本發(fā)明涉及組織皮膚敷料領域，還涉及一種皮膚敷料的制備方法。
背景技術：
皮膚是人體面積最大的器官，是重要的保護屏障，還具有感覺、保護、調解體溫等重要生理功能。當正常皮膚組織在外界致傷因素(燒傷、創(chuàng)傷等)及機體內在因素(營養(yǎng)不良、缺氧和感染等)作用導致的損害形成創(chuàng)面，表現(xiàn)為皮膚完整性的破壞、正常組織的缺失和皮膚功能的喪失。
臨床上常見創(chuàng)面有燒傷、創(chuàng)傷等重大疾病，瘢痕、皮膚色素性疾病、良性惡性腫瘤等手術切除后形成的皮膚缺損等急性創(chuàng)面，還有如糖尿病性潰瘍、血管性潰瘍、壓力性潰瘍、放射性潰瘍、腫瘤性潰瘍、瘢痕性潰瘍、神經(jīng)性潰瘍等慢性創(chuàng)面。
手術修復是目前治療創(chuàng)面的主要方法，但是，無論是傳統(tǒng)的皮片移植、皮瓣移植、郵票皮移植、微粒皮移植、網(wǎng)狀皮移植、復合皮移植等，還是目前的組織工程皮膚，目前都未能有效的解決創(chuàng)面修復的難題。尤其是重大疾病燒傷患者康復后往往瘢痕增生，汗腺缺失，皮膚失去原有的功能，生活質量低下；慢性創(chuàng)面則遷延不愈，輕者極大消耗醫(yī)療資源，重者并發(fā)感染、膿毒血癥等嚴重危害生命。
技術實現(xiàn)要素：
本發(fā)明目的在于提供一種組織工程皮膚，以解決上述技術問題的至少一個，也即是解決上述提及的創(chuàng)面修復難的問題。
本發(fā)明的另一個目的在于提供上述組織工程皮膚的制備方法，以解決上述技術問題的至少一個。
根據(jù)本發(fā)明的一個方面，提供了一種海藻酸鈉水凝膠支架構建的組織工程皮膚，自上而下由表皮層和真皮層組成，
表皮層是位于真皮層上方的一層種子細胞，
真皮層包括種子細胞和海藻酸鈉水凝膠支架，種子細胞位于海藻酸鈉水凝膠支架的表面和支架中，以形成皮膚附屬器。
在一些具體的實施方式中，上述種子細胞可以是表皮干細胞或通過人工培養(yǎng)得到的表皮基底層細胞懸液。
在一些具體的實施方式中，上述表皮基底層細胞懸液可以通過以下方法制備得到：取人工皮片，將皮片放置于消化酶溶液中消化15～25分鐘，再將自體皮片取出，并放入至乳酸鈉林格氏液中，中和酶反應，撕下皮片的表皮，在皮片基底層上刮削基底層細胞，用乳酸鈉林格氏液沖洗收集掛下的基底層細胞，制得表皮基底層細胞懸液。
在一些具體的實施方式中，海藻酸鈉水凝膠支架可以通過以下方式制備得到：
(1)如下式所示，將4～6g的BLG-NCA單體溶解于80～100mL的苯-二氧六環(huán)混合溶劑中，以ω-端氨基聚乙二醇為引發(fā)劑，室溫反應60～72小時，將反應液倒入無水乙醇中沉淀，過濾，真空干燥得淡黃色半透明狀固體，得PEG-PBLG(PEG即聚乙二醇，PBLG即聚γ-芐基L-谷氨酸)嵌段共聚物，
苯-二氧六環(huán)混合溶劑中苯與二氧六環(huán)的體積比為4:1，BLG-NCA單體與ω-端氨基聚乙二醇的摩爾比為70～80:1，反應液與無水乙醇的體積比為1:20～30；
(2)將步驟(1)所得的PEG-PBLG嵌段共聚物溶于水中，使其濃度大于1g/20ml，攪拌下加入EGF(表皮生長因子)原液至溶液中的EGF達到最大容量為止，靜置4～12小時，使EGF包埋于PEG-PBLG形成的球形納米粒中；
親水的PEG和疏水的PBLG復合形成兩親性聚合物，在水介質中自動發(fā)生定向排列，當高于一定濃度(1g/20ml)時，PBLG之間緊密聚集于內，而PEG則舒展于外，自組裝形成納米級大小的球形納米粒。在形成納米粒的過程中，EGF在親水介質和PBLG疏水微區(qū)之間發(fā)生分配，大部分包埋在納米粒的核內，生成載有EGF的PEG-PBLG納米粒。
(3)往步驟(2)所得溶液中加入EGF原液至溶液中的EGF達到最大容量為止，按0.02～0.04g海藻酸鈉/mL溶液的比例往步驟(2)所得溶液中加入海藻酸鈉，攪拌使其完全溶解，然后按0.04～0.1g乙二胺/mL溶液的比例往步驟(2)所得溶液中加入乙二胺，40℃下攪拌至完全溶解，2℃-6℃靜止過夜，得到海藻酸鈉水凝膠支架。
根據(jù)本發(fā)明的另外一個方面，本發(fā)明還提供了上述海藻酸鈉水凝膠支架構建的組織工程皮膚的制備方法，包括以下步驟：
(1)將4～6g的BLG-NCA單體溶解于80～100mL的苯-二氧六環(huán)混合溶劑中，以ω-端氨基聚乙二醇為引發(fā)劑，室溫反應60～72小時，將反應液倒入無水乙醇中沉淀，過濾，真空干燥得淡黃色半透明狀固體，得PEG-PBLG嵌段共聚物，
苯-二氧六環(huán)混合溶劑中苯與二氧六環(huán)的體積比為4:1，BLG-NCA單體與ω-端氨基聚乙二醇的摩爾比為70～80:1，反應液與無水乙醇的體積比為1:20～30；
(2)將步驟(1)所得的PEG-PBLG嵌段共聚物溶于水中，使其濃度大于1g/20ml，攪拌下加入EGF原液至溶液中的EGF達到最大容量為止，靜置4～12小時，使EGF包埋于PEG-PBLG形成的球形納米粒中；
(3)往步驟(2)所得溶液中加入EGF原液至溶液中的EGF達到最大容量為止，按0.02～0.04g海藻酸鈉/mL溶液的比例往步驟(2)所得溶液中加入海藻酸鈉，攪拌使其完全溶解，然后按0.04～0.1g乙二胺/mL溶液的比例往步驟(2)所得溶液中加入乙二胺，40℃下攪拌至完全溶解，2℃-6℃靜止過夜，得到海藻酸鈉水凝膠支架；
(4)按105個細胞/cm3海藻酸鈉水凝膠支架的比例往步驟(3)中得到的海藻酸鈉水凝膠支架中加入表皮干細胞或淋灑表皮基底層細胞懸液。
相較于現(xiàn)有的組織工程皮膚或者傳統(tǒng)的自體植皮相比，本發(fā)明的組織工程皮膚具有下列優(yōu)點：
1.本發(fā)明將種子細胞(表皮干細胞或表皮基底層細胞)置于海藻酸鈉水凝膠支架中或支架上，構建具有生物活性的組織工程皮膚替代物。由于種子細胞與海藻酸鈉水凝膠支架形成皮膚附屬器，將本發(fā)明敷在創(chuàng)面上時，可以幫助創(chuàng)面恢復正常的組織結構。
2.由于水凝膠支架交聯(lián)網(wǎng)絡中含有大量水分，可以很好地供給細胞養(yǎng)分，同時交聯(lián)了EGF，可以調節(jié)細胞的生長和分化，因此水凝膠支架可以更好地模擬細胞生長所需的類組織樣物理和空間結構，也就是提供了細胞的三維培養(yǎng)空間，更有利于表皮基底層細胞的培養(yǎng)和功能維持，并且可塑性高、制作工藝相對簡單、臨床應用方便。
3.本發(fā)明的組織工程皮膚，制作快速，工藝簡單，可批量生產(chǎn)，能有效緩解臨床中皮源不足的問題。
附圖說明
圖1是組織工程皮膚的結構示意圖。
具體實施方式
下面結合具體實施例對本發(fā)明作進一步詳細的說明。
(1)如下式所示，將4～6g的BLG-NCA單體溶解于80～100mL的苯-二氧六環(huán)混合溶劑中，以ω-端氨基聚乙二醇為引發(fā)劑，室溫反應60～72小時，將反應液倒入無水乙醇中沉淀，過濾，真空干燥得淡黃色半透明狀固體，得PEG-PBLG(PEG即聚乙二醇，PBLG即聚γ-芐基L-谷氨酸)嵌段共聚物，
苯-二氧六環(huán)混合溶劑中苯與二氧六環(huán)的體積比為4:1，BLG-NCA單體與ω-端氨基聚乙二醇的摩爾比為70～80:1，反應液與無水乙醇的體積比為1:20～30；
(2)將步驟(1)所得的PEG-PBLG嵌段共聚物溶于水中，使其濃度大于1g/20ml，攪拌下加入EGF(表皮生長因子)原液至溶液中的EGF達到最大容量為止，靜置4～12小時，使EGF包埋于PEG-PBLG形成的球形納米粒中；
親水的PEG和疏水的PBLG復合形成兩親性聚合物，在水介質中自動發(fā)生定向排列，當高于一定濃度(1g/20ml)時，PBLG之間緊密聚集于內，而PEG則舒展于外，自組裝形成納米級大小的球形納米粒。在形成納米粒的過程中，EGF在親水介質和PBLG疏水微區(qū)之間發(fā)生分配，大部分包埋在納米粒的核內，生成載有EGF的PEG-PBLG納米粒。
(3)往步驟(2)所得溶液中加入EGF原液至溶液中的EGF達到最大容量為止，按0.02～0.04g海藻酸鈉/mL溶液的比例往步驟(2)所得溶液中加入海藻酸鈉，攪拌使其完全溶解，然后按0.04～0.1g乙二胺/mL溶液的比例往步驟(2)所得溶液中加入乙二胺，40℃下攪拌至完全溶解，2℃-6℃靜止過夜，得到海藻酸鈉水凝膠支架。
(4)按105個細胞/cm3海藻酸鈉水凝膠支架的比例往步驟(3)中得到的海藻酸鈉水凝膠支架中加入表皮干細胞或淋灑表皮基底層細胞懸液。
由此，細胞經(jīng)過生長后，形成如圖1所示的組織工程皮膚，自上而下由表皮層1和真皮層2組成。海藻酸鈉水凝膠支架的表面和支架中，形成有皮膚附屬器3。
由于水凝膠支架交聯(lián)網(wǎng)絡中含有大量水分，可以很好地供給細胞養(yǎng)分，同時交聯(lián)了EGF，可以調節(jié)細胞的生長和分化，因此水凝膠支架可以更好地模擬細胞生長所需的類組織樣物理和空間結構，也就是提供了細胞的三維培養(yǎng)空間，更有利于表皮基底層細胞的培養(yǎng)和功能維持，構建具有生物活性的組織工程皮膚替代物。將本發(fā)明敷在創(chuàng)面上時，可以幫助創(chuàng)面恢復正常的組織結構。
以上的僅是本發(fā)明的一些實施方式。對于本領域的普通技術人員來說，在不脫離本發(fā)明創(chuàng)造構思的前提下，還可以做出若干變形和改進，這些都屬于本發(fā)明的保護范圍。