本發(fā)明涉及納米顆粒的制備與生物應用領域，具體涉及一種粒徑可控的阿霉素納米顆粒及其制備方法。

背景技術：

長期以來，科研工作者的一直致力于研究一種能制備粒徑可控的有機聚合物納米顆粒的方法。過去幾十年里，在納米顆粒的生物學及藥學領域的應用方面做出了大量研究，并且有幾種不同類型的納米顆粒已經得到不同領域、不同程度的應用。例如，修飾相應的具有靶向性的分子的金納米顆粒、超順磁性納米粒子，可用于顯示體內腫瘤細胞；藥物分子修飾到納米粒子上，通過一定的轉運機制可以使抗腫瘤藥物在病灶部位緩慢釋放，這可以大大降低抗癌藥物的副作用，同時延長藥物作用時間，提高藥物抗腫瘤效果；此外，納米顆粒還可應用于影像學，用于實時動態(tài)檢測如MRI、PET等。

然而，納米顆粒的合成與應用上依然面臨諸多問題，例如，納米顆粒的大小與形態(tài)不易控制，生物安全性低及免疫原性強，人體循環(huán)系統穩(wěn)定不好，進而很難順利到達病灶，體內不易降解等問題。

技術實現要素：

為克服現有技術中存在的技術缺陷，本發(fā)明的目的之一是提供一種粒徑可控的阿霉素納米顆粒。

本發(fā)明的另一目的是提供所述阿霉素納米顆粒的制備方法。

本發(fā)明提供的粒徑可控的阿霉素納米顆粒以聚乙二醇維生素E琥珀酸酯為內核，由聚乙二醇-阿霉素與聚(異丁烯-alt-馬來酸酐)改性的β-環(huán)糊精通過自組裝包裹所述內核形成。

具體來說，本發(fā)明的粒徑可控的阿霉素納米顆粒包括外層、中間層以及內核，其中，內核為聚乙二醇維生素E琥珀酸酯(TPGS)，中間層為聚(異丁烯-alt-馬來酸酐)改性的β-環(huán)糊精(p(IB-alt-MAnh)-CD)，其在納米顆粒的 組裝中起到橋梁作用，阿霉素可憑借超分子作用嵌入到環(huán)糊精的疏水內腔中，而聚(異丁烯-alt-馬來酸酐)中的疏水鏈段則可與內核相互作用，起到連接內核與外層的作用。外層則為聚乙二醇-阿霉素(mPEG-DOX)，其結構如下所示：

在主-客體分子自組裝過程中，利用環(huán)糊精內腔的疏水性以及阿霉素的苯環(huán)結構相互作用，阿霉素端嵌入到環(huán)糊精的內腔中，連接阿霉素的聚乙二醇端形成親水的外層。

本發(fā)明提供的阿霉素納米顆粒中，可根據粒徑的要求調整聚乙二醇維生素E琥珀酸酯的用量。在本發(fā)明的實施方式中，所述聚乙二醇維生素E琥珀酸酯內核的質量為所述聚乙二醇-阿霉素與聚(異丁烯-alt-馬來酸酐)改性的β-環(huán)糊精總質量的0.05～20倍；優(yōu)選為0.1～10倍；更優(yōu)選為0.2～5倍。

本發(fā)明提供的阿霉素納米顆粒中，內核還可包含其他活性成分，尤其是可與阿霉素聯用增加抗腫瘤活性的抗腫瘤藥物。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方式中，所述內核中還含有紫杉醇納米晶體，紫杉醇與阿霉素聯用可產生協同增效作用，因而能大大提高納米顆粒的抗腫瘤活性，通過調節(jié)紫杉醇的用量可以調節(jié)紫杉醇納米晶體的大小，進而也可調節(jié)納米顆粒粒徑大小；而且，紫杉醇的結構也可更好地與聚(異丁烯-alt-馬來酸酐)中的烯鍵端結合，從而形成更加穩(wěn)定的納米顆粒。

本發(fā)明提供的阿霉素納米顆粒中，所述聚(異丁烯-alt-馬來酸酐)改性的β-環(huán)糊精為聚(異丁烯-alt-馬來酸酐)與己二胺-β-環(huán)糊精通過偶聯反應所得。其制備過程在EDC/NHS作用下，可以在DMSO等溶劑中進行，調節(jié)反應體系的pH值為8.0～9.0，室溫攪拌48～72小時，反應結束后以磷酸鹽緩沖液透析(pH8.0～9.0)36～48小時，冷凍干燥后即得，并于低溫保存。

本發(fā)明提供的阿霉素納米顆粒中，所述聚(異丁烯-alt-馬來酸酐)的平均分子量可以為5000～10000。

本發(fā)明提供的阿霉素納米顆粒中，所述聚乙二醇-阿霉素中聚乙二醇的聚合度n可以為45～450，分子量可以為2000～20000。

聚乙二醇-阿霉素的制備可采用已有方法，也可如以下過程：將mPEG-酰肼與阿霉素溶解于無水的極性溶劑中，加入過量三乙胺，室溫，避光，攪拌48～72h使其反應完全，純化。mPEG-酰肼與阿霉素的摩爾比可以為1:0.2～5，優(yōu)選為1:1.5～2.0。反應過程中可使用NaOH溶液等調節(jié)反應體系的pH值，使其保持在8.0～10.0，優(yōu)選為8.5～9.0。

本發(fā)明提供的阿霉素納米顆粒中，還可包含有表面活性劑、乳化劑中的一種或多種，可部分或全部替代內核為聚乙二醇維生素E琥珀酸酯(TPGS)。例如，可以為表面活性劑IGEPAL CO-520、乳化劑PluronicF 127等。

本發(fā)明提供的阿霉素納米顆粒的制備方法，包括以下步驟：

S1：將聚乙二醇-阿霉素與聚(異丁烯-alt-馬來酸酐)改性的β-環(huán)糊精溶于水中超聲條件下進行自組裝，冷凍干燥得到超分子復合物；

S2：將聚乙二醇維生素E琥珀酸酯以及可選的紫杉醇納米晶體溶于無水乙醇中制得乳濁液；

S3：將步驟S1所得的超分子復合物溶于水中，再將步驟S2所得乳濁液加入到其中，揮干無水乙醇，0.45μm濾膜過濾后離心即得所述阿霉素納米顆粒。

上述制備方法中，步驟S2所得的乳濁液中，聚乙二醇維生素E琥珀酸酯以及可選的紫杉醇納米晶體形成納米膠束形態(tài)。

上述制備方法中，所述聚乙二醇-阿霉素與所述聚(異丁烯-alt-馬來酸酐)改性的β-環(huán)糊精的質量比為1:50～60。

上述制備方法中，所述步驟S1中，將聚乙二醇-阿霉素與聚(異丁烯-alt-馬來酸酐)改性的β-環(huán)糊精溶于水中，調節(jié)pH值為8.0～9.0，進行自組裝。

本發(fā)明提供的阿霉素納米顆粒利用了p(IB-alt-MAnh)與mPEG-DOX間的主-客體自組裝反應形成納米顆粒，mPEG-DOX分子中腙鍵具有酸敏性，在酸性環(huán)境下，mPEG-DOX釋放出阿霉素分子，而在生物體生理環(huán)境下(pH7.35～7.45)，mPEG-DOX不會發(fā)生水解，不會釋放阿霉素分子。另一方面， 本發(fā)明提供的阿霉素納米顆粒加入了具有表面活性的分子TPGS，同時包裹疏水性的抗腫瘤藥物紫杉醇(PTX),調節(jié)紫杉醇用量可調節(jié)納米顆粒大小。TPGS與PTX組成疏水內核，有助于疏水性的藥物紫杉醇在機體內的運輸，尺寸越小納米顆粒越易于進入腫瘤組織內部。本發(fā)明提供的阿霉素納米顆粒到達腫瘤組織內之后，mPEG-DOX發(fā)生分解，DOX、PTX得以釋放，二者聯合用藥，具有協同作用，可明顯提高抗腫瘤活性，藥物的靶向性更強，治療效果大大增強。

不同于傳統的通過化學鍵的形成與斷裂的方法制備的納米顆粒，本發(fā)明的納米顆粒制備過程簡單，反應條件溫和，原料易于獲取，采用超聲方式組裝最終所得的納米顆粒，通過改變超聲條件也可調節(jié)顆粒大小。本發(fā)明的納米顆粒具有良好的生物安全性及組織相容性，利用超分子間的主-客體自組裝反應制備納米顆粒，可修飾阿霉素甚至多種組合的抗癌藥物，以發(fā)揮抗腫瘤藥物的協同作用，大大增強藥物療效。此外，本發(fā)明制備的納米顆粒具有酸敏性，在腫瘤組織的酸性環(huán)境中更利于藥物的釋放。另一方面，通過調節(jié)TPGS的用量，可以方便調控納米顆粒的粒徑，同時還能起到納米橋作用，使形成的納米顆粒在生物體生理環(huán)境下具有良好的穩(wěn)定性。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實施例制得的p(IB-alt-MAnh)-CD的¹H-NMR圖。

圖2為p(IB-alt-MAnh)-CD對乳腺癌細胞MCF-7細胞株及抗阿霉素乳腺癌細胞株MCF-7/ADR細胞的毒性測試結果圖表。

圖3為本發(fā)明實施例制得的mPEG-DOX的¹H-NMR圖。

圖4A-4C為本發(fā)明實施例中不同的紫杉醇濃度條件下DLS測得的納米顆粒粒徑分布圖及透射電鏡結果；其中，圖4A表示PTX濃度為0.5mg/ml時所得納米顆粒粒徑分布圖及其透射電鏡，圖4B表示PTX濃度為1mg/ml時所得納米顆粒粒徑分布圖及其透射電鏡，圖4C表示PTX濃度為2mg/ml時所得納米顆粒粒徑分布圖及其透射電鏡。

圖5為本發(fā)明實施例制得的納米顆粒的FT-IR圖譜。

具體實施方式

下面通過實施例對本發(fā)明進行詳細說明，以使本發(fā)明的特征和優(yōu)點更清 楚。但應該指出，實施例用于理解本發(fā)明的構思，本發(fā)明的范圍并不僅僅局限于本文中所列出的實施例。

如沒有特別說明，實施例所使用的原料均為市售產品、所使用的操作均為本領域的常規(guī)操作。

實施例粒徑可控的阿霉素納米顆粒的制備

1、聚(異丁烯-alt-馬來酸酐)改性的β-環(huán)糊精(p(IB-alt-MAnh)-CD)的制備

(1)將聚(異丁烯-alt-馬來酸酐)(p(IB-alt-MAnh)，Mn(0.5K-1K)溶于DMSO中，濃度為5-15mg/ml；

(2)加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽摩爾比2-3倍于馬來酸酐的重復鏈數；

(3)調整所得溶液的pH至8.0-9.0；

(4)10-20min內加入N-羥基丁二酰亞胺(NHS)(EDC:NHS摩爾比＝1:1)；

(5)將己二胺-β-環(huán)糊精溶于DMSO中(濃度為0.01-0.1mg/ml)，磁力攪拌，得到己二胺-β-環(huán)糊精溶液；

(6)在步驟(4)加入NHS后15-20min，將所得的含p(IB-alt-MAnh)的溶液以60-80滴/分鐘的速度加入到步驟(5)的己二胺-β-環(huán)糊精溶液中，同時劇烈攪拌，室溫攪拌48-72小時；

(7)將步驟(6)所得的溶液進行磷酸鹽緩沖液透析(pH 8.0-9.0)36-48小時，

(8)冷凍干燥得到白色粉末固體，置于-20℃保存。

該反應過程如下圖式所示：

反應產物p(IB-alt-MAnh)-CD溶于氧化氘做¹H-NMR，結果如圖1所示。

為進一步探索該物質的生物相容性，選用細胞為人乳腺癌細胞系MCF-7及MCF-7ADR細胞進行測試(參照[1]R.Namgung,Y.Mi Lee,J.Kim,Y.Jang,B.Lee,I.Kim,P.Sokkar,Y.M.Rhee,A.S.Hoffman,W.J.Kim,Poly-cyclodextrin and poly-paclitaxel nano-assembly for anticancer therapy.Nature Communications 5(2014).[2]X.Xu,X.Chen,Z.Wang,X.Jing,Ultrafine PEG–PLA fibers loaded with both paclitaxel and doxorubicin hydrochloride and their in vitro cytotoxicity.Eur J Pharm Biopharm 72(1)(2009)18-25.)，結果如圖2所示，圖中橫坐標表示p(IB-alt-MAnh)-CD的濃度，縱坐標表示對細胞系的細胞活性。

2、化合物mPEG-DOX的制備

(1)將鹽酸阿霉素溶于二甲基亞砜中(濃度為1-100mg/ml)，磁力攪拌；

(2)加入適量三乙胺，為鹽酸阿霉素的1.5倍當量；

(3)加入NaOH溶液調整溶液pH至堿性(pH＝8.5-9.0)；

(4)加入mPEG-HZ(Mw＝2000-20000)，室溫，避光，磁力攪拌72h；

(5)加入大量乙醚進行沉淀(10-15倍于溶液體積)；

(6)真空干燥，得到mPEG-DOX紅色粉末，置于-20℃保存。

該反應過程示如下圖式：

產物mPEG-DOX以氘代二甲基亞砜為溶劑，¹H-NMR結果如圖3所示。

3、p(IB-alt-MAnh)-CD/mPEG-DOX納米顆粒的制備

(1)將p(IB-alt-MAnh)(10mg)、mPEG-DOX(0.2mg)溶于去離子水2ml中；

(2)調節(jié)pH至8.0-9.0，室溫，避光，超聲，60～100W,20K HZ；

(3)冷凍干燥，得到粉末樣固體；

(4)將凍干后的固體粉末，溶于去離子水，濃度為3mg/ml；

(5)超聲，60～100W,20K HZ，10-20min，標記為A；

(6)將Paclitaxel(PTX)(分別為1mg/ml,2mg/ml,5mg/ml)，維生素E聚乙二醇琥珀酸酯(TPGS)(質量比TPGS:PTX＝2：1)溶于無水乙醇，充分攪拌，標記為B；

(7)微量注射泵將B逐滴加入A中(1.0-1.5ml/min)，同時劇烈攪拌,完全加入后超聲60-100W,20K HZ 10-20min；

(8)室溫，避光，磁力攪拌24h，使無水乙醇完全揮發(fā)；

(9)0.45μm濾膜過濾；

(10)14000rpm，10-15min離心；

(11)去上清，沉淀重懸，超聲(100W，15min)。

測動態(tài)光散射(馬爾文ZS90)，結果如圖4A-4C所示，分別表示PTX濃度為1mg/ml、2mg/ml、5mg/ml條件下，動態(tài)光散射測得納米顆粒粒徑大 小，PTX濃度為0.5mg/ml時所得納米顆粒平均粒徑為88.7±4.5nm，PTX濃度為1mg/ml時所得納米顆粒平均粒徑為136.5±6.1nm，PTX濃度為2mg/ml時所得納米顆粒平均粒為214.5±7.4nm；磷鎢酸染色，透射電鏡檢測納米顆粒形態(tài)。此外，圖5的FT-IR結果表明納米顆粒中含有p(IB-alt-MAnh)-CD，mPEG-HZ、TPGS、PTX。

由實施例可知，本發(fā)明的納米顆?？赏ㄟ^內核紫杉醇的量控制納米顆粒的粒徑，由此使其粒徑可控，從而有利于增強納米顆粒的穩(wěn)定性。

除非特別限定，本發(fā)明所用術語均為本領域技術人員通常理解的含義。

本發(fā)明所描述的實施方式僅出于示例性目的，并非用以限制本發(fā)明的保護范圍，本領域技術人員可在本發(fā)明的范圍內作出各種其他替換、改變和改進，因而，本發(fā)明不限于上述實施方式，而僅由權利要求限定。