本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及VCP蛋白抑制劑與溶瘤病毒的聯(lián)合在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

溶瘤病毒(oncolytic virus)是一類選擇性的感染并殺傷腫瘤細(xì)胞，而不損傷正常細(xì)胞的可復(fù)制病毒。溶瘤病毒療法(oncolytic virotherapy)是一種創(chuàng)新的腫瘤靶向治療策略，它利用天然的或經(jīng)基因工程改造的病毒選擇性的感染腫瘤細(xì)胞，并在腫瘤細(xì)胞中復(fù)制，達(dá)到靶向性溶解、殺傷腫瘤細(xì)胞的作用，但是對正常細(xì)胞沒有損傷。

M1病毒(Alphavirus M1)屬于甲病毒屬(Alphavirus)，其在制備抗腫瘤藥物方面具有較好的應(yīng)用效果。例如中國發(fā)明專利申請201410425510.3公開了M1病毒能選擇性引起腫瘤細(xì)胞死亡而不影響正常細(xì)胞存活，其在抗腫瘤方面具有非常好的應(yīng)用前景。然而，不同腫瘤對M1病毒的敏感性不一，對于某些腫瘤，M1病毒單獨用藥時，溶瘤作用還不夠理想。例如中國發(fā)明專利申請201410425510.3所記載的，M1作為抗腫瘤藥物使用時，對于結(jié)直腸癌、肝癌、膀胱癌和乳腺癌的效果不如胰腺癌、鼻咽癌、前列腺癌和黑色素瘤明顯；而膠質(zhì)瘤、宮頸癌、肺癌則更其次；而胃癌則最不顯著。

篩選增加溶瘤病毒腫瘤治療效果的化合物有望增加溶瘤病毒的抗瘤譜及抗瘤強度。發(fā)明人此前申請的專利201510990705.7中，將大黃酚及其衍生生物作為溶瘤病毒的抗瘤增效劑，二者組合可以將腫瘤細(xì)胞的存活率降低至39.6％，但其抗癌強度存在很大的進(jìn)步空間，此外，這種聯(lián)合應(yīng)用的作用機制尚不明確。本發(fā)明的目的在于提供一種基于精確機制的溶瘤病毒抗癌增效劑，能夠選擇性 的增強M1病毒對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用，而不影響正常細(xì)胞。本發(fā)明提供了一種更精準(zhǔn)更安全的溶瘤病毒增效療法。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的之一在于提供一種VCP抑制劑在制備溶瘤病毒抗瘤增效劑方面的應(yīng)用。

本發(fā)明的另一個目的在于提供一種抗瘤藥物組合物，其可以使得溶瘤病毒發(fā)揮更好的抗瘤效果。

本發(fā)明的另一個目的在于提供一種針對溶瘤病毒不敏感的腫瘤，安全有效的溶瘤病毒增效藥物。

本發(fā)明的另一個目的在于提供一種個性化的用藥系統(tǒng)和方法。

發(fā)明通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)上述目的：

發(fā)明人通過研究、篩選發(fā)現(xiàn)，VCP抑制劑可以增強溶瘤病毒的溶瘤效果。

所述的VCP抑制劑為抑制VCP蛋白活性的物質(zhì)、或降解VCP蛋白的物質(zhì)、或降低VCP蛋白水平的基因工具。

VCP(valosin containing protein,VCP)，又稱P97，是一種細(xì)胞內(nèi)廣泛表達(dá)的ATP酶，它作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)降解通路的重要組成元件，負(fù)責(zé)識別和遞呈泛素化蛋白，并將這些蛋白轉(zhuǎn)運至蛋白酶體進(jìn)行降解，以保證細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)。已有多篇文獻(xiàn)報道VCP在腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，抑制VCP能夠顯著的誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡。

發(fā)明人通過用VCP干擾片段(Si RNA)抑制這個基因的表達(dá)，降低相應(yīng)蛋白的表達(dá)量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，單獨干擾VCP和未干擾并未引起細(xì)胞形態(tài)病變，同時單獨應(yīng)用M1病毒也不引起細(xì)胞形態(tài)病變，只有干擾VCP聯(lián)合應(yīng)用M1病毒組引起了顯著細(xì)胞形態(tài)病變。

進(jìn)一步地，發(fā)明人的進(jìn)一步實驗驗證了通過抑制VCP可以顯著增強溶瘤病毒的溶瘤效應(yīng)。發(fā)明人采用了抑制VCP活性的化合物Eeyarestatin I、NMS-873 或CB-5083協(xié)同溶瘤病毒例如M1病毒作用于腫瘤細(xì)胞，實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Eeyarestatin I、NMS-873或CB-5083或其組合，均可以協(xié)同溶瘤病毒增強抗腫瘤效應(yīng)。

本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)，VCP抑制劑可以作為溶瘤病毒的抗瘤增效劑/耐藥逆轉(zhuǎn)劑。

本發(fā)明提供了VCP抑制劑在制備溶瘤病毒抗瘤增效劑/耐藥逆轉(zhuǎn)劑方面的應(yīng)用。

所述的VCP抑制劑包括但不限于Eeyarestatin I(式1)、NMS-873(式2)、CB-5083(式3)等抑制VCP蛋白活性的化合物?；衔锏墨@取方式可選但不限于：自己化學(xué)分離或合成或者從商業(yè)途徑購買。

在本發(fā)明優(yōu)選的實施例中，VCP蛋白抑制劑為Eeyarestatin I、CB-5083或他們的組合。

VCP抑制劑還包括針對VCP基因表達(dá)抑制工具，包括但不限于RNA干擾(RNAi)microRNA以及基因編輯或敲除等工具手段。

在本發(fā)明另一優(yōu)選的實施例中，VCP蛋白抑制劑為VCP的干擾RNA片段。

所述的溶瘤病毒選自M1病毒、蓋塔病毒、腺病毒、牛痘病毒、麻疹病毒、水泡口炎病毒、和單純性皰疹病毒中的一種或多種；優(yōu)選M1病毒、蓋塔病毒或者他們的組合。

本發(fā)明所說的溶瘤病毒(甲病毒(例如M1病毒、蓋塔病毒等)、腺病毒、牛痘病毒、麻疹病毒、水泡口炎病毒、和單純性皰疹病毒等)可以尤其地指目前已有的溶瘤病毒，但也不排除一些可能發(fā)生的自然變異或者進(jìn)行了突變、修飾、序列增加、減少等的病毒，只要這些變異、突變、修飾、序列增加或減少等的變化并不影響所說的溶瘤病毒發(fā)揮本發(fā)明所述的作用，則屬于本發(fā)明所述的同質(zhì)的病毒。所說的VCP抑制劑為能起到敲低或影響VCP基因表達(dá)或者降低VCP蛋白量或蛋白活性的物質(zhì)(例如化合物、或氨基酸序列、核苷酸序列等)或工具等。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對其抑制化合物或者基因工具進(jìn)行修飾、替換、改變等，但只要起到上述抑制VCP的作用的，則屬于本發(fā)明的VCP抑制劑，屬于上述物質(zhì)、化合物或工具等的同質(zhì)替換。

本發(fā)明還提供一種用于治療腫瘤的藥物組合物，其包含VCP抑制劑以及溶瘤病毒。本發(fā)明還提供用于治療腫瘤的藥品套裝，其包含VCP抑制劑，以及溶瘤病毒。藥品套裝區(qū)別于組合物的地方在于，在藥品套裝中，VCP抑制劑未必、并且通常不與溶瘤病毒混合存在，而是通常地被分開包裝。分開包裝的溶瘤病毒與VCP抑制劑也可含有其各自的佐劑。所述的佐劑是指在藥學(xué)中，可輔助藥物療效的手段。藥品套裝也可以包含獨立包裝的VCP抑制劑，以及獨立包裝的溶瘤病毒。藥物套裝中VCP抑制劑，以及溶瘤病毒的施用，可以是同時施用或者是以任意的前后順序施用，其中患者先用一種藥物治療，然后再給以另一種藥物。所述的患者是指哺乳動物受治療者，尤其是人類。

所述的VCP抑制劑包括但不限于Eeyarestatin I(式1)、NMS-873(式2)、CB-5083(式3)等這一類的抑制VCP蛋白活性的化合物?；蛘哚槍CP基因表達(dá)抑制工具，包括但不限于RNA干擾(RNAi)microRNA以及基因編輯或敲除等工具手段。優(yōu)選Eeyarestatin I、CB-5083或它們的組合。

所述的溶瘤病毒選自M1病毒、蓋塔病毒、腺病毒、牛痘病毒、麻疹病毒、水泡口炎病毒、和單純性皰疹病毒中的一種或多種；優(yōu)選M1病毒和蓋塔病毒的至少一種。

在組合物或藥品套裝中，Eeyarestatin I或NMS-873或CB-5083與溶瘤病毒的配比可選地為：0.01～200mg:10³～10⁹PFU；優(yōu)選0.1～200mg:10⁴～10⁹PFU；進(jìn)一步優(yōu)選0.1～100mg:10⁵～10⁹PFU。

優(yōu)選使用劑量為：Eeyarestatin I或NMS-873或CB-5083使用范圍為0.01mg/kg至200mg/kg，同時溶瘤病毒使用滴度為MOI從10³至10⁹(PFU/kg)；優(yōu)選Eeyarestatin I或NMS-873或CB-5083使用范圍為0.1mg/kg至200mg/kg，同時溶瘤病毒使用滴度為MOI從10⁴至10⁹(PFU/kg)；更優(yōu)選Eeyarestatin I或NMS-873或CB-5083使用范圍為0.1mg/kg至100mg/kg，同時溶瘤病毒使用滴度為MOI從10⁵至10⁹(PFU/kg)。

在一個實施方式中，所述溶瘤病毒選自M1病毒、蓋塔病毒、腺病毒、牛痘病毒、麻疹病毒、水泡口炎病毒和單純性皰疹病毒。優(yōu)選地，所述溶瘤病毒為M1病毒和蓋塔病毒中的至少一種。M1病毒屬于蓋塔相似病毒，據(jù)報道在已發(fā)現(xiàn)的相關(guān)病毒中，這兩者的同源性高達(dá)97.8％。

在一個實施例中，采用的溶瘤病毒為保藏編號CCTCC V201423(具體信息如中國專利104814984A所記載)的M1病毒。

在一個實施方式中，所述腫瘤為實體瘤或血液瘤。在一個實施方式中，所述實體瘤為肝癌、結(jié)直腸癌、膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌、前列腺癌、膠質(zhì)瘤、黑色素瘤、胰腺癌、鼻咽癌、肺癌、或胃癌。在優(yōu)選的實施方式中，所述腫瘤為對溶瘤病毒不敏感的腫瘤。在更優(yōu)選的實施方式中，所述腫瘤為對M1溶瘤病 毒不敏感的腫瘤。

作為可選的實施方案，本發(fā)明所提供的Eeyarestatin I或NMS-873或CB-5083或其組合可以是注射劑、片劑、膠囊、貼劑、試劑盒等。作為優(yōu)選的實施方案，本發(fā)明的增效藥物是注射劑；優(yōu)選地，可采用靜脈注射。

另外，本發(fā)明還發(fā)現(xiàn)，降低VCP蛋白水平，可顯著增加溶瘤病毒處理后腫瘤細(xì)胞的生存率(實施例4)；在不對VCP水平予以干預(yù)的情況下，發(fā)現(xiàn)VCP的表達(dá)與Eeyarestatin I聯(lián)合溶瘤病毒的抗腫瘤效應(yīng)呈正相關(guān)(實施例5)，VCP表達(dá)水平的高低會對Eeyarestatin I聯(lián)合溶瘤病毒抗腫瘤效應(yīng)產(chǎn)生關(guān)聯(lián)性的影響，VCP可以作為VCP抑制劑與溶瘤病毒聯(lián)用的生物標(biāo)記物。Eeyarestatin I/M1病毒聯(lián)合抗腫瘤效應(yīng)的有效性，與腫瘤VCP表達(dá)水平密切相關(guān)，VCP在多種腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，Eeyarestatin I聯(lián)合溶瘤病毒抗腫瘤可選擇性地治療VCP高表達(dá)的腫瘤/個體。

因此，為了進(jìn)一步提高所述溶瘤病毒作為抗腫瘤藥物治療的有效率，在治療方案的選擇中，可以首先判斷患者腫瘤的VCP表達(dá)情況，再針對性地給予溶瘤病毒的治療方案，以此來提高治療方案的有效性，避免無效給藥所造成的時間上的拖延和藥物濫用。例如，在給藥前先測定患者腫瘤VCP表達(dá)情況，如果是VCP低表達(dá)或VCP陰性的腫瘤，可直接給以溶瘤病毒治療；如果是VCP正常表達(dá)/VCP高表達(dá)腫瘤，則可在溶瘤病毒給藥前或同時或之后給予VCP抑制劑(例如VCP表達(dá)或功能抑制劑，VCP干擾片段，或者VCP抗體等)，以提高腫瘤對溶瘤病毒的敏感性，提高治療有效性。腫瘤VCP表達(dá)量的高低直接影響到溶瘤治療的有效性。VCP表達(dá)量越低的腫瘤越有利于溶瘤病毒的治療效果。判斷某個體/腫瘤是否適于利用所述溶瘤病毒直接進(jìn)行治療，可先檢測腫瘤VCP的表達(dá)水平。

因此本發(fā)明提供了一種抗腫瘤用藥系統(tǒng)，包括VCP檢測試劑或檢測系統(tǒng)，以及溶瘤病毒；所述的溶瘤病毒選自甲病毒、腺病毒、牛痘病毒、麻疹病毒、水泡口炎病毒、和單純性皰疹病毒中的一種或多種。

VCP檢測試劑或檢測系統(tǒng)可以是任意的可用于對VCP表達(dá)水平進(jìn)行的試劑/系統(tǒng)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以通過常規(guī)的基因或蛋白量檢測分析手段進(jìn)行選擇，具體方法包括但不限于Western Blot(參考實施例4)、免疫組化、ELISA、QRT-PCR。

腫瘤VCP表達(dá)量的高低直接影響到VCP抑制劑聯(lián)合溶瘤病毒治療的有效性。VCP表達(dá)量越高的腫瘤越適用以下治療方案：VCP抑制劑聯(lián)合溶瘤病毒的聯(lián)合療法。判斷某個體/腫瘤是否適于利用VCP抑制劑聯(lián)合溶瘤病毒進(jìn)行治療，可先檢測腫瘤VCP的表達(dá)水平。

判斷VCP表達(dá)水平高低可以優(yōu)選但不限于以下方式：

VCP低或高表達(dá)是指兩組(個)樣本之間VCP mRNA或者蛋白質(zhì)數(shù)量比較后得出的結(jié)論，如果一組(個)樣本比另外一組(個)VCP mRNA或者蛋白質(zhì)數(shù)量少或多稱為該樣本VCP低或高表達(dá)；VCP陰性是指樣本完全不表達(dá)VCP mRNA或蛋白。用于VCP mRNA和蛋白質(zhì)的數(shù)量比較的樣本可以是腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞、腫瘤組織與癌旁非瘤組織，或者溶瘤病毒治療有效與無效的腫瘤。

作為一種可選的方式，腫瘤的VCP高、低或陰性表達(dá)均指腫瘤組織與相應(yīng)癌旁非瘤組織比較，VCP mRNA和蛋白質(zhì)的數(shù)量多、少或者無表達(dá)。

若腫瘤組織的VCP的mRNA或蛋白質(zhì)均一化表達(dá)量比相應(yīng)癌旁非瘤組織少(即腫瘤組織較癌旁非瘤組織的VCP均一化表達(dá)量比值<1)，則屬于VCP低表達(dá)，可以利用溶瘤病毒直接進(jìn)行治療。

若腫瘤組織的VCP的mRNA或蛋白質(zhì)均一化表達(dá)量比相應(yīng)癌旁非瘤組織高(即腫瘤組織較癌旁非瘤組織的VCP均一化表達(dá)量比值＞1)，則屬于VCP高表達(dá)，適于利用VCP抑制劑聯(lián)合溶瘤病毒進(jìn)行治療(聯(lián)合療法)。對于以下治療對象，聯(lián)合療法將更為必要：腫瘤組織較癌旁非瘤組織的VCP相對表達(dá)量即均一化表達(dá)量比值＞1.5的腫瘤，尤其是＞2，尤其是＞2.5，尤其是＞3，尤其是＞3.5，尤其是＞4。這些腫瘤組織與相應(yīng)癌旁非瘤組織包括但不限于病理穿刺手術(shù)或外科切除手術(shù)來源組織樣本。

VCP mRNA或蛋白檢測方法包括但不限于QRT-PCR、Northern Blot、 Western Blot、免疫組織化學(xué)、ELISA等。為準(zhǔn)確判定不同樣本之間VCP mRNA或蛋白數(shù)量的差異，首先計算出每一個樣本VCP mRNA或蛋白的均一化表達(dá)量。均一化表達(dá)量是指每個樣本的VCP mRNA或蛋白值和樣本內(nèi)參VCP mRNA或蛋白平相除，進(jìn)行均一化處理得出該樣本VCP均一化表達(dá)量。在不同檢測方法中內(nèi)參可以不同，其共同特征是在不同細(xì)胞或組織樣本中內(nèi)參表達(dá)量一致，這樣經(jīng)過均一化處理的不同樣本的VCP表達(dá)量才具備可比性，用于判斷樣本之間VCP mRNA或蛋白的數(shù)量差異。

優(yōu)選地，所述的甲病毒選自M1病毒和蓋塔病毒中的至少一種；

優(yōu)選地，所述的腫瘤為實體瘤或血液瘤；

更優(yōu)選地，所述的實體瘤為肝癌、結(jié)直腸癌、膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌、前列腺癌、膠質(zhì)瘤、黑色素瘤、胰腺癌、鼻咽癌、肺癌或胃癌。

同時本發(fā)明還提供了一種抗腫瘤藥物，包括溶瘤病毒，所述溶瘤病毒選自甲病毒、腺病毒、牛痘病毒、麻疹病毒、水泡口炎病毒、和單純性皰疹病毒中的一種或多種，并且，其尤其針對于VCP陰性或VCP低表達(dá)腫瘤；

優(yōu)選地，所述的甲病毒選自M1病毒和蓋塔病毒中的至少一種；

更優(yōu)選地，所述的腫瘤為VCP高表達(dá)的腫瘤時，采用聯(lián)合療法；所述的腫瘤為VCP陰性或低表達(dá)的腫瘤時，采用M1病毒單獨治療。

更優(yōu)選地，所述的腫瘤為肝癌、結(jié)直腸癌、膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌、前列腺癌、膠質(zhì)瘤、黑色素瘤、胰腺癌、鼻咽癌、肺癌或胃癌。

本發(fā)明所采用的用藥系統(tǒng)將可以個性化地提高溶瘤病毒的用藥有效性。

作為本發(fā)明進(jìn)一步優(yōu)選的實施方案：

本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了VCP抑制劑，尤其是Eeyarestatin I和CB-5083可以增加溶瘤病毒的抗腫瘤效應(yīng)，以提高溶瘤病毒作為抗腫瘤藥物時的治療有效性。細(xì)胞學(xué)實驗證明M1病毒分別和Eeyarestatin I、CB-5083聯(lián)合應(yīng)用，可顯著引起腫瘤細(xì)胞的形態(tài)學(xué)病變，從而顯著增強對腫瘤細(xì)胞的抑制作用。

我們聯(lián)合Eeyarestatin I或CB-5083和M1病毒作用于人肝細(xì)胞癌Hep3B株， 出人意料的發(fā)現(xiàn)抗病毒化合物Eeyarestatin I或CB-5083和M1病毒聯(lián)合應(yīng)用時，顯著增加腫瘤細(xì)胞形態(tài)病變，顯著降低腫瘤細(xì)胞生存率。例如在本發(fā)明的一個實施例中，當(dāng)M1病毒(MOI＝0.001)單獨處理肝癌細(xì)胞時，腫瘤細(xì)胞存活率為83.0％，而當(dāng)以5μM的Eeyarestatin I或CB-5083與同樣MOI的M1病毒聯(lián)用時，腫瘤細(xì)胞存活率大幅下降至21.6％。與單用M1病毒的抗腫瘤效果相比，Eeyarestatin I與M1聯(lián)用時，溶瘤效果顯著提升。

發(fā)明人此前將大黃酚及其衍生物作為M1病毒的抗癌增效劑，經(jīng)試驗發(fā)現(xiàn)，50μM的大黃酚與(MOI＝0.001)M1病毒聯(lián)用后，腫瘤細(xì)胞的存活率下降至39.6％，而本發(fā)明發(fā)現(xiàn)，將5μM的Eeyarestatin I或CB-5083與M1病毒聯(lián)用后，腫瘤細(xì)胞的存活率顯著下降至21.6％。與大黃酚及其衍生物相比，本發(fā)明的M1抗腫瘤增效劑顯著提高了腫瘤的殺傷率，同時，Eeyarestatin I或CB-5083在藥物有效劑量上僅為大黃酚的十分之一，并且作用快速，用時為大黃酚的三分之二(大黃酚處理72h，Eeyarestatin I處理48h)，具備顯著優(yōu)越性。

本發(fā)明發(fā)現(xiàn)，Eeyarestatin I或CB-5083與溶瘤病毒聯(lián)合應(yīng)用處理腫瘤細(xì)胞，對腫瘤細(xì)胞殺傷作用顯著優(yōu)于單用相同濃度的Eeyarestatin I或CB-5083，例如當(dāng)同樣例如以5μM的Eeyarestatin I處理腫瘤細(xì)胞時，腫瘤細(xì)胞存活率仍高達(dá)87.2％，當(dāng)以5μM的Eeyarestatin I與M1病毒聯(lián)用時，腫瘤細(xì)胞存活率大幅下降至21.6％?？梢?，Eeyarestatin I與M1聯(lián)用時大幅提升的溶瘤效果，是得益于Eeyarestatin I與M1病毒之間的協(xié)同性機制，并非簡單地通過Eeyarestatin I的抗腫瘤機制發(fā)揮作用。

附圖說明

圖1 Eeyarestatin I與M1病毒顯著增加人肝細(xì)胞癌株形態(tài)學(xué)病變。

圖2 Eeyarestatin I/CB-5083與M1病毒聯(lián)合處理顯著降低人肝細(xì)胞癌株生存率；

其中，圖2a Eeyarestatin I與M1病毒聯(lián)合處理顯著降低人肝細(xì)胞癌株Hep3B生存率；圖2b CB-5083與M1病毒聯(lián)合處理顯著降低人肝細(xì)胞癌株Hep3B生存率。

圖3敲低VCP可以增強溶瘤病毒M1在肝癌細(xì)胞上的溶瘤效應(yīng)；

其中，圖3a VCP蛋白敲低的效率；圖3b敲低VCP顯著增加人肝細(xì)胞癌株形態(tài)學(xué)病變；圖3c敲低VCP增強溶瘤病毒M1在兩株肝癌細(xì)胞上的溶瘤效應(yīng)。

圖4 VCP的蛋白表達(dá)與VCP抑制劑和M1病毒聯(lián)合療法的抗癌效應(yīng)呈正相關(guān)；

其中，圖4a在多種肝癌細(xì)胞和正常細(xì)胞中，VCP的蛋白表達(dá)量；圖4b Eeyarestatin I與M1病毒聯(lián)合使用對多種肝癌細(xì)胞和正常細(xì)胞上的生存率影響；圖4c Eeyarestatin I與M1病毒聯(lián)合使用與VCP蛋白表達(dá)的相關(guān)性分析。

圖5 VCP抑制劑協(xié)同M1病毒通過誘導(dǎo)不可逆內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激引起腫瘤細(xì)胞凋亡；

其中，圖5a VCP抑制劑協(xié)同M1病毒能夠抑制IRE1-XBP1通路；圖5b VCP抑制劑協(xié)同M1病毒能夠促進(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。

圖6 Eeyarestatin I與M1病毒聯(lián)合處理顯著抑制人肝細(xì)胞癌株移植瘤生長；其中其中，圖6a和b Eeyarestatin I與M1病毒聯(lián)合處理顯著抑制人肝細(xì)胞癌株Hep3B移植瘤生長；圖6c和d Eeyarestatin I與M1病毒聯(lián)合處理顯著抑制人肝細(xì)胞癌株Huh 7移植瘤生長.

圖標(biāo)說明：

EerI：Eeyarestatin I處理組；CB-5083：CB-5083處理組；M1+EerI：M1病毒與Eeyarestatin I聯(lián)用處理組；M1+CB-5083：M1病毒與CB-5083聯(lián)用處理組。

具體實施方式

以下實施方式是對本發(fā)明作進(jìn)一步說明，但本發(fā)明的實施方式不局限于以下的實施例介紹，凡依照本發(fā)明的原理或理念所作的等同的變化或變通都應(yīng)視為本發(fā)明保護(hù)的范疇。

在沒有特別指明的情況下，本發(fā)明采用的材料及實驗方法為常規(guī)材料及方法。

實施例1Eeyarestatin I與M1病毒顯著增加人肝癌細(xì)胞株形態(tài)學(xué)病變

材料：

人肝細(xì)胞癌Hep3B，M1病毒，高糖DMEM培養(yǎng)基，倒置相差顯微鏡。

方法：

a)細(xì)胞的培養(yǎng)：人肝細(xì)胞癌Hep3B生長在含10％FBS、100U/ml青霉素及0.1mg/ml鏈霉素的DMEM完全培養(yǎng)基中；所有細(xì)胞株均置于5％CO₂,37℃恒溫密閉式孵箱(相對濕度95％)內(nèi)培養(yǎng)傳代，倒置顯微鏡觀察生長情況。大約2～3天傳代一次，取處于對數(shù)生長期的細(xì)胞用于正式實驗。

b)細(xì)胞處理和形態(tài)學(xué)觀察：選擇對數(shù)生長期細(xì)胞，DMEM完全培養(yǎng)液(含10％胎牛血清、1％雙抗)制成細(xì)胞懸液，細(xì)胞以2.5×10⁴/孔的密度接種在24孔培養(yǎng)板內(nèi)。用Eeyarestatin I(5μM)單獨處理、M1病毒(MOI＝0.001)感染細(xì)胞、M1病毒(MOI＝0.001)聯(lián)合Eeyarestatin I(5μM)處理細(xì)胞，以不加M1病毒和Eeyarestatin I為對照，48時后在倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)的變化。

結(jié)果：

如圖1所示,相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，對照組Hep3B細(xì)胞是單層貼壁生長，并且細(xì)胞緊密排列，表型一致，并且分別單獨使用Eeyarestatin I(5μM)或M1病毒(MOI＝0.001)處理48h后，細(xì)胞形態(tài)沒有顯著改變。而Eeyarestatin I(5μM)與M1病毒(MOI＝0.001)聯(lián)合處理細(xì)胞48h后，與對照組以及各單獨處理組比較，聯(lián)合處理組細(xì)胞數(shù)目明顯減少，并且細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生了明顯改變，胞體收縮成球狀，折光率明顯增強，呈死亡病變樣。

實施例2Eeyarestatin I或CB-5083與M1病毒聯(lián)合處理顯著降低人肝癌細(xì)胞株生存率

材料：

人肝細(xì)胞癌Hep3B，M1病毒，高糖DMEM培養(yǎng)基，自動酶聯(lián)檢測酶標(biāo)儀。

方法：

a)接種細(xì)胞、給藥處理：選擇對數(shù)生長期細(xì)胞，DMEM完全培養(yǎng)液(含10％胎牛血清、1％雙抗)制成細(xì)胞懸液，以每孔4×10³/孔的密度接種在96孔培養(yǎng) 板內(nèi)。12小時后見細(xì)胞完全貼壁，實驗分無藥物與病毒處理的對照組、單獨Eeyarestatin I或者CB-5083組，M1單獨感染組和Eeyarestatin I/M1聯(lián)用組或者CB-5083/M1聯(lián)用組。所用劑量為：所用劑量為：M1病毒(MOI＝0.001)感染細(xì)胞；Eeyarestatin I或CB-5083設(shè)不同的劑量梯度。

b)MTT與細(xì)胞內(nèi)的琥珀酸脫氫酶反應(yīng)：培養(yǎng)至48h時，每孔加入MTT 20μl(5mg/ml)，繼續(xù)孵育4小時，此時鏡檢可觀察到、活細(xì)胞內(nèi)形成的顆粒狀藍(lán)紫色甲臜結(jié)晶。

c)溶解甲臜顆粒：小心吸去上清，加DMSO 100μl/孔溶解形成的結(jié)晶，在微型振蕩器上震蕩5min，然后在酶聯(lián)檢測儀上用波長570nm檢測各孔的光密度(OD值)。每組實驗重復(fù)3次。細(xì)胞存活率＝藥物處理組OD值/對照組OD值×100％。

d)用origin 8進(jìn)行非線性曲線擬合，以藥物劑量為橫坐標(biāo)，相對細(xì)胞存活率為縱坐標(biāo)繪制兩條量效曲線，即Eeyarestatin I或CB-5083單用的量效曲線以及Eeyarestatin I或CB-5083與M1病毒聯(lián)用的量效曲線，計算兩條曲線的曲線下面積差值，即圖中DAUC(Differnence in Area Under the Curve,DAUC)，該差值越大說明藥物協(xié)同越顯著。各種不同處理后細(xì)胞的存活率除以無藥物與病毒處理的對照組存活率作為相對細(xì)胞存活率,并以倍數(shù)表示。One way ANOVA統(tǒng)計，表明具有統(tǒng)計學(xué)差異時*表示P<0.05、**表示P<0.01。

結(jié)果:

如圖2a所示，M1病毒(MOI＝0.001)單獨處理對腫瘤細(xì)胞Hep3B具有較小的生存率抑制作用，腫瘤細(xì)胞相對細(xì)胞存活率達(dá)到83.0％，5μM的Eeyarestatin I處理組腫瘤細(xì)胞相對細(xì)胞存活率仍高達(dá)87.2％，然而，當(dāng)同樣的5μM的Eeyarestatin I與M1病毒(MOI＝0.001)聯(lián)用(Eeyarestatin I+M1)時，腫瘤細(xì)胞相對細(xì)胞存活率大幅下降至21.6％。與單用處理比較，濃度0.625μM至10μM的Eeyarestatin I分別與M1病毒(MOI＝0.001)聯(lián)合應(yīng)用都顯著降低腫瘤細(xì)胞Hep3B存活率。

如圖2b顯示，與單用相應(yīng)濃度CB-5083處理比較，0.125μM至2μM CB-5083分別聯(lián)合溶瘤病毒M1(MOI＝0.001)顯著降低腫瘤細(xì)胞Hep3B存活率。在細(xì)胞水平說明了VCP抑制劑可以增強M1病毒的溶瘤效應(yīng)。

實施例3敲低VCP表達(dá)水平可以增強溶瘤病毒M1在肝癌細(xì)胞上的溶瘤效應(yīng)

材料：

M1病毒、人肝細(xì)胞癌Hep3B、人肝癌細(xì)胞Huh 7、VCP干擾片段(Si RNA)、MTT(甲基偶氮唑藍(lán))、Lipofectamine^TM RNAiMAX(invertrogen，USA)Western bolt：細(xì)胞總蛋白抽提液(Mammalian Protein Extraction Reagent，Thermo)、VCP抗體(CST，USA)、GAPDH抗體(CST，USA)；

方法：

選擇對數(shù)生長期細(xì)胞，DMEM完全培養(yǎng)液(10％胎牛血清、1％雙抗)制成細(xì)胞懸液，細(xì)胞以1×10⁵/孔的密度接種在6孔板內(nèi)。24小時后，加入RNAiMAX包裹的Si RNA片段。48小時后，感染M1病毒。感染48小時后，處理樣本。

a)每孔加入MTT 20μl(5mg/ml)，4小時后檢測吸光度值，計算細(xì)胞存活率，siVCP實驗組以VCP RNA干擾片段處理，siNC對照組以VCP亂碼干擾片段處理。

b)抽提蛋白質(zhì)樣本，Western blot檢測VCP蛋白表達(dá)，內(nèi)參是GAPDH。

c)試驗重復(fù)3次，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示；與各自對照組比較進(jìn)行students’t檢驗統(tǒng)計，**表示P<0.01。

結(jié)果:

如圖3a所示，以VCP RNA干擾片段處理人肝癌細(xì)胞Hep3B和Huh 7后，VCP蛋白表達(dá)量顯著下降。

如圖3b所示，相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，對照組(NTi)以及各干擾VCP處理組(VCPi#1和VCPi#2組)的Hep3B和Huh 7是單層貼壁生長，并且細(xì)胞緊密排列，表型一致，細(xì)胞形態(tài)沒有顯著改變。而各干擾VCP處理(VCPi#1 和VCPi#2)并感染M1病毒(MOI＝0.001)的聯(lián)合處理組Hep3B和Huh 7細(xì)胞數(shù)目明顯減少，并且細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生了明顯改變，胞體收縮成球狀，折光率明顯增強，呈死亡病變樣。

如圖3c所示，與單獨干擾VCP處理組(VCPi#1和VCPi#2組)比較，各干擾VCP處理(VCPi#1和VCPi#2)并感染M1病毒(MOI＝0.001)的聯(lián)合處理組Hep3B和Huh 7細(xì)胞存活率顯著下降，具有統(tǒng)計學(xué)差異。Hep3B和Huh 7在感染M1病毒(MOI＝0.001)后，顯著引起敲低VCP水平后的肝癌Hep3B細(xì)胞(VCPi#1和VCPi#2組)存活率降低為22.5％和22.1％，Huh 7細(xì)胞(VCPi#1和VCPi#2組)存活率降低為31.8％和40.8％；以上結(jié)果表明敲低VCP可以增強溶瘤病毒M1在肝癌細(xì)胞上的溶瘤效應(yīng)。

實施例4VCP的蛋白表達(dá)與VCP抑制劑和M1病毒聯(lián)合療法的抗癌效應(yīng)呈正相關(guān)

材料：M1病毒、人肝細(xì)胞癌Hep3B、人肝癌細(xì)胞Huh 7、人肝癌細(xì)胞Sk-Hep-1、人肝癌細(xì)胞SNU-387、人肝癌細(xì)胞SNU-449、人肝癌細(xì)胞SNU-182、人肝癌細(xì)PLC、人正常肝細(xì)胞L02、人原代分離正常肝細(xì)胞HH、Western blot：細(xì)胞總蛋白抽提液(Mammalian Protein Extraction Reagent，Thermo)、VCP抗體(CST，USA)、GAPDH抗體(CST，USA)；

方法：選擇對數(shù)生長期細(xì)胞，DMEM完全培養(yǎng)液(10％胎牛血清、1％雙抗)制成細(xì)胞懸液，細(xì)胞以1×10⁶/孔的密度接種在60mm細(xì)胞培養(yǎng)皿內(nèi)，培養(yǎng)24小時。

1.Western blot檢測VCP蛋白表達(dá)。

a)抽提細(xì)胞總蛋白、定量，進(jìn)行Western Blot實驗(電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、孵育一抗和二抗、顯影)。

b)通過成像儀軟件Image Lab 2.0軟件對VCP和內(nèi)參GAPDH條帶灰度掃描，檢測條帶灰度，計算VCP均一化蛋白表達(dá)量按照以下公式進(jìn)行：VCP均一化蛋 白表達(dá)量＝VCP條帶灰度/內(nèi)參條帶灰度。

c)相對VCP蛋白表達(dá)＝不同細(xì)胞的VCP均一化蛋白表達(dá)量/HH細(xì)胞的VCP均一化蛋白表達(dá)量。

2.非線性擬合曲線發(fā)繪制M1病毒單用和Eeyarestatin I聯(lián)合M1病毒的量效曲線。

a)接種細(xì)胞、給藥處理：選擇對數(shù)生長期細(xì)胞，DMEM完全培養(yǎng)液(含10％胎牛血清、1％雙抗)制成細(xì)胞懸液，以每孔4×10³/孔的密度接種在96孔培養(yǎng)板內(nèi)。12小時后見細(xì)胞完全貼壁，實驗分對照組，單獨Eeyarestatin I組，M1感染組和Eeyarestatin I/M1聯(lián)用組。所用劑量為：Eeyarestatin I(5μM)；M1病毒設(shè)不同的劑量梯度。

b)MTT與細(xì)胞內(nèi)的琥珀酸脫氫酶反應(yīng)：培養(yǎng)至72h時，每孔加入MTT 20μl(5mg/ml)，繼續(xù)孵育4小時，此時鏡檢可觀察到、活細(xì)胞內(nèi)形成的顆粒狀藍(lán)紫色甲臜結(jié)晶。

c)溶解甲臜顆粒：小心吸去上清，加DMSO 100μl/孔溶解形成的結(jié)晶，在微型振蕩器上震蕩5min，然后在酶聯(lián)檢測儀上用波長570nm檢測各孔的光密度(OD值)。每組實驗重復(fù)3次。細(xì)胞存活率＝藥物處理組OD值/對照組OD值×100％。

d)用origin 8軟件進(jìn)行非線性曲線擬合，繪制兩條量效曲線：1.Eeyarestatin I單用；2.Eeyarestatin I與M1病毒聯(lián)用，計算兩條曲線的曲線下面積差值，并以倍數(shù)表示(Eeyarestatin I單用曲線下面積-Eeyarestatin I與M1病毒聯(lián)用曲線下面積/Eeyarestatin I與M1病毒聯(lián)用曲線下面積)，即相對曲線下面積差異倍數(shù)。圖4b中DAUC表示不同細(xì)胞中相對曲線下面積差異倍數(shù)，該數(shù)值越大說明藥物協(xié)同越顯著。

e)相對曲線下面積與相對VCP表達(dá)采用pearson相關(guān)性分析法計算，r表示相關(guān)系數(shù),r值越接近于1說明正相關(guān)性越強。

結(jié)果:

如圖4a所示，Western blot圖片底部顯示不同細(xì)胞相對VCP蛋白表達(dá)值，表明VCP的蛋白表達(dá)水平在不同細(xì)胞中不一樣。其中，人肝癌細(xì)胞Hep3B和Huh 7的VCP表達(dá)量是人原代正常細(xì)胞HH的7倍以上；人肝癌細(xì)胞Sk-Hep-1、SNU-387、SNU-449、SNU-182的VCP表達(dá)量是人原代正常細(xì)胞HH的3倍以上；人肝癌細(xì)胞PLC的VCP表達(dá)量是人原代正常細(xì)胞HH的2倍。

如圖4b所示，通過繪制兩條量效曲線，采用origin 8軟件非線性擬合表明，在腫瘤細(xì)胞中相對曲線下面積的差值(DAUC)倍數(shù)顯著高于正常細(xì)胞，這表明，Eeyarestatin I與M1病毒聯(lián)用在VCP高表達(dá)的腫瘤細(xì)胞中引起顯著的殺傷作用，但是對VCP低表達(dá)的正常細(xì)胞存活率無顯著影響。

圖4c所示，通過pearson相關(guān)性分析方法統(tǒng)計，發(fā)現(xiàn)VCP的表達(dá)與Eeyarestatin I/M1病毒聯(lián)合療法的效應(yīng)呈正相關(guān)。因此VCP的蛋白表達(dá)與VCP抑制劑和M1病毒聯(lián)合療法的抗癌效應(yīng)呈正相關(guān)，表明VCP可以作為VCP抑制劑與M1病毒聯(lián)用的生物標(biāo)記物。

實施例5VCP抑制劑協(xié)同M1溶瘤病毒通過誘導(dǎo)不可逆內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激引起腫瘤細(xì)胞凋亡

材料：

M1病毒，人肝癌細(xì)胞Hep3B，單克隆抗體(IRE1，XBP1(S),BiP,p-PERK,p-eIF2α，ATF6，poly-ub，GAPDH，caspase-12，CHOP，p-JNK)。

方法：

選擇對數(shù)生長期細(xì)胞，DMEM完全培養(yǎng)液調(diào)制成細(xì)胞懸液，細(xì)胞以1×10⁶的密度接種在60mm培養(yǎng)皿內(nèi)。12小時后見細(xì)胞完全貼壁，實驗分對照組，單獨Eeyarestatin I組，M1感染組和Eeyarestatin I/M1聯(lián)用組。所用劑量為：所用劑量為：M1病毒(MOI＝0.001)感染細(xì)胞；Eeyarestatin I(5μM)。

藥物處理設(shè)定時間后，收集蛋白質(zhì)樣本，進(jìn)行Western blot檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激marker(IRE1，XBP1(S),BiP,p-PERK,p-eIF2α，ATF6，poly-ub)；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激 相關(guān)凋亡通路激活情況(caspase-12，CHOP，p-JNK)。

結(jié)果:

單獨使用Eeyarestatin I(5μM)能夠上調(diào)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)的未折疊蛋白反應(yīng)通路(unfold protein response)，如圖5a所示，Eeyarestatin I(5μM)能夠誘導(dǎo)升高IRE1，XBP1(S)，p-PERK,p-eIF2α等內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)的標(biāo)志物。而單獨使用溶瘤病毒M1(MOI＝0.001)能夠抑制IRE1，XBP1(s)，同時不影響其他通路。我們觀察到當(dāng)Eeyarestatin I(5μM)與M1病毒聯(lián)合使用時，M1病毒能夠阻斷由Eeyarestatin I引起的IRE1、XBP1通路的上調(diào)，從而促進(jìn)劇烈的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，激活caspase-12和JNK通路(圖5b)，誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡。

實施例6Eeyarestatin I與M1病毒聯(lián)合應(yīng)用顯著抑制人肝細(xì)胞癌株移植瘤生長。

材料：

M1病毒、人肝癌細(xì)胞株Hep3B、人肝癌細(xì)胞株Huh 7、4周齡雌性BALB/c裸鼠。

方法：

本實驗采用隨機的、單盲的設(shè)計。將5×10⁶Hep 3B或者Huh 7細(xì)胞注入到4周齡BALB/c裸鼠背側(cè)皮下。

當(dāng)腫瘤大小達(dá)到50mm³時分組，包括不處理的對照組、單獨應(yīng)用Eeyarestatin I組(腹腔注射2mg/kg/d)、單獨應(yīng)用M1感染組(尾靜脈注射M1病毒5×10⁵PFU/次)和Eeyarestatin I/M1聯(lián)用組(相同方式給予相同劑量的Eeyarestatin I和M1病毒)，連續(xù)注射6次。每兩天測量腫瘤的長寬和體重，腫瘤的體積依據(jù)公式(長×寬2)/2。測量腫瘤體積后進(jìn)行One way ANOVA統(tǒng)計，***表示p<0.001。

結(jié)果:

在人肝癌細(xì)胞株Hep3B、人肝癌細(xì)胞株Huh 7兩種腫瘤細(xì)胞移植瘤動物體內(nèi)，病理解剖測定腫瘤體積表明，和對照組比較，單獨應(yīng)用Eeyarestatin I組和單獨M1感染組只能引起腫瘤體積輕微的縮小，Eeyarestatin I/M1聯(lián)用組能引起腫瘤體積 顯著地縮小(圖6b和6d)，在實驗終點，人肝癌細(xì)胞株Hep3B模型中對照組腫瘤體積是1463.6mm²，單獨應(yīng)用Eeyarestatin I組和單獨M1感染組腫瘤體積是1189.7mm²和1117.5mm²，而Eeyarestatin I/M1聯(lián)用組腫瘤體積是404.3mm²。人肝癌細(xì)胞株Huh 7模型中對照組腫瘤體積是401.6mm²，單獨應(yīng)用Eeyarestatin I組和單獨M1感染組腫瘤體積是279.5mm²和346.2mm²，而Eeyarestatin I/M1聯(lián)用組腫瘤體積是128.3。運用One way ANOVA統(tǒng)計表明差異具備統(tǒng)計學(xué)意義(圖6a和6c)。

本發(fā)明所記載的實施方式僅為闡釋性例子，本發(fā)明的實施方式并不受上述的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應(yīng)為等同的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。