本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中艾滋病免疫凈化儀的制備及應(yīng)用，主要用于艾滋病患者血細(xì)胞內(nèi)、外艾滋病毒的清除，從而達(dá)到預(yù)防、控制和治療艾滋病的目的。

背景技術(shù)：

艾滋病是由人類免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus，HIV)引起的傳染病，在全球廣泛流行，根據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)和聯(lián)合國艾滋病規(guī)劃署的有關(guān)報告，自1981年美國發(fā)現(xiàn)首例艾滋病病例以來，至今全球有208個國家和地區(qū)受到了艾滋病的嚴(yán)重威脅，約有4000萬人感染了艾滋病，死亡人數(shù)已超過2000萬，每天約有6000人成為艾滋病感染者，同時每天約有300多人死于艾滋病。在中國HIV感染者正處于高速增長期，目前已遠(yuǎn)超過100萬。艾滋病已經(jīng)成為繼腫瘤、心腦血管疾病、結(jié)核病、糖尿病后又一個人類面臨的重大感染性疾病，已成為全球關(guān)注的嚴(yán)重的公共衛(wèi)生和社會問題。

人類免疫缺陷病毒是一種感染人類免疫細(xì)胞的慢病毒(Lentivirus)，屬反轉(zhuǎn)錄病毒的一種，直徑約120納米，大致呈球形。病毒外膜是類脂包膜(來自宿主細(xì)胞)，并嵌有病毒的蛋白gp120與gp41。gp41是跨膜蛋白，gp120位于表面，并與gp41通過非共價作用結(jié)合。向內(nèi)是由蛋白p17形成的球形基質(zhì)(Matrix)，以及蛋白p24形成的半錐形衣殼(Capsid)，衣殼在電鏡下呈高電子密度，內(nèi)含有病毒的RNA基因組、酶(逆轉(zhuǎn)錄酶、整合酶、蛋白酶)以及其他來自宿主細(xì)胞的成分。

HIV進(jìn)入人體后，首先被巨噬細(xì)胞吞噬，但HIV很快改變了巨噬細(xì)胞內(nèi)某些部位的酸性環(huán)境，創(chuàng)造了適合其生存的條件，不但不被殺滅反而在其內(nèi)繁殖。因為CD4是HIV的受體，所以經(jīng)巨噬細(xì)胞內(nèi)繁殖的HIV通過其囊膜蛋白gp120并在gp41的輔助下(gp41起著橋的作用，利用自身的疏水作用介導(dǎo)病毒囊膜與細(xì)胞膜融合)進(jìn)入CD4+細(xì)胞(細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞等)，在細(xì)胞內(nèi)迅速增殖，每天產(chǎn)生10⁹～0¹⁰病毒顆粒，并不斷進(jìn)入其他正常的和再生的CD4+細(xì)胞內(nèi)復(fù)制，制造更多的病毒感染細(xì)胞，使外周血CD4+T細(xì)胞持續(xù)破壞、減少。HIV的gp120與CD4受體結(jié)合可直接激活受感染的細(xì)胞凋亡，甚至感染HIV的T細(xì)胞表達(dá)的囊膜抗原也可啟動正常T細(xì)胞，通過細(xì)胞表面CD4分子交聯(lián)間接地引起CD4+細(xì)胞的大量破壞，結(jié)果造成以CD4+T細(xì)胞缺損為中心的嚴(yán)重免疫缺陷，患者主要表現(xiàn)：外周淋巴細(xì)胞減少，T4/T8比例配置，對植物血凝素和某些抗原的反應(yīng)消失，遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)下降，NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞活性減弱，IL2、γ干擾素等細(xì)胞因子合成減少。CD4+T細(xì)胞是最重要的免疫細(xì)胞，感染者一旦失去了大量CD4+T細(xì)胞，整個免疫系統(tǒng)就會遭到致命的打擊，對各種疾病的感染都失去抵抗力。HIV進(jìn)入宿主CD4+細(xì)胞后也可以表現(xiàn)為長期潛伏而不表現(xiàn)出臨床癥狀，其基因組RNA反轉(zhuǎn)錄成雙鏈DNA，與病毒整合酶進(jìn)入宿主細(xì)胞核內(nèi)，在整合酶的作用下，雙鏈DNA整合到宿主細(xì)胞基因組內(nèi)，被整合的病毒DNA稱為前病毒，可潛伏數(shù)月甚至多年不復(fù)制，造成AIDS數(shù)月至多年的潛伏期。在AIDS的潛伏期，HIV主要在淋巴結(jié)的巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞內(nèi)繁殖，這些細(xì)胞是體內(nèi)的HIV貯存庫，可釋放至外周血或轉(zhuǎn)染外周血中的CD4+T細(xì)胞，有絲分裂原、抗原、TNF、IL-2和淋巴素(LT)都能激發(fā)HIV前病毒基因在感染的CD4+T細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄復(fù)制。經(jīng)大量增殖后，HIV病毒顆粒不斷從被破壞的感染細(xì)胞釋放并游離于血液，然后再進(jìn)入新的CD4+T細(xì)胞，繼續(xù)感染過程。而且細(xì)胞被HIV感染后，表達(dá)于感染細(xì)胞表面的gp120和gp41能介導(dǎo)感染與未感染細(xì)胞間的融合，例如感染HIV的CD4+T細(xì)胞表達(dá)的gp120與未感染細(xì)胞的CD4結(jié)合，導(dǎo)致細(xì)胞融合而形成多核巨細(xì)胞。

HIV感染后可刺激機(jī)體生產(chǎn)囊膜蛋白(Gp120，Gp41)抗體和核心蛋白(P24)抗體。在HIV攜帶者、艾滋病病人血清中測出低水平的抗病毒中和抗體，其中艾滋病病人水平最低，HIV攜帶者最高，說明該抗體在體內(nèi)有保護(hù)作用。但抗體不能與單核巨噬細(xì)胞內(nèi)存留的病毒接觸，且HIV囊膜蛋白易發(fā)生抗原性變異，原有抗體失去作用，使中和抗體不能發(fā)揮應(yīng)有的作用。在潛伏感染階段，HIV前病毒整合入宿主細(xì)胞基因組中，因此HIV不會被免疫系統(tǒng)所識別，所以僅依靠自身免疫功能無法將其清除。另外一個很重要的原因應(yīng)該是，根據(jù)抗體殺滅、清除抗原的機(jī)理推測，免疫性抗體與抗原結(jié)合后，要產(chǎn)生免疫效應(yīng)，要么通過激活補(bǔ)體，介導(dǎo)ADCC效應(yīng)溶解細(xì)胞性抗原，但HIV不是細(xì)胞性抗原；要么通過趨化作用吸引吞噬細(xì)胞吞噬抗原，但HIV反而在吞噬細(xì)胞內(nèi)被保護(hù)、增殖；要么抗體與抗原結(jié)合起中和作用，使之失去感染力，但HIV抗原結(jié)構(gòu)多變，往往使抗體難以識別。

從目前已用于臨床的艾滋病治療方法看，效果不那么理想：(1)HIV逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑：僅能防止尚未感染HIV的易感細(xì)胞感染，對已感染的細(xì)胞沒有治療作用，且毒副作用較多，包括腺粒體毒性、骨髓抑制、紅細(xì)胞性貧血、粒細(xì)胞和血小板減少、胰腺炎，加之交叉耐藥性的產(chǎn)生，這類藥已不單獨使用，主要做聯(lián)合用藥，且易產(chǎn)生耐藥變株，導(dǎo)致臨床療效下降或失效。(2)HIV蛋白酶抑制劑：易產(chǎn)生藥物性肝損傷、脂質(zhì)代謝紊亂等毒副作用及耐藥性。(3)HIV整合酶抑制劑：通過抑制HIV病毒DNA與宿主細(xì)胞DNA整合而發(fā)揮作用，與HIV逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑和蛋白酶抑制劑聯(lián)合同時使用對抗病毒有協(xié)同作用。(4)抑制HIV病毒進(jìn)入抑制劑：包括阻斷gp120與CD4結(jié)合、阻斷HIV與輔助受體結(jié)合、作用于gp41膜亞單位及作用于T淋巴細(xì)胞表面CC趨化因子受體5(CCR5)來阻斷HIV進(jìn)入宿主細(xì)胞，但對肝和心臟有副作用。(5)細(xì)胞因子治療：主要用于調(diào)節(jié)T細(xì)胞動態(tài)平衡。(6)HIV疫苗治療：由于HIV的特殊性，如固有免疫不足以抵御HIV及其靶向破壞免疫系統(tǒng)，病毒突變迅速，導(dǎo)致至今尚未開發(fā)出真正安全有效的疫苗。(7)基因治療：HIV基因治療的研究從未間斷，包括反義技術(shù)、RNA誘餌、RNA干擾、細(xì)胞內(nèi)抗體、顯性陰性突變體、自殺基因等，但進(jìn)入II期臨床試驗階段的基因療法幾乎沒有。(8)單克隆抗體被動免疫療法：通過下調(diào)CD4+T細(xì)胞表面CCR5來降低HIV的易感性、延緩艾滋病的進(jìn)展和減少HIV的擴(kuò)散，中和單克隆抗體2G12、2F5和4E10應(yīng)用于HIV感染者具有良好的耐受性和安全性，能延緩但不能阻止病毒的反彈(9)過繼性免疫細(xì)胞治療：體外大量培養(yǎng)HIV自體的CD4+T細(xì)胞時會導(dǎo)致病毒大量擴(kuò)增，增加病毒感染的CD4+T細(xì)胞數(shù)量，而回輸CD4+T細(xì)胞可能會增加體內(nèi)病毒復(fù)制的場所，導(dǎo)致病毒載量反彈，總體上看，過繼性免疫細(xì)胞治療無明顯的毒副作用，也未取得滿意的治療效果。

凝膠中抗原-抗體沉淀反應(yīng)于1905年首先應(yīng)用于研究利澤甘氏現(xiàn)象，1932年應(yīng)用于鑒定細(xì)菌菌株，1946年Oudin在試管中進(jìn)行免疫擴(kuò)散試驗，用于分析抗原混合物，1948年Elek和Ouchterlony分別建立了瓊脂雙向雙擴(kuò)散法，用于同時鑒定、比較兩種以上抗原或抗體。凝膠中抗原-抗體沉淀反應(yīng)的介質(zhì)凝膠瓊脂或瓊脂糖是一種含有硫酸基的多糖體，高溫時能溶于水，冷后凝成凝膠，內(nèi)部形成一種多孔的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，而且孔徑很大，可允許大分子物質(zhì)(分子量可達(dá)百萬以上)自由通過?？讖降拇笮∵€決定于瓊脂濃度，瓊脂濃度大，孔徑相對較小，瓊脂濃度小，孔徑相對較大。1％瓊脂凝膠的孔徑約為85nm，由于瓊脂或瓊脂糖具有很好的化學(xué)穩(wěn)定性，凝膠后含水量大，透明度好，來源方便，易處理，因此是一種很好的擴(kuò)散介質(zhì)。抗原和抗體的分子量一般都在20萬以下，在凝膠中從高濃度區(qū)域向低濃度區(qū)域擴(kuò)散時所受的阻力很小，基本上呈自由擴(kuò)散形式。由于不同抗原分子的分子量、結(jié)構(gòu)、形狀和電荷量不同，因此其擴(kuò)散系數(shù)不同，在凝膠中擴(kuò)散速度也就不同。當(dāng)抗原與相應(yīng)抗體經(jīng)擴(kuò)散后在凝膠中相遇，形成抗原抗體復(fù)合物，若兩者在相遇處比例適當(dāng)，則形成最大的復(fù)合物。由于復(fù)合物的分子量增大，顆粒增大，因而不再繼續(xù)擴(kuò)散而產(chǎn)生沉淀，呈現(xiàn)出線狀或帶狀，這種沉淀就形成了一個“特異性屏障”，凡在免疫學(xué)上與其相同的抗原或抗體分子不能通過，而性質(zhì)不同的那些分子可以通過這個屏障而繼續(xù)擴(kuò)散，直到形成它們自己的復(fù)合物為止。這樣，不同抗原所形成的沉淀各有各的位置。此種反應(yīng)稱為瓊脂凝膠擴(kuò)散，或瓊脂擴(kuò)散，或免疫擴(kuò)散，其形成的線狀或帶狀的“特異性屏障”稱為免疫沉淀線或免疫沉淀帶，簡稱沉淀線或沉淀帶。是目前用已知抗體檢測未知量相應(yīng)抗原的常規(guī)實驗診斷項目，也是《中國藥典》2010版中規(guī)定用于流感病毒疫苗血凝素含量檢測的標(biāo)準(zhǔn)方法。通常將一定量的羊抗人Ig抗血清成分混合于瓊脂凝膠中，制成含有特異性羊抗人Ig抗血清的瓊脂板，待凝固后打孔，并在相應(yīng)孔中加入待檢人血清(IgG，IgA，IgM等)，使待檢血清在瓊脂板中向四周擴(kuò)散，在抗原和抗體濃度比例合適處發(fā)生結(jié)合，形成肉眼可見的白色沉淀環(huán)而不再擴(kuò)散。由此可見，當(dāng)一種溶液通過半固體凝膠時，其中的大分子溶質(zhì)就被分子篩作用的凝膠孔阻留在凝膠中，特別是其中的抗原能被預(yù)先固定在凝膠中的抗體結(jié)合而被吸附在凝膠中。所以，可根據(jù)瓊脂凝膠擴(kuò)散的原理，設(shè)計治療艾滋病的凈化器，即制備不同感染株的HIV抗體，將HIV抗體預(yù)先固定在凝膠中，當(dāng)患者經(jīng)體外循環(huán)分離出的血漿流經(jīng)凈化器時，血漿中的HIV被預(yù)先固定在凝膠中的相應(yīng)的抗體結(jié)合而阻留在凈化器內(nèi)的凝膠中，同時因1％瓊脂凝膠的孔徑約為85nm，也能將100～120nm的HIV阻留在凝膠中，經(jīng)如此抗體吸附和凝膠分子篩作用，人工體外清除HIV后的血漿與血細(xì)胞匯合后回輸體內(nèi)，從而達(dá)到治療艾滋病的目的。

總之，各種藥物及生物制品無法有效殺滅體內(nèi)的艾滋病毒，且價格貴，副作用大，至今尚無治療艾滋病的有效方法，已成為久攻不克的世界性難題。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為了解決久攻不克的艾滋病治療領(lǐng)域的世界性難題，本發(fā)明人提出了本發(fā)明。

本發(fā)明的目的是要提供艾滋病免疫凈化儀；另一目的是要提供艾滋病免疫凈化儀的制備及應(yīng)用方法。

本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的：制備能濾除多細(xì)胞結(jié)合而成的含有HIV的大體積細(xì)胞的血液分離器及能分離單個血細(xì)胞及血漿的血漿分離器，并制備gp120和gp41抗體，再以gp120和gp41抗體為抗原制備羊抗gp120和gp41抗體，取gp120和gp41抗體以及羊抗gp120和gp41抗體混合，使混合液中的羊抗gp120和gp41抗體均被完全結(jié)合，但剩有足夠高滴度的gp120和gp41抗體，將抗體以反向?qū)?yīng)梯度滴度配入起載體作用的經(jīng)100℃溶化后保溫在39～41℃的梯度濃度的瓊脂糖，按抗體滴度從低至高依次取瓊脂糖加入血液凈化器，待冷卻至37℃成為半固體凝膠后再接著加下一次，使凈化器中的凝膠從上到下形成從高到低的抗體滴度而從低到高的瓊脂糖濃度的分層分布，有利于血漿灌流及分子篩和免疫清除的作用，其中與羊抗HIV抗體結(jié)合的和未結(jié)合的gp120及gp41抗體均被固定在瓊脂糖凝膠中，起吸附HIV的作用，所制備的凈化器進(jìn)而與血液分離器、血漿分離器組合并附加計算機(jī)調(diào)控程序而制備艾滋病免疫凈化儀，體外循環(huán)中的血液被凈化儀中的血液分離器濾除大體積的多核血細(xì)胞，進(jìn)而被血漿分離器分成血漿和單個血細(xì)胞，血漿經(jīng)凈化器濾除HIV后與單個血細(xì)胞匯合后回輸。

本發(fā)明的技術(shù)核心由血液、血漿分離器和血液凈化器構(gòu)成，其中血液分離器的孔徑型號為150～250μm、50～150μm、15～40μm、8～15μm、5～8μm、3～5μm、1～2μm，能濾除血液中HIV感染細(xì)胞形成的多核巨細(xì)胞或多細(xì)胞聚合體；血漿分離器能分離中等體積的單個血細(xì)胞和血漿；凈化器中的凈化劑由固定于瓊脂凝膠的HIV抗體、與羊抗Ig結(jié)合的HIV抗體制成，其中與羊抗Ig結(jié)合的RIV抗體其結(jié)合物的分子量比未結(jié)合的HIV抗體分子量大，不易通過凝膠分子篩，以及所含羊抗Ig易與瓊脂凝膠固定結(jié)合的特點，HIV抗體也隨之更易被固定于瓊脂凝膠，血漿中的HIV與被固定于瓊脂凝膠的HIV抗體相遇時會發(fā)生結(jié)合反應(yīng)而形成抗原抗體復(fù)合物，從而通過HIV抗體被固定于瓊脂凝膠，而且瓊脂凝膠所形成的濾孔隨著瓊脂糖濃度的增高而減少，凈化器進(jìn)口處瓊脂糖濃度低，濾孔就大，有利于血漿灌流及高滴度抗體與HIV的結(jié)合反應(yīng)；而出口處濃度高，濾孔就小，易于阻留HIV或大分子結(jié)合物，凈化劑器組合了多種特異和非特異的HIV清除成份，以免特種毒株因免疫差異所致的無效治療。所以在體外循環(huán)中，含有大量HIV的大體積細(xì)胞首先被血液分離器濾除，而血漿中游離的HIV被血液凈化器吸附清除，凈化后的血漿與中等體積的單個血細(xì)胞匯合后回輸，從而清除結(jié)合在細(xì)胞表面和/或細(xì)胞內(nèi)的HIV以及游離于血漿的HIV。

具體實施方式

圖1是根據(jù)本發(fā)明提出的艾滋病免疫凈化儀的應(yīng)用示意圖。

圖2是根據(jù)本發(fā)明提出的血液分離器的內(nèi)部結(jié)構(gòu)示意圖。

圖3是根據(jù)本發(fā)明提出的血漿分離器的內(nèi)部結(jié)構(gòu)示意圖。

圖4是根據(jù)本發(fā)明提出的凈化器的內(nèi)部結(jié)構(gòu)示意圖。

圖1中，動脈血路管(1)的一端與動脈血管相連通，另一端經(jīng)肝素和血液泵(2)與含有廢液出口(5)的血液分離器(3)相連，血液分離器(3)經(jīng)血液出口(4)、血液泵(6)、循環(huán)管路(7)與血漿分離器(8)相連，血漿分離器(8)的血漿出口經(jīng)血漿泵(9)和血路管(10)與兩個并聯(lián)的凈化器(11)和凈化器(12)相連，兩個凈化器的出口管路(13)與血漿分離器(8)的血細(xì)胞出口管路(14)匯合后經(jīng)靜脈管路(15)匯流體循環(huán)。

圖2表示圖1中的血液分離器(3)的內(nèi)部結(jié)構(gòu)。圖2中，分離器(1)的內(nèi)腔(2)的管壁上有很多微孔(3)，多核巨細(xì)胞(4)不能濾過微孔(3)而被阻留在內(nèi)腔(2)，從而可被清除，能通過微孔(3)的中、小體積的單個血細(xì)胞(5)進(jìn)入外腔(6)，然后經(jīng)出口(7)流出，進(jìn)而經(jīng)圖1所示的血漿分離器(8)分離出血細(xì)胞和血漿。

圖3表示圖1中的血漿分離器(8)的內(nèi)部結(jié)構(gòu)。圖3中，1是血漿分離器，2是血漿分離器內(nèi)腔，3是血漿分離器內(nèi)腔管壁上的微孔，4是不能通過微孔(3)的單個血細(xì)胞，5是能通過微孔(3)的血漿化學(xué)成份，6是血漿分離器外腔，7是血漿流出口，8是具有可開關(guān)閥門的血細(xì)胞出口。

圖4中，1為凈化器，2是游離的HIV，3為固定于瓊脂凝膠(6)中的HIV抗體，4為HIV與HIV抗體結(jié)合后而被阻留在瓊脂凝膠(6)中的結(jié)合物，5為被瓊脂凝膠(6)分子篩阻留的較大體積的HIV。

下面結(jié)合圖1、圖2、圖3和圖4，對本發(fā)明提出的艾滋病免疫治療儀的實施方案作詳細(xì)的描述。

一、艾滋病血液凈化劑的制備

(一)HIV-1gp120抗體的制備

本發(fā)明所涉及的抗體可以委托專業(yè)商家制備，或直接從專業(yè)商家購買，如上海瑞齊生物科技有限公司及上海領(lǐng)潮生物科技有限公司等單位都專業(yè)從事HIV-1gp120抗體、gp41抗體及羊抗人IgG等各種抗體的制備和銷售。方法包括雜交瘤技術(shù)制備單克隆抗體、EB病毒轉(zhuǎn)化技術(shù)制備單克隆抗體、雜交瘤技術(shù)與EB病毒轉(zhuǎn)化技術(shù)相結(jié)合制備單克隆抗體和基因工程抗體，具體列舉如下。

1、采用淋巴細(xì)胞EB病毒轉(zhuǎn)化與雜交瘤技術(shù)相結(jié)合制備HIV-1gp120單克隆抗體

標(biāo)本來源有以下幾種途經(jīng)：取傳染病實驗室樣本庫中凍存的淋巴細(xì)胞株(經(jīng)滅活HIV免疫和EBV轉(zhuǎn)染的淋巴細(xì)胞)；購買血站新鮮濃縮白細(xì)胞，然后進(jìn)行過滅活HIV感染株免疫的淋巴細(xì)胞；取自作為科研而保存的臍帶血淋巴細(xì)胞(經(jīng)滅活HIV免疫)；直接取自HIV-1感染者自身的外周血淋巴細(xì)胞(用于自身)，采用Histopaque淋巴細(xì)胞分離液分離單個核細(xì)胞(PBMC)，調(diào)節(jié)濃度為2x 10⁶后加入適量的EB病毒(EBV)原液，置于370C，5％CO2培養(yǎng)過夜，制備待雜交B細(xì)胞，用ELISA方法篩選抗HIV-1外膜蛋白(gp120)陽性孔，轉(zhuǎn)移細(xì)胞至24孔板繼續(xù)培養(yǎng)2周，重復(fù)用ELISA法測定抗gp120確認(rèn)陽性者，連續(xù)克隆二次并大量擴(kuò)增培養(yǎng)。將陽性細(xì)胞株與人鼠異質(zhì)骨髓瘤細(xì)胞(由浙江大學(xué)免疫系購得)混合(3∶1)后，加入1ml50％PEG使二者融合，然后重懸細(xì)胞在IMDM培養(yǎng)液中培養(yǎng)過液，第二天加入小鼠腹腔細(xì)胞(由浙江大學(xué)免疫系購得)作為滋養(yǎng)細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)3周后用ELISA篩選抗gp120抗體，挑選強(qiáng)陽性孔雜交瘤細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)，并進(jìn)行多次克隆直至獲得穩(wěn)定的細(xì)胞系，以此細(xì)胞系培養(yǎng)、制備HIV-1抗體，采用ELISA檢測試劑盒，按說明書操作，測定抗體的Ig亞類，并以常規(guī)ELISA法測定抗體的效價和特異性，選出特異性強(qiáng)、效價高的抗體。

2、采用基因重組HIV-1gp120結(jié)合雜交瘤技術(shù)制備抗體

(1)試劑與重組抗原：涉及試劑：HIV-1gp120基因片段，HIV-1gp120抗原、HIV抗原硝酸纖維膜條由北京萬泰藥業(yè)公司提供BamH I內(nèi)切酶Xho I內(nèi)切酶、核酸共沉淀劑、T4 DNA Ligase購自寶生物有限公司；Liagen膠回收試劑盒購自QIAquick公司；RPMI 1640干粉培養(yǎng)基購自Gibco公司；優(yōu)級新生牛血清購自明海生物工程有限公司；SupersignalWest Pico Trial Kit、TMB Substrate Kit購自Pierce公司；小鼠Ig亞類檢測試劑盒、福氏佐劑及PEG、Hy-poxanthine、Thymidine和Aminoptem購自Sigma公司。HIV-抗體診斷試劑盒購自上?？迫A生物有限公司，辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG抗體購自博士德有限公司。重組質(zhì)粒構(gòu)建及鑒定：載體質(zhì)粒PEGX-4T-2用BamH I、Xho I酶切，T4DNA Ligase連接gp120基因片段，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌XL1-blue，進(jìn)行測序。重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及鑒定：重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入XL1-Blue大腸桿菌中，在IPTG誘導(dǎo)劑作用下25℃，190r/min震蕩，過夜，4000r/min離心10min，收集細(xì)菌，SDS-PAGE檢測目的蛋白表達(dá)情況。融合蛋白純化和鑒定：表達(dá)產(chǎn)物離心收集沉淀經(jīng)PBS懸起，用30W超聲粉碎儀裂解細(xì)菌后，將其離心收集上清過濾，濾液用AKTA PURIFYER100蛋白純化儀、GST柱純化，得到融合蛋白GST-HIV，濃縮離心管進(jìn)行濃縮，S21型生物分光光度計測量濃度，SDS-PAGE對純化蛋白進(jìn)行鑒定。

(2)動物免疫：BALB/c小鼠6周齡，雌性，4只，免疫前取小鼠靜脈血，分離血清留做陰性血清。將50-100μg的GST-HIV融合蛋白與等體積弗氏完全佐劑混合、乳化后腹腔注射免疫小鼠。初次免疫后，每隔2周使用弗氏不完全佐劑與融合蛋白乳化后加強(qiáng)免疫小鼠，免疫劑量和途徑同前，重復(fù)免疫2-3次，最后一次加強(qiáng)免疫直接腹腔注射50-100μg的GST-HIV融合蛋白。

(3)單抗檢測方法的建立：第三次免疫后一周尾靜脈采血，用方陣法確定陽性血清的最佳工作濃度和GST-HIV融合蛋白的最佳包被濃度。操作如下：按照1∶1000、1∶500、1∶200、1∶100四個稀釋度，使用包被緩沖液稀釋抗原，縱向包被96孔酶標(biāo)板，每孔100μL，4℃包被過夜，洗滌3次，每次間隔3分鐘。將陽性血清和陰性血清分別由1∶1000開始作倍比稀釋，橫向加樣到第10孔，每孔100μL，置于濕盒中37℃溫育1h，洗滌3次，每次間隔3分鐘。酶標(biāo)抗體HRP-羊抗鼠IgG按照說明書作1∶10000稀釋，每孔100μL，37℃溫育1h，洗滌3次。加人現(xiàn)配的OPD底物液，每孔100μL，37℃避光反應(yīng)適當(dāng)時間，每孔加100μL終止液終止反應(yīng)，檢測其OD492值。陽性雜交瘤細(xì)胞篩選方法建立。按照方陣法中實驗條件和方法，分別以GST-HIV融合蛋白為實驗組，誘導(dǎo)表達(dá)后重組菌(含質(zhì)粒pET-32a)蛋白為對照組，篩選陽性克隆。操作步驟如下：在96孔酶標(biāo)板上以最適包被濃度包被抗原，100μl/孔，4℃冰箱包被過夜。取出包被板后加入洗滌液洗滌3次，每次洗滌3min；每孔加待測細(xì)胞上清(1∶5稀釋)100μL，37℃溫箱孵育50min，之后洗滌3次，每次洗滌3min；每孔再加入二抗100μl，37℃溫箱孵育30min，洗滌3次，每次洗滌3min；每孔加入現(xiàn)配的OPD底物液100μL，室溫避光反應(yīng)10-15min；在每孔中加入2mol/L H2SO4終止液100μl用于終止反應(yīng)；將檢測板放在酶標(biāo)儀上測OD492值。對照組的設(shè)立：陽性對照組為適當(dāng)稀釋的陽性血清，陰性對照組是和一抗有相同稀釋度的無關(guān)單抗的細(xì)胞上清。間接ELISA篩選結(jié)果判定。每組檢測OD492值，以P(樣品值)/N(陰性值)≥2.0者判為陽性值。篩選陽性克隆標(biāo)準(zhǔn)：細(xì)胞上清與正篩選組(純化后融合蛋白包被)反應(yīng)呈陽性，同時與負(fù)篩選組(誘導(dǎo)后的含pET-32a質(zhì)粒的菌體蛋白)反應(yīng)呈陰性的檢測孔為陽性樣品。

(4)細(xì)胞融合：骨髓瘤細(xì)胞準(zhǔn)備：融合前一周從液氮罐內(nèi)取出一管凍存的骨髓瘤細(xì)胞，立即放入熱水解凍。融化后加入適量完全培養(yǎng)液，1000r/min離心3min；重復(fù)1次。將沉淀物移入細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，加DMEM培養(yǎng)液，置CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，3-4天進(jìn)行一次傳代或擴(kuò)大培養(yǎng)，融合前24小時內(nèi)調(diào)整細(xì)胞狀態(tài)，保證融合前細(xì)胞形態(tài)良好、生長旺盛。融合前使用適量胰酶消化后使用離心管收集，加入適量基礎(chǔ)培養(yǎng)基到離心管中，輕輕敲打混勻后1000r/min離心5-10min，重復(fù)洗滌細(xì)胞2次。脾細(xì)胞準(zhǔn)備：融合前，取一只Balb/c小鼠，摘取眼球取血，放血完全后拉頸處死，在75％乙醇中浸濕。取出后仰放固定于解剖板上，無菌環(huán)境下取脾臟，將脾臟移入平皿中。然后在平皿加入10mL RPMI 1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基，用平口鑷子反復(fù)擠壓破碎后，使用無菌注射器反復(fù)抽吸吹打，制成單細(xì)胞懸液。計活細(xì)胞數(shù)后1000r/min離心10min，加入基礎(chǔ)培養(yǎng)基調(diào)整總細(xì)胞數(shù)到1×10⁸～2×10⁸用于細(xì)胞融合。細(xì)胞融合：將脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞以10∶1-5∶1的比例加入離心管中，混和均勻，1000r/min離心5min，棄去上清，輕輕敲打管底至細(xì)胞無顆粒狀沉淀，重復(fù)2次。在37℃水浴中輕輕旋轉(zhuǎn)預(yù)熱離心管，取出后無菌條件下將預(yù)熱的1000μL的50％PEG3000在60s內(nèi)沿管壁滴加到融合管中同時輕輕旋轉(zhuǎn)離心管，之后將預(yù)熱的25mL的基礎(chǔ)培養(yǎng)基在3-5min內(nèi)也沿管壁滴加到離心管中，在加入的過程中輕輕地旋轉(zhuǎn)離心管，然后靜置于37℃水浴10min，1000r/m離心5min，棄去上清，加入50mL HA T培養(yǎng)基。適當(dāng)混勻后接種到96孔培養(yǎng)板中，置于37℃，5％的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

(5)陽性克隆株的篩選：觀察96孔培養(yǎng)板中細(xì)胞生長情況，7-10天后僅有雜交瘤細(xì)胞能夠生長分裂，此時棄去HAT培養(yǎng)基，更換完全培養(yǎng)基。細(xì)胞克隆生長面積達(dá)到1/10個細(xì)胞孔時，去培養(yǎng)上清，通過之前建立的單抗篩選方法篩選陽性雜交瘤細(xì)胞克隆。采用改進(jìn)的有限稀釋法——梯度有限稀釋法連續(xù)對間接ELISA初步篩選出的陽性細(xì)胞孔進(jìn)行3-4輪的亞克隆。選擇有生長狀態(tài)良好的陽性雜交瘤細(xì)胞株的培養(yǎng)孔，顯微鏡下標(biāo)記細(xì)胞株生長的位置、大小，使用無菌槍頭在標(biāo)注的位置吸取細(xì)胞克隆到新的有完全培養(yǎng)基的培養(yǎng)孔內(nèi)，然后依次倍比稀釋到后面數(shù)孔，37℃，5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)一周左右，顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況，待細(xì)胞克隆長滿至孔底面積1/10以上時，取細(xì)胞培養(yǎng)上清進(jìn)行抗體檢側(cè)。對檢測結(jié)果為陽性的培養(yǎng)孔中的細(xì)胞克隆重復(fù)進(jìn)行下一輪稀釋培養(yǎng)，重復(fù)2-3輪，檢測上清效價穩(wěn)定后取出，轉(zhuǎn)入培養(yǎng)瓶大量培養(yǎng)。

(6)雜交瘤細(xì)胞株的保存與傳代培養(yǎng)：保存與復(fù)蘇：保存前12小時調(diào)整細(xì)胞生長狀態(tài)。取一瓶生長旺盛，形態(tài)良好的細(xì)胞，適當(dāng)消化后制成細(xì)胞懸液，1000r/m離心5min，去上清液，輕彈管底使細(xì)胞松散，加入4℃保存的9份完全培養(yǎng)液和1份DMSO，分裝細(xì)胞凍存管，1mL/管，-70℃冰箱過夜，取出后將凍存管放入液氮容器中保存?zhèn)溆?。?fù)蘇前準(zhǔn)備好40℃左右的熱水，將凍存管從液氮中小心取出，迅速置于熱水中均勻搖動使細(xì)胞解凍，解凍后在1000r/m離心5min，超凈工作臺內(nèi)無菌條件下打開凍存管，將解凍后的細(xì)胞用完全培養(yǎng)液洗滌一次，然后在1000r/m離心5min，棄去上清，細(xì)胞沉淀使用完全培養(yǎng)液輕輕重懸后移入培養(yǎng)瓶內(nèi)，置37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。傳代培養(yǎng)陽性雜交瘤細(xì)胞連續(xù)傳10代，采用間接ELISA的方法測定培養(yǎng)上清抗體效價，觀察效價的變化，觀察此陽性雜交瘤細(xì)胞株是否能穩(wěn)定分泌抗體。

(7)單抗小鼠腹水的制備：低速離心收集培養(yǎng)后的雜交瘤細(xì)胞，經(jīng)過基礎(chǔ)培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞數(shù)為1×10⁷/mL。小鼠腹腔注射0.2mL/只，注射后觀察小鼠腹水產(chǎn)生情況，待腹部明顯臌起，用針頭穿刺腹腔，離心管收集腹水。采集完畢，對小鼠腹腔注射適量基礎(chǔ)培養(yǎng)基，間隔2-3天，同樣方法再取腹水。收集到的腹水，10000r/m離心5min，吸取上清液，分裝，-20℃保存。

(8)單抗的特性鑒定：特異性：Weston-Blotting實驗參照《分子克隆》方法進(jìn)行，半干法轉(zhuǎn)印，程序如下：首先以純化的CD4融合蛋白和誘導(dǎo)后重組菌蛋白經(jīng)12％SDS-PAGE，一組用做對照，一組用做轉(zhuǎn)印。電泳完畢，將膠切割后和同樣大小的6張濾紙放入陰極緩沖液中；將NC膜先用乙醇浸泡3-5min，然后放入去離子水中，1-3min后再與6張同樣大小大的濾紙一起放入陽極液中；用陰極緩沖液將電泳槽的陰極板涂抹濕潤，取出陰極緩沖液中的濾紙和凝膠依次放在陰極板，輕輕壓出氣泡。再將陽極緩沖液中NC膜和6張濾紙從陽極液中取出依次鋪在凝膠上，輕輕壓出氣泡。最后輕輕蓋上電泳槽陽極板。接通電源后，根據(jù)NC膜的面積，2mA/cm2電流大小，轉(zhuǎn)印2h；轉(zhuǎn)印結(jié)束后，膠取出后進(jìn)行染色，轉(zhuǎn)移膜取出后，用PBS稀釋的5％脫脂奶粉封閉，4℃冰箱靜置過夜。封閉過夜后，棄去封閉液，用洗滌緩沖液洗滌3次，每次5min。洗滌過后，加入1∶10稀釋的單抗細(xì)胞上清，在搖床上輕搖，室溫反應(yīng)60min。棄去一抗，再用洗滌緩沖液洗滌3次，每次5min。根據(jù)Dot-ELISA摸索的條件，加入1∶5000稀釋度的二抗，在搖床上輕搖，室溫反應(yīng)50min。棄去二抗，再用洗滌緩沖液洗滌3次，每次5min。將有蛋白條帶的NC膜做好標(biāo)記，加入DAB顯色劑，反應(yīng)適當(dāng)時間后用去離子水沖洗終止反應(yīng)。效價以純化的CD4融合蛋白為檢測抗原，采用間接ELISA方法測定雜交瘤細(xì)胞上清和單抗腹水的效價。單抗亞類鑒定選用小鼠單抗Ig類/亞類鑒定用酶標(biāo)二抗即用試劑盒測定，按照試劑盒操作說明書來操作，步驟如下：將適當(dāng)稀釋的純化后CD4融合蛋白包被于酶標(biāo)板，每孔100uL，置4℃冰箱過夜。將酶標(biāo)板中的包被液拍干，然后用洗滌緩沖液洗一次，3min。然后將待測的雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清加入孔中，每孔100μL，置37℃溫箱溫育30min。拍干后用洗滌緩沖液洗五次，3min/次。將本試劑盒中的6種酶標(biāo)記物分別加入孔中，每孔100μL，置于37℃溫育30min。繼續(xù)用洗滌緩沖液洗五次，3min/次。加OPD底物液避光顯色15分鐘后加入終止液，用酶標(biāo)儀檢測OD492值，OD492值明顯高出其它孔的類型即為HIV-1gp120單抗Ig類別。

(9)HIV-1gp120單抗經(jīng)進(jìn)一步精制后應(yīng)用(可委托專業(yè)商家完成)。

(二)HIV-1gp41抗體的制備

同HIV-1gp120抗體的制備

(三)羊抗人-Ig的制備

將所制HIV-1gp120抗體和gp41抗體為抗原，免疫羊制備抗體。

1、實驗動物：免疫用實驗動物選用的是浙江大學(xué)動物學(xué)院雜交白山羊，體重30斤左右的健康青壯年母羊二只，免疫前用染料涂沫在動物的背部，作出明確的標(biāo)記。采用隨群圈養(yǎng)的飼養(yǎng)方式，每天保證羊只得到適量的運(yùn)動，運(yùn)動時間在傍晚，每次運(yùn)動大概半小時左右，這樣利于身體健壯，避免羊只過肥，增加機(jī)體的免疫力，飲水充足，并給予適量的精料、青草、玉米、麩皮、小麥、維生素等等，使其營養(yǎng)均衡。經(jīng)常查看實驗羊只健康狀況。

2、HIV-1gp120抗體和gp41抗體為抗原：本發(fā)明制備的HIV-1gp120抗體和gp41抗體(IgG)濃度分別為2.5mg/mL(可由商家提供)，接種前混合0.1mL抗原、1.9mL無菌PBS、2mL弗氏完全(或不完全)佐劑制成免疫原乳劑備用。

3、山羊的免疫：選取兩只山羊，標(biāo)記為山羊A、山羊B，接種抗原(HIV-1gp120抗體和HIV-1gp41抗體)。免疫部位為前后腹股溝，每處腹股溝分2個點注射，總共有8個注射點。注射方式為皮下注射，每只山羊每次注射4mL免疫原，含250μg抗原；每個注射點注射免疫原0.5mL，約含32μg抗原。免疫前兩只山羊分別抽血10mL，標(biāo)記為0dP1，-20℃保存；第一次免疫即一4、免免疫原：0.1mL抗原+1.9mL無菌PBS+弗氏完全佐劑2mL(CFA)；免疫7天后抽血10mL，分離血清，標(biāo)記為7dP1，ELISA檢測血清效價，剩余血清-20℃保存。3～4周開始第二次免疫，二免疫原：0.1mL抗原+1.9mL無菌PBS+2mL弗氏不完全佐劑(IFA)，免疫7天后抽血10mL，分離血清，標(biāo)記為7dP2，ELISA檢測血清效價，剩余血清-20℃保存。第三次免疫時間為6-8周后，三免免疫原：0.1mL抗原+1.9mL無菌PBS+2mL弗氏不完全佐劑(IFA)，免疫7天后抽血10mL，分離血清，標(biāo)記為7dP3，ELISA檢測血清效價，剩余血清-20℃保存。如果此時血清效價沒達(dá)到1∶10⁶以上，則需要再免一次；如果血清效價已達(dá)10⁶以上則不用再免疫，以后每隔一周抽血50mL，分離血清，-20℃保存。

4、血清制備：一般每次免疫后7～10天即可于羊頸靜脈采血檢測。由助手協(xié)助保定動物，使其保持站立姿勢，頸部剪毛、無菌棉球擦拭消毒后，尋找到頸靜脈手持注射器采血，將注射器位置固定取血5-10mL。分離出血清后進(jìn)行效價檢測。在第三次免疫后7～10天，經(jīng)效價檢測合格后一次可取血30-50mL。在無菌條件下分離血清，待收集于平皿或三角瓶內(nèi)的血液凝固之后，用無菌滴管在無菌環(huán)境(例如超凈工作臺)中把血塊與瓶壁剝離后，放入37℃，1～2h取出后放入4℃過夜，使血清充分析出(不能冰凍，否則產(chǎn)生溶血)，經(jīng)離心沉淀分出血清，放進(jìn)低溫冰箱保存。使用前須經(jīng)過簽定合格后再分裝保存?zhèn)溆谩?/p>

5、抗血清效價的測定：抗血清效價是采用ELISA測定方法：包被時是將樣品用包被液稀釋到1∶1000的濃度后，在酶標(biāo)板上每孔加100μL，然后放在鋁盒中放入4℃冰箱里過夜。第二天早上拿出來拍干包被液，用PBST洗滌三次，每次間隔五分鐘，最后一次用紗布拍干酶標(biāo)板，加入10％血清的封閉液，每孔加100UL，放入37℃，水浴1～2h。然后再拿出來拍干封閉液，用PBST洗滌酶標(biāo)板3每次間隔五分鐘，最后一次用紗布拍干，加入100μL/孔一抗(1∶2000稀釋，用4％牛血清的PBST稀釋，放入37℃，水浴1～2h)。然后再拿出來拍干一抗液，PBST洗滌酶標(biāo)板三次，每次間隔5分鐘，最后一次用紗布拍干酶標(biāo)板，加入二抗液(兔抗羊1∶1000)，每孔加100μL，放入37℃，水浴1～2h。再拿出來拍干二抗液用PBST洗滌酶標(biāo)板3每次間隔五分鐘，最后一次用紗布拍干，每孔加50μL底物顯色液，閉光顯色10-20分鐘后加入2M的H SO溶液50μL終止反應(yīng)，后用酶標(biāo)儀測OD值(半小時內(nèi))。

二、艾滋病血液凈化器的制備

1、凈化器的制備方法

將gp120和gp41抗體分別與羊抗gp120和gp41抗體混合，使混合液中的羊抗gp120和gp41抗體均被完全結(jié)合，但剩有高滴度的游離的gp120和gp41抗體，然后將含有結(jié)合型和游離型gp120抗體的混合抗體以及含有結(jié)合型和游離型gp41抗體的混合抗體再次以等效價混合，配成最終混合抗體，分別以梯度濃度的瓊脂糖C1-4B溶液配制5種凝膠混合抗體，使HIVgp120和gp41抗體的效價均為1∶700、1∶500、1∶300、1∶200、1∶100而對應(yīng)的瓊脂糖濃度依次為0.7％、0.8％、0.9％、1.0％、1.1％，按抗體效價從低到高以均等體積灌注凈化器。瓊脂凝膠所形成的濾孔隨著瓊脂糖濃度的增高而減少。凈化器進(jìn)口處瓊脂糖濃度低，濾孔就大，有利于血漿灌流及高滴度抗體與HIV的結(jié)合反應(yīng)；而出口處濃度高，濾孔就小，易于阻留HIV或大分子結(jié)合物。凈化器組合了多種特異和非特異的HIV清除成份，以免特種毒株因免疫差異所致的無效治療。

配方一：將gp120和gp41抗體與起載體作用的經(jīng)100℃溶化后保溫在39～41℃的0.7％、0.8％、0.9％、1.0％、1.1％的瓊脂糖C1-4B生理鹽水配成反向?qū)?yīng)的1∶700、1∶500、1∶300、1∶200、1∶100的梯度滴度的凝膠抗體，按低滴度至高滴度依次取10～15ml凝膠抗體加入血液凈化柱內(nèi)，要求在先加入的凝膠抗體冷卻至37℃成為半固體瓊脂凝膠后才接著加下一次，使血液凈化柱從上到下(從進(jìn)口到出口)形成從高到低的抗體滴度而從低到高的瓊脂糖濃度的分層分布，其中與羊抗HIV(gp120和gp41)抗體結(jié)合的和未結(jié)合的gp120抗體、gp41抗體均被固定在凝膠中起吸附HIV的作用。

配方二：將gp120和gp41抗體以起載體作用的經(jīng)100℃溶化后冷卻至39～41℃的1％含量的瓊脂糖C1-4B按倍比配成1∶50～1000的滴度梯度后，再灌注血液凈化柱，使血液凈化柱從上到下(從進(jìn)口到出口)形成從高到低的抗體滴度而從低到高的瓊脂糖濃度的分層分布，其中與羊抗HIV(gp120和gp41)抗體結(jié)合的和未結(jié)合的gp120抗體、gp41抗體均被固定在凝膠中起吸附HIV的作用。

配方三：分別標(biāo)示不同的HIV感染株所制備的抗體及其對應(yīng)的按倍比配成的滴度梯度的效價值，比如HIV感染株1滴度1∶100管、1∶200管……；HIV感染株2滴度1∶100管、1∶200管……，依此類推，然后將感染株1滴度1∶100管與10ml39～41℃保溫的液態(tài)瓊脂糖C1-4B混勻后放入血液凈化柱，待放置冷卻成半固體凝膠后，再將感染株1滴度1∶200管與10ml39～41℃保溫的液態(tài)瓊脂糖C1-4B混勻，混勻液放入血液凈化柱的凝膠上層，依此類推。在實際應(yīng)用中要按組合制備，比如某地區(qū)某時期的HIV感染株有A、B、C共3株，制備的抗體有A株1∶100管、1∶200管……；B株1∶100管、1∶200管……；C株1∶100管、1∶200管……；經(jīng)組合后就是ABC株1∶100管、ABC株1∶200管……ABC株1∶1000管，然后將ABC株1∶1000管與10ml39～41℃保溫的液態(tài)瓊脂糖C1-4B混勻后放入血液凈化柱，待放置冷卻成半固體凝膠后，再將ABC株1∶900管與10ml39～41℃保溫的液態(tài)瓊脂糖C1-4B混勻，混勻液放入血液凈化柱內(nèi)已冷卻成半固體的凝膠上層，依此類推，中間可以間隔選用，比如接著選ABC株1∶500管與10ml39～41℃保溫的液態(tài)瓊脂糖C1-4B混勻，混勻液放入血液凈化柱內(nèi)已冷卻成半固體的凝膠上層，液態(tài)瓊脂糖C1-4B的用量也可以在1ml～10ml內(nèi)調(diào)整(按這樣制成的血液凈化柱，從進(jìn)口至出口形成從低到高的梯度抗體含量，鑒于抗原和抗體只有在合適比例時才會起免疫反應(yīng)、形成沉淀線而阻止同類抗體或抗原的前行，所以不同HIV含量的血漿通過凈化劑時，HIV就在不同的層面上被吸附阻留，而且本發(fā)明的HIV感染株可以函蓋當(dāng)時幾乎所有的感染株，以及吸附劑中與羊抗Ig結(jié)合的和未結(jié)合的gp120和gp41抗體都是預(yù)先固定于凝膠瓊脂中的HIV配基，HIV抗體特別是結(jié)合有羊抗HIV的HIV抗體與HIV結(jié)合所形成的免疫復(fù)合物分子量更大，完全能被阻留在凝膠瓊脂中而被清除，再加上孔徑約為85nm的凝膠瓊脂本身就能阻留直徑為100～120nm的HIV，所以從理論上推斷幾乎不會有治療無效的艾滋病患者)。

2、凈化器外殼的制備及規(guī)格

血液凈化柱或血液凈化器為底徑小、頂徑大的圓柱形，或方形、漏斗形，容積為200～300ml，進(jìn)出口均設(shè)有細(xì)胞篩網(wǎng)，進(jìn)口處頂徑篩網(wǎng)目數(shù)為800目；出口處底徑篩網(wǎng)目數(shù)為2.0～5.0目(2.5～5.0目相當(dāng)于0.1～0.2微米或100～200納米)，具體可制成2.0目、2.5目、3.0目、3.5目、4.0目、4.5目和5.0目的7種不同規(guī)格，用以阻擋120納米的HIV病毒或更大的細(xì)菌；液體出口處設(shè)置目數(shù)為100目(相當(dāng)于4微米)的細(xì)胞濾網(wǎng)，用以阻擋可能濾出的細(xì)胞；液體進(jìn)出口與網(wǎng)篩之間設(shè)有緩沖區(qū)，有利于系統(tǒng)循環(huán)的穩(wěn)定性。

3、凈化器的制備材料

血液凈化器選用丙烯酸酯之類的高分子材料，要求生物相容性好，幾乎不激活補(bǔ)體、不引起炎癥反應(yīng)、不引起白細(xì)胞、血小板、血氧分壓、補(bǔ)體C3a、C5a的改變?？赏ㄟ^共價、接枝、聚合等方法改進(jìn)材料的結(jié)構(gòu)、調(diào)節(jié)表面的不均勻性、親水性、減少對凝血及氧化應(yīng)激的影響、從而提高生物相容性、減少并發(fā)癥的發(fā)生。在凈化器內(nèi)表面加親水凝膠，將2甲基丙烯酰氧乙基磷酸膽堿-丁基異丁烯酸固化在醋酸纖維素膜上，通過控制濕紡過程，可生成CA/PMB30、CA/PMB80和CA/PMB30-80，具有較高的血液和細(xì)胞相容性。將某些具有抗凝作用的物質(zhì)固化在載體或凈化器內(nèi)表面的材料上，可抑制血液凝固，提高生物相容性，還可降低肝素用量，并有可能實現(xiàn)無肝素化。如將肝素聚合在聚丙烯腈-聚乙烯亞胺膜上，效果可能會更好，并可減少凈化期間的過敏反應(yīng)，固化殼聚糖和肝素共價物的聚丙烯腈表面也顯示了良好的血液相容性，并可抑制銅綠假單孢菌的活性，降低細(xì)胞毒性反應(yīng)。將肝素共價結(jié)合到聚醚砜表面，既保持了聚醚砜的力學(xué)性能，又能提高凈化器內(nèi)表面的抗凝血性能。在醋酸纖維膜上共價固化亞油酸膜，或?qū)⒐矁r結(jié)合到聚丙烯酸的亞油酸嫁接到聚砜膜表面，都可以有更好的組織相容性和抗凝血效果。

三、分離器的制備

(一)血液分離器的制備

1、制備原理：①血細(xì)胞、細(xì)菌、病毒的分子大?。喝梭w血液中有形成份(細(xì)胞)的大小為：正常紅細(xì)胞大約為7微米(μm)，是雙凹圓盤狀的細(xì)胞；白細(xì)胞分為5種，中性粒細(xì)胞約12μm，嗜酸性粒細(xì)胞略大些，嗜堿性粒細(xì)胞與中性粒細(xì)胞接近，小淋巴細(xì)胞6-8μm，與紅細(xì)胞近似，單核細(xì)胞最大，約15-20μm。血小板為圓盤形，直徑1～4微米到7～8微米不等，人的血小板平均直徑為2-4微米，厚0.5～1.5微米。細(xì)菌的大小為：球菌的直徑約在0.75-1.25μm之間，桿菌長度約在2-5μm，螺旋菌長約100-200μm。病毒的大小以納米(nm)為單位[1cm＝10mm，1mm＝1000μm，1μm＝1000nm]，不同病毒間大小差異很大，最小的如植物的聯(lián)體病毒(Geminiviruses)直徑僅18-20nm，最大的動物痘病毒(Poxviruses)大小達(dá)300-450nm×170-260nm，最長的如絲狀病毒科(Filoviridae)病毒粒子大小為80nm×790-14000nm，多數(shù)單個病毒粒子的直徑在100nm左右，艾滋病毒為100-120nm(0.1-0.12μm)。②艾滋病患者血液中存在的相關(guān)成份：多核巨細(xì)胞(HIV感染細(xì)胞表面的gp120與CD4+細(xì)胞結(jié)合而成的大體積的HIV感染細(xì)胞)、gp120細(xì)胞(表面有g(shù)p120但以單個細(xì)胞存在的HIV感染細(xì)胞)、基因整合細(xì)胞(艾滋病感染初期或潛伏期，整合有HIV雙鏈DNA，但細(xì)胞表面沒有g(shù)p120的HIV感染細(xì)胞)、正常白細(xì)胞(未感染HIV的單個細(xì)胞存在的粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞)、紅細(xì)胞、血小板、化學(xué)成份(蛋白質(zhì)、糖類、脂類、電解質(zhì)等)、游離的HIV、細(xì)菌及其他微生物。③多核巨細(xì)胞為天然的大體積細(xì)胞；gp120細(xì)胞和基因整合細(xì)胞可通過抗原和抗體的免疫反應(yīng)使細(xì)胞凝集為大體積多細(xì)胞聚合體；游離的HIV可通過載體顆粒/免疫反應(yīng)轉(zhuǎn)變?yōu)榇篌w積成份。④根據(jù)上述3點，可以制備能通過單個細(xì)胞但不能通過大體積細(xì)胞或顆粒的血液分離器。⑤選用具有選擇性吸附功能的材料，經(jīng)本發(fā)明的體外血液循環(huán)支路篩除血液中的HIV感染細(xì)胞。

2、血液分離器的材料與要求：同本發(fā)明的血液凈化器，選用聚醋無紡布、醋酸纖維、脫脂棉等，要求生物相容性好，幾乎不激活補(bǔ)體、不引起炎癥反應(yīng)和白細(xì)胞、血小板、血氧分壓、C3a、C5a的改變。

3、血液分離器的型號與規(guī)格：血液分離器的外形制備成柱形結(jié)構(gòu)(以醋酸纖維或脫脂棉等材料作濾芯)、扁平結(jié)構(gòu)(以聚醋無紡布等材料作濾芯)等形狀；孔徑制備成150～250μm、50～150μm、15～40μm、8～15μm、5～8μm、3～5μm、1～2μm等型號。

4、血液分離器的應(yīng)用原則：根據(jù)艾滋病患者的病情選用不同型號的分離器，原則上先選用大孔徑型號做預(yù)篩濾，然后選用較小孔徑的型號。重度艾滋病患者常發(fā)生嚴(yán)重的機(jī)會性感染，血液中含有不同大小的成份。如含有特大體積的真菌、螺旋菌、腫瘤細(xì)胞及其他異物，則選用孔徑為150～250μm或50～150μm的分離器；如為篩濾HIV感染的單核巨噬細(xì)胞、多核巨細(xì)胞、多細(xì)胞聚合體及吸附有HIV的顆粒性物質(zhì)，以及為了置換易受HIV感染的CD4+細(xì)胞，則選用15～40μm、8～15μm、5～8μm、3～5μm之類的型號。這幾種型號近似或小于血液中單個紅細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、小淋巴細(xì)胞的體積，但紅細(xì)胞、中性粒細(xì)胞及巨噬細(xì)胞具有變形運(yùn)動的特性，能通過比自身體積更小的微孔。

(二)血漿分離器的制備

(1)制備原理：根據(jù)血細(xì)胞和血漿成份的分子大小制備。如人體血液中有形成份(血細(xì)胞)的大小為：正常紅細(xì)胞大約為7微米(μm)，是雙凹圓盤狀的細(xì)胞；白細(xì)胞分為5種，中性粒細(xì)胞約12μm，嗜酸性粒細(xì)胞略大些，嗜堿性粒細(xì)胞與中性粒細(xì)胞接近，小淋巴細(xì)胞6-8μm，與紅細(xì)胞近似，單核細(xì)胞最大，約15-20μm。血小板為圓盤形，直徑1～4微米到7～8微米不等，人的血小板平均直徑為2-4微米，厚0.5～1.5微米。

(2)材料：可選用聚醋無紡布、醋酸纖維、脫脂棉等，要求生物相容性好，幾乎不激活補(bǔ)體、不引起炎癥反應(yīng)、不引起白細(xì)胞、血小板、血氧分壓、補(bǔ)體C3a、C5a的改變?？赏ㄟ^共價、接枝、聚合等方法改進(jìn)材料的結(jié)構(gòu)、調(diào)節(jié)表面的微觀不均勻性、親水性、減少對凝血及氧化應(yīng)激的影響、從而提高篩濾充分性和生物相容性、減少并發(fā)癥的發(fā)生。

(3)型號與規(guī)格：就分離器的外形來說，可以醋酸纖維或脫脂棉等材料作濾芯制備成柱形結(jié)構(gòu)、以聚醋無紡布等材料作濾芯制備成扁平結(jié)構(gòu)等形狀；按待分離的血細(xì)胞和血漿成份的分子大小確定孔徑。本發(fā)明所涉及的血漿分離器用性質(zhì)穩(wěn)定、生物相容性好、通透性高的高分子聚合物制成空心纖維型濾器，空心纖維膜直徑為270～370μm，膜厚度為50μm，孔徑為0.2～0.6μm，纖維長度為13.5～26μm。該孔僅準(zhǔn)許血漿濾過，但能阻擋所有的細(xì)胞成分。

四、艾滋病免疫凈化儀的構(gòu)件

1、關(guān)鍵構(gòu)件：(1)血液分離器：用于按體積大小篩除以多核巨細(xì)胞或多細(xì)胞聚合體狀態(tài)存在的HIV感染細(xì)胞，即用于清除血細(xì)胞內(nèi)的HIV；(2)血漿分離器：用于分離單個血細(xì)胞和血漿；(3)血液凈化器：用于吸附血漿中的HIV。

2、附加構(gòu)件：包括血泵、肝素泵、動靜脈壓和空氣監(jiān)測、溫度控制系統(tǒng)、除氣系統(tǒng)、電導(dǎo)率監(jiān)測系統(tǒng)、超濾監(jiān)測和漏血監(jiān)測等部分組成。(1)血泵(Blood Pump)：用來推動血液循環(huán)以維持血液凈化治療的順利進(jìn)行，通常血泵部分往往具有轉(zhuǎn)速檢測功能，以監(jiān)測病人的血流情況，因此血泵轉(zhuǎn)輪與凹槽間距設(shè)定要精確，并需要經(jīng)常調(diào)整，根據(jù)血路泵管的情況，一般將間距設(shè)定為3.2～3.3mm，不可太松，否則會造成血流檢測不準(zhǔn)；也不可太緊，否則會造成管路破裂。(2)肝素泵(Heparin Pump)：肝素泵相當(dāng)于臨床上應(yīng)用的微量注射泵，用以持續(xù)向篩濾管道(病人血液)中注射肝素，由于病人的血液在體外循環(huán)與空氣接觸，容易發(fā)生凝血現(xiàn)象，使用肝素泵可以防止凝血的發(fā)生。(3)動靜脈壓監(jiān)測：動脈壓監(jiān)測主要用以動態(tài)監(jiān)測血液分離器微孔的堵塞情況，另外用以監(jiān)測體外循環(huán)血栓、凝固和壓力的變化。當(dāng)血流不足時，動脈壓就會降低；當(dāng)有凝血、血栓形成，特別是分離器微孔堵塞時，動脈壓就會升高；靜脈壓監(jiān)測用來監(jiān)測管路血液回流的壓力，當(dāng)分離器微孔堵塞、凝血、血栓形成、血流不足以及靜脈血回流針頭脫落時，靜脈壓就會下降，如果血路回流管扭曲堵塞或回流針頭發(fā)生堵塞時，靜脈壓就會升高。(4)空氣監(jiān)測(Air Detector)：用來監(jiān)測血液流路的空氣氣泡，一般用超聲波探測的原理，為了避免病人發(fā)生空氣栓塞而設(shè)置。當(dāng)監(jiān)測到有空氣氣泡時，檢測系統(tǒng)會驅(qū)動動、靜脈血路夾來阻斷血流，防止危險的發(fā)生。

總之，在本發(fā)明關(guān)鍵構(gòu)件和附加構(gòu)件的基礎(chǔ)上，引入計算機(jī)調(diào)控而制成操作的人性化、治療的個性化、設(shè)計的安全性，以及模塊化、自動監(jiān)測及調(diào)控、液晶顯示、自行判斷警報原因及解除信號等微電腦處理的血液凈化治療儀。

五、艾滋病免疫凈化儀的連接通路與使用方法

1、安裝：如圖1，以無菌操作連接各部件，包括血液分離器、血漿分離器、血液凈化器及各循環(huán)管路。

2、排氣：以無菌生理鹽水充液分離器、凈化器及各循環(huán)管路，排除分離器、凈化器及其循環(huán)管路內(nèi)的氣體、氣泡，仔細(xì)檢查，確認(rèn)無氣體、氣泡后使用。

3、通液：將動脈血路管(1)接通艾滋病患者的動脈血管，在操作中再次仔細(xì)檢查排氣是否完全，液流是否通暢，并避免管內(nèi)流液污染。

4、抗凝：從肝素泵(2)向液流中注射抗凝劑(肝素)，初次為2500∪或20～30∪/kg。

5、啟動：將動脈血路管(1)的一端與動脈血管相連通，將靜脈管路(15)接通靜脈血管，然后打開血液泵(2)，血流量為100～150ml/min，如圖1，當(dāng)動脈血液經(jīng)動脈血路管(1)、肝素和血液泵(2)進(jìn)入血液分離器(3)時，因HIV感染而形成的大體積多核巨細(xì)胞被阻留在血液分離器(3)內(nèi)，單個血細(xì)胞和血漿依次經(jīng)血液出口(4)、血液泵(6)和循環(huán)管路(7)流入血漿分離器(8)，分離的血漿依次經(jīng)血漿泵(9)和血路管(10)流入此時開放的凈化器(11)，待充滿血漿、約10分鐘，開始放出血漿，經(jīng)出口管路(13)流出，同步向凈化器(12)灌注血漿，在凈化器(11)內(nèi)的血漿將近流完時，再次開始灌注血漿，此時凈化器(12)開始放出血漿，兩個并聯(lián)的凈化器(11)和(12)交替進(jìn)行。如表示圖1中的血液分離器(3)的內(nèi)部結(jié)構(gòu)的圖2，血液分離器(1)的內(nèi)腔(2)的管壁上有很多微孔(3)，多核巨細(xì)胞(4)不能濾過微孔(3)而被阻留在內(nèi)腔(2)，從而可被清除，能通過微孔(3)的中、小體積的單個血細(xì)胞(5)及血漿進(jìn)入外腔(6)，然后經(jīng)出口(7)流出，進(jìn)而經(jīng)圖1所示的血漿分離器(8)分離出血細(xì)胞和血漿。如表示圖1中的血漿分離器(8)的內(nèi)部結(jié)構(gòu)的圖3，血漿分離器(1)的內(nèi)腔(2)的管壁上有很多微孔(3)，不能通過微孔(3)的單個血細(xì)胞(4)經(jīng)具有可開關(guān)閥門的血細(xì)胞出口(8)流出，進(jìn)入圖1所示的血細(xì)胞出口管路(14)；能通過微孔(3)的血漿及其化學(xué)成分(5)進(jìn)入血漿分離器外腔(6)，然后經(jīng)血漿流出口(7)、圖1所示的血漿泵(9)和血路管(10)進(jìn)入凈化器。如表示圖1中凈化器(11)和(12)內(nèi)部結(jié)構(gòu)的圖4，當(dāng)含有HIV(2)的血漿進(jìn)入凈化器時，其中的HIV(2)被固定在瓊脂凝膠(6)中的HIV抗體(3)結(jié)合成抗原抗體復(fù)合物(4)，被結(jié)合后的HIV不再往下移動，另外未被結(jié)合的較大體積的HIV又被因濃度更高而微孔更小的下層瓊脂凝膠分子篩阻擋在(5)處。被吸附HIV后的凈化血漿經(jīng)圖1所示的出口管路(13)與血漿分離器(8)分離的單個細(xì)胞在出口管路(14)匯合后經(jīng)靜脈管路(15)匯流。如此凈化血液、清除HIV，直至事先設(shè)定的血漿循環(huán)量(通常為9L)，治療才宣告結(jié)束。整個治療過程均由電腦控制，并可隨時檢測工作狀態(tài)，使用方便、自動化和安全。

六、艾滋病免疫凈化儀功效的驗證

1、血液分離器濾除HIV感染細(xì)胞功效的驗證

本發(fā)明人按照本發(fā)明的基本方法，做了如下的簡易驗證實驗：取疾控中心和傳染病實驗室生物樣本庫保存的已確診的艾滋病(AIDS)患者的抗凝全血若干份，分別取數(shù)份相同ABO血型的抗凝全血混合成為5例，使血液量足夠大，然后委托浙江省醫(yī)院中心血站按成份輸血的血液成份分離方法，經(jīng)血液成份分離系統(tǒng)分離出白細(xì)胞、紅細(xì)胞、血漿，取白細(xì)胞成份按常規(guī)離心沉淀，吸棄上清液，以適量的生理鹽水懸浮白細(xì)胞沉淀，然后加入合適比例的gp120抗體(上海廣銳生物科技有限公司)，混勻后置37℃反應(yīng)5分鐘，然后以孔徑為20～30um的血液成份分離系統(tǒng)分離出大體積的白細(xì)胞(稱為大白細(xì)胞)，對濾過的白細(xì)胞濾液再進(jìn)一步以孔徑為15～25um的血液成份分離系統(tǒng)分離出中等體積的白細(xì)胞(稱為中白細(xì)胞)，濾液中的白細(xì)胞為小體積的白細(xì)胞(稱為小白細(xì)胞)，分別收集大、中、小白細(xì)胞分離懸液，常規(guī)離心沉淀，吸棄上清液，以定量移液器分別吸取等量的大、中、小白細(xì)胞沉淀，常規(guī)方法(機(jī)械或細(xì)胞裂解液)裂解細(xì)胞(如用同種裂解液，需加量相等)，離心沉淀后取上清液，然后根據(jù)HIV-1p24抗原檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫法，上海啟發(fā)生物科技有限公司)操作，以已知濃度0pg/ml、0.5pg/ml、1pg/ml、2.5pg/ml、5pg/ml、20pg/ml、40pg/ml、80pg/ml的p24抗原作為對照，最低檢測限低于5pg/ml，測定范圍0～400pg/ml，線性范圍0.5pg/ml～80pg/ml，15min內(nèi)450nm測定吸光度(OD)，空白對照校準(zhǔn)品吸光度值不高于0.050，0pg吸光度值不高于0.100，1000pg/ml吸光度不低于1.000，當(dāng)吸光度＞0.12時被認(rèn)為是陽性，檢測結(jié)果(表1)說明，AIDS患者不同體積大小的白細(xì)胞中的HIV-p24含量不同，在大、中、小白細(xì)胞中HIV-p24的平均含量分別為275.0pg/ml、196.0pg/ml、126.4pg/ml，其中大、小白細(xì)胞中HIV-p24平均含量相差148.6pg/ml，減少了54.4％；在大、中、小白細(xì)胞中HIV-P24的總含量分別為1375.0pg/ml、979.9pg/ml、632.1pg/ml，其中大、小白細(xì)胞中HIV-p24總含量相差742.9pg/ml，減少了54.3％，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)檢驗，t＝2.43，p＜0.05。說明AIDS患者體內(nèi)的大體積白細(xì)胞或經(jīng)gp120抗體作用后而形成的大體積白細(xì)胞中含有較高含量的HIV，能通過實施本發(fā)明的技術(shù)方案被分離清除。

表1 AIDS患者外周血大、中、小白細(xì)胞中HIV-p24檢測結(jié)果(p24：pg/ml)

2、血液凈化器(劑)清除HIV功效的驗證

HIV-1gp120抗體、gp41抗體吸附清除HIV功效的驗證：按照本發(fā)明的基本方法，做了如下的簡易驗證實驗：取HIV-1gp120抗體、gp41抗體(上海瑞齊生物科技有限公司)，加入到經(jīng)100℃溶化后保溫在50℃?zhèn)溆玫?.0％瓊脂糖C1-4B中，混合后滴度為1∶300～500，取滅菌的2.5×300mm魏氏血沉管5支，分別吸取1.0％瓊脂糖C1-4B溶液至200mm刻度，冷卻后瓊脂糖成為半固體。另取疾控中心和傳染病實驗室樣本庫保存的5例艾滋病患者的標(biāo)本，去細(xì)胞后的血漿各約10mL，各取9mLAIDS濾前血漿分批次注入血沉管上端空管，待流經(jīng)血沉管下層的含有抗體的1.0％瓊脂糖C1-4B并從血沉管內(nèi)流出后，收集流出液，稱為AIDS濾后血漿。取AIDS濾前血漿和濾后血漿，根據(jù)HIV-1p24抗原檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫法，上海啟發(fā)生物科技有限公司)操作，以已知濃度0pg/ml、0.5pg/ml、1pg/ml、2.5pg/ml、5pg/ml、20pg/ml、40pg/ml、80pg/ml的p24抗原作為對照，最低檢測限低于5pg/ml，測定范圍0～400pg/ml，線性范圍0.5pg/ml～80pg/ml，15min內(nèi)450nm測定吸光度(OD)，空白對照校準(zhǔn)品吸光度值不高于0.050，0pg吸光度值不高于0.100，1000pg/ml吸光度不低于1.000，當(dāng)吸光度＞0.12時被認(rèn)為是陽性，檢測結(jié)果(表1)說明，AIDS血漿濾過簡易凈化裝置后，部分HIV已被相應(yīng)抗體吸附，經(jīng)第1次濾過后，HIV總清除率為20.01％，經(jīng)第2次濾過后，總清除率為27.99％，經(jīng)第3次濾過后，總清除率為37.36％。說明隨著濾過次數(shù)的增加HIV會被不斷地清除，從而達(dá)到治療AIDS目的。

表1 AIDS血漿濾過簡易凈化裝置前后p24檢測結(jié)果(pg/ml)

總之，上述簡易驗證實驗表明，已被HIV感染的外周血白細(xì)胞易融合成大體積的多核巨細(xì)胞或多細(xì)胞聚合體，能被血液分離器分離清除；而血漿中游離的HIV，能被血液凈化劑(HIVgp120抗體、HIVgp41抗體)吸附清除。表明以血液分離器和血液凈化器(劑)為關(guān)鍵部件構(gòu)成的艾滋病免疫凈化儀具有顯著的清除血液細(xì)胞內(nèi)、外HIV病毒的治療功效。