本發(fā)明涉及組織工程學醫(yī)用生物材料技術領域，具體地涉及一種同時處理多種生物組織的方法。

背景技術：

隨著社會老齡化現(xiàn)象越來越嚴重，癌癥發(fā)生率也隨之增加。各類實體瘤切除后，常常造成腫瘤組織周圍軟組織的缺損或薄弱，如乳腺癌切除后，造成胸壁軟組織薄弱，再行乳房重建術時，常易引發(fā)假體移位、突出等并發(fā)癥。

針對上述問題，采用同種異體脫細胞真皮基質及異種脫細胞基質進行腫瘤切除后軟組織修復效果較佳，國內(nèi)外臨床應用已有二十余年歷史。該類脫細胞基質產(chǎn)品也可用于其他原因造成的各類軟組織薄弱處的增強或修復，如各類疝修復、肌腱加強、肩袖修復、腸胃吻合口加固等等。

目前有較多制備脫細胞基質的專利技術報道，但由于方法均采用強酸、強堿、蛋白酶或表面活性劑等對組織破壞較大的試劑，無法同批次相同工藝參數(shù)同時處理多種不同組織結構、不同厚度、不同成分及來源的生物組織，否則各種生物組織無法同時實現(xiàn)較好的脫細胞效果或較好的降解性能。例如較厚、組織結構較致密的豬真皮與較薄、組織結構較松散的豬小腸粘膜下層進行同時處理，往往能夠實現(xiàn)前者完全去除細胞并保證組織不受破壞、降解性能較好的工藝參數(shù)用于后者時，后者亦能完全去除細胞，但組織破壞則較大，降解性能無法保證；而能夠實現(xiàn)后者完全去除細胞并保證組織不受破壞、降解性能較好的工藝參數(shù)用于前者時，前者無法實現(xiàn)細胞完全去除，不能滿足產(chǎn)品安全性相關要求。除此之外，目前的專利技術報道也有下述缺陷：

(1)采用酶及TritonX-100作為脫細胞試劑，試劑殘留較難清洗，對膠原纖維破壞較大；

(2)采用苯扎溴銨溶液消毒，NaCl或EDTA高滲溶液及去垢劑Tween、SDS或Triton脫細胞，最后采用磷酸鹽緩沖液洗滌后環(huán)氧乙烷滅菌，該方法采用的消毒液毒性較大，采用的脫細胞試劑較難清洗，對膠原纖維破壞亦較大；

(3)采用工藝中也使用到過氧乙酸強酸、去垢劑、胰酶等對材料破壞較大的試劑，材料完整性被破壞。

(4)采用工藝中使用毒性較大的化學交聯(lián)劑，如戊二醛、環(huán)氧化物等，交聯(lián)劑殘留易降低材料生物相容性，部分交聯(lián)劑處理的材料長期植入體內(nèi)易引發(fā)鈣化。

(5)單批次僅能處理單種生物組織，效率較低，產(chǎn)業(yè)化設備利用率低。

為了解決上述問題，本發(fā)明亟需開發(fā)一種同時處理多種生物組織的方法。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種同時處理多種生物組織的方法。

本發(fā)明的第一方面，提供一種同時處理多種生物組織的方法，包括以下步驟：

(a)預處理：將生物組織清洗后剝離無用組織，并進行消毒，獲得預處理的目標組織；

(b)脫脂：采用脫氧膽酸鈉或異丙醇浸泡所述預處理的目標組織，獲得脫脂的目標組織；

(c)脫細胞：通過高壓物理方法處理脫脂的目標組織以破碎細胞，再通過DNA酶浸泡及α-Gal酶溶液浸泡去除所有細胞碎片及抗原得到脫細胞的目標組織；

(d)交聯(lián)：采用物理交聯(lián)方法或化學交聯(lián)方法對所述脫細胞的目標組織進行交聯(lián)。

(e)滅菌：采用輻照或環(huán)氧乙烷對經(jīng)步驟(d)交聯(lián)的目標組織進行滅菌。

在另一優(yōu)選例中，所述生物組織指動物源或同種異體組織，包括豬小腸、豬皮、牛皮、牛心包、豬心包、同種異體皮、牛心臟瓣膜、豬心臟瓣膜等任意兩種或兩種以上生物組織。

在另一優(yōu)選例中，所述無用組織為脂肪。

在另一優(yōu)選例中，步驟a)中，所述清洗為采用純化水進行清洗。

在另一優(yōu)選例中，步驟a)中，所述消毒為用75％乙醇或2％過氧化氫室溫下消毒0.5-2h。

在另一優(yōu)選例中，步驟b)中，所述浸泡為將所述預處理的目標組織置于1-3％脫氧膽酸鈉或異丙醇中室溫下浸泡12-48h。

在另一優(yōu)選例中，步驟b)中，浸泡后再用純化水沖洗3-8次，去除脫氧膽酸鈉或異丙醇。

在另一優(yōu)選例中，所述高壓物理方法是指將所述脫脂的目標組織置于超高壓設備中，在1-10MPa、4-40℃條件下處理1-60min。

在另一優(yōu)選例中，所述DNA酶浸泡為室溫下采用1-50U/mL的DNA酶溶液振蕩浸泡4-24h。

在另一優(yōu)選例中，所述α-Gal酶溶液浸泡為室溫下采用1-50U/L的α-Gal酶溶液振蕩浸泡4-24h。

在另一優(yōu)選例中，所述振蕩浸泡的振蕩頻率為80-150rpm。

在另一優(yōu)選例中，所述振蕩浸泡后用純化水清洗5-10次。

在另一優(yōu)選例中，所述物理交聯(lián)方法是指將所述脫細胞的目標組織進行冷凍干燥，使其含水率低于10％，再置于真空干燥箱中，在80-130℃條件下，真空熱處理24-120h，然后包裝送滅菌。

在另一優(yōu)選例中，所述化學交聯(lián)方法為將所述脫細胞的目標組織浸泡于0.01-0.5mol/L的EDC溶液中，在室溫下交聯(lián)12-48h，再用純化水清洗3-8次，最后包裝送滅菌。

在另一優(yōu)選例中，所述輻照采用的輻照源為伽馬射線或電子束，滅菌劑量為15-30kGy。

在另一優(yōu)選例中，采用環(huán)氧乙烷滅菌的參數(shù)為35-55℃下，滅菌4-20h，環(huán)氧乙烷濃度500-900mg/L。

本發(fā)明所提出的同時處理多種生物組織的方法，可同時處理多種生物組織，批處理生物組織量大，處理程度均一，工藝簡單，易于產(chǎn)業(yè)化，實現(xiàn)高效生產(chǎn)。

本發(fā)明所提出的同時處理多種生物組織的方法，完全避免使用強酸、強堿和蛋白酶，可保留多種生物組織細胞外基質的天然三維膠原支架纖維結構，去除組織中引起免疫原性的細胞成分。采用本方法制備的生物組織，具有良好的生物相容性及機械性能，且相比天然生物組織，具有較高抗降解能力，可用于各類軟組織損傷修復。

應理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術特征和在下文(如實施例)中具體描述的各技術特征之間都可以互相組合，從而構成新的或優(yōu)選的技術方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附圖說明

圖1為同批次處理的多種生物組織的HE染色圖片，其中A為脫細胞豬真皮基質，B為脫細胞豬小腸粘膜下層基質，C為脫細胞牛心包膜。

圖2為同批次處理的脫細胞豬真皮基質，脫細胞豬小腸粘膜下層基質及脫細胞牛心包膜在熱處理前后的降解性能對比圖片。

圖3為同批次處理的脫細胞豬真皮基質、脫細胞牛心包膜、脫細胞豬小腸粘膜下層基質與同類產(chǎn)品降解性能對比圖片。

圖4為同批次處理的脫細胞豬心包，脫細胞牛真皮基質、脫細胞豬心臟瓣膜的細胞毒性檢測結果圖片。

具體實施方式

本發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究，首次開發(fā)了一種同時處理多種生物組織的方法。所述方法包括步驟：預處理、脫脂、物理方法脫細胞、交聯(lián)、輻照滅菌。本發(fā)明所提出的同時處理多種生物組織的方法，可同時處理多種生物組織，批處理生物組織量大，工藝處理程度均一，工藝簡單，易于產(chǎn)業(yè)化，實現(xiàn)高效生產(chǎn)，避免產(chǎn)業(yè)化設備投料少、相對能耗大的問題。

處理方法

本發(fā)明的同時處理多種生物組織的方法，包括步驟：預處理、脫脂、物理方法脫細胞、交聯(lián)、滅菌。

步驟一、預處理

將各類生物組織采用純化水清洗，剝離無用組織如脂肪，并用75％乙醇或2％過氧化氫室溫下消毒0.5-2h。各類生物組織指動物源或同種異體組織，包括豬小腸、豬皮、牛皮、牛心包、豬心包、同種異體皮、牛心臟瓣膜、豬心臟瓣膜等任意兩種或兩種以上生物組織。

本步驟通過清洗，物理剝離無用組織，并進行消毒，獲得預處理目標組織以便后續(xù)處理。

步驟二、脫脂

將完成步驟一預處理的各類組織置于1-3％脫氧膽酸鈉或異丙醇中室溫下浸泡12-48h，浸泡后再用純化水沖洗3-8次，去除脫氧膽酸鈉或異丙醇。

本步驟通過脫氧膽酸鈉或異丙醇浸泡，獲得脫脂的目標組織。

由于本步驟去脂工藝對材料結構及完整性無破壞，所以對于厚薄不同，結構不同的多種組織同時處理，以最難去脂的組織為標準來選擇浸泡時間。

步驟三、物理方法脫細胞

將完成步驟二脫脂的各類組織，置于超高壓設備中，在1-10MPa、4-40℃條件下處理1-60min，再用1-50U/mL DNA酶溶液室溫下振蕩浸泡4-24h，1-50U/Lα-Gal酶溶液室溫下振蕩浸泡4-24h，振蕩頻率為80-150rpm，最后用純化水清洗5-10次。

本步驟通過高壓物理方法處理，可實現(xiàn)厚薄不同、結構不同的各種組織內(nèi)部細胞同時破碎，不受組織來源影響；再通過DNA酶及α-Gal酶溶液浸泡即可去除所有細胞碎片及抗原。各種組織處理程度均一可控。本步驟采用的DNA酶及α-Gal酶均為非蛋白酶，對生物組織結構及完整性無破壞。

步驟四、交聯(lián)

可采用物理交聯(lián)方法，如熱處理：將完成步驟三脫細胞的各類組織同批次冷凍干燥，使其含水率低于10％，再置于真空干燥箱中，在80-130℃條件下，真空熱處理24-120h，然后包裝送滅菌。

也可采用化學交聯(lián)方法，如EDC(碳二亞胺)進行處理：將完成步驟三脫細胞的各類組織同批次浸泡于0.01-0.5mol/L的EDC溶液中，在室溫下交聯(lián)12-48h，再用純化水清洗3-8次，最后包裝送滅菌。

本步驟通過真空高溫物理方法處理或采用無殘留、生物相容性較高的催化劑EDC溶液浸泡處理，可實現(xiàn)厚薄不同、結構不同的各種組織同時交聯(lián)處理，不受組織來源影響。各種組織處理程度均一可控。

催化劑EDC已用于多種植入醫(yī)療器械產(chǎn)品如膠原膜、透明質酸凝膠的交聯(lián)處理，其能夠催化膠原分子中的羧基發(fā)生酰胺反應，其本身作為催化劑未發(fā)生變化，且極容易溶于水，用純化水清洗可徹底去除殘留。

步驟五、滅菌

將最終包裝完畢的各類組織，采用輻照滅菌或環(huán)氧乙烷滅菌方式進行滅菌；輻照滅菌的滅菌劑量為15-30kGy，輻照源為伽馬射線或電子束；環(huán)氧乙烷滅菌參數(shù)為35-55℃下，滅菌4-20h，環(huán)氧乙烷濃度500-900mg/L。

本步驟通過輻照或環(huán)氧乙烷滅菌，可實現(xiàn)所有各類組織達到無菌狀態(tài)，并可起到滅活各類病毒的效果。

本發(fā)明并非多工藝步驟簡單排序，而是具有創(chuàng)新摸索出適合多種生物組織同時處理的工藝步驟及參數(shù)。并且本發(fā)明制備方采用了創(chuàng)新的1-10MPa超高壓物理方法處理，使得多種組織的去細胞關鍵工序的效果均一。

本發(fā)明的主要優(yōu)點包括：

(1)本發(fā)明所提出的同時處理多種生物組織的方法，完全避免使用強酸、強堿和蛋白酶，可保留多種生物組織細胞外基質的天然三維膠原支架纖維結構，去除組織中引起免疫原性的細胞成分。采用本方法制備的生物組織，具有良好的生物相容性及機械性能，且相比天然生物組織，具有較高抗降解能力，可用于各類軟組織損傷修復。

(2)本發(fā)明所提出的同時處理多種生物組織的方法，可同批次處理多種生物組織，相比一批次處理單種生物組織的方法，可大大提高工藝處理效率，尤其是當某種生物組織數(shù)量較少的情況下，可混合多種組織處理，避免工業(yè)大型設備投料量過低，造成能源浪費及設備損耗相對較高的問題。

(3)本發(fā)明主要采用物理方法脫細胞，可實現(xiàn)多種生物組織同批次處理，相比化學試劑處理法處理程度更加均一可控。

下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克?。簩嶒炇沂謨?New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)是重量百分比和重量份數(shù)。

需要說明的是，在本專利的權利要求和說明書中，諸如第一和第二等之類的關系術語僅僅用來將一個實體或者操作與另一個實體或操作區(qū)分開來，而不一定要求或者暗示這些實體或操作之間存在任何這種實際的關系或者順序。而且，術語“包括”、“包含”或者其任何其他變體意在涵蓋非排他性的包含，從而使得包括一系列要素的過程、方法、物品或者設備不僅包括那些要素，而且還包括沒有明確列出的其他要素，或者是還包括為這種過程、方法、物品或者設備所固有的要素。在沒有更多限制的情況下，由語句“包括一個”限定的要素，并不排除在包括所述要素的過程、方法、物品或者設備中還存在另外的相同要素。

實施例1

步驟一、預處理

將豬小腸、牛心包、豬皮采用純化水清洗，剝離無用組織如豬小腸的腸系膜及漿膜層、牛心包外表粘附脂肪顆粒、豬皮表皮及皮下脂肪層等，獲得豬小腸粘膜下層、牛心包、豬真皮層，并用75％乙醇室溫下消毒0.5h。

步驟二、脫脂

將完成步驟一預處理的各類組織置于異丙醇中室溫下浸泡48h，浸泡后再用純化水沖洗8次，去除異丙醇。

步驟三、物理方法脫細胞

將完成步驟二脫脂的各類組織，置于超高壓設備中，在10MPa、4℃條件下處理60min，再用50U/mL DNA酶溶液室溫下100rpm振蕩浸泡24h，50U/L的α-Gal酶溶液室溫下100rpm振蕩浸泡24h，最后用純化水清洗10次。

步驟四、交聯(lián)

將完成步驟三脫細胞的各類組織同批次冷凍干燥，使其含水率低于10％，再置于真空干燥箱中，在130℃條件下，真空熱處理120h，然后包裝送滅菌。

步驟五、輻照滅菌

將最終包裝完畢的各類組織，采用輻照滅菌進行滅菌；輻照滅菌的滅菌劑量為30kGy，輻照源為伽馬射線。

本實施例制備得到的脫細胞豬小腸粘膜下層基質、脫細胞牛心包、脫細胞豬真皮基質均實現(xiàn)了良好的脫細胞效果，各組織結構無破壞。

圖1為采用上述三種組織的HE染色結果，其中A為脫細胞豬真皮基質，B為脫細胞牛心包，C為脫細胞豬小腸粘膜下層基質，從圖中可以看出無任何細胞核殘留，且各組織膠原纖維緊密無破壞。

實施例2

步驟一、預處理

將豬小腸、牛心包、豬皮采用純化水清洗，剝離無用組織如豬小腸的腸系膜及漿膜層、牛心包外表粘附脂肪顆粒、豬皮表皮及皮下脂肪層等，獲得豬小腸粘膜下層、牛心包、豬真皮層，并用2％過氧化氫室溫下消毒1h。

步驟二、脫脂

將完成步驟一預處理的各類組織置于1％脫氧膽酸鈉中室溫下浸泡12h，浸泡后再用純化水沖洗3次，去除脫氧膽酸鈉。

步驟三、物理方法脫細胞

將完成步驟二脫脂的各類組織，置于超高壓設備中，在5MPa、40℃條件下處理1min，再用30U/mL DNA酶溶液室溫下120rpm振蕩浸泡18h，30U/Lα-Gal酶溶液室溫下80rpm振蕩浸泡20h，最后用純化水清洗8次。

步驟四、交聯(lián)

將完成步驟三脫細胞的各類組織同批次冷凍干燥，使其含水率低于10％，再置于真空干燥箱中，在120℃條件下，真空熱處理100h，然后包裝送滅菌。

步驟五、輻照滅菌

將最終包裝完畢的各類組織，采用輻照滅菌方式進行滅菌；輻照滅菌的滅菌劑量為25kGy，輻照源為電子束。

本實施例制備得到的脫細胞豬小腸粘膜下層基質、脫細胞牛心包、脫細胞豬真皮基質實現(xiàn)了同批次物理熱交聯(lián)處理，各組織的體外降解速率均明顯慢于未經(jīng)熱處理的對照組織。

圖2為上述三種本實施例制備的組織與未經(jīng)熱處理對照組織的體外降解對比結果。其中A為本實施例制備的脫細胞豬真皮基質(TC ADM)與未經(jīng)熱處理的脫細胞豬真皮基質(U ADM)的體外降解結果，B為本實施例制備的脫細胞豬小腸粘膜下層基質(TC SIS)與未經(jīng)熱處理的脫細胞豬小腸粘膜下層基質(U SIS)的體外降解結果，C為本實施例制備的脫細胞牛心包(TC ABP)與未經(jīng)熱處理的脫細胞牛心包(U ABP)的體外降解結果，上述三張對比圖橫坐標為降解時間，單位為h，縱坐標為組織質量剩余率，單位為％。從圖中可以看出，采用本實施例的方法制備的各種組織，在實現(xiàn)較完整結構保留的基礎上，均達到了良好的熱交聯(lián)效果，降解速率遠遠慢于未經(jīng)熱處理的各對照組織。

實施例3

步驟一、預處理

將豬小腸、牛心包、豬皮采用純化水清洗，剝離無用組織如豬小腸的腸系膜及漿膜層、牛心包外表粘附脂肪顆粒、豬皮表皮及皮下脂肪層等，獲得豬小腸粘膜下層、牛心包、豬真皮層，并用75％乙醇消毒2h。

步驟二、脫脂

將完成步驟一預處理的各類組織置于3％脫氧膽酸鈉中室溫下浸泡24h，浸泡后再用純化水沖洗4次，去除脫氧膽酸鈉。

步驟三、物理方法脫細胞

將完成步驟二脫脂的各類組織，置于超高壓設備中，在1MPa、25℃條件下處理30min，再用1U/mL DNA酶溶液室溫下150rpm振蕩浸泡4h，1U/Lα-Gal酶溶液室溫下150rpm振蕩浸泡4h，最后用純化水清洗5次。

步驟四、交聯(lián)

將完成步驟三脫細胞的各類組織同批次浸泡于0.01mol/L的EDC溶液中，在室溫下交聯(lián)12h，再用純化水清洗3次，最后包裝送滅菌。

步驟五、輻照滅菌

將最終包裝完畢的各類組織，采用環(huán)氧乙烷滅菌方式進行滅菌，環(huán)氧乙烷滅菌參數(shù)為55℃，滅菌4h，環(huán)氧乙烷濃度900mg/L。

本實施例制備得到的各類脫細胞組織，在實現(xiàn)良好的脫細胞效果同時，也能維持較完整的組織結構和完整性，與同類產(chǎn)品進行體外降解速率對比結果顯示，本實施例制備得到的各類脫細胞組織的降解性能均優(yōu)于或不差于同類產(chǎn)品。

圖3為上述三種本實施例制備的組織與同類產(chǎn)品的體外降解對比結果。其中A為本實施例制備的脫細胞豬真皮基質(TC ADM)與同類未交聯(lián)豬脫細胞真皮基質商品的體外降解結果，B為本實施例制備的脫細胞牛心包(TC ABP)與同類交聯(lián)脫細胞牛心包商品的體外降解結果，C為本實施例制備的脫細胞豬小腸粘膜下層基質(TC SIS)與同類交聯(lián)脫細胞豬小腸粘膜下層基質商品的體外降解結果，上述三張對比圖橫坐標為降解時間，單位為h，縱坐標為組織質量剩余率，單位為％。從圖中可以看出，采用本實施例的方法制備的各種組織，在實現(xiàn)較好脫細胞效果的同時，均達到了良好的熱交聯(lián)效果，降解速率優(yōu)于同類未交聯(lián)產(chǎn)品或與同類交聯(lián)產(chǎn)品相近。

實施例4

步驟一、預處理

將豬心包、牛皮、豬心臟瓣膜采用純化水清洗，剝離無用組織如豬心包外表粘附脂肪顆粒、牛皮表皮及皮下脂肪層等，獲得豬心包、牛真皮層、豬心臟瓣膜，并用75％乙醇室溫下消毒1h。

步驟二、脫脂

將完成步驟一預處理的各類組織置于異丙醇中室溫下浸泡36h，浸泡后再用純化水沖洗5次，去除異丙醇。

步驟三、物理方法脫細胞

將完成步驟二脫脂的各類組織，置于超高壓設備中，在8MPa、30℃條件下處理15min，再用20U/mL DNA酶溶液室溫下110rpm振蕩浸泡10h，40U/Lα-Gal酶溶液室溫下140rpm振蕩浸泡20h，最后用純化水清洗7次。

步驟四、交聯(lián)

將完成步驟三脫細胞的各類組織同批次浸泡于0.5mol/L的EDC溶液中，在室溫下交聯(lián)48h，再用純化水清洗8次，最后包裝送滅菌。

步驟五、輻照滅菌

將最終包裝完畢的各類組織，采用環(huán)氧乙烷滅菌方式進行滅菌，滅菌參數(shù)為35℃滅菌20h，環(huán)氧乙烷濃度500mg/L。

本實施例制備得到的各類脫細胞組織，在有效去除細胞、熱交聯(lián)的同時，也具有良好的生物相容性及體外細胞毒性。

圖4為上述三種本實施例制備得到組織體外細胞毒性檢測結果之細胞增殖數(shù)量圖片。其中A為空白對照組，B為陰性對照組，C為陽性對照組，D為脫細胞豬心包，E為脫細胞牛真皮基質，F(xiàn)為脫細胞豬心臟瓣膜。從圖中可以看出，空白對照組A、陰性對照組B以及本實施例制備得到的三種脫細胞組織的細胞增殖數(shù)量接近，細胞形態(tài)均正常，說明本實施例制備得到的三種脫細胞組織具有良好的體外細胞相容性。

實施例5

本實施例與實施例1相同，僅步驟一中“將豬小腸、牛心包、豬皮采用純化水清洗，剝離無用組織如豬小腸的腸系膜及漿膜層、牛心包外表粘附脂肪顆粒、豬皮表皮及皮下脂肪層等，獲得豬小腸粘膜下層、牛心包、豬真皮層”更改為“將豬小腸，同種異體皮，豬皮，牛皮，牛心臟瓣膜采用純化水清洗，剝離無用組織如豬小腸的腸系膜及漿膜層、各類皮的表皮及皮下脂肪層等，獲得豬小腸粘膜下層，同種異體真皮層，豬真皮層，牛真皮層，牛心臟瓣膜”。

實施例6

本實施例與實施例3相同，僅步驟三、物理方法脫細胞中“將完成步驟二脫脂的各類組織，置于超高壓設備中，在1MPa、25℃條件下處理1min，再用1U/mL DNA酶溶液室溫下150rpm振蕩浸泡4h，1U/Lα-Gal酶溶液室溫下150rpm振蕩浸泡4h，最后用純化水清洗5次”更改為“將完成步驟二脫脂的各類組織，置于超高壓設備中，在6MPa、10℃條件下處理25min，再用15U/mL DNA酶溶液室溫下125rpm振蕩浸泡14h，25U/Lα-Gal酶溶液室溫下115rpm振蕩浸泡10h，最后用純化水清洗4次”。

在本發(fā)明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領域技術人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。