添加物，制備配方4～6的HGF溶液(1mL)，將其在小瓶中與實(shí)施例1同樣地進(jìn)行冷凍干燥，制作各冷凍干燥制劑。將各冷凍干燥制劑在50℃下保存1周，與實(shí)驗(yàn)例1同樣地測(cè)定保存前后的聚合物含量。將結(jié)果示于表6。

[表5]

[表6]

可知在添加有甘氨酸和乳糖的配方5的HGF冷凍干燥制劑的情況下，抑制了聚合物的生成，制劑的穩(wěn)定性好。

實(shí)驗(yàn)例3

為了確認(rèn)添加有甘氨酸和乳糖的HGF冷凍干燥制劑的穩(wěn)定性，以2.5mg/mL HGF、5mM檸檬酸緩沖液(pH6.0)、0.375M氯化鈉和0.005％聚山梨酯80作為基本成分，在該基本成分中添加表7的各添加物，制備配方4、5、7和8的HGF溶液(1mL)，將其在小瓶中與實(shí)施例1同樣地進(jìn)行冷凍干燥，制作各冷凍干燥制劑。將各冷凍干燥制劑在25℃下保存1～2個(gè)月或在50℃下保存2周，與實(shí)驗(yàn)例1同樣地測(cè)定保存前后的聚合物含量。將結(jié)果示于表8。

[表7]

[表8]

在由添加有甘氨酸和乳糖的配方5和7的HGF溶液制作的冷凍干燥制劑的情況下，在室溫25℃下保存2個(gè)月后聚合物含量也被抑制在稍有增加的程度。此外，在由配方5和7的HGF溶液制作的冷凍干燥制劑的情況下，在苛酷條件下、即50℃下保存2周后，聚合物含量也只不過(guò)稍過(guò)1％，聚合物的生成得到抑制。由配方5和7的HGF溶液制作的冷凍干燥制劑中的聚合物形成抑制效果與配方8基本同等，該配方8中與甘氨酸一同添加有已知對(duì)HGF冷凍干燥制劑的穩(wěn)定化有效的精制蔗糖。

實(shí)驗(yàn)例4

將實(shí)施例2中得到的HGF冷凍干燥制劑用注射用蒸餾水2.5mL溶解，得到表2的組成的HGF注射液。將該注射液在密閉容器中在40℃下保存2周。與實(shí)驗(yàn)例1同樣地測(cè)定保存前后的HGF注射液的聚合物含量。另外，對(duì)于保存前后的HGF注射液的HGF的生物活性，以美洲水鼬肺來(lái)源的上皮樣細(xì)胞Mv1Lu細(xì)胞(理研、BRC ID：RCB0996)的增殖性為指標(biāo)進(jìn)行評(píng)價(jià)。

保存前和保存后的HGF注射液中的聚合物含量分別為1.54％和2.67％，在40℃下保存2周期間的聚合物含量的增加限制于約1％。另外，與保存前相比，在40℃下保存2周后的HGF注射液中的HGF的生物活性維持了89.4％(將保存前作為100％的相對(duì)活性)的高活性。這樣，本發(fā)明的HGF注射液在40℃下保存2周的期間也基本穩(wěn)定。

試驗(yàn)例1

向大鼠鞘內(nèi)靜脈推注(bolus)單次給藥表9的HGF溶液1、2或各種溶劑(溶劑A或B)或者生理鹽溶液45μL，研究對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的安全性。需要說(shuō)明的是，大鼠的腦脊液量為約200μL，向其中靜脈推注單次給藥過(guò)量的溶液本身就會(huì)導(dǎo)致大鼠引起異常的癥狀，因此，將可向大鼠的鞘內(nèi)靜脈推注單次給藥的最大可接受量設(shè)定為45μL。

在戊巴比妥麻醉下用電推剪從頸部至背部對(duì)大鼠進(jìn)行剪毛，用消毒用乙醇和イソジン液10％(商品名、株式會(huì)社明治：聚維酮碘10％溶液)對(duì)剃毛部位進(jìn)行擦洗和消毒。切開(kāi)背部皮膚，露出第11胸椎至第2腰椎后，切除第12/13胸椎間的韌帶，使硬膜露出。在露出部位的硬膜和蛛網(wǎng)膜切開(kāi)小口，確認(rèn)腦脊液的流出后，立即將充滿生理鹽溶液(株式會(huì)社大塚制藥工場(chǎng))的聚氨酯導(dǎo)管(將MRE025(OD：0.25mm、10cm)和MRE010(OD：0.65mm、2.5cm)連接而成的兩段導(dǎo)管；布倫特里，USA)的前端從切開(kāi)部向鞘內(nèi)(朝向頭部側(cè))插入約2.5cm。使用醫(yī)療用Aron Alpha膠粘劑(商品名：アロンアルファA“三共”、第一三共株式會(huì)社)將導(dǎo)管與周圍組織固定，同時(shí)通過(guò)熱處理將導(dǎo)管的末端封閉，以適當(dāng)長(zhǎng)度從頸部皮膚露出。使用縫合線將創(chuàng)部縫合。在大鼠從麻醉至清醒為止的期間用保溫墊進(jìn)行保溫，清醒后，返回至飼養(yǎng)籠內(nèi)。導(dǎo)管留置次日，在大鼠清醒的狀態(tài)下經(jīng)由留置導(dǎo)管單次靜脈推注給藥表9的HGF溶液1、2、溶劑A或B或者生理鹽溶液45μL，接著進(jìn)行10μL生理鹽溶液的給藥(為了將殘留在導(dǎo)管內(nèi)的HGF溶液或溶劑推入鞘內(nèi))。然后，對(duì)導(dǎo)管進(jìn)行熱處理使其封閉，放回至皮下，觀察大鼠的狀態(tài)。

[表9]

大鼠鞘內(nèi)的靜脈推注給藥中，在生理鹽溶液給藥的情況下，大鼠未顯示出任何異常。另一方面，在配合以往已知對(duì)HGF制劑的穩(wěn)定化效果的添加物而制備的溶劑A的鞘內(nèi)給藥的情況下，雖然是暫時(shí)性的，但確認(rèn)到大鼠的自發(fā)運(yùn)動(dòng)降低、流涎、痙攣等神經(jīng)學(xué)異常所見(jiàn)。與此相對(duì)，在配合本發(fā)明的HGF制劑中使用的添加物而制備的溶劑B的鞘內(nèi)給藥的情況下，與給藥生理鹽溶液時(shí)同樣，大鼠未顯示出任何異常。將利用該溶劑B制備的HGF溶液1(與實(shí)施例4的注射液相同，相當(dāng)于本發(fā)明的HGF注射液)同樣地給藥至大鼠的鞘內(nèi)，大鼠也未顯示出任何異常。確認(rèn)到本發(fā)明的HGF注射液對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)不造成不良影響，為非常安全的組成。另一方面，將溶劑B的乳糖替換為蔗糖，在將利用所得到的組成的溶劑制備的HGF溶液2給藥至大鼠鞘內(nèi)的情況下，大鼠在給藥后約20分鐘的期間顯示出啼叫、四肢僵直等神經(jīng)學(xué)上的異常癥狀。

試驗(yàn)例2

制作大鼠的脊髄損傷模型，從損傷后立即反復(fù)向鞘內(nèi)給藥HGF溶液(45μL/shot、3次/周、4周)(HGF給藥組；n＝6)。此時(shí)，作為HGF溶液，使用將實(shí)施例2的冷凍干燥制劑用2.5mL的注射用蒸餾水再溶解而得到的表2的組成的HGF溶液。另外，對(duì)于對(duì)照組的脊髄損傷模型大鼠(n＝6)，同樣地給藥不含HGF的溶劑(2mM檸檬酸緩沖液(pH6.0)、0.15M氯化鈉、0.002％聚山梨酯80、0.16mg/mL甘氨酸和3mg/mL乳糖)。

脊髄損傷模型大鼠的制作如下進(jìn)行。首先在氯胺酮和賽拉嗪麻醉下用電推剪從頸部到腰部對(duì)大鼠進(jìn)行剪毛，用70％乙醇和イソジン液10％(商品名、株式會(huì)社明治：聚維酮碘10％溶液)進(jìn)行擦洗。將背部皮膚切開(kāi)，露出第6胸椎至第5腰椎附近后，切除第9～10胸椎的椎弓和韌帶，使硬膜露出。立即使用MASCIS撞擊儀(羅格斯大學(xué)，USA)，使10g的重錘從25mm的高度落下至第10胸椎高位，制作脊髄損傷。在脊髄損傷后立即切除第1/2腰椎間的韌帶，使硬膜露出，在硬膜和蛛網(wǎng)膜上切開(kāi)小口。確認(rèn)腦脊液的漏出，立即將聚氨酯導(dǎo)管(將MRE025(OD：0.25mm、10cm、布倫特里、USA)和MRE010(OD：0.65mm、2.5cm、布倫特里、USA)連接而成的兩段導(dǎo)管)的前端朝向頭側(cè)插入到鞘內(nèi)，前進(jìn)至脊髄損傷附近。利用醫(yī)療用Aron Alpha膠粘劑(商品名：アロンアルファA“三共”、第一三共株式會(huì)社)將導(dǎo)管固定于肌層而留置，進(jìn)行第1次藥液(HGF溶液或溶劑)給藥后，使導(dǎo)管末端以適當(dāng)長(zhǎng)度從頸部皮膚露出，縫合創(chuàng)部。利用保溫墊進(jìn)行保溫直至動(dòng)物從麻醉清醒為止，清醒后，返回至飼養(yǎng)籠內(nèi)。之后，經(jīng)由留置的導(dǎo)管以3次/周的頻率進(jìn)行4周HGF溶液或溶劑的給藥。各次給藥中，在給藥HGF溶液或溶劑45μL之后，進(jìn)行10μL生理鹽溶液的給藥(為了將殘留在導(dǎo)管內(nèi)的HGF溶液或溶劑推入鞘內(nèi))。各給藥結(jié)束后，每次都對(duì)導(dǎo)管端進(jìn)行熱處理而使其封閉。

使用BBB評(píng)分(滿分21分：以0分(完全麻痹)～21分(正常的后肢運(yùn)動(dòng))的21個(gè)等級(jí)進(jìn)行評(píng)價(jià))(Basso DM,Beattie MS,Bresnahan JC:A sensitive and reliable locomotor rating scale for open field testing in rats.J Neurotrauma 12：1-21,1995)經(jīng)時(shí)地對(duì)大鼠的后肢運(yùn)動(dòng)功能進(jìn)行評(píng)價(jià)，研究HGF對(duì)脊髄損傷的治療效果。在脊髄損傷的次日，BBB得分在全部個(gè)體中均為0分，但在脊髄損傷4周后，HGF給藥組中BBB得分的平均值恢復(fù)至10分以上，與溶劑給藥組(對(duì)照組)的得分(平均值低于10分)相比顯著地顯示出高值。確認(rèn)到HGF對(duì)脊髄損傷的治療效果。需要說(shuō)明的是，在4周的給藥期間中，溶劑給藥組(對(duì)照組)和HGF給藥組的大鼠均未顯示出脊髄損傷以外的異常癥狀。另外，在脊髄損傷4周后將大鼠解剖，結(jié)果在大鼠的脊髄中除了受到脊髄損傷的部位以外未確認(rèn)到異常。確認(rèn)到將實(shí)施例2的冷凍干燥制劑再溶解而得到的HGF溶液在脊髄損傷的治療中是安全且有效的。

產(chǎn)業(yè)上的可利用性

根據(jù)本發(fā)明，能夠提供作為藥物有用的保存穩(wěn)定性優(yōu)良的HGF制劑。另外，本發(fā)明的HGF注射液可為了治療ALS、脊髄損傷等中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病而給藥至鞘內(nèi)或腦室內(nèi)、或者脊髄實(shí)質(zhì)內(nèi)或腦實(shí)質(zhì)內(nèi)。因此，本發(fā)明在醫(yī)療領(lǐng)域等中有用。

序列表

<110> 克霖固魯制藥股份有限公司（KRINGLE PHARMA INC.）

<120> 適合神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療的HGF制劑（HGF preparation usable for treating a neurological disease）

<130> K12F5359

<150> JP 2014-184475

<151> 2014-09-10

<160> 6

<170> PatentIn version 3.1

<210> 1

<211> 2187

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 1

atgtgggtga ccaaactcct gccagccctg ctgctgcagc atgtcctcct gcatctcctc 60

ctgctcccca tcgccatccc ctatgcagag ggacaaagga aaagaagaaa tacaattcat 120

gaattcaaaa aatcagcaaa gactacccta atcaaaatag atccagcact gaagataaaa 180

accaaaaaag tgaatactgc agaccaatgt gctaatagat gtactaggaa taaaggactt 240

ccattcactt gcaaggcttt tgtttttgat aaagcaagaa aacaatgcct ctggttcccc 300

ttcaatagca tgtcaagtgg agtgaaaaaa gaatttggcc atgaatttga cctctatgaa 360

aacaaagact acattagaaa ctgcatcatt ggtaaaggac gcagctacaa gggaacagta 420

tctatcacta agagtggcat caaatgtcag ccctggagtt ccatgatacc acacgaacac 480

agctttttgc cttcgagcta tcggggtaaa gacctacagg aaaactactg tcgaaatcct 540

cgaggggaag aagggggacc ctggtgtttc acaagcaatc cagaggtacg ctacgaagtc 600

tgtgacattc ctcagtgttc agaagttgaa tgcatgacct gcaatgggga gagttatcga 660

ggtctcatgg atcatacaga atcaggcaag atttgtcagc gctgggatca tcagacacca 720

caccggcaca aattcttgcc tgaaagatat cccgacaagg gctttgatga taattattgc 780

cgcaatcccg atggccagcc gaggccatgg tgctatactc ttgaccctca cacccgctgg 840

gagtactgtg caattaaaac atgcgctgac aatactatga atgacactga tgttcctttg 900

gaaacaactg aatgcatcca aggtcaagga gaaggctaca ggggcactgt caataccatt 960

tggaatggaa ttccatgtca gcgttgggat tctcagtatc ctcacgagca tgacatgact 1020

cctgaaaatt tcaagtgcaa ggacctacga gaaaattact gccgaaatcc agatgggtct 1080

gaatcaccct ggtgttttac cactgatcca aacatccgag ttggctactg ctcccaaatt 1140

ccaaactgtg atatgtcaca tggacaagat tgttatcgtg ggaatggcaa aaattatatg 1200

ggcaacttat cccaaacaag atctggacta acatgttcaa tgtgggacaa gaacatggaa 1260

gacttacatc gtcatatctt ctgggaacca gatgcaagta agctgaatga gaattactgc 1320

cgaaatccag atgatgatgc tcatggaccc tggtgctaca cgggaaatcc actcattcct 1380

tgggattatt gccctatttc tcgttgtgaa ggtgatacca cacctacaat agtcaattta 1440

gaccatcccg taatatcttg tgccaaaacg aaacaattgc gagttgtaaa tgggattcca 1500

acacgaacaa acataggatg gatggttagt ttgagataca gaaataaaca tatctgcgga 1560

ggatcattga taaaggagag ttgggttctt actgcacgac agtgtttccc ttctcgagac 1620

ttgaaagatt atgaagcttg gcttggaatt catgatgtcc acggaagagg agatgagaaa 1680

tgcaaacagg ttctcaatgt ttcccagctg gtatatggcc ctgaaggatc agatctggtt 1740

ttaatgaagc ttgccaggcc tgctgtcctg gatgattttg ttagtacgat tgatttacct 1800

aattatggat gcacaattcc tgaaaagacc agttgcagtg tttatggctg gggctacact 1860

ggattgatca actatgatgg cctattacga gtggcacatc tctatataat gggaaatgag 1920

aaatgcagcc agcatcatcg agggaaggtg actctgaatg agtctgaaat atgtgctggg 1980

gctgaaaaga ttggatcagg accatgtgag ggggattatg gtggcccact tgtttgtgag 2040

caacataaaa tgagaatggt tcttggtgtc attgttcctg gtcgtggatg tgccattcca 2100

aatcgtcctg gtatttttgt ccgagtagca tattatgcaa aatggataca caaaattatt 2160

ttaacatata aggtaccaca gtcatag 2187

<210> 2

<211> 2172

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 2