免疫監(jiān)測點阻斷藥物和腫瘤疫苗聯(lián)合的制藥用途的制作方法
本發(fā)明涉及免疫監(jiān)測點阻斷藥物和腫瘤疫苗聯(lián)合在制備用于治療癌癥的藥物中的用途。
背景技術(shù)：
我國每年的新發(fā)癌癥病人約有 250 萬，因癌癥而死亡的人數(shù)約為 140 萬。未來空氣、水質(zhì)污染、環(huán)境破壞可能進一步提高癌癥的發(fā)病率和病死率。目前，結(jié)直腸癌已經(jīng)成為3種最常見的癌癥之一，局限性的結(jié)直腸癌可通過手術(shù)治療，而轉(zhuǎn)移患者只有少部分可以獲得多模式治療。約50%的局限性結(jié)直腸癌患者在手術(shù)治療后出現(xiàn)轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)?；颊叩念A(yù)后依賴于腫瘤分級并受宿主腫瘤相互作用的影響，表現(xiàn)為病灶的T細(xì)胞浸潤。
免疫治療依賴于微環(huán)境中T細(xì)胞的激活，目前研究較多的是免疫監(jiān)測點藥物，包括CTLA-4拮抗型抗體、PD-1拮抗型抗體、TIM-3拮抗型抗體、LAG-3拮抗型抗體、可溶性O(shè)X40L、激活型OX40抗體、激活型GITR抗體、激活型4-1BB抗體、激活型CD40抗體、激活型CD27抗體、拮抗型CD70抗體等。在黑色素瘤、非小細(xì)胞肺癌等多種腫瘤中針對CTLA-4、PD-1的抗體顯示了良好的腫瘤治療效果，并批準(zhǔn)為特定條件下的標(biāo)準(zhǔn)治療方法。
PD-1是T細(xì)胞、B細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞上表達(dá)的抑制性受體，其配體包括PD-L1、PD-L2。PD-L1表達(dá)在免疫細(xì)胞上，更過量表達(dá)在腫瘤細(xì)胞上。PD-L1/PD-1通路和免疫逃逸、T細(xì)胞耗竭相關(guān)，導(dǎo)致T細(xì)胞增殖、細(xì)胞因子產(chǎn)生和細(xì)胞毒性受損。相比淋巴結(jié)的T細(xì)胞，結(jié)直腸癌病灶的浸潤性T細(xì)胞PD-1的表達(dá)上調(diào)，產(chǎn)生細(xì)胞因子和穿孔素的能力降低；腫瘤微環(huán)境中PD-L1的表達(dá)高，提示PD-L1/PD-1軸在產(chǎn)生免疫抑制環(huán)境上起到重要的作用。
但是，臨床試驗未發(fā)現(xiàn)PD-1免疫監(jiān)測點阻斷對錯配修復(fù)穩(wěn)定結(jié)直腸癌患者的療效，卻對錯配修復(fù)缺陷的結(jié)直腸癌患者有療效。PD-1免疫監(jiān)測點阻斷對錯配修復(fù)穩(wěn)定結(jié)直腸癌患者失敗的原因可能如下：1. 該腫瘤的免疫原性差，沒有預(yù)先存在的免疫反應(yīng)，T細(xì)胞不產(chǎn)生顯著效果，所以針對免疫監(jiān)測點的分子也就不起效果，但也有報道T細(xì)胞在原發(fā)性結(jié)直腸癌中起到顯著效果；2. 轉(zhuǎn)移性腫瘤的局部微環(huán)境處于高度免疫抑制狀態(tài)，抑制了活化型T細(xì)胞的流入。特別是通過CCL5/CCR5軸形成T細(xì)胞抑制微環(huán)境，得到CCR5抑制劑Maraviroc臨床試驗的證實。PD-L1單抗（Atezolizumab）加FOLFOX 加VEGF單抗（Avastin）對頑固性的結(jié)直腸癌有高的控制效果。
另外一種免疫治療方法是接種腫瘤疫苗，其原理是利用腫瘤細(xì)胞或腫瘤抗原物質(zhì)誘導(dǎo)機體產(chǎn)生特異性細(xì)胞免疫和體液免疫反應(yīng)，即激活患者自身的免疫系統(tǒng)，來增強機體的抗癌能力，進而阻止腫瘤的生長、擴散和復(fù)發(fā)，最終達(dá)到控制甚至清除腫瘤的目的。
腫瘤不是外來的，而是自體細(xì)胞發(fā)生的，因此機體對它的反應(yīng)不如對細(xì)菌、病毒的反應(yīng)那樣強烈，以致早期癥狀不明顯，發(fā)現(xiàn)的時候腫瘤往往已經(jīng)到了晚期階段，腫瘤細(xì)胞發(fā)生了轉(zhuǎn)移，所有的治療方法也無法達(dá)到治愈的目的。而接種腫瘤疫苗則可以在腫瘤發(fā)生的早期就可以高效、特異地清除腫瘤，而且不良反應(yīng)小。
此外，腫瘤疫苗治療也可與手術(shù)治療、放療及化療相結(jié)合，在綜合治療腫瘤中占有重要地位。一種方法就是將純化或者重組的腫瘤相關(guān)抗原和佐劑一起注射，誘發(fā)體液免疫和細(xì)胞免疫。研究表明，有一種分子MUC1和腫瘤關(guān)系密切，已經(jīng)成為腫瘤免疫治療的靶點。
國外以MUC1的VNTR為基礎(chǔ)的肽結(jié)合或混合多種固有免疫系統(tǒng)的固有刺激物的疫苗進行了I期臨床試驗。佐劑包括 SB-AS2、不完全弗氏佐劑和鑰孔蟲戚血蘭素（KLH）等。兩個非糖基化的 VNTR 劑型已經(jīng)非常成功地進入 III 期臨床試驗。
第一個是 Stimuvax （Merck, NJ, USA），它是一個 25 聚體的 VNTR MUC1肽被脂質(zhì)體包裹聯(lián)合和一個Toll樣受體-4激動劑（脂質(zhì)A），現(xiàn)在正在進行三個III 期臨床試驗：兩個在非小細(xì)胞肺癌（NSCLC），一個在雌激素受體陽性的乳腺癌聯(lián)合激素治療。這些試驗是基于IIB期研究的令人鼓舞的結(jié)果，即證明了處于 IIIB 階段 NSCLC（限于局部的疾病）的一群病人，接受Stimuvax和最高標(biāo)準(zhǔn)護理的中位生存期為30.6 個月，而只接受最高標(biāo)準(zhǔn)護理的病人的中位生存期為13.3個月。最近一千多人的肺癌治療試驗表明癌癥疫苗，總體治療效果并不明顯，可能和入組的是晚期肺癌患者有關(guān)系。通過分組發(fā)現(xiàn)以下規(guī)律：吸煙患者（n=762）的治療效果好于非吸煙的患者，中位數(shù)生存時間從20.6個月延長到32.1個月（p=0.0058）；女性患者（n=269）的中位數(shù)生存時間從20.6個月延長到36.8個月(p=0.0370) ，非腺癌患者（n=496）的中位數(shù)生存時間從19.6個月延長到29.6個月(p=0.0435)；同時合并化療的患者（n=806）中位數(shù)生存時間從20.6個月延長到30.8個月(p=0.0175)的研究顯示，相對于化療后使用疫苗的患者，只有化療和疫苗同時使用的患者受益。
第二個是 MUC1（100 聚體）聯(lián)合被氧化的甘露聚糖，它已經(jīng)被使用很多年，在臨床前、I 期和 II 期試驗和III 期試驗的研究中證明了有效性?？偣?31 名絕經(jīng)后的乳腺癌 II 期病人在 36 周內(nèi)被免疫了甘露聚糖-MUC1 9 次，并且聯(lián)合他莫昔芬。安慰劑組15名病人中有 4名復(fù)發(fā)，而用氧化甘露聚糖-MUC1治療的16 名病人中沒有發(fā)生復(fù)發(fā)（p=0.0292）。13位接受疫苗的患者中9位檢測到MUC1的抗體，10位接受疫苗的患者中4位檢測到MUC1特異性T細(xì)胞反應(yīng)。安慰劑組未出現(xiàn)MUC1特異性免疫反應(yīng)。2012-2015年隨訪III期臨床研究表明：安慰劑組的乳腺癌復(fù)發(fā)率為60%（6/15），使用癌癥疫苗的患者乳腺癌復(fù)發(fā)率為12.5%（2/16），壽命顯著延長，總體使用癌癥疫苗后無癌患者的百分比極顯著增加；病人從未出現(xiàn)疫苗引起的毒性和自身免疫病，疫苗注射保證這些乳腺癌患者7年內(nèi)無癌癥復(fù)發(fā)。
臨床試驗還表明癌癥疫苗對胰腺癌、前列腺癌、卵巢癌和腎細(xì)胞癌患者都是安全有效的。根據(jù)肝癌、結(jié)直腸癌、甲狀腺癌的抗原表達(dá)情況，癌癥疫苗可能適合這部分腫瘤患者的治療。1例不能手術(shù)的復(fù)發(fā)胃癌患者使用抗原誘導(dǎo)DC細(xì)胞局部治療，30個月內(nèi)未出現(xiàn)復(fù)發(fā)。對15位多發(fā)性骨髓瘤患者的I/II期臨床試驗研究表明，應(yīng)用癌癥疫苗的大部分患者病情穩(wěn)定（至少17.5~41.3個月），出現(xiàn)T細(xì)胞和B細(xì)胞的特異性免疫。I期臨床試驗研究表明，肝臟轉(zhuǎn)移結(jié)直腸癌患者經(jīng)肝轉(zhuǎn)移手術(shù)切除后使用表達(dá)GM-CSF的異種癌細(xì)胞疫苗，同時靜脈低劑量給予環(huán)磷酰胺，患者產(chǎn)生抗MUC1的抗體，9位患者中6位存活時間超過3年，4位再無復(fù)發(fā)。II期臨床研究發(fā)現(xiàn)，74位患者使用DC細(xì)胞治療和疫苗治療，結(jié)直腸癌患者的2年無復(fù)發(fā)生存率相近（分別為47%和55%），都好于非免疫組。39位晚期結(jié)腸腺瘤（結(jié)腸癌前病變）接種癌癥疫苗后，17位產(chǎn)生抗MUC1的抗體和長期免疫記憶，而剩余未產(chǎn)生抗體的22位患者是因為接種疫苗前血液中的髓系抑制細(xì)胞數(shù)量較多有關(guān)。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
針對目前在治療結(jié)直腸癌方面存在的上述問題，本發(fā)明提供了免疫監(jiān)測點阻斷藥物和腫瘤疫苗聯(lián)合在制備用于治療癌癥的藥物中的用途，達(dá)到單一治療方法都無法達(dá)到的治療效果，有效延長患者生存時間。
作為其中一個優(yōu)選的方案，上述應(yīng)用中，所述癌癥為結(jié)直腸癌。結(jié)直腸癌包括結(jié)腸癌和直腸癌，結(jié)腸癌和直腸癌僅僅是患病部位不同，病灶癌細(xì)胞種類是一樣的。免疫監(jiān)測點阻斷藥物和腫瘤疫苗聯(lián)合制備的藥物對于結(jié)直腸癌的治療特別有效。
作為其中一個優(yōu)選的方案，上述應(yīng)用中，所述免疫監(jiān)測點包括CTLA-4、PD-1、TIM-3和LAG-3中的至少一種。
作為其中一個優(yōu)選的方案，上述應(yīng)用中，所述免疫監(jiān)測點阻斷藥物為PD-1拮抗型抗體。
作為其中一個優(yōu)選的方案，上述應(yīng)用中，所述腫瘤疫苗為以MUC1蛋白為靶點的肺癌疫苗。
更優(yōu)選地，上述應(yīng)用中，所述肺癌疫苗是由以下任意一種蛋白質(zhì)作為抗原制備而成的：
（1）氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；
（2）在SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的基礎(chǔ)上經(jīng)過取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸且具有相同功能的衍生蛋白質(zhì)；
（3）氨基酸序列中含有SEQ ID NO.2所示的必需序列；
（4）與SEQ ID NO.2所示的必需序列有30%及以上同源性的氨基酸序列。
更優(yōu)選地，上述應(yīng)用中，所述肺癌疫苗的制備方法為：擴增作為抗原的蛋白質(zhì)的編碼基因，連接到表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，經(jīng)過IPTG誘導(dǎo)表達(dá)的產(chǎn)物進行純化后獲得的抗原蛋白，加入氫氧化鋁佐劑混合即可。
更優(yōu)選地，上述應(yīng)用中，所述表達(dá)載體為pMAL-p5X質(zhì)粒，所述純化包括經(jīng)內(nèi)壓式濾膜過濾除菌，濾液再經(jīng)外壓式濾膜濃縮；濃縮液經(jīng)過10K濾膜透析2次至Tris緩沖液，離心后上Amylose親和樹脂純化得到疫苗主要組分蛋白質(zhì)，經(jīng)內(nèi)毒素去除達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)<0.5EU/μg。pMAL-p5X質(zhì)粒是商品化的大腸桿菌表達(dá)載體，用于表達(dá)本發(fā)明的抗原蛋白具有較顯著的高效率。
作為其中一個優(yōu)選的方案，上述應(yīng)用中，所述免疫監(jiān)測點阻斷藥物采用靜脈輸液給藥，靜脈給藥有利于免疫監(jiān)測點阻斷藥物快速進入循環(huán)系統(tǒng)，直達(dá)癌癥部位；腫瘤疫苗采用肌肉注射的方式給藥，肌肉給藥利于藥物的緩慢釋放，在較長時間內(nèi)刺激免疫系統(tǒng)，產(chǎn)生靶向腫瘤的免疫細(xì)胞。
作為其中一個優(yōu)選的方案，上述應(yīng)用中，所述免疫監(jiān)測點阻斷藥物和腫瘤疫苗分別單獨給藥，聯(lián)合藥物的劑量和藥物單獨使用時劑量相同。腫瘤疫苗不增加免疫監(jiān)測點阻斷藥物的副作用，腫瘤疫苗本身無副作用。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：
本發(fā)明通過將免疫監(jiān)測點阻斷藥物和腫瘤疫苗聯(lián)合制備成新的藥物，實現(xiàn)兩種免疫療法聯(lián)合對結(jié)直腸癌的治療，達(dá)到單藥治療都不能達(dá)到的優(yōu)異治療效果，顯著限制了腫瘤的生長，延長了患者的生存時間。
附圖說明
圖1為實施例1中DH5α-pMAL-p5X-MNR表達(dá)的蛋白質(zhì)電泳圖；
圖2為實施例2中各實驗組結(jié)腸癌生長情況檢測結(jié)果；
圖3為實施例2中各實驗組結(jié)腸癌小鼠壽命的檢測結(jié)果。
具體實施方式
為了使本技術(shù)領(lǐng)域的人員更好地理解本發(fā)明方案，下面結(jié)合附圖和具體實施方式對本發(fā)明作進一步的詳細(xì)說明。實施例中用到的生物材料如無特殊說明，均來自于市售商品。
實施例1 以MUCI蛋白為靶點的肺癌疫苗的制備
抗原蛋白的合成
根據(jù)SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，使用Gene Designer軟件對其編碼基因進行密碼子優(yōu)化，并在基因上游引入NdeI內(nèi)切酶位點，下游引入NcoI內(nèi)切酶位點，合成基因克隆入pUC57載體，氨芐抗性?；蚝铣珊笥?i>NdeI和NcoI內(nèi)切酶雙酶切，連接入經(jīng)過同樣酶切的pMAL-p5X質(zhì)粒，并用DNA連接酶連接，轉(zhuǎn)化到感受態(tài)DH5α細(xì)菌，用含有氨芐（AMP）的瓊脂培養(yǎng)板上篩選，挑選單克隆用LB-AMP培養(yǎng)基培養(yǎng)，提取質(zhì)粒酶切鑒定，然后進行測序鑒定。將含有編碼基因的pMAL-p5X質(zhì)粒（為方便描述，將該質(zhì)粒命名為pMAL-p5X-MNR）的DH5α細(xì)菌用LB-AMP培養(yǎng)，待OD600nm達(dá)到0.5加入終濃度為1mM的IPTG，誘導(dǎo)表達(dá)12h。同樣誘導(dǎo)表達(dá)帶有pMAL-p5X的DH5α細(xì)菌做為對照。取誘導(dǎo)前后的菌液進行蛋白質(zhì)電泳，考馬斯亮藍(lán)R250染色。DH5α-pMAL-p5X-MNR表達(dá)出約65KD的蛋白質(zhì)（如圖1右指箭頭所示），而對照細(xì)菌DH5α-pMAL-p5X表達(dá)出約48KD的蛋白質(zhì)（如圖1左指箭頭所示）。
采用上述相同的方法，擴增表達(dá)出SEQ ID NO.2~4所示的蛋白質(zhì)。
肺癌疫苗MNRVax的制備
肺癌疫苗的制備以DH5α-pMAL-p5X-MNR表達(dá)的抗原蛋白質(zhì)為例進行詳細(xì)說明。
先培養(yǎng)含pMAL-p5X-MNR質(zhì)粒的DH5α菌株，待OD600nm達(dá)到0.5加入終濃度為1mM的IPTG，誘導(dǎo)表達(dá)12h。離心收集培養(yǎng)基。經(jīng)內(nèi)壓式濾膜過濾除菌，濾液再經(jīng)外壓式濾膜濃縮。濃縮液經(jīng)過10K濾膜透析2次至Tris緩沖液，離心后上Amylose親和樹脂純化得到疫苗主要組分蛋白質(zhì)，經(jīng)內(nèi)毒素去除達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)<0.5EU/μg。制備無菌氫氧化鋁佐劑，0.22μm濾膜過濾后4℃保存?zhèn)溆?。?.5ml氫氧化鋁佐劑加入0.5mg （0.5ml）疫苗蛋白質(zhì)，混合均勻即成為肺癌疫苗，命名為MNRVax1。
采用上述相同的方法，以SEQ ID NO.2~4所示的蛋白質(zhì)為抗原制備肺癌疫苗，順序命名為MNRVax2~4。
組合免疫治療動物實驗
取36只6-8周齡雌性C57BL/6J小鼠，腋下注射MC38結(jié)腸癌細(xì)胞1×106個/100μl，待腫瘤長至可觸摸檢測到后分成以下六組，每組6只。每周聯(lián)合給藥2次，共6次。
分組情況：
雙鹽水對照組：腹腔和肌肉分別注射生理鹽水100μl；
肌肉對照組：肌肉注射生理鹽水100μl；
腹腔對照：腹腔注射生理鹽水100μl；
肌肉MNRVax1組：肌肉注射MNRVax1疫苗100μl，內(nèi)含50 μg蛋白質(zhì)；
腹腔PD-1抗體組：腹腔注射PD-1抗體，注射100μl，含抗體150μg；
MNRVax1+PD-1抗體組：肌肉注射MNRVax1疫苗（注射100μl，含50 μg蛋白質(zhì)）加腹腔注射PD-1抗體（注射100μl，含150μg）。
每周測量腫瘤大小3次，連續(xù)測量4周，按照長×寬2/2計算腫瘤體積，并觀察肌肉對照組、肌肉MNRVax1組、腹腔PD-1抗體組、MNRVax1+PD-1抗體組小鼠的生存率。
結(jié)果給藥后第4天，MNRVax1+PD-1抗體組（以下稱聯(lián)合治療組）的腫瘤大小為0.308±0.056cm3，顯著低于抗體組(0.575±0.208 cm3)、疫苗組(0.575±0.154 cm3)和雙鹽水對照組(0.561±0.206 cm3)。
聯(lián)合治療后的第8天，聯(lián)合治療組的腫瘤大小為0.302±0.101 cm3，極顯著低于抗體組的腫瘤大小0.516±0.199 cm3，疫苗組的0.832±0.301 cm3，雙鹽水對照組的0.983±0.512 cm3。即抗體治療降低了47.5%的腫瘤負(fù)載，而聯(lián)合治療降低了69.3%的腫瘤負(fù)載?？贵w治療組的腫瘤大小低于腹腔生理鹽水對照組（0.996±0.155 cm3，p<0.01）,表明聯(lián)合治療比單獨的抗體治療好，對腫瘤的抑制作用起效早。聯(lián)合治療組響應(yīng)率為100%，抗體治療組響應(yīng)率為67%。
聯(lián)合治療后的13天，腫瘤從第4天的0.308±0.056cm3縮小為0.224±0.154cm3，而抗體治療組0.575±0.208 cm3從增加到0.890±0.419 cm3。即抗體治療降低了29.9%的腫瘤負(fù)載，而聯(lián)合治療降低了82.3%的腫瘤負(fù)載。聯(lián)合治療組響應(yīng)率為100%，抗體治療組響應(yīng)率為50%。
一直到治療25天的腫瘤生長曲線見圖2。從生存曲線上可以看出，聯(lián)合免疫治療好于抗體組和疫苗組，而抗體組和疫苗組又好于對照組，抗體和疫苗可以協(xié)同延長直腸癌動物的生存時間，見圖3?？傊?，對結(jié)直腸癌的治療效果，疫苗加抗體的聯(lián)合治療不但起效時間早，而且，持續(xù)時間長。這種治療方法不但可以抑制腫瘤的生長，還可以延長動物的生存時間。
MNRVax2、MNRVax3和MNRVax4與PD-1抗體聯(lián)合的實驗效果與MNRVax1差別不大，均優(yōu)于單獨使用疫苗或單獨使用PD-1抗體，具體過程在此不一一贅述。
結(jié)直腸癌患者用途
PD-1抗體用量約3mg/Kg體重，靜脈注射給藥，每周給藥一次；癌癥疫苗用量約7 μg/Kg體重，上臂肌肉注射給藥，每周給藥一次。持續(xù)使用1-12個月，效果優(yōu)于單獨使用疫苗或單獨使用PD-1抗體。
肺癌患者用途
PD-1抗體用量約3mg/Kg體重，靜脈注射給藥，每周給藥一次；癌癥疫苗用量約7 μg/Kg體重，上臂肌肉注射給藥，每周給藥一次。持續(xù)使用1-12個月，效果優(yōu)于單獨使用疫苗或單獨使用PD-1抗體。
以上實施例的說明只是用于幫助理解本發(fā)明的核心思想。應(yīng)當(dāng)指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以對本發(fā)明進行若干改進和修飾，這些改進和修飾也落入本發(fā)明權(quán)利要求的保護范圍內(nèi)。
SEQUENCE LISTING
<110> 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院
<120> 免疫監(jiān)測點阻斷藥物和腫瘤疫苗聯(lián)合的制藥用途
<130> P20160107
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 573
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Met Lys Ile Lys Thr Gly Ala Arg Ile Leu Ala Leu Ser Ala Leu Thr
1 5 10 15
Thr Met Met Phe Ser Ala Ser Ala Leu Ala Lys Ile Glu Glu Gly Lys
20 25 30
Leu Val Ile Trp Ile Asn Gly Asp Lys Gly Tyr Asn Gly Leu Ala Glu
35 40 45
Val Gly Lys Lys Phe Glu Lys Asp Thr Gly Ile Lys Val Thr Val Glu
50 55 60
His Pro Asp Lys Leu Glu Glu Lys Phe Pro Gln Val Ala Ala Thr Gly
65 70 75 80
Asp Gly Pro Asp Ile Ile Phe Trp Ala His Asp Arg Phe Gly Gly Tyr
85 90 95
Ala Gln Ser Gly Leu Leu Ala Glu Ile Thr Pro Asp Lys Ala Phe Gln
100 105 110
Asp Lys Leu Tyr Pro Phe Thr Trp Asp Ala Val Arg Tyr Asn Gly Lys
115 120 125
Leu Ile Ala Tyr Pro Ile Ala Val Glu Ala Leu Ser Leu Ile Tyr Asn
130 135 140
Lys Asp Leu Leu Pro Asn Pro Pro Lys Thr Trp Glu Glu Ile Pro Ala
145 150 155 160
Leu Asp Lys Glu Leu Lys Ala Lys Gly Lys Ser Ala Leu Met Phe Asn
165 170 175
Leu Gln Glu Pro Tyr Phe Thr Trp Pro Leu Ile Ala Ala Asp Gly Gly
180 185 190
Tyr Ala Phe Lys Tyr Glu Asn Gly Lys Tyr Asp Ile Lys Asp Val Gly
195 200 205
Val Asp Asn Ala Gly Ala Lys Ala Gly Leu Thr Phe Leu Val Asp Leu
210 215 220
Ile Lys Asn Lys His Met Asn Ala Asp Thr Asp Tyr Ser Ile Ala Glu
225 230 235 240
Ala Ala Phe Asn Lys Gly Glu Thr Ala Met Thr Ile Asn Gly Pro Trp
245 250 255
Ala Trp Ser Asn Ile Asp Thr Ser Lys Val Asn Tyr Gly Val Thr Val
260 265 270
Leu Pro Thr Phe Lys Gly Gln Pro Ser Lys Pro Phe Val Gly Val Leu
275 280 285
Ser Ala Gly Ile Asn Ala Ala Ser Pro Asn Lys Glu Leu Ala Lys Glu
290 295 300
Phe Leu Glu Asn Tyr Leu Leu Thr Asp Glu Gly Leu Glu Ala Val Asn
305 310 315 320
Lys Asp Lys Pro Leu Gly Ala Val Ala Leu Lys Ser Tyr Glu Glu Glu
325 330 335
Leu Val Lys Asp Pro Arg Ile Ala Ala Thr Met Glu Asn Ala Gln Lys
340 345 350
Gly Glu Ile Met Pro Asn Ile Pro Gln Met Ser Ala Phe Trp Tyr Ala
355 360 365
Val Arg Thr Ala Val Ile Asn Ala Ala Ser Gly Arg Gln Thr Val Asp
370 375 380
Glu Ala Leu Lys Asp Ala Gln Thr Asn Ser Ser Ser Asn Asn Asn Asn
385 390 395 400
Asn Asn Asn Asn Asn Asn Leu Gly Ile Glu Gly Arg Ile Ser His Met
405 410 415
Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala
420 425 430
Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro
435 440 445
Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr
450 455 460
Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser
465 470 475 480
Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His
485 490 495
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