技術(shù)領(lǐng)域：
概括而言，本發(fā)明涉及通過使用TEMPO/NCS作為氧化物質(zhì)(oxidizingagent)來制備包含與載體蛋白綴合的糖的糖綴合物(glycoconjugate)的方法、包含此類糖綴合物的免疫原性組合物以及使用此類糖綴合物和免疫原性組合物的方法。本發(fā)明還涉及通過在選擇性氧化糖的伯羥基的氧化劑的存在下使用穩(wěn)定的硝?；虻?nitroxide)自由基(例如哌啶-N-氧基或吡咯烷-N-氧基)化合物制備包含與載體蛋白綴合的糖的糖綴合物的方法、包含此類糖綴合物的免疫原性組合物以及使用此類糖綴合物和免疫原性組合物的方法。
背景技術(shù)：
：使用與蛋白載體連接的多糖(通常來自細菌的表面包衣)制備多糖蛋白綴合物疫苗。多糖與蛋白載體的化學(xué)鍵合誘導(dǎo)針對在其表面上展現(xiàn)疫苗內(nèi)所包含的多糖的細菌的免疫應(yīng)答，由此預(yù)防疾病。因此，使用來自致病細菌的多糖的疫苗接種是增強宿主免疫力的潛在策略。覆蓋細菌的多糖大為不同，甚至在單一細菌物種內(nèi)也是如此。例如，在肺炎鏈球菌(Streptococcuspneumoniae，全世界范圍內(nèi)嬰兒和幼兒的腦膜炎、肺炎及嚴重的侵襲性疾病的主要誘因)中，由于細菌多糖包衣的變化而具有超過90種不同的血清型。因此，多糖疫苗通常由一組多糖組成以增加保護。盡管多糖自身是免疫原性的，但多糖與蛋白載體的綴合已用于改善免疫原性。載體蛋白可以是來自靶標病原體的增強對該病原體的特異性免疫應(yīng)答的相關(guān)蛋白抗原，或是主要作為佐劑或一般免疫應(yīng)答刺激劑的一般免疫原性蛋白。多價肺炎球菌多糖-蛋白綴合物疫苗已經(jīng)被許可多年，并且已證明在預(yù)防嬰兒的肺炎球菌疾病方面是有價值的，并且最近已經(jīng)推薦用于成人。技術(shù)實現(xiàn)要素：在一個方面，本發(fā)明提供了制備包含與載體蛋白綴合的糖的糖綴合物的方法，其包括以下步驟：a)使糖與2,2,6,6-四甲基-1-哌啶氧基(TEMPO)和N-氯代琥珀酰亞胺(NCS)在水性溶劑中反應(yīng)以產(chǎn)生活化的糖；以及b)使所述活化的糖與包含一個或多個氨基的載體蛋白反應(yīng)。在另一方面，所述活化的糖的氧化度為1至50、1至40、1至30、1至20、1至10、1至5、3至40、3至30、3至20、3至10、4至40、4至30、4至20、4至10、5至30、5至25、5至20、5至10、6至50、6至40、6至30、6至20、6至15、6至14、6至13、6至12、6至11、6至10、7至40、7至30、7至20、7至15、7至14、7至13、7至12、7至11、7至10、8至40、8至30、8至20、8至15、8至14、8至13、8至13、8至12、8至11、8至10、9至40、9至30、9至20、9至15、10至40、10至30、10至20或10至15。在另一方面，所述活化的糖的氧化度為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40。在另一方面，本發(fā)明提供了制備包含與載體蛋白綴合的糖的糖綴合物的方法，其包括以下步驟：a)在選擇性氧化糖的伯羥基的氧化劑的存在下，使所述糖與穩(wěn)定的硝?；虻踝杂苫衔锶邕哙?N-氧基或吡咯烷-N-氧基化合物反應(yīng)以產(chǎn)生包含醛基的活化的糖；以及b)使所述活化的糖與包含一個或多個氨基的載體蛋白反應(yīng)。在所述反應(yīng)中，實際的氧化劑為催化性循環(huán)的N-氧代銨鹽(N-oxoammoniumsalt)。優(yōu)選地，所述穩(wěn)定的硝?；虻踝杂苫衔锞哂性谘趸瘎┑拇嬖谙聦⒉歼x擇性氧化成醛而不過度氧化成羧酸的能力。在一方面，反應(yīng)的步驟a)在水性溶劑中進行。在另一方面，步驟a)在非質(zhì)子溶劑中進行。在一方面，步驟a)在DMSO(二甲亞砜)、二甲基乙酰胺(DMA)、環(huán)丁砜、N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)、六甲基磷酰胺(HMPA)中或在DMF(二甲基甲酰胺)溶劑中進行。在一方面，未反應(yīng)的醛基在與載體蛋白綴合之后使用硼氫化物在加帽步驟中被轉(zhuǎn)化回伯醇，由此使在涉及氧化及隨后的綴合的修飾步驟期間的糖表位修飾最小化。在一方面，所述穩(wěn)定的硝?；虻踝杂苫衔锸沁哙?N-氧基或吡咯烷-N-氧基化合物。優(yōu)選地，所述化合物具有在氧化劑的存在下選擇性氧化伯醇以生成醛基而不影響仲羥基的能力。更優(yōu)選地，所述化合物具有在氧化劑的存在下選擇性氧化伯醇以生成醛基而不過度氧化成羧基的能力。在一方面，所述穩(wěn)定的硝?；虻踝杂苫衔飵в蠺EMPO或PROXYL(2,2,5,5-四甲基-1-吡咯烷氧基)部分。優(yōu)選地，所述化合物具有在氧化劑的存在下選擇性氧化伯醇以生成醛基而不影響仲羥基的能力。更優(yōu)選地，所述化合物具有在氧化劑的存在下選擇性氧化伯醇以生成醛基而不過度氧化成羧基的能力。在一方面，所述穩(wěn)定的硝酰基化合物是TEMPO或其衍生物。在一個方面，所述穩(wěn)定的硝?；衔镞x自TEMPO、2,2,6,6-四甲基-4-(甲基磺酰氧基)-1-哌啶氧基、4-膦酰氧基-TEMPO、4-氧代-TEMPO、4-甲氧基-TEMPO、4-異硫氰酸基-TEMPO、4-(2-碘乙酰氨基)-TEMPO自由基、4-羥基-TEMPO、4-氰基-TEMPO、4-羧基-TEMPO、4-(2-溴乙酰氨基)-TEMPO、4-氨基-TEMPO、4-乙酰氨基-2,2,6,6-四甲基哌啶1-氧基。優(yōu)選地，所述硝?；衔锸荰EMPO。在另一方面，所述穩(wěn)定的硝?；衔镞x自3β-DOXYL-5α-膽甾烷、5-DOXYL-硬脂酸、16-DOXYL-硬脂酸、5-DOXYL-硬脂酸甲酯、3-(氨基甲基)-PROXYL、3-氨甲酰基-PROXYL、3-氨甲?；?2,2,5,5-四甲基-3-吡咯啉-1-氧基、3-羧基-PROXYL、3-氰基-PROXYL。在一個方面，所述氧化劑是帶有N-鹵代部分的分子。優(yōu)選地，所述分子具有在硝?；衔锏拇嬖谙逻x擇性氧化伯醇的能力。在一個方面，所述氧化劑選自N-氯代琥珀酰亞胺、N-溴代琥珀酰亞胺、N-碘代琥珀酰亞胺、二氯異氰尿酸、1,3,5-三氯-1,3,5-三嗪-2,4,6-三酮、二溴異氰尿酸、1,3,5-三溴-1,3,5-三嗪-2,4,6-三酮、二碘異氰尿酸以及1,3,5-三碘-1,3,5-三嗪-2,4,6-三酮。優(yōu)選地，所述氧化劑為N-氯代琥珀酰亞胺。在一方面，所述活化的糖的氧化度為1至50、1至40、1至30、1至20、1至10、1至5、3至40、3至30、3至20、3至10、4至40、4至30、4至20、4至10、5至30、5至25、5至20、5至10、6至50、6至40、6至30、6至20、6至15、6至14、6至13、6至12、6至11、6至10、7至40、7至30、7至20、7至15、7至14、7至13、7至12、7至11、7至10、8至40、8至30、8至20、8至15、8至14、8至13、8至13、8至12、8至11、8至10、9至40、9至30、9至20、9至15、10至40、10至30、10至20或10至15。在另一方面，所述活化的糖的氧化度為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40。在一方面，所述糖與0.1至10摩爾當量的所述氧化劑反應(yīng)。優(yōu)選地，所述糖與0.2至5、0.5至2.5或0.5至1.5摩爾當量的所述氧化劑反應(yīng)。在一方面，所述多糖與約0.2、0.4、0.6、0.8、1、1.2、1.4、1.6、1.8、2、2.2、2.4、2.6、2.8、3、3.2、3.4、3.6、3.8、4、4.2、4.4、4.6、4.8或5摩爾當量的所述氧化劑反應(yīng)。在一方面，所述穩(wěn)定的硝?；虻踝杂苫衔镆源呋看嬖凇Ｔ谝环矫?，所述糖與少于約0.3摩爾當量的穩(wěn)定的硝?；虻踝杂苫衔锓磻?yīng)。在一方面，所述糖與少于約0.005摩爾當量的穩(wěn)定的硝?；虻踝杂苫衔锓磻?yīng)。在一方面，所述糖與約0.005、0.01、0.05或0.1摩爾當量的穩(wěn)定的硝酰基或氮氧自由基化合物反應(yīng)。在另一方面，所述糖是細菌莢膜多糖。在另一方面，所述糖是合成得到的寡糖或多糖。在一個方面，所述莢膜多糖源自肺炎鏈球菌(Pn)。在另一方面，所述莢膜多糖選自Pn-血清型10A、Pn-血清型12F和Pn-血清型33F莢膜多糖。例如，在一方面，所述莢膜多糖是Pn-血清型12F莢膜多糖。在另一方面，所述莢膜多糖源自腦膜炎奈瑟氏球菌(N.meningitidis)。在一個方面，所述莢膜多糖選自腦膜炎球菌(Mn)-血清型A、C、W135和Y莢膜多糖。在另一方面，所述莢膜多糖是腦膜炎球菌(Mn)-血清型X莢膜多糖。在另一方面，所述莢膜多糖源自B組鏈球菌(GroupBStreptococcus，GBS)。在一方面，所述莢膜多糖選自GBS血清型Ia、Ib、II、III、IV、V、VI、VII和VIII。在一方面，本發(fā)明提供了本文所公開的任何方法，其中所述載體蛋白是來自破傷風(fēng)、白喉、百日咳、假單胞菌屬(Pseudomonas)、大腸桿菌(E.coli)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)或鏈球菌屬(Streptococcus)的毒素。在一方面，所述載體蛋白是CRM197。在另一方面，本發(fā)明提供了本文所述的方法，其中在步驟a)之前，將所述糖水解至100kDa至400kDa的分子量。例如，在一方面，所述分子量為100kDa至350kDa、100kDa至300kDa、100kDa至250kDa、100kDa至200kDa、100kDa至150kDa、200kDa至400kDa、200kDa至350kDa、200kDa至300kDa、200kDa至250kDa、300kDa至400kDa、或300kDa至350kDa。在另一方面，本發(fā)明提供了本文提供的任何方法，其還包括在步驟b)之前純化所述活化的多糖的步驟。在另一方面，所述方法還包括在步驟b)之后添加還原劑的步驟。在一方面，所述還原劑為NaCNBH3。在另一方面，所述方法還包括在添加NaCNBH3之后添加NaBH4的步驟。在另一方面，所述方法包括在添加NaBH4之后的純化步驟。在另一方面，本發(fā)明提供了通過本文所公開的任何方法而產(chǎn)生或可獲得的糖綴合物。例如，在一個方面，本發(fā)明提供了通過包括以下步驟的方法產(chǎn)生或可獲得的包含與載體蛋白綴合的糖的糖綴合物：a)使糖與2,2,6,6-四甲基-1-哌啶氧基(TEMPO)和N-氯代琥珀酰亞胺(NCS)在水性溶劑中反應(yīng)以產(chǎn)生活化的糖；以及b)使所述活化的糖與包含一個或多個氨基的載體蛋白反應(yīng)。在另一方面，本發(fā)明提供了通過包括以下步驟的方法產(chǎn)生或可獲得的包含與載體蛋白綴合的糖的糖綴合物：a)使糖與穩(wěn)定的硝?；虻踝杂苫衔锖脱趸瘎┓磻?yīng)以產(chǎn)生包含醛基的活化的糖；以及b)使所述活化的糖與包含一個或多個氨基的載體蛋白反應(yīng)。穩(wěn)定的硝?；衔锖脱趸瘎┛梢匀缟衔乃x。在另一方面，本發(fā)明提供了包含本文所公開的任何糖綴合物以及藥學(xué)上可接受的賦形劑、載體或稀釋劑的免疫原性組合物。在另一方面，所述免疫原性組合物包含其它抗原。在另一方面，所述其它抗原包括蛋白抗原或源自肺炎鏈球菌的莢膜多糖的糖綴合物。例如，在一方面，所述其它抗原包括莢膜多糖的糖綴合物，所述莢膜多糖選自Pn-血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、11A、14、15B、18C、19A、19F、22F和23F莢膜多糖。在另一方面，所述其它抗原包括蛋白抗原或源自腦膜炎奈瑟氏球菌的莢膜多糖的糖綴合物。在另一方面，所述其它抗原包括莢膜多糖的糖綴合物，所述莢膜多糖選自血清型A、C、W135和Y莢膜多糖。在另一方面，所述其它抗原包括莢膜多糖的糖綴合物，所述莢膜多糖來自血清型X莢膜多糖。在另一方面，所述其它抗原包括莢膜多糖的糖綴合物，所述莢膜多糖源自B組鏈球菌(GBS)。在一方面，所述其它抗原包括莢膜多糖的糖綴合物，所述莢膜多糖選自GBS血清型Ia、Ib、II、III、IV、V、VI、VII和VIII。在另一方面，本發(fā)明提供了本文所公開的任何免疫原性組合物，其還包含佐劑。在一方面，所述佐劑是鋁系佐劑。在另一方面，所述鋁系佐劑選自磷酸鋁、硫酸鋁和氫氧化鋁。在另一方面，本發(fā)明提供了預(yù)防、治療或改善個體的細菌感染、疾病或病癥的方法，其包括向所述個體給藥免疫有效量的本文所公開的任何免疫原性組合物。在一方面，所述感染、疾病或病癥與肺炎鏈球菌相關(guān)。在一方面，所述感染、疾病或病癥與腦膜炎奈瑟氏球菌相關(guān)。在另一方面，本發(fā)明提供了在個體中誘導(dǎo)保護性免疫應(yīng)答的方法，其包括向所述個體給藥免疫有效量的本文所公開的任何免疫原性組合物。在另一方面，本發(fā)明提供了包含與載體蛋白綴合的Pn-血清型12F的免疫原性組合物，其中所述綴合物是穩(wěn)定的。例如，在一方面，本發(fā)明提供了包含與載體蛋白綴合的Pn-血清型12F的免疫原性組合物，其中從其制備時起120天之后，所述組合物中游離Pn-血清型12F多糖的量少于35％。在另一方面，從其制備時起120天之后，游離Pn-血清型12F多糖的量少于30％、少于28％、少于27％、少于26％、或少于25％。在另一方面，從其制備時起90天之后，游離Pn-血清型12F多糖的量少于35％、少于30％、少于28％、少于27％、少于26％、或少于25％。在另一方面，從其制備時起60天之后，游離Pn-血清型12F多糖的量少于35％、少于30％、少于28％、少于27％、少于26％、或少于25％。在另一方面，從其制備時起30天之后，游離Pn-血清型12F多糖的量少于35％、少于30％、少于28％、少于27％、少于26％、或少于25％。在另一方面，本發(fā)明提供了包含與載體蛋白綴合的Pn-血清型3、10A或33F的組合物，其中從其制備時起120天之后，所述組合物中游離Pn-血清型3、10A或33F多糖的量分別少于35％。在另一方面，從其制備時起120天之后，游離Pn-血清型3、10A或33F多糖的量少于30％、少于28％、少于27％、少于26％、或少于25％。在另一方面，從其制備時起90天之后，游離Pn-血清型3、10A或33F多糖的量少于35％、少于30％、少于28％、少于27％、少于26％、或少于25％。在另一方面，從其制備時起60天之后，游離Pn-血清型3、10A或33F多糖的量少于35％、少于30％、少于28％、少于27％、少于26％、或少于25％。在另一方面，從其制備時起30天之后，游離Pn-血清型3、10A或33F多糖的量少于35％、少于30％、少于28％、少于27％、少于26％、或少于25％。在一方面，上文所討論的游離多糖的量是在25℃下測量的。在一方面，上文所公開的組合物中的載體蛋白是來自來自破傷風(fēng)、白喉、百日咳、假單胞菌、大腸桿菌、葡萄球菌或鏈球菌的毒素。在另一方面，所述載體蛋白是CRM197。本發(fā)明還提供了包含上文所公開的任何此類糖綴合物以及藥學(xué)上可接受的賦形劑、載體或稀釋劑的免疫原性組合物。在另一方面，此類免疫原性組合物包含其它抗原。例如，在另一方面，所述其它抗原包括蛋白抗原或源自肺炎鏈球菌的莢膜多糖的糖綴合物。在一方面，所述其它抗原包括莢膜多糖的糖綴合物，所述莢膜多糖選自Pn-血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、11A、14、15B、18C、19A、19F、22F和23F莢膜多糖。在另一方面，所述其它抗原包括蛋白抗原或源自腦膜炎奈瑟氏球菌的莢膜多糖的糖綴合物。在另一方面，所述其它抗原包括莢膜多糖的糖綴合物，所述莢膜多糖選自血清型A、C、W135和Y莢膜多糖。在另一方面，所述其它抗原包括莢膜多糖的糖綴合物，所述莢膜多糖來自血清型X莢膜多糖。在另一方面，所述其它抗原包括莢膜多糖的糖綴合物，所述莢膜多糖來自B組鏈球菌(GBS)。在一方面，所述莢膜多糖選自GBS血清型Ia、Ib、II、III、IV、V、VI、VII和VIII。在另一方面，此類免疫原性組合物還包含佐劑。例如，在一方面，所述佐劑是鋁系佐劑。在另一方面，所述鋁系佐劑選自磷酸鋁、硫酸鋁和氫氧化鋁。附圖說明圖1示出Pn-血清型12F的莢膜多糖的結(jié)構(gòu)。圖2示出N-氯代琥珀酰亞胺在Tempo/NCS氧化(oxidationation)反應(yīng)中對氧化度(DO)的依賴性。圖3示出Pn-血清型10A的莢膜多糖的結(jié)構(gòu)。圖4示出Pn-血清型33F的莢膜多糖的結(jié)構(gòu)。圖5示出Pn-血清型3的莢膜多糖的結(jié)構(gòu)。圖6示出使用TEMPO/NCS氧化/綴合Pn-血清型12F的推定機制。圖7示出使用高碘酸鹽氧化相對于使用TEMPO/NCS氧化所制備的Pn-血清型12F的穩(wěn)定性比較。發(fā)明詳述通過參考本發(fā)明的各種實施方案的以下詳細說明和本文中所包括的實施例可以更容易地理解本發(fā)明。除非另有定義，否則本文所用的所有技術(shù)術(shù)語和科學(xué)術(shù)語都與本發(fā)明所屬領(lǐng)域技術(shù)人員通常所理解的含義相同。雖然本文中描述了某些優(yōu)選方法和材料，但類似或等同于本文所述的那些的任何方法和材料均可用于實踐或測試本發(fā)明。在描述實施方案及權(quán)利要求書時，會根據(jù)下文所述的定義使用某些術(shù)語。除非另有說明，否則如本文所使用的單數(shù)形式“a”、“an”和“the”包括復(fù)數(shù)指代。因此，例如，“所述方法”包括本文所述類型的一種或多種方法和/或一個或多個步驟，和/或其會在本領(lǐng)域技術(shù)人員閱讀本公開內(nèi)容之后而變得明了。如本文所使用的術(shù)語“約”意指在某一值的統(tǒng)計學(xué)上有意義的范圍內(nèi)，例如所述濃度范圍、時間范圍、分子量、溫度或pH。此類范圍可在所給定的值或范圍的一個數(shù)量級內(nèi)，通常在20％內(nèi)，更通常在10％內(nèi)，甚至更通常在5％內(nèi)或在1％內(nèi)。有時，此類范圍可在用于測量和/或測定給定值或范圍的標準方法的典型實驗誤差內(nèi)。術(shù)語“約”所涵蓋的允許變化會取決于所研究的具體系統(tǒng)，并且可容易被本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解。無論何時在本申請內(nèi)列舉一個范圍，所述范圍內(nèi)的每個整數(shù)也被涵蓋作為本發(fā)明的實施方案。應(yīng)注意，在本公開內(nèi)容中，諸如“包括”、“包含”等術(shù)語可具有在美國專利法中所歸屬于它們的含義；例如，它們可意指“包括”等。此類術(shù)語是指包括具體成分或成分組而不排除任何其他的成分。諸如“基本上由……組成”等術(shù)語具有在美國專利法中所歸屬于它們的含義，例如，它們允許包括不損害本發(fā)明的新穎或基本特征的其他成分或步驟，即，它們排除損害本發(fā)明的新穎或基本的特征的其他未列舉的成分或步驟。術(shù)語“由……組成”具有在美國專利法中所歸屬于它們的含義；也就是說，這些術(shù)語是封閉式的。因此，這些術(shù)語是指包括具體成分或成分組并且排除所有其他成分。如本文所使用的術(shù)語“糖”可以用于指多糖、寡糖或單糖。如本文所使用的關(guān)于糖的術(shù)語“氧化度”是指每摩爾醛的糖重復(fù)單元摩爾比。糖的氧化度可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法而測定。如本文所使用的術(shù)語“綴合物”或“糖綴合物”是指與載體蛋白共價綴合的糖。本發(fā)明的糖綴合物和包含其的免疫原性組合物可以包含一定量的游離糖。如本文所使用的術(shù)語“游離糖”意指未與載體蛋白共價綴合但仍然存在于糖綴合物組合物中的糖。所述游離糖可與綴合的糖-載體蛋白糖綴合物非共價締合(即，非共價結(jié)合到綴合的糖-載體蛋白糖綴合物、吸附到綴合的糖-載體蛋白糖綴合物或截留于綴合的糖-載體蛋白糖綴合物中或與其一起被截留)。術(shù)語“游離多糖”和“游離莢膜多糖”可在本文中用于傳達關(guān)于糖綴合物的相同含義，其中所述糖分別是多糖或莢膜多糖。如本文所使用的“綴合”是指借以使例如細菌莢膜多糖的糖與載體分子或載體蛋白共價連接的過程。可根據(jù)下文所述的方法或通過本領(lǐng)域內(nèi)已知的其他方法進行綴合。綴合增強了細菌莢膜多糖的免疫原性。術(shù)語“個體”是指包括人類在內(nèi)的哺乳動物，或指鳥、魚、爬行動物、兩棲動物或任意其他動物。術(shù)語“個體”還包括家庭寵物或研究用動物。家庭寵物和研究用動物的非限制性實例包括：狗、貓、豬、兔、大鼠、小鼠、沙鼠、倉鼠、豚鼠、白鼬、猴、鳥、蛇、蜥蜴、魚、烏龜和青蛙。術(shù)語“個體”還包括牲畜動物。牲畜動物的非限制性實例包括：羊駝、美洲野牛、駱駝、牛、鹿、豬、馬、美洲駝、騾、驢、綿羊、山羊、兔、馴鹿、牦牛、雞、鵝和火雞。糖綴合物本發(fā)明涉及制備包含與載體蛋白綴合的糖的糖綴合物的方法，所述方法特別通過使用穩(wěn)定的硝?；虻踝杂苫衔飳⑺鎏堑牟歼x擇性氧化成醛，并且使用氧化劑來進行。在一方面，所述穩(wěn)定的硝?；衔锸沁哙?N-氧基或吡咯烷-N-氧基化合物。優(yōu)選地，所述化合物具有在氧化劑的存在下將伯醇選擇性氧化成醛而不過度氧化成羧酸且不影響仲羥基的能力。在一方面，所述穩(wěn)定的硝?；衔锸菐в蠺EMPO或PROXYL(2,2,5,5-四甲基-1-吡咯烷氧基)部分的分子。優(yōu)選地，所述分子具有在氧化劑的存在下選擇性氧化伯醇以生成醛基而不影響仲羥基的能力。更優(yōu)選地，所述分子具有在氧化劑的存在下選擇性氧化伯醇以生成醛基而不過度氧化成羧基的能力。在一個方面，所述穩(wěn)定的硝?；衔镞x自TEMPO、2,2,6,6-四甲基-4-(甲基磺酰氧基)-1-哌啶氧基、4-膦酰氧基-TEMPO、4-氧代-TEMPO、4-甲氧基-TEMPO、4-異硫氰酸基-TEMPO、4-(2-碘乙酰氨基)-TEMPO自由基、4-羥基-TEMPO、4-氰基-TEMPO、4-羧基-TEMPO、4-(2-溴乙酰氨基)-TEMPO、4-氨基-TEMPO、4-乙酰氨基-2,2,6,6-四甲基哌啶1-氧基。優(yōu)選地，所述穩(wěn)定的硝?；衔锸荰EMPO。在另一方面，所述穩(wěn)定的硝?；衔镞x自3β-DOXYL-5α-膽甾烷、5-DOXYL-硬脂酸、16-DOXYL-硬脂酸、5-DOXYL-硬脂酸甲酯、3-(氨基甲基)-PROXYL、3-氨甲?；?PROXYL、3-氨甲?；?2,2,5,5-四甲基-3-吡咯啉-1-氧基、3-羧基-PROXYL、3-氰基-PROXYL。在一個方面，所述氧化劑是帶有N-鹵代部分的分子。優(yōu)選地，所述分子具有在硝酰基化合物的存在下選擇性氧化伯醇的能力。在一個方面，所述氧化劑選自N-氯代琥珀酰亞胺、N-溴代琥珀酰亞胺、N-碘代琥珀酰亞胺、二氯異氰尿酸、1,3,5-三氯-1,3,5-三嗪-2,4,6-三酮、二溴異氰尿酸、1,3,5-三溴-1,3,5-三嗪-2,4,6-三酮、二碘異氰尿酸以及1,3,5-三碘-1,3,5-三嗪-2,4,6-三酮。優(yōu)選地，所述氧化劑為N-氯代琥珀酰亞胺。在一方面，本發(fā)明涉及制備包含與載體蛋白綴合的糖的糖綴合物的方法，所述方法特別通過使用2,2,6,6-四甲基-1-哌啶氧基自由基(TEMPO)、使用作為共氧化劑(cooxidant)的N-氯代琥珀酰亞胺(NCS)將所述糖的伯醇氧化成醛來進行。在本發(fā)明的糖綴合物中，所述糖選自多糖、寡糖和單糖，并且所述載體蛋白選自本文進一步描述或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任意合適的載體。在一些實施方案中，所述糖是多糖，尤其是細菌莢膜拖多糖，例如肺炎鏈球菌血清型10A(Pn-血清型10A)、Pn-血清型12F或Pn-血清型33F。在一些此類實施方案中，所述載體蛋白是CRM197。莢膜多糖可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的標準技術(shù)制備。例如，莢膜多糖可以由多種血清型制備，例如肺炎鏈球菌的1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F和33F。這些肺炎球菌綴合物通過分離過程而制備，并被配制成單劑量制劑。例如，在一個實施方案中，每一肺炎球菌多糖血清型在大豆基培養(yǎng)基中生長。然后，通過離心、沉淀、超濾和柱層析來純化各多糖。純化的多糖經(jīng)化學(xué)活化以使所述糖(即，活化的糖)能夠與載體蛋白反應(yīng)。一旦活化，則每一莢膜多糖分別與載體蛋白綴合以形成糖綴合物。在一個實施方案中，每一莢膜多糖與相同的載體蛋白綴合。多糖的化學(xué)活化及隨后與載體蛋白的綴合可以通過常規(guī)手段而實現(xiàn)。參見例如第4,673,574、4,902,506、7,709,001和7,955,605號美國專利。在一個實施方案中，本發(fā)明的糖綴合物具有約50kDa至約20,000kDa的分子量。在另一實施方案中，所述糖綴合物具有約200kDa至約10,000kDa的分子量。在另一實施方案中，所述糖綴合物具有約500kDa至約5,000kDa的分子量。在一個實施方案中，所述糖綴合物具有約1,000kDa至約3,000kDa的分子量。在其他實施方案中，所述糖綴合物具有約600kDa至約2800kDa；約700kDa至約2700kDa；約1000kDa至約2000kDa；約1800kDa至約2500kDa；約1100kDa至約2200kDa；約1900kDa至約2700kDa；約1200kDa至約2400kDa；約1700kDa至約2600kDa；約1300kDa至約2600kDa；約1600kDa至約3000kDa的分子量。任何上述范圍內(nèi)的任何整數(shù)也被涵蓋作為本發(fā)明的實施方案。本發(fā)明的糖綴合物的新穎特征還包括所述糖和得到的綴合物的分子量分布(profile)、每個載體蛋白綴合的賴氨酸與共價連接到多糖的賴氨酸的數(shù)量的比率、作為糖的重復(fù)單元的函數(shù)的載體蛋白與所述糖之間的共價鍵的數(shù)量、以及游離糖相對于總糖的相對量。在另一實施方案中，所述多糖是源自腦膜炎奈瑟氏球菌(Neisseriameningitidi)的莢膜多糖。在一些此類實施方案中，所述莢膜多糖選自腦膜炎奈瑟氏球菌的血清型A、B、C、W135、X和Y莢膜多糖。在一個此類實施方案中，所述莢膜多糖是血清型C莢膜多糖。在另一此類實施方案中，所述莢膜多糖是血清型W135莢膜多糖。在另一此類實施方案中，所述莢膜多糖是血清型Y莢膜多糖。在一些實施方案中，本發(fā)明的糖綴合物包括細菌莢膜多糖，其中所述莢膜多糖具有10kDa至2,000kDa或50kDa至1,000kDa的分子量。在一些此類實施方案中，所述莢膜多糖源自肺炎鏈球菌或腦膜炎奈瑟氏球菌。在一些此類實施方案中，所述莢膜多糖源自肺炎鏈球菌，并選自血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F和33F莢膜多糖。在其他此類實施方案中，所述莢膜多糖源自腦膜炎奈瑟氏球菌并選自血清型A、B、C、W135、X和Y莢膜多糖。在一個實施方案中，本發(fā)明提供了包含與載體蛋白共價綴合的莢膜多糖的糖綴合物，其具有下列特征中的一個或多個：所述多糖具有50kDa至1,000kDa的分子量；所述糖綴合物具有1,000kDa至3,000kDa的分子量；以及所述綴合物包含相對于總多糖少于約45％的游離多糖。在一些實施方案中，所述多糖具有10kDa至2,000kDa的分子量。在一些實施方案中，所述糖綴合物具有50kDa至20,000kDa的分子量。在其他實施方案中，所述糖綴合物具有200kDa至10,000kDa的分子量。在其他實施方案中，所述綴合物包含相對于總多糖少于約30％、20％、15％、10％或5％的游離多糖。可以時間函數(shù)的形式測量游離多糖的量，例如在制備綴合物之后的10、20、30、40、50、60、70、80、90或120天之后或更久。在與糖綴合的載體蛋白中的賴氨酸殘基的數(shù)量可以表征為綴合的賴氨酸的范圍，其可以摩爾比形式表示。例如，在其中CRM197的4至15個賴氨酸殘基與糖共價連接的免疫原性組合物中，綴合的賴氨酸與CRM197在糖綴合物中的摩爾比為約10:1至約40:1。在其中CRM197的2至20個賴氨酸殘基與糖共價連接的免疫原性組合物中，綴合的賴氨酸與CRM197在糖綴合物中的摩爾比為約5:1至約50:1。在一個實施方案中，綴合的賴氨酸與載體蛋白的摩爾比為約10:1至約25:1。在一些此類實施方案中，所述載體蛋白為CRM197。在一個實施方案中，糖:載體蛋白的比率(w/w)為0.2至4。在另一實施方案中，糖:載體蛋白的比率(w/w)為1.1至1.7。在一些實施方案中，所述糖是細菌莢膜多糖，并且糖:載體蛋白的比率(w/w)為0.2至4。在其他實施方案中，所述糖是細菌莢膜多糖，并且糖:載體蛋白的比率(w/w)為1.1至1.7。在一些此類實施方案中，所述載體蛋白是CRM197。糖鏈與載體蛋白上的賴氨酸的連接頻率是表征本發(fā)明的糖綴合物的另一參數(shù)。例如，在一個實施方案中，對于多糖的每100個糖重復(fù)單元，在載體蛋白與多糖之間存在至少一個共價鍵。在一個實施方案中，對于多糖的每50個糖重復(fù)單元，在載體蛋白與多糖之間存在至少一個共價鍵。在一個實施方案中，對于多糖的每25個糖重復(fù)單元，在載體蛋白與多糖之間存在至少一個共價鍵。在另一實施方案中，在多糖的每4個糖重復(fù)單元中載體蛋白與多糖之間的共價鍵出現(xiàn)至少一次。在另一實施方案中，在多糖的每10個糖重復(fù)單元中載體蛋白與多糖之間的共價鍵出現(xiàn)至少一次。在其他實施方案中，在多糖的每15個糖重復(fù)單元中載體蛋白與多糖之間的共價鍵出現(xiàn)至少一次。在常見的實施方案中，所述載體蛋白是CRM197，并且在多糖的每4、10、15或25個糖重復(fù)單元中CRM197與多糖之間的共價鍵出現(xiàn)至少一次。在一些此類實施方案中，所述多糖是細菌莢膜多糖，例如源自肺炎鏈球菌或腦膜炎奈瑟氏球菌的莢膜多糖。在其他實施方案中，對于每5至10個糖重復(fù)單元；每2至7個糖重復(fù)單元；每3至8個糖重復(fù)單元；每4至9個糖重復(fù)單元；每6至11個糖重復(fù)單元；每7至12個糖重復(fù)單元；每8至13個糖重復(fù)單元；每9至14個糖重復(fù)單元；每10至15個糖重復(fù)單元；每2至6個糖重復(fù)單元；每3至7個糖重復(fù)單元；每4至8個糖重復(fù)單元；每6至10個糖重復(fù)單元；每7至11個糖重復(fù)單元；每8至12個糖重復(fù)單元；每9至13個糖重復(fù)單元；每10至14個糖重復(fù)單元；每10至20個糖重復(fù)單元；或每4至25個糖重復(fù)單元，所述綴合物包含至少一個在載體蛋白與糖之間的共價鍵。在另一實施方案中，對于多糖的每2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25個糖重復(fù)單元，發(fā)生載體蛋白與糖之間的至少一個鍵合。在一個實施方案中，對于多糖的每25個糖重復(fù)單元，本發(fā)明的糖綴合物包含至少一個在載體蛋白與多糖之間的共價鍵。在另一實施方案中，在多糖的每4個糖重復(fù)單元中載體蛋白與多糖之間的共價鍵出現(xiàn)至少一次。在另一實施方案中，在多糖的每10個糖重復(fù)單元中載體蛋白與多糖之間的共價鍵出現(xiàn)至少一次。在又一實施方案中，在多糖的每15個糖重復(fù)單元中載體蛋白與多糖之間的共價鍵出現(xiàn)至少一次。在一個實施方案中，與糖的總量相比，所述糖綴合物包含少于約45％的游離糖。在另一實施方案中，與糖的總量相比，所述糖綴合物包含少于約30％的游離糖。在另一實施方案中，與糖的總量相比，所述糖綴合物包含少于約20％的游離糖。在其他實施方案中，與糖的總量相比，所述糖綴合物包含少于約10％的游離糖。在另一實施方案中，與糖的總量相比，所述糖綴合物包含少于約5％的游離糖。在另一實施方案中，與糖的總量相比，所述糖綴合物包含少于約20摩爾％的載體蛋白殘基。在另一方面，本發(fā)明提供了免疫原性組合物，其包含本發(fā)明的糖綴合物以及佐劑、稀釋劑或載體中的至少一種。在一個實施方案中，本發(fā)明提供了免疫原性組合物，其包含本發(fā)明的糖綴合物以及佐劑、稀釋劑或載體中的至少一種，其中所述糖綴合物包含與載體蛋白共價綴合的細菌莢膜多糖。在一些此類實施方案中，所述莢膜多糖源自肺炎鏈球菌或腦膜炎奈瑟氏球菌。在一些實施方案中，所述免疫原性組合物包含佐劑。在一些此類實施方案中，所述佐劑是選自磷酸鋁、硫酸鋁和氫氧化鋁的鋁系佐劑。在一個實施方案中，所述免疫原性組合物包含佐劑磷酸鋁。在一些實施方案中，本發(fā)明的糖綴合物或免疫原性組合物可以用于生成功能性的抗體，如通過在動物效力模型中或通過調(diào)理吞噬殺滅測定對細菌的殺滅所測量的。在一個實施方案中，本發(fā)明提供了誘導(dǎo)個體的免疫應(yīng)答的方法，其包括向所述個體給藥免疫有效量的本文所述的本發(fā)明的免疫原性組合物。在另一方面，本發(fā)明提供了在個體中誘導(dǎo)針對致病菌的免疫應(yīng)答的方法，其包括向所述個體給藥免疫有效量的本文所述的免疫原性組合物。在另一方面，本發(fā)明提供了預(yù)防或改善個體的由致病菌引發(fā)的疾病或病癥的方法，其包括向所述個體給藥免疫有效量的本文所述的免疫原性組合物。在另一方面，本發(fā)明提供了降低個體的由致病菌的感染而引發(fā)的疾病或病癥的至少一種癥狀的嚴重性的方法，其包括向所述個體給藥免疫有效量的本文所述的免疫原性組合物。在一些實施方案中，所述致病菌是肺炎鏈球菌或腦膜炎奈瑟氏球菌。此外，本發(fā)明提供了誘導(dǎo)針對肺炎鏈球菌或腦膜炎奈瑟氏球菌的免疫應(yīng)答的方法、預(yù)防由肺炎鏈球菌或腦膜炎奈瑟氏球菌引發(fā)的疾病的方法、以及降低由肺炎鏈球菌或腦膜炎奈瑟氏球菌的感染而引發(fā)的疾病的至少一種癥狀的嚴重性的方法。糖糖包括多糖、寡糖和單糖。在一些實施方案中，所述糖是多糖，尤其是細菌莢膜多糖。莢膜多糖的分子量是供在免疫原性組合物中使用的一個考慮因素。高分子量莢膜多糖由于存在于抗原表面上的表位的化合價較高而能夠誘導(dǎo)某些抗體免疫應(yīng)答。高分子量莢膜多糖的分離和純化被涵蓋用于本發(fā)明的綴合物、組合物和方法中。在一個實施方案中，所述莢膜多糖具有10kDa至2,000kDa的分子量。在一個實施方案中，所述莢膜多糖具有50kDa至1,000kDa的分子量。在另一實施方案中，所述莢膜多糖具有50kDa至300kDa的分子量。在另一實施方案中，所述莢膜多糖具有70kDa至300kDa的分子量。在其他實施方案中，所述莢膜多糖具有90kDa至250kDa；90kDa至150kDa；90kDa至120kDa；80kDa至120kDa；70kDa至100kDa；70kDa至110kDa；70kDa至120kDa；70kDa至130kDa；70kDa至140kDa；70kDa至150kDa；70kDa至160kDa；80kDa至110kDa；80kDa至120kDa；80kDa至130kDa；80kDa至140kDa；80kDa至150kDa；80kDa至160kDa；90kDa至110kDa；90kDa至120kDa；90kDa至130kDa；90kDa至140kDa；90kDa至150kDa；90kDa至160kDa；100kDa至120kDa；100kDa至130kDa；100kDa至140kDa；100kDa至150kDa；100kDa至160kDa的分子量；以及類似的期望分子量范圍。任何上述范圍內(nèi)的任何整數(shù)也被涵蓋作為本發(fā)明的實施方案。肺炎鏈球菌血清型12F(Pn-血清型12F)的莢膜多糖具有圖1所示的結(jié)構(gòu)。肺炎鏈球菌血清型10A(Pn-血清型10A)的莢膜多糖具有圖3所示的結(jié)構(gòu)。肺炎鏈球菌血清型33F(Pn-血清型33F)的莢膜多糖具有圖4所示的結(jié)構(gòu)。肺炎鏈球菌血清型3(Pn-血清型3)的莢膜多糖具有圖5所示的結(jié)構(gòu)。在一些實施方案中，本發(fā)明的莢膜多糖、糖綴合物或免疫原性組合物用于生成功能性的抗體，如通過在證實抗體殺滅細菌的動物效力模型中或調(diào)理吞噬殺滅測定中對細菌的殺滅所測量的?？墒褂帽绢I(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的分離操作直接從細菌獲得莢膜多糖。參見例如Fournier等人(1984)，見上文；Fournier等人(1987)Ann.Inst.Pasteur/Microbiol.138:561-567；美國專利申請公開第2007/0141077號；以及國際專利申請公開第WO00/56357號；這些文獻各自以其整體援引加入本文。另外，可使用合成方案產(chǎn)生莢膜多糖。此外，可使用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員還已知的基因工程操作重組產(chǎn)生莢膜多糖(參見Sau等人(1997)Microbiology143:2395-2405；以及美國專利第6,027,925號；這些文獻各自以其整體援引加入本文)。從已確定的培養(yǎng)收集物或臨床樣本獲得的肺炎鏈球菌株或腦膜炎奈瑟氏球菌(N.menigitidis)菌株可用于制備各自的多糖。載體蛋白本發(fā)明的糖綴合物的另一組分是與所述糖綴合的載體蛋白。術(shù)語“蛋白載體”或“載體蛋白”或“載體”是指可與期望的免疫應(yīng)答所針對的抗原(例如莢膜多糖)綴合的任何蛋白分子。與載體綴合可增強抗原的免疫原性。用于所述抗原的蛋白載體可為毒素，類毒素，或來自破傷風(fēng)、白喉、百日咳、假單胞菌屬、大腸桿菌、葡萄球菌屬和鏈球菌屬的毒素的任何突變交叉反應(yīng)性物質(zhì)(CRM)。在一個實施方案中，載體是源自產(chǎn)生CRM197蛋白的白喉棒桿菌(C.diphtheriae)菌株C7(β197)的白喉類毒素CRM197。這一菌株具有ATCC保藏號53281。產(chǎn)生CRM197的方法描述于美國專利第5,614,382號中，該美國專利以其整體援引加入本文?；蛘撸墒褂玫鞍纵d體或其他免疫原性蛋白的片段或表位。例如，半抗原可偶聯(lián)到細菌毒素、類毒素或CRM的T細胞表位。其他合適的載體蛋白包括滅活的細菌毒素，例如霍亂類毒素(例如，如國際專利申請第WO2004/083251號中所述)、大腸桿菌LT、大腸桿菌ST和來自綠膿假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)的外毒素A。還可使用細菌外膜蛋白，例如外膜復(fù)合物c(OMPC)、孔蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合蛋白、肺炎球菌溶血素、肺炎球菌表面蛋白A(PspA)、肺炎球菌粘著蛋白(PsaA)或流感嗜血桿菌(Haemophilusinfluenzae)蛋白D。還可使用其他蛋白(例如卵白蛋白、鑰孔血藍蛋白(KLH)、牛血清白蛋白(BSA)或純化的結(jié)核菌素蛋白衍生物(PPD))作為載體蛋白。如本文先前所討論，在變得與糖綴合的載體蛋白中的賴氨酸殘基的數(shù)量可被表征為綴合的賴氨酸的范圍。例如，在給定的免疫原性組合物中，CRM197可在39個賴氨酸殘基中包含1至15個與糖共價連接的賴氨酸殘基。表示此參數(shù)的另一方式是約2.5％至約40％的CRM197賴氨酸與糖共價連接。例如，在給定的免疫原性組合物中，CRM197可在39個賴氨酸殘基中包含1至20個與糖共價連接的賴氨酸殘基。表示此參數(shù)的另一方式是約2.5％至約50％的CRM197賴氨酸與糖共價連接。制備糖綴合物的方法為了制備糖綴合物，首先必須將多糖活化(即化學(xué)修飾)，然后其可與諸如蛋白質(zhì)的載體化學(xué)連接。在活化步驟之前，可將糖水解或通過加壓均化而機械地按尺寸分級(size)以達到適于活化和后續(xù)綴合的分子量(例如50kDA至500kDa)。在多糖中的碳水化合物的部分氧化已有效地用于生成醛基，所述醛基隨后偶聯(lián)到氨基如載體蛋白的賴氨酸殘基以產(chǎn)生免疫原性綴合物。重要的是，用于使多糖與載體蛋白綴合的方法產(chǎn)生穩(wěn)定的共價鍵，并且反應(yīng)條件足夠溫和到保持各組分的結(jié)構(gòu)完整性。常用于活化多糖并使多糖與載體蛋白偶聯(lián)的方法包括還原氨基化化學(xué)(RAC)、氰化以及使用碳二亞胺。還原氨基化通常包括使用高碘酸鈉或高碘酸鉀或高碘酸以將鄰近的-OH基團選擇性氧化成活性醛基。氰化用于將-OH基團隨機地轉(zhuǎn)化成活性-CN基團。碳二亞胺用于通過由碳二亞胺替代-OH基團而活化羧基。還原氨基化化學(xué)(RAC)是用于將多糖與蛋白質(zhì)偶聯(lián)的最常見的方法之一，因為多糖的所得羰基與載體蛋白的氨基之間的反應(yīng)可以形成相應(yīng)的席夫堿，其可隨后在氰基硼氫化鈉(NaCNBH3)的存在下被選擇性還原成非常穩(wěn)定的飽和碳-氮鍵。此外，在溫和到足以保持糖和蛋白組分的結(jié)構(gòu)完整性的條件下，在水溶液中進行還原氨基化。在綴合之后，未反應(yīng)的醛可隨后經(jīng)由硼氫化鈉(NaBH4)還原而加帽。綴合物隨后可被純化(例如通過超濾/滲濾)，在琥珀酸鹽緩沖鹽水中產(chǎn)生最終的大量糖綴合物。然而，根據(jù)特定的多糖，使用上述常用方法并非總是提供恰當?shù)慕Y(jié)果。例如，多糖與高碘酸鈉的直接氧化可能導(dǎo)致多糖骨架的裂解。例如，觀察到對于使用標準高碘酸鹽氧化條件(然后是還原氨基化)制備的綴合物，典型批次在25℃以上表現(xiàn)出游離多糖的增加和分子量的降低。本發(fā)明提供了下述發(fā)現(xiàn)：使用基于N-氧代銨鹽的氧化法導(dǎo)致多種肺炎鏈球菌糖綴合物(尤其是血清型12F)的穩(wěn)定性得到改善。特別地，如實施例1至7中進一步詳細所示的，使用自由基2,2,6,6-四甲基-1-哌啶氧基(TEMPO)與N-氯代琥珀酰亞胺(NCS)的組合有效地氧化了血清型12F、10A、3和33F的伯羥基，從而改善了所得的綴合物的穩(wěn)定性。盡管在有機溶劑中使用小分子的有機化學(xué)反應(yīng)的情形中已證明使用TEMPO/NCS將伯醇選擇性氧化成醛(參見例如Einhorn等人，J.Org.Chem.61,pp.7452-7454(1996))，但本發(fā)明提供了新穎的發(fā)現(xiàn)，即，TEMPO/NCS可用作氧化物質(zhì)以在水溶液中選擇性氧化復(fù)合多糖，從而產(chǎn)生穩(wěn)定的多糖蛋白綴合物。因此，在一個實施方案中，本發(fā)明提供了制備包含與載體蛋白綴合的糖的糖綴合物的方法，其包括以下步驟：a)使糖與穩(wěn)定的硝?；衔锖脱趸瘎┓磻?yīng)以產(chǎn)生活化的糖；以及b)使所述活化的糖與包含一個或多個氨基的載體蛋白反應(yīng)。在一方面，在與載體蛋白綴合之后，在加帽步驟中使用硼氫化物將未反應(yīng)的醛基轉(zhuǎn)化回伯醇，由此使在涉及氧化及隨后的綴合的修飾步驟期間的糖表位修飾最小化。在一方面，反應(yīng)的步驟a)在水性溶劑中進行。在另一方面，步驟a)在非質(zhì)子溶劑中進行。在一方面，步驟a)在DMSO(二甲亞砜)、二甲基乙酰胺(DMA)、環(huán)丁砜、N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)、六甲基磷酰胺(HMPA)中或在DMF(二甲基甲酰胺)中進行。在一方面，所述穩(wěn)定的硝?；衔锸沁哙?N-氧基或吡咯烷-N-氧基化合物。優(yōu)選地，所述化合物具有在氧化劑的存在下選擇性氧化伯醇以生成醛基而不影響仲羥基的能力。更優(yōu)選地，所述化合物具有在氧化劑的存在下選擇性氧化伯醇以生成醛基而不過度氧化成羧基的能力。在一個實施方案中，所述穩(wěn)定的硝?；衔锸菐в蠺EMPO或PROXYL(2,2,5,5-四甲基-1-吡咯烷氧基)部分的分子。優(yōu)選地，所述分子具有在氧化劑的存在下選擇性氧化伯醇以生成醛基而不影響仲羥基的能力。更優(yōu)選地，所述分子具有在氧化劑的存在下選擇性氧化伯醇以生成醛基而不過度氧化成羧基的能力。在一方面，所述穩(wěn)定的硝?；衔锸荰EMPO或其衍生物。在一個實施方案中，所述穩(wěn)定的硝?；衔镞x自TEMPO、2,2,6,6-四甲基-4-(甲基磺酰氧基)-1-哌啶氧基、4-膦酰氧基-TEMPO、4-氧代-TEMPO、4-甲氧基-TEMPO、4-異硫氰酸基-TEMPO、4-(2-碘乙酰氨基)-TEMPO自由基、4-羥基-TEMPO、4-氰基-TEMPO、4-羧基-TEMPO、4-(2-溴乙酰氨基)-TEMPO、4-氨基-TEMPO、4-乙酰氨基-2,2,6,6-四甲基哌啶1-氧基。優(yōu)選地，所述硝?；衔锸荰EMPO。在另一實施方案中，所述穩(wěn)定的硝?；衔镞x自3β-DOXYL-5α-膽甾烷、5-DOXYL-硬脂酸、16-DOXYL-硬脂酸、5-DOXYL-硬脂酸甲酯、3-(氨基甲基)-PROXYL、3-氨甲?；?PROXYL、3-氨甲?；?2,2,5,5-四甲基-3-吡咯啉-1-氧基、3-羧基-PROXYL、3-氰基-PROXYL。在一個實施方案中，所述氧化劑是帶有N-鹵代部分的分子。優(yōu)選地，所述分子具有在硝酰基化合物的存在下選擇性氧化伯醇的能力。在一個實施方案中，所述氧化劑選自N-氯代琥珀酰亞胺、N-溴代琥珀酰亞胺、N-碘代琥珀酰亞胺、二氯異氰尿酸、1,3,5-三氯-1,3,5-三嗪-2,4,6-三酮、二溴異氰尿酸、1,3,5-三溴-1,3,5-三嗪-2,4,6-三酮、二碘異氰尿酸以及1,3,5-三碘-1,3,5-三嗪-2,4,6-三酮。優(yōu)選地，所述氧化劑為N-氯代琥珀酰亞胺。在一方面，所述糖與0.1至10摩爾當量的氧化劑反應(yīng)。優(yōu)選地，所述糖與0.2至5、0.5至2.5或0.5至1.5摩爾當量的氧化劑反應(yīng)。在一方面，所述多糖與約0.2、0.4、0.6、0.8、1、1.2、1.4、1.6、1.8、2、2.2、2.4、2.6、2.8、3、3.2、3.4、3.6、3.8、4、4.2、4.4、4.6、4.8或5摩爾當量的氧化劑反應(yīng)。在一方面，所述穩(wěn)定的硝酰基化合物以催化量存在。在一方面，所述糖與少于約0.3摩爾當量的穩(wěn)定的硝?；衔锓磻?yīng)。在一方面，所述糖與少于約0.005摩爾當量的穩(wěn)定的硝?；衔锓磻?yīng)。在一方面，所述糖與約0.005、0.01、0.05或0.1摩爾當量的穩(wěn)定的硝?；衔锓磻?yīng)。在一個實施方案中，本發(fā)明提供了制備包含與載體蛋白綴合的糖的糖綴合物的方法，其包括以下步驟：a)使糖與2,2,6,6-四甲基-1-哌啶氧基(TEMPO)和N-氯代琥珀酰亞胺(NCS)在水性溶劑中反應(yīng)以產(chǎn)生活化的糖；以及b)使所述活化的糖與包含一個或多個氨基的載體蛋白反應(yīng)。在其他實施方案中，所述方法還包括例如通過滲濾純化所述糖綴合物的步驟。在每一情況下，所述糖選自多糖、寡糖和單糖。在每一情況下，所述糖可從發(fā)酵培養(yǎng)基純化，或可為合成得到的。在常見的實施方案中，載體蛋白是CRM197。在一個實施方案中，所述細菌莢膜多糖是源自肺炎鏈球菌的莢膜多糖。在另一優(yōu)選的實施方案中，所述細菌莢膜多糖是源自腦膜炎奈瑟氏球菌的莢膜多糖。在一個實施方案中，產(chǎn)生本發(fā)明的糖綴合物的方法包括在糖-載體蛋白綴合物產(chǎn)生之后將其分離的步驟。在常見的實施方案中，通過超濾分離所述糖綴合物。在一個實施方案中，用于產(chǎn)生分離的肺炎鏈球菌莢膜多糖-載體蛋白綴合物的方法的載體蛋白包括CRM197。在一個實施方案中，用于產(chǎn)生分離的腦膜炎奈瑟氏球菌莢膜多糖-載體蛋白綴合物的方法的載體蛋白包括CRM197。在一個實施方案中，CRM197以約1:1的重量比與所述活化的多糖反應(yīng)。在一個實施方案中，產(chǎn)生分離的肺炎鏈球菌莢膜多糖:載體蛋白綴合物的方法包括對多糖-載體蛋白綴合物反應(yīng)混合物加帽以去除未反應(yīng)的活化基團的步驟。在一個實施方案中，在產(chǎn)生莢膜多糖-CRM197綴合物的方法中的CRM197以約0.4:1的CRM197:莢膜多糖分子的重量比添加。在其他實施方案中，CRM197:莢膜多糖的重量比為約0.5:1、約0.6:1、約0.7:1、約0.8:1、約0.9:1、約1:1、約1.1:1、約1.2:1、約1.3:1、約1.4:1、或約1.5:1。在一個實施方案中，用于產(chǎn)生本發(fā)明的糖綴合物的方法的糖具有約10kDa至約2,000kDa的分子量。在其他實施方案中，所述分子量為約50kDa至約1,000kDa、約50kDa至約20,000kDa、約200kDa至約10,000kDa、約1,000kDa至約3,000kDa。在另一方面，本發(fā)明提供了包含通過本文所述的任何方法產(chǎn)生的糖綴合物的免疫原性組合物。在另一方面，本發(fā)明提供了包含可通過本文所述的任何方法而獲得的糖綴合物的免疫原性組合物。免疫原性組合物術(shù)語“免疫原性組合物”是指含有抗原如微生物或其組分的任何藥物組合物，該組合物可用于在個體中誘發(fā)免疫應(yīng)答。如本文所使用的“免疫原性”意指抗原(或抗原的表位)例如細菌莢膜多糖或包含該抗原的糖綴合物或免疫原性組合物在宿主(例如哺乳動物)中誘發(fā)體液或細胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答或二者的能力。因此，如本文所使用的“糖綴合物”或“綴合物”意指包含與可用于誘發(fā)免疫應(yīng)答的載體分子綴合的細菌莢膜多糖的抗原或抗原決定子(即表位)的任何糖綴合物。所述糖綴合物可通過在細胞表面提供與MHC分子相關(guān)的抗原而用于使宿主敏化。另外，可生成抗原特異性T細胞或抗體以允許對被免疫宿主的未來保護。因此，糖綴合物可保護宿主免于一種或多種與細菌感染相關(guān)的癥狀，或可保護宿主免于因與莢膜多糖相關(guān)的細菌感染所致的死亡。還可使用糖綴合物來生成可用于賦予個體被動免疫的多克隆抗體或單克隆抗體。還可使用糖綴合物來生成功能性的抗體，如通過在動物效力模型中或通過調(diào)理吞噬殺滅測定對細菌的殺滅所測量的?！翱贵w”是能夠通過位于免疫球蛋白分子的可變區(qū)中的至少一個抗原識別位點特異性結(jié)合到靶標(例如碳水化合物、多核苷酸、脂質(zhì)、多肽等)的免疫球蛋白分子。如本文所使用，除非上下文另有說明，否則所述術(shù)語意圖不僅涵蓋完整的多克隆或單克隆抗體，而且涵蓋工程抗體(例如，經(jīng)嵌合、人源化和/或衍生化以改變效應(yīng)子功能、穩(wěn)定性和其他生物活性)及其片段(例如Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv)、單鏈(ScFv)和域抗體(包括鯊魚和駱駝抗體)和包含抗體部分的融合蛋白、多價抗體、多特異性抗體(例如，雙特異性抗體，只要它們表現(xiàn)出期望的生物活性即可)和如本文所述的抗體片段，以及包含抗原識別位點的免疫球蛋白分子的任何其他經(jīng)修飾的構(gòu)型?？贵w包括任何類別的抗體，例如IgG、IgA或IgM(或其亞類)，并且所述抗體不必屬于任何具體類別。取決于其重鏈的恒定域的抗體氨基酸序列，可將免疫球蛋白歸屬于不同類別。存在5大類免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且這些中的若干類別可進一步被劃分為亞類(同種型)，例如，人類中的IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。對應(yīng)于不同類別的免疫球蛋白的重鏈恒定域分別被稱為α、δ、ε、γ和μ。不同類別的免疫球蛋白的亞單位結(jié)構(gòu)和三維構(gòu)型是公知的?！翱贵w片段”僅包含完整抗體的一部分，其中該部分在存在于完整抗體中時優(yōu)選保留通常與該部分相關(guān)的至少一種、優(yōu)選大部分或所有功能。術(shù)語“抗原”通常是指免疫原性組合物中的生物分子，通常為蛋白質(zhì)、肽、多糖或綴合物，或者可刺激動物中產(chǎn)生抗體或T細胞反應(yīng)或兩者的免疫原性物質(zhì)，包括被注射或吸收到動物中的組合物。可針對整個分子或針對所述分子的各個部分(例如，表位或半抗原)生成免疫應(yīng)答。該術(shù)語可用于指單個分子或同源或異源抗原分子群體。抗原由抗體、T細胞受體或具有特定體液免疫性和/或細胞免疫性的其他成分識別?！翱乖边€包括所有相關(guān)的抗原表位。給定抗原的表位可使用本領(lǐng)域內(nèi)熟知的任何數(shù)量的表位定位技術(shù)來鑒別。參見例如EpitopeMappingProtocolsinMethodsinMolecularBiology，第66卷(GlennE.Morris編輯，1996)HumanaPress,Totowa,N.J。例如，線性表位可例如通過以下方式來確定：在固體支撐物上同時合成大量肽，所述肽對應(yīng)于蛋白分子的各部分，并且在使所述肽仍然連接到所述支撐物的情況下使所述肽與抗體反應(yīng)。此類技術(shù)為本領(lǐng)域內(nèi)已知并且描述于例如美國專利第4,708,871號；Geysen等人(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA81:3998-4002；Geysen等人(1986)Molec.Immunol.23:709-715中；這些文獻各自以其整體援引加入本文。類似地，構(gòu)象表位可通過例如x射線晶體學(xué)和二維核磁共振確定氨基酸的空間構(gòu)象來鑒別。參見例如EpitopeMappingProtocols，見上文。此外，出于本發(fā)明的目的，“抗原”還可用于指包括對天然序列所作的修飾(例如缺失、添加和取代)(通常性質(zhì)保守，但它們可為不保守的)的蛋白質(zhì)，只要所述蛋白質(zhì)維持誘發(fā)免疫應(yīng)答的能力即可。這些修飾可以是人為的，如通過定點誘變、或通過特定合成操作、或通過遺傳工程方法，或可為偶發(fā)性的，例如通過產(chǎn)生抗原的宿主的突變。此外，抗原可從微生物(例如，細菌)衍生、獲得或分離，或可為整個生物體。類似地，所述定義中還包括在例如核酸免疫應(yīng)用中表達抗原的寡核苷酸或多核苷酸。合成抗原還包括例如多表位、側(cè)接表位(flankingepitope)和其他重組或合成衍生抗原(Bergmann等人(1993)Eur.J.Immunol.23:27772781；Bergmann等人(1996)J.Immunol.157:3242-3249；Suhrbier(1997)Immunol.CellBiol.75:402408；Gardner等人(1998)第12屆世界艾滋病會議(12thWorldAIDSConference)，瑞士日內(nèi)瓦，1998年6月28日-7月3日)?！氨Ｗo性”免疫應(yīng)答是指免疫原性組合物誘發(fā)用于保護個體免于感染的體液或細胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答或兩者的能力。所提供的保護不必是絕對的，即，不必完全阻止或根除感染，只要相對于對照個體群體(例如未給藥疫苗或免疫原性組合物的受感染動物)存在統(tǒng)計學(xué)上顯著的改進即可。保護可限于緩和感染癥狀的嚴重性或發(fā)作快速性。通常，“保護性免疫應(yīng)答”會包括在至少50％的個體中誘導(dǎo)對特定抗原具有特異性的抗體水平增加，包括對各抗原的可測量功能性抗體反應(yīng)的一定水平的增加。在特定情況下，“保護性免疫應(yīng)答”可包括在至少50％的個體中誘導(dǎo)對特定抗原具有特異性的抗體水平增加兩倍或抗體水平增加4倍，包括對各抗原的可測量功能性抗體反應(yīng)的一定水平的增加。在某些實施方案中，調(diào)理吞噬抗體與保護性免疫應(yīng)答相關(guān)。因此，保護性免疫應(yīng)答可通過在調(diào)理吞噬測定(例如下述測定)中測量細菌計數(shù)減少百分比而測定。優(yōu)選地，細菌計數(shù)減少至少10％、25％、50％、65％、75％、80％、85％、90％、95％或以上。在組合物中的具體綴合物的“免疫原性量”通?；谠摼Y合物的總多糖(綴合和非綴合的)來給藥。例如，在100mcg劑量中，具有20％游離多糖的莢膜糖綴合物具有約80mcg的綴合的多糖和約20mcg的非綴合的多糖。當計算綴合物的劑量時，通常不考慮蛋白質(zhì)對綴合物的貢獻。通常，每一劑量會包含0.1mcg至100mcg，特別是0.1mcg至10mcg，更特別是1mcg至10mcg的多糖。本發(fā)明的一個實施方案提供了免疫原性組合物，其包含任何上述包含與載體蛋白綴合的肺炎鏈球菌莢膜多糖的糖綴合物。本發(fā)明的免疫原性組合物可用于借助于通過全身性、皮膚或粘膜途徑給藥所述免疫原性組合物來保護或治療易受由例如肺炎鏈球菌或腦膜炎奈瑟氏球菌引起的細菌感染的人類，或可用于生成可用于賦予另一個體被動免疫的多克隆或單克隆抗體制劑。這些給藥可包括通過肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮內(nèi)或皮下途徑注射；或通過粘膜給藥到口腔/消化道、呼吸道或泌尿生殖道。還可使用免疫原性組合物來生成功能性的抗體，如通過在動物效力模型中或通過調(diào)理吞噬殺滅測定對細菌的殺滅所測量的。用于特定免疫原性組合物的組分的最佳量可通過涉及在個體中觀察適當免疫應(yīng)答的標準研究來確定。在進行初始疫苗接種后，個體可接受一次或若干次充分間隔的加強免疫。在一個實施方案中，本發(fā)明的免疫原性組合物還包含佐劑、緩沖劑、冷凍保護劑、鹽、二價陽離子、非離子清潔劑、自由基氧化抑制劑、稀釋劑或載體中的至少一種。在一個實施方案中，本發(fā)明的免疫原性組合物中的佐劑是鋁系佐劑。在一個實施方案中，所述佐劑是選自磷酸鋁、硫酸鋁和氫氧化鋁的鋁系佐劑。在一實施方案中，所述佐劑為磷酸鋁。佐劑是當與免疫原或抗原一起給藥時增強免疫應(yīng)答的物質(zhì)。已證明多種細胞因子或淋巴因子具有免疫調(diào)節(jié)活性，因此可以與佐劑相同或相似的方式使用，所述包括細胞因子或淋巴因子但不限于：白介素1-α、1-β、2、4、5、6、7、8、10、12(參見例如美國專利第5,723,127號)、13、14、15、16、17和18(及其突變體形式)；干擾素-α、β和γ；粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)(參見例如美國專利第5,078,996號和ATCC保藏號39900)；巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)；粒細胞集落刺激因子(G-CSF)；以及腫瘤壞死因子α和β?？捎糜诒疚乃龅拿庖咴越M合物的其他佐劑包括：趨化因子，其包括而不限于MCP-1、MIP-1α、MIP-1β和RANTES；粘附分子，例如選擇蛋白，如L-選擇蛋白、P-選擇蛋白和E-選擇蛋白；粘蛋白樣分子，例如CD34、GlyCAM-1和MadCAM-1；整聯(lián)蛋白家族中的一員，例如LFA-1、VLA-1、Mac-1和p150.95；免疫球蛋白超家族如PECAM、ICAM中的一員，例如ICAM-1、ICAM-2和ICAM-3、CD2和LFA-3；共刺激分子，例如B7-1、B7-2、CD40和CD40L；生長因子，包括血管生長因子、神經(jīng)生長因子、成纖維細胞生長因子、上皮生長因子、PDGF、BL-1和血管內(nèi)皮生長因子；受體分子，包括Fas、TNF受體、Flt、Apo-1、p55、WSL-1、DR3、TRAMP、Apo-3、AIR、LARD、NGRF、DR4、DR5、KILLER、TRAIL-R2、TRICK2和DR6；以及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶，包括ICE。用于增強免疫應(yīng)答的合適的佐劑可以還包括而不限于：MPLTM(3-O-脫?；鶈瘟柞Ｖ|(zhì)A,Corixa；Hamilton,MT)，其描述于美國專利第4,912,094號。還適于用作佐劑的是合成脂質(zhì)A類似物或氨基烷基葡糖胺磷酸鹽化合物(AGP)或其衍生物或類似物，其可購自Corixa并且描述于美國專利第6,113,918號中。一種此類AGP是2-[(R)-3-十四酰氧基十四酰氨基]乙基2-脫氧-4-O-膦酰基-3-O-[(R)-3-十四酰氧基十四?；鵠-2-[(R)-3-十四酰氧基十四酰氨基]-b-D-吡喃葡萄糖苷，其也被稱為529(以前被稱為RC529)。這種529佐劑也被配制為含水形式(AF)或穩(wěn)定乳液(SE)。其他佐劑包括：胞壁肽，例如N-乙?；邗；?L-蘇氨酰基-D-異谷氨酰胺(thr-MDP)、N-乙酰基去甲胞壁?；?normuramyl)-L-丙氨酸-2-(1'-2'二棕櫚?；?sn-甘油基-3-羥基磷酰基氧基)-乙胺(MTP-PE)；水包油乳液，例如MF59(美國專利第6,299,884號)(使用微型流化器如110Y型微型流化器(Microfluidics,Newton,MA)配制成亞微米粒子，其含有5％角鯊烯、0.5％聚山梨酯80和0.5％Span85(任選地含有不同量的MTP-PE))、和SAF(微流化為亞微米乳液或渦旋生成較大粒度的乳液，其含有10％角鯊烯、0.4％聚山梨酯80、5％Pluronic封阻的聚合物L(fēng)l21和thr-MDP)；弗氏不完全佐劑(IFA)；鋁鹽(alum)，例如氫氧化鋁、磷酸鋁、硫酸鋁；愛菲金(Amphigen)；阿夫立定；L121/角鯊烯；D-丙交酯-聚丙交酯/糖苷；普朗尼克多元醇(pluronicpolyol)；殺滅的博德特菌(Bordetella)；皂苷，例如STIMULONTMQS-21(Antigenics,Framingham,MA.，描述于美國專利第5,057,540號)、ISCOMATRIXTM(CSLLimited,Parkville,Australia，描述于美國專利第5,254,339號)、以及免疫刺激復(fù)合物(ISCOMS)；結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)；細菌脂多糖；合成多核苷酸，例如含有CpG基序的寡核苷酸(美國專利第6,207,646號)；IC-31(IntercellAG,Vienna,Austria)，描述于歐洲專利第1,296,713號和第1,326,634號；百日咳毒素(PT)或其突變體、霍亂毒素或其突變體(例如，美國專利第7,285,281號、第7,332,174號、第7,361,355號和第7,384,640號)；或大腸桿菌不耐熱毒素(LT)或其突變體，特別是LT-K63、LT-R72(例如，美國專利第6,149,919號、第7,115,730號和第7,291,588號)。所述免疫原性組合物可任選地包含藥學(xué)上可接受的載體。所述藥學(xué)上可接受的載體包括獲得聯(lián)邦、州政府的管理機構(gòu)或其他管理機構(gòu)批準或列示于美國藥典(U.S.Pharmacopeia)或其他公認藥典中用于動物(包括人類以及非人類哺乳動物)的載體。術(shù)語載體可用于指與藥物組合物一起給藥的稀釋劑、佐劑、賦形劑或媒介物?？刹捎盟Ⅺ}水溶液以及含水的右旋糖和甘油溶液作為尤其用于注射溶液劑的液體載體。合適藥物載體的示例描述于E.W.Martin的“Remington'sPharmaceuticalSciences”中。所述制劑應(yīng)適合給藥方式。本發(fā)明的免疫原性組合物還可包含一種或多種額外的免疫調(diào)節(jié)劑，其是擾亂或改變免疫系統(tǒng)從而觀察到體液和/或細胞介導(dǎo)的免疫的上調(diào)或下調(diào)的物質(zhì)。在一個實施方案中，提供了免疫系統(tǒng)的體液和/或細胞介導(dǎo)的能力(arms)的上調(diào)。某些細胞調(diào)節(jié)劑的實例包括例如佐劑或細胞因子，或尤其是ISCOMATRIXTM(CSLLimited；Parkville,Australia，描述于美國專利第5,254,339號)?？捎糜诒景l(fā)明的免疫原性組合物的佐劑的非限制性實例包括RIBI佐劑系統(tǒng)(RibiInc.；Hamilton,MT)、明礬(alum)、礦物質(zhì)凝膠如氫氧化鋁凝膠、水包油乳液、油包水乳液如弗氏完全和不完全佐劑、嵌段共聚物(CytRx；Atlanta,GA)、QS-21(CambridgeBiotechInc.；Cambridge,MA)、SAF-M(Chiron；Emeryville,CA)、AMPHIGENTM佐劑、皂苷、QuilA或其他皂苷部分、單磷酰脂質(zhì)A、以及阿夫立定(N,N-雙十八烷基-N′,N′-雙(2-羥乙基)-1,3-二氨基丙烷、N,N-雙十八烷基-N′,N′-雙(2-羥乙基)丙二胺)脂質(zhì)-胺佐劑?？捎糜诒景l(fā)明的免疫原性組合物中的水包油乳液的非限制性實例包括改性的SEAM62和SEAM1/2制劑。改性SEAM62是包含5％(v/v)角鯊烯(Sigma)、1％(v/v)SPANTM85清潔劑(ICISurfactants)、0.7％(v/v)聚山梨酯80清潔劑(ICISurfactants)、2.5％(v/v)乙醇、200mcg/mLQuilA、100mcg/ml膽固醇和0.5％(v/v)卵磷脂的水包油乳液。改性SEAM1/2是包含5％(v/v)角鯊烯(Sigma)、1％(v/v)SPANTM85清潔劑、0.7％(v/v)聚山梨酯80清潔劑、2.5％(v/v)乙醇、100mcg/mLQuilA和50mcg/ml膽固醇的水包油乳液?？砂诿庖咴越M合物中的其他免疫調(diào)節(jié)劑包括例如一種或多種白介素、干擾素或其他已知的細胞因子或趨化因子。在一個實施方案中，佐劑可以是環(huán)糊精衍生物或多聚陰離子聚合物，例如分別在美國專利第6,165,995號和第6,610,310號中描述的那些。應(yīng)理解，所用的免疫調(diào)節(jié)劑和/或佐劑會取決于被給藥所述免疫原性組合物的個體、規(guī)定的注射途徑及注射次數(shù)。除多種莢膜多糖-蛋白綴合物外，本發(fā)明的免疫原性組合物還可包含一種或多種防腐劑。FDA要求存于多劑量(multiple-dose、multi-dose)小瓶中的生物產(chǎn)品含有防腐劑，只有少數(shù)例外。含防腐劑的疫苗產(chǎn)品包括含有芐索氯銨(炭疽熱)、2-苯氧基乙醇(DTaP、HepA、萊姆病(Lyme)、小兒麻痹癥(腸胃外))、苯酚(肺炎(Pneumo)、傷寒(腸胃外)、牛痘病)和硫柳汞(DTaP、DT、Td、HepB、Hib、流行性感冒、JE、腦膜炎(Mening)、肺炎、狂犬病)的疫苗。被批準用于注射藥物的防腐劑包括例如氯代丁醇、間甲酚、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸丙酯、2-苯氧基乙醇、芐索氯銨、苯扎氯銨、苯甲酸、苯甲醇、苯酚、硫柳汞和硝酸苯汞。包裝和給藥形式本發(fā)明的制劑還可包含緩沖劑、鹽、二價陽離子、非離子清潔劑、冷凍保護劑如糖、以及抗氧化劑如自由基清除劑或螯合劑、或其任意多重組合中的一種或多種。任一組分(例如螯合劑)的選擇可以決定是否需要另一組分(例如清除劑)。為給藥而配制的最終組合物應(yīng)是無菌的和/或無熱原的。本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)多種因素如所需的特定儲存和給藥條件來憑經(jīng)驗決定這些組分及其他組分的哪種組合對于包含在本發(fā)明的含防腐劑的免疫原性組合物中是最佳的。在某些實施方案中，本發(fā)明的與腸胃外給藥相容的制劑包含一種或多種生理學(xué)可接受的緩沖劑，其選自但不限于Tris(氨基丁三醇)、磷酸鹽、乙酸鹽、硼酸鹽、檸檬酸鹽、甘氨酸、組氨酸和琥珀酸鹽。在某些實施方案中，將制劑緩沖到約6.0至約9.0、優(yōu)選約6.4至約7.4的pH范圍內(nèi)。在某些實施方案中，可能期望調(diào)節(jié)本發(fā)明的免疫原性組合物或制劑的pH?？墒褂帽绢I(lǐng)域的標準技術(shù)來調(diào)節(jié)本發(fā)明的制劑的pH。制劑的pH可以調(diào)節(jié)到3.0至8.0。在某些實施方案中，制劑的pH可以為或可調(diào)節(jié)到3.0至6.0、4.0至6.0、或5.0至8.0。在其他實施方案中，制劑的pH可以為或可調(diào)節(jié)到約3.0、約3.5、約4.0、約4.5、約5.0、約5.5、約5.8、約6.0、約6.5、約7.0、約7.5或約8.0。在某些實施方案中，pH可以為或可調(diào)節(jié)到4.5至7.5、或4.5至6.5、5.0至5.4、5.4至5.5、5.5至5.6、5.6至5.7、5.7至5.8、5.8至5.9、5.9至6.0、6.0至6.1、6.1至6.2、6.2至6.3、6.3至6.5、6.5至7.0、7.0至7.5、或7.5至8.0。在特定的實施方案中，制劑的pH為約5.8。在某些實施方案中，本發(fā)明的與腸胃外給藥相容的制劑包含一種或多種二價陽離子，包括但不限于MgCl2、CaCl2和MnCl2，其濃度為約0.1mM至約10mM，優(yōu)選至多5mM。在一些實施方案中，本發(fā)明的與腸胃外給藥相容的制劑包含一種或多種鹽，包括但不限于氯化鈉、氯化鉀、硫酸鈉和硫酸鉀，其以當腸胃外給藥時對于個體是生理學(xué)可接受的離子強度存在，并以在最終制劑中產(chǎn)生選定的離子強度或滲量(osmolarity)的最終濃度而包含在內(nèi)。制劑的最終離子強度或重量摩爾滲透壓濃度(osmolality)會由多種組分(例如來自一種或多種緩沖化合物的離子及其他非緩沖的鹽)來決定。優(yōu)選的鹽NaCl以至多約250mM的范圍存在，并且選擇鹽濃度以補足其他組分(例如糖)，從而使制劑的最終總滲量與腸胃外給藥(例如肌內(nèi)注射或皮下注射)相容，并且會促進免疫原性組合物制劑的免疫原性組分在多種溫度范圍內(nèi)的長期穩(wěn)定性。不含鹽的制劑會容忍一種或多種選定的冷凍保護劑的范圍增加以保持期望的最終滲量水平。在某些實施方案中，本發(fā)明的與腸胃外給藥相容的制劑包含一種或多種冷凍保護劑，其選自但不限于二糖(例如乳糖、麥芽糖、蔗糖或海藻糖)以及多羥基烴(例如衛(wèi)矛醇、甘油、甘露醇和山梨醇)。在某些實施方案中，制劑的滲量為約200mOs/L至約800mOs/L的范圍內(nèi)，并且優(yōu)選的范圍是約250mOs/L至約500mOs/L或約300mOs/L至約400mOs/L。不含鹽的制劑可包含例如約5％至約25％的蔗糖，優(yōu)選約7％至約15％、或約10％至約12％的蔗糖?；蛘?，不含鹽的制劑可包含例如約3％至約12％的山梨醇，優(yōu)選約4％至7％、或約5％至約6％的山梨醇。如果添加諸如氯化鈉的鹽，則蔗糖或山梨醇的有效范圍相對減少。這些及其他此類重量摩爾滲透壓濃度和滲量的考慮也完全在本領(lǐng)域技術(shù)人員的范圍內(nèi)。在某些實施方案中，本發(fā)明的與腸胃外給藥相容的制劑包含一種或多種自由基氧化抑制劑和/或螯合劑。多種自由基清除劑和螯合劑是本領(lǐng)域已知的，并且用于本文所述的制劑及使用方法。實例包括但不限于乙醇、EDTA、EDTA/乙醇混合物、三乙醇胺、甘露醇、組氨酸、甘油、檸檬酸鈉、六磷酸肌醇、三聚磷酸鹽、抗壞血酸/抗壞血酸鹽、琥珀酸/琥珀酸鹽、馬來酸/馬來酸鹽、去鐵胺、EDDHA和DTPA，以及上述的兩種或更多種的各種組合。在某些實施方案中，可以有效增強制劑的長期穩(wěn)定性的濃度添加至少一種非還原自由基清除劑。還可以各種組合形式添加一種或多種自由基氧化抑制劑/螯合劑，例如清除劑和二價陽離子。螯合劑的選擇會決定是否需要添加清除劑。在某些實施方案中，本發(fā)明的與腸胃外給藥相容的制劑包含一種或多種非離子表面活性劑，包括但不限于聚氧乙烯脫水山梨醇脂肪酸酯，聚山梨酯-80(TWEENTM80)、聚山梨酯-60(TWEENTM60)、聚山梨酯-40(TWEENTM40)和聚山梨酯-20(TWEENTM20)；聚氧乙烯烷基醚，包括但不限于Brij58、Brij35；以及其他，例如TRITONTMX-100、TRITONTMX-114、NP40(壬基苯氧基聚乙氧基乙醇)、SPANTM85和PLURONICTM系列的非離子型表面活性劑(例如，PLURONICTM121)，并且優(yōu)選組分為濃度為約0.001％至約2％(優(yōu)選至多約0.25％)的聚山梨酯-80或濃度為約0.001％至1％(優(yōu)選至多約0.5％)的聚山梨酯-40。在某些實施方案中，本發(fā)明的制劑包含一種或多種適于腸胃外給藥的額外的穩(wěn)定劑，例如包含至少一個巰基(-SH)的還原劑(例如，半胱氨酸、N-乙酰基半胱氨酸、還原谷胱甘肽、硫基乙醇酸鈉、硫代硫酸鹽、單硫代甘油或其混合物)。替代地或任選地，本發(fā)明的含防腐劑的免疫原性組合物制劑可以通過從儲存容器中去除氧、保護制劑免于光(例如，通過使用琥珀色玻璃容器)而進一步穩(wěn)定化。本發(fā)明的含防腐劑的免疫原性組合物制劑可包含一種或多種藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑，其包含自身不誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的任何賦形劑。合適的賦形劑包括但不限于大分子，例如蛋白質(zhì)、糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚合氨基酸、氨基酸共聚物、蔗糖(Paoletti等人，2001,Vaccine,19:2118)、海藻糖、乳糖和脂質(zhì)聚集體(例如油液滴或脂質(zhì)體)。此類載體是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。藥學(xué)上可接受的賦形劑在例如Gennaro,2000,Remington:TheScienceandPracticeofPharmacy,第20版,ISBN:0683306472中討論。本發(fā)明的組合物可以被凍干或處于含水形式(即，溶液或懸浮液)。脂質(zhì)制劑可有利地從其包裝形式直接給藥而無需在水性介質(zhì)中復(fù)原，因此對于注射是理想的(如本發(fā)明的凍干組合物所需的那樣)。將本發(fā)明的免疫原性組合物直接遞送到個體可以通過腸胃外給藥(肌內(nèi)給藥、腹腔內(nèi)給藥、皮內(nèi)給藥、皮下給藥、靜脈內(nèi)給藥、或向組織的間質(zhì)間隙給藥)；或通過直腸給藥、口服給藥、陰道給藥、局部給藥、經(jīng)皮給藥、鼻內(nèi)給藥、眼部給藥、耳部給藥、肺部給藥或其他粘膜給藥而實現(xiàn)。在優(yōu)選的實施方案中，腸胃外給藥是通過肌內(nèi)注射到例如個體的大腿或上臂來進行的。注射可通過針(例如皮下注射針)進行，或者可使用無針注射。典型的肌內(nèi)劑量是0.5mL。本發(fā)明的組合物可以多種形式制備，例如，作為液體溶液劑或混懸劑用于注射。在某些實施方案中，所述組合物可被制備成粉末或噴霧劑用于肺部給藥，例如呈吸入劑形式。在其它實施方案中，所述組合物可被制備成栓劑或陰道栓，或用于鼻、耳或眼給藥，例如，制備成噴霧劑、滴劑、凝膠劑或粉末。用于特定免疫原性組合物的組分的最佳量可通過涉及在個體中觀察適當免疫應(yīng)答的標準研究來確定。在進行初始疫苗接種后，個體可接受一次或若干次充分間隔的加強免疫。本發(fā)明的免疫原性組合物可以單位劑量或多劑量形式(例如，2劑量、4劑量或更多劑量)包裝。對于多劑量形式來說，小瓶通常但未必優(yōu)于載藥注射器。合適的多劑量形式包括但不限于：每個容器2-10劑量，每劑量0.1mL-2mL。在某些實施方案中，所述劑量是0.5mL劑量。參見例如國際專利申請WO2007/127668，其援引加入本文。組合物可提供于小瓶或其它合適的儲存容器中，或可提供于預(yù)裝藥遞送裝置中，所述裝置是例如可供給有針或無針的單組份或多組份注射器。注射器通常但未必含有單劑量的含防腐劑的本發(fā)明的免疫原性組合物，但還包括預(yù)裝藥多劑量注射器。同樣，小瓶可包括單劑量，但也可包括多劑量?？沙Ｒ?guī)地確定有效劑量體積，但用于注射的組合物的典型劑量為0.5mL的體積。在某些實施方案中，配制劑量以向人類個體給藥。在某些實施方案中，配制劑量以向成人、少年、青少年、幼兒或嬰兒(即，不超過1周齡)的人類個體給藥，并且在優(yōu)選實施方案中可通過注射給藥。本發(fā)明的液體免疫原性組合物還適合用于復(fù)原以凍干形式提供的其他免疫原性組合物。倘若免疫原性組合物將用于此類即時復(fù)原，則本發(fā)明提供具有兩個或更多個小瓶、兩個或更多個即時裝藥的(ready-filled)注射器、或每一者中的一個或多個的藥盒，其中注射器的內(nèi)容物用于在注射前復(fù)原小瓶的內(nèi)容物，或反之亦然?；蛘?，本發(fā)明的免疫原性組合物可以是凍干并復(fù)原的，例如使用本領(lǐng)域熟知的眾多冷凍干燥方法之一以形成干燥的、規(guī)則成形(例如球形)的顆粒，例如微丸或微球，所述顆粒具有可通過改變用于制備該顆粒的確切方法而選擇和控制的顆粒特性，例如平均粒徑。所述免疫原性組合物還可包含佐劑，該佐劑可任選地與單獨的干燥的、規(guī)則成形(例如球形)的顆粒(例如微丸或微球)一起制備或包含在所述顆粒內(nèi)。在此類實施方案中，本發(fā)明還提供了免疫原性組合物藥盒，其包含含有穩(wěn)定的干燥免疫原性組合物的第一組分，任選地還包含本發(fā)明的一種或多種防腐劑，以及含有用于復(fù)原所述第一組分的無菌水溶液的第二組分。在某些實施方案中，所述水溶液包含一種或多種防腐劑，并且可以任選地包含至少一種佐劑(參見例如WO2009/109550(援引加入本文))。在再一實施方案中，多劑量形式的容器選自但不限于以下中的一種或多種：一般實驗室玻璃器皿、燒瓶、燒杯、量筒、發(fā)酵器、生物反應(yīng)器、管道、管、袋、罐、小瓶、小瓶蓋(例如，橡皮塞、螺口蓋(screwoncap))、安瓿、注射器、雙室或多室注射器、注射器塞、注射器柱塞、橡皮蓋、塑料蓋、玻璃蓋、藥筒和一次性筆等。本發(fā)明的容器不受制造材料限制，并且包括例如玻璃、金屬(例如，鋼、不銹鋼、鋁等)和聚合物(例如，熱塑性塑料、彈性體、熱塑性彈性體)等材料。在具體實施方案中，所述形式的容器是具有丁基塞的5mLSchott1型玻璃小瓶。本領(lǐng)域技術(shù)人員會了解，上述形式?jīng)Q不是詳盡列表，而僅僅就可用于本發(fā)明的形式種類充當技術(shù)人員的指導(dǎo)。用于本發(fā)明中的其它形式可在來自實驗室設(shè)備供應(yīng)商和制造商(例如UnitedStatesPlastic公司(Lima,OH),VWR)的公開目錄中找到。誘導(dǎo)免疫應(yīng)答和保護免于感染的方法本發(fā)明還包括使用本文所述的免疫原性組合物的方法。例如，本發(fā)明的一個實施方案提供誘導(dǎo)抗致病細菌(例如肺炎鏈球菌)的免疫應(yīng)答的方法，其包括向個體給藥免疫原性量的本文所述的任何免疫原性組合物，所述免疫原性組合物包含細菌抗原，例如源自致病細菌的細菌莢膜多糖。本發(fā)明的一個實施方案提供保護個體免于肺炎鏈球菌感染的方法，或預(yù)防肺炎鏈球菌感染的方法，或降低與由肺炎鏈球菌引起的感染相關(guān)的至少一種癥狀的嚴重性或延遲與由肺炎鏈球菌引起的感染相關(guān)的至少一種癥狀的發(fā)作的方法，所述方法包括向個體給藥免疫原性量的本文所述的任何免疫原性組合物，所述免疫原性組合物包含細菌抗原，例如源自肺炎鏈球菌的細菌莢膜多糖。本發(fā)明的一個實施方案提供了治療或預(yù)防個體的與鏈球菌屬(Streptococcussp.)相關(guān)的鏈球菌感染、疾病或病癥的方法，所述方法包括向所述個體給藥治療有效量或預(yù)防有效量的本文所述的免疫原性組合物的步驟。在一些實施方案中，治療或預(yù)防鏈球菌感染、疾病或病癥的方法包括人類、獸類、動物或農(nóng)業(yè)治療。另一實施方案提供治療或預(yù)防個體的與鏈球菌屬相關(guān)的鏈球菌感染、疾病或病癥的方法，所述方法包括由本文所述的免疫原性組合物生成多克隆或單克隆抗體制劑，并且使用所述抗體制劑來賦予所述個體被動免疫。本發(fā)明的一個實施方案提供預(yù)防正經(jīng)歷手術(shù)操作的個體的鏈球菌感染的方法，所述方法包括在所述手術(shù)操作之前向所述個體給藥預(yù)防有效量的本文所述的免疫原性組合物的步驟。對抗原或免疫原性組合物的“免疫應(yīng)答”是個體中產(chǎn)生對存在于目標抗原或疫苗組合物中的分子的體液和/或細胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。出于本發(fā)明的目的，“體液免疫應(yīng)答”是抗體介導(dǎo)的免疫應(yīng)答并且涉及引入和生成以一定親和力識別和結(jié)合本發(fā)明的免疫原性組合物中的抗原的抗體，而“細胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答”是由T細胞和/或其他白細胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答?！凹毎閷?dǎo)的免疫應(yīng)答”是通過提供與主要組織相容性復(fù)合物(MHC)的I類或II類分子、CD1或其他非典型MHC樣分子相關(guān)的抗原表位而誘發(fā)的。這激活了抗原特異性CD4+T輔助細胞或CD8+細胞毒性T淋巴細胞(“CTL”)。CTL對表現(xiàn)出與典型或非典型MHC編碼并且在細胞表面上表達的蛋白質(zhì)有關(guān)的肽抗原具有特異性。CTL幫助誘導(dǎo)和促進對細胞內(nèi)微生物的細胞內(nèi)破壞、或?qū)κ艽祟愇⑸锔腥镜募毎娜芙?。細胞免疫的另一方面涉及通過輔助T細胞進行的抗原特異性反應(yīng)。輔助T細胞用于幫助刺激針對表現(xiàn)出與其表面上的典型或非典型MHC分子相關(guān)的肽或其他抗原的細胞的非特異性效應(yīng)細胞的功能，并且集中于所述非特異性效應(yīng)細胞的活性。“細胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答”還指由活化的T細胞和/或其他白細胞(包括那些源自CD4+和CD8+T細胞的細胞)產(chǎn)生的細胞因子、趨化因子和其他此類分子的產(chǎn)生。特定抗原或組合物刺激細胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的能力可通過多種測定來確定，例如通過淋巴組織增生(淋巴細胞活化)測定、CTL細胞毒性細胞測定，通過測定敏化個體中對所述抗原具有特異性的T-淋巴細胞，或通過測量T細胞響應(yīng)抗原再刺激而實現(xiàn)的細胞因子產(chǎn)生。此類測定為本領(lǐng)域內(nèi)所熟知。參見例如Erickson等人(1993)J.Immunol.151:4189-4199；以及Doe等人(1994)Eur.J.Immunol.24:2369-2376。如本文所用的“治療”(包括其變體，例如“治療(treat)”或“治療的(treated)”)意指以下中的任意一個或多個：(i)預(yù)防感染或再感染，如在傳統(tǒng)疫苗中，(ii)降低癥狀的嚴重性或消除癥狀，和(iii)基本上或完全消除目標病原體或病癥。因此，可預(yù)防性地(在感染前)或治療性地(在感染后)實現(xiàn)治療。在本發(fā)明中，預(yù)防性治療是優(yōu)選方式。根據(jù)本發(fā)明的特定實施方案，提供針對微生物感染(例如，細菌如鏈球菌)治療(包括預(yù)防性和/或治療性免疫)宿主動物的組合物和方法。本發(fā)明的方法可用于賦予個體預(yù)防性和/或治療性免疫。還可對用于生物醫(yī)學(xué)研究應(yīng)用的個體實施本發(fā)明的方法。如本文所使用的“哺乳動物”意指人類或非人類動物。更具體地，哺乳動物是指歸類為哺乳動物的任何動物，包括人類、馴養(yǎng)和農(nóng)場動物以及研究用動物、動物園動物、運動型動物和寵物伴侶動物，例如家庭寵物和其他家養(yǎng)動物，包括但不限于牛、綿羊、雪貂、豬、馬、兔、山羊、狗、貓等。優(yōu)選的伴侶動物是狗和貓。優(yōu)選地，所述哺乳動物是人類。“免疫原性量”和“免疫有效量”二者在本文可交換使用，是指抗原或免疫原性組合物足以引發(fā)免疫應(yīng)答(細胞(T細胞)或體液(B細胞或抗體)應(yīng)答或二者，如通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的標準測定所測量的)的量。組合物中特定綴合物的量通常是基于用于該綴合物的總多糖(綴合和非綴合的)來計算的。例如，在100mcg多糖劑量中，含有20％游離多糖的綴合物會含有約80mcg的綴合的多糖和約20mcg的非綴合多糖。當計算綴合物的劑量時，通常不考慮蛋白質(zhì)對綴合物的貢獻。綴合物的量可根據(jù)鏈球菌血清型而變化。通常，每一劑量會包含0.1mcg至100mcg，特別是0.1mcg至10mcg，更特別是1mcg至10mcg的多糖。免疫原性組合物中不同多糖組分的“免疫原性量”可存在差異，并且各自可包含1mcg、2mcg、3mcg、4mcg、5mcg、6mcg、7mcg、8mcg、9mcg、10mcg、15mcg、20mcg、30mcg、40mcg、50mcg、60mcg、70mcg、80mcg、90mcg或約100mcg的任何特定的多糖抗原。肺炎鏈球菌“侵襲性疾病”是指從存在相關(guān)的臨床疾病體征/癥狀的通常無菌的部位分離細菌。通常無菌的身體部位包括血液、CSF、胸膜液、心包液、腹膜液、關(guān)節(jié)/滑液、骨、內(nèi)部身體部位(淋巴結(jié)、腦、心臟、肝、脾、玻璃體液、腎、胰、卵巢)或其他通常無菌的部位。特征為侵襲性疾病的臨床病癥包括菌血癥、肺炎、蜂窩組織炎、骨髓炎、心內(nèi)膜炎、敗血性休克等?？乖鳛槊庖咴挠行钥赏ㄟ^增殖測定、通過細胞溶解測定(例如鉻釋放測定以測量T細胞溶解其特異性靶細胞的能力)、或通過測量B細胞活性水平(通過測量對血清中抗原具有特異性的循環(huán)抗體的水平來測量B細胞活性水平)來測量。如本文所述，免疫應(yīng)答還可通過測量給藥所述抗原之后誘導(dǎo)的抗原特異性抗體的血清水平來檢測，并且更特別地，通過測量這樣誘導(dǎo)的抗體增強特定白細胞的調(diào)理吞噬能力的能力來檢測。所述免疫應(yīng)答的保護水平可通過用已給藥的抗原攻擊免疫的宿主來測量。例如，如果需要免疫應(yīng)答的抗原是細菌，則通過檢測用所述細菌細胞攻擊動物之后的存活百分比或死亡百分比來測量免疫原性量的抗原所誘導(dǎo)的保護水平。在一個實施方案中，保護量可通過測量與細菌感染相關(guān)的至少一種癥狀(例如，與感染相關(guān)的發(fā)熱)來測量。多抗原或多組分疫苗或免疫原性組合物中每種抗原的量會相對于每種其他組分而變化，并且可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法來確定。此類方法會包括用于測量免疫原性和/或體內(nèi)效力的操作。在某些實施方案中，術(shù)語“約”意指指定的值或范圍的20％內(nèi)，優(yōu)選10％內(nèi)，且更優(yōu)選5％內(nèi)。本發(fā)明還提供特異性且選擇性地結(jié)合到本發(fā)明的莢膜多糖或糖綴合物的抗體和抗體組合物。在一些實施方案中，當向個體給藥本發(fā)明的莢膜多糖或糖綴合物后生成抗體。在一些實施方案中，本發(fā)明提供針對本發(fā)明的一種或多種莢膜多糖或糖綴合物的純化或分離的抗體。在一些實施方案中，本發(fā)明的抗體是功能性的，如通過在動物效力模型中或通過調(diào)理吞噬殺滅測定對細菌的殺滅所測量的。在一些實施方案中，本發(fā)明的抗體賦予個體被動免疫。本發(fā)明還提供編碼本發(fā)明的抗體或抗體片段的多核苷酸分子，以及使用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的技術(shù)產(chǎn)生本發(fā)明的抗體或抗體組合物的細胞、細胞系(例如雜交瘤細胞或用于重組產(chǎn)生抗體的其他工程細胞系)或轉(zhuǎn)基因動物。本發(fā)明的抗體或抗體組合物可用于治療或預(yù)防個體的與鏈球菌屬相關(guān)的鏈球菌感染、疾病或病癥的方法，所述方法包括產(chǎn)生多克隆或單克隆抗體制劑，并且使用所述抗體或抗體組合物以賦予所述個體被動免疫。本發(fā)明的抗體還可用于診斷方法，例如檢測莢膜多糖或其糖綴合物的存在、或?qū)ηv膜多糖或其糖綴合物的水平進行定量。以下實施例以例示且非限制性方式提供?？s寫：MW＝分子量；WFI＝注射用水；TEMPO＝2,2,6,6-四甲基-1-哌啶氧基自由基；NCS＝N-氯代琥珀酰亞胺。實施例實施例1：使用TEMPO/NCS的Pn血清型-12F的綴合為了改善血清型12F-CRM197糖綴合物的穩(wěn)定性，使用2,2,6,6-四甲基-1-哌啶氧基自由基(TEMPO)和作為共氧化劑的N-氯代琥珀酰亞胺(NCS)來將伯醇氧化成醛基，從而開發(fā)供替代的化學(xué)物。GC/MS分析表明氧化位點與高碘酸鹽介導(dǎo)的氧化的位點不同。在TEMPO-NCS氧化的情況下，α-D-Glcp和2-Glcp被氧化，而當使用高碘酸鹽時，α-D-Galp是主要的氧化位點(參見圖1)。如本文更詳細地所描述的，TEMPO以催化量(≤0.1摩爾當量)使用，并且通過改變所用的NCS的量來實現(xiàn)期望的氧化度(DO)。隨后，合成并表征多個綴合物。通常，在多個階段中進行血清型12F糖綴合物的產(chǎn)生，如下：1)將血清型12多糖水解至50kDa至500kDa的分子量2)用TEMPO/NCS活化血清型12F多糖3)純化活化的多糖4)將活化的血清型12F與CRM197蛋白綴合5)純化血清型12F-CRM綴合物。實施例2：血清型12F的水解和氧化通常在酸性條件下通過加熱來進行多糖的水解以獲得100kDa至350kDa的期望范圍的平均分子量。典型的實驗在下文描述。水解向帶夾套的反應(yīng)容器添加血清型12F多糖溶液。對此，添加所需體積的0.30M乙酸和注射用水(WFI)以保持約0.1M乙酸濃度。使用1NNaOH或冰乙酸將溶液的pH調(diào)節(jié)至3.2±0.3。將反應(yīng)混合物的溫度升高至70±5℃。在70±5℃下攪拌反應(yīng)混合物90分鐘至120分鐘。將反應(yīng)混合物冷卻至23±2℃，并通過添加1MNaOH溶液而中和(pH7.0)。使用30KMWCO膜，通過用對WFI的超濾/滲濾來純化水解的多糖。通過0.22μm過濾器過濾溶液，并在2℃至8℃下儲存，直至氧化。通過SEC-MALLS來分析水解的多糖的分子量以確保分子量滿足100kDa至350kDa的目標范圍。部分氧化在一個實驗中，使用微流化器，利用加壓均化來機械地按尺寸分級血清型12F多糖，以將分子量降低至約100kDa至500kDa。向反應(yīng)容器以4.0mg/mL的濃度添加按尺寸分級的多糖，并以1:1v/v的比率與碳酸氫鹽/碳酸鹽緩沖液(0.5MNaHCO3/0.05MNa2CO3緩沖液,pH8.6)混合。向攪拌的混合物添加≤0.1摩爾當量的TEMPO。通過添加0.6摩爾當量至1.0摩爾當量的NCS來開始反應(yīng)。將反應(yīng)混合物在室溫下攪拌2小時，此后使用30K超濾膜、通過用WFI滲濾來純化活化的多糖。將純化的多糖收集并通過定量測量醛(使用3-甲基-2-苯并異噻唑酮(benziothiazolinone)腙(MBTH)測定)和多糖(使用蒽酮測定)來測定氧化度(DO)。在另一實驗中，將血清型12F多糖水解以將分子量降低成約100kDa至500kDa的分子量。向反應(yīng)容器添加血清型12F多糖并以1:1v/v的比率與0.5MNaHCO3/0.05MNa2CO3緩沖液(pH8.6)混合。向攪拌的混合物添加0.6摩爾當量至1.0摩爾當量的溶解在WFI中的NCS。通過添加約0.1摩爾當量的溶解在WFI中的TEMPO來啟動活化。將反應(yīng)混合物在室溫下攪拌2小時，此后使用30K超濾膜通過用WFI滲濾來純化活化的多糖。將純化的活化的多糖通過0.2μm過濾器過濾，并在使用前于4℃下儲存。還在pH6.5、7.0、7.5和8.0的磷酸鈉緩沖液中成功地進行了TEMPO/NCS介導(dǎo)的氧化。在一些活化實驗中，諸如正丙醇的伯醇用于中止試劑，從而避免糖過氧化。在另一組實驗中，使化學(xué)水解的多糖直接經(jīng)歷氧化，而沒有超濾/滲濾純化步驟。實施例3：血清型12F氧化多糖的綴合在一個實驗中，向反應(yīng)容器添加純化的氧化的血清型12F多糖，然后添加0.5M磷酸鈉緩沖液(pH6.5)，直至0.1M的最終緩沖濃度。向該溶液添加先前凍干的CRM197，并徹底混合，從而獲得均質(zhì)溶液。使用稀HCl或1NNaOH溶液將pH調(diào)節(jié)至6.8。之后添加1.5摩爾當量的NaCNBH3。將反應(yīng)混合物在室溫(23℃)攪拌24小時，并在37℃攪拌2.5天。然后，用1×0.9％鹽水稀釋反應(yīng)混合物，并用2摩爾當量的硼氫化鈉將未反應(yīng)的醛基“加帽”。加帽反應(yīng)時間為3小時。在另一實驗中，向反應(yīng)容器添加純化的活化的血清型12F，然后添加0.5M磷酸鈉緩沖液(pH6.5)，直至0.1M的最終緩沖濃度。向該溶液添加先前凍干的CRM197，并徹底混合，從而獲得均質(zhì)溶液。使用稀HCl或1NNaOH溶液將pH調(diào)節(jié)至6.8。之后添加3摩爾當量的NaCNBH3。將反應(yīng)混合物在23℃攪拌24小時，并在37℃攪拌48小時。然后，用1×0.9％鹽水稀釋反應(yīng)混合物并攪拌，用1摩爾當量硼氫化鈉NaBH4將未反應(yīng)的醛基“加帽”。加帽反應(yīng)時間為3小時。在另一實驗中，向反應(yīng)容器添加純化的活化的血清型12F，并與CRM197溶液混合。將混合物凍干，并且將粉末溶解在0.1M磷酸鈉緩沖液(pH6.8)中，直至5mg/mL的最終糖濃度。如需要，使用稀HCl或1NNaOH溶液將pH調(diào)節(jié)至6.8。之后添加3摩爾當量NaCNBH3。將反應(yīng)混合物在23℃攪拌24小時，并在37℃攪拌48小時。然后，用1×0.9％鹽水稀釋反應(yīng)混合物，用1摩爾當量硼氫化鈉NaBH4將未反應(yīng)的醛基“加帽”。加帽反應(yīng)時間為3小時。實施例4：綴合物純化使用5μm過濾器過濾加帽的反應(yīng)混合物，然后使用100KMWCO超濾膜純化。首先使用10mM琥珀酸鹽/0.9％鹽水，pH6.0緩沖液滲濾綴合物。然后，將純化的綴合物通過0.45/0.22μm過濾器過濾以獲得大量綴合物。實施例5：氧化度使用TEMPO/NCS體系實現(xiàn)血清型12F多糖中伯醇的成功氧化。通過調(diào)節(jié)NCS共氧化劑的量來將水解的血清型12F多糖氧化至不同的氧化度(DO)水平。在圖2中示出使用不同多糖批次和分子量的由不同量的NCS對DO的影響。通常，0.5摩爾當量至2.5摩爾當量的NCS用于實現(xiàn)目標氧化度。通常，氧化反應(yīng)在2小時內(nèi)完成，因為在2小時之后沒有觀察到DO的顯著變化。使用TEMPO/NCS氧化的多糖生成并表征多個血清型12F綴合物。結(jié)果總結(jié)于表1中。使用其他用TEMPO/NCS體系活化的肺炎球菌血清型也成功地生成了一些代表性綴合物。生成其他肺炎球菌血清型的操作與用于血清型12F的方法相同。結(jié)果描述于表2至4中。表1：肺炎球菌血清型12F-CRM197綴合物表2：肺炎球菌血清型3F-CRM197綴合物綴合物批次Pn3-106-1Pn3-106-4多糖MALLS(Mw)kDa430430氧化氧化時間(hr)22D.O.9.415活化的糖的產(chǎn)率百分比5565經(jīng)SEC-MALLS得到的活化的糖MW(kDa)340360綴合綴合物結(jié)果糖產(chǎn)率(％)29.955.0糖-蛋白比0.71.6游離糖的百分比21.030.0經(jīng)SEC-MALLS得到的MW(kDa)21002600表3：肺炎球菌血清型33F-CRM197綴合物綴合物批次33F-#5533F-#63多糖MALLS(Mw)kDa128kDa150kDaD.O.205產(chǎn)率92％97％糖產(chǎn)率(％)44％68％糖-蛋白比0.540.68游離糖的百分比＜1％1.10％游離蛋白質(zhì)＜1％＜1％經(jīng)SEC-MALLS得到的Mw(kDa)11160kDa2730kDa表4：肺炎球菌血清型10A綴合物實施例6：使用TEMPO/NCS氧化法的Pn-血清型12F-CRM197綴合物的免疫原性在標準條件下的小鼠中測定血清型12F-CRM197綴合物在小鼠中的調(diào)理吞噬活性(OPA)效價。在表5中示出在4周和7周時具有95％置信區(qū)間的OPA效價(幾何平均效價(GMT))，證明血清型12F-CRM197綴合物(批次12F-97B；還參見表1對該綴合物的表征數(shù)據(jù))在鼠科免疫原性模型中引發(fā)OPA效價。與由高碘酸鹽氧化生成的對照綴合物(171B)相比，由TEMPO-NCS生成的綴合物免疫原性更高。表5：血清型12F-CRM197綴合物的免疫原性綴合物樣品/劑量0.001ug0.01ug0.1ug高碘酸鹽氧化(171B)對照416172TEMPO/NCS氧化(12F-97B)40417880實施例7：在諸如TEMPO/NCS的氧化劑的存在下使用硝酰基的Pn-血清型12F的推定機制在圖6中示出Pn-血清型12F的氧化/綴合的推定機制。通過催化量的硝?；鏣EMPO以及氧化劑如NCS作為化學(xué)計量氧化劑來氧化多糖的伯羥基。在催化周期中，實際的氧化劑為N-氧代銨鹽。C-6伯羥基的氧化生成醛基，其隨后與載體蛋白(CRM197)的賴氨酸的伯氨基反應(yīng)以生成糖綴合物。實施例8：穩(wěn)定性比較由高碘酸鹽氧化生成的綴合物與由TEMPO/NCS氧化生成的綴合物的穩(wěn)定性(在25℃)的比較(參見圖7)表明由Pn-12F多糖的氧化生成的綴合物是相對更穩(wěn)定的。如圖7所示，對于通過高碘酸鹽氧化Pn-12F多糖而生成的糖綴合物，在25℃下觀察到游離糖隨時間增加。相反，使用TEMPO/NCS氧化Pn-12F多糖而制備的糖綴合物在類似的條件下未表現(xiàn)出對游離糖的顯著趨勢。當前第1頁1 2 3