本發(fā)明涉及一種藥物制劑，特別涉及一種免疫抑制藥物西羅莫司的納米混懸劑及其制備方法，屬藥品領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

西羅莫司是一種新型強效親脂性三烯含氮大環(huán)內(nèi)酯抗生素類免疫抑制劑。作為第三代免疫抑制劑，對外周血單核細(xì)胞有效抗增殖作用比環(huán)孢素強50-500倍。由于腎毒性低，作為腎移植抗排斥藥，于1999年10月在美國首次上市。同時西羅莫司還具有鎮(zhèn)痛、抗真菌、抗炎和抗腫瘤等作用。

國外市售的西羅莫司制劑有口服液和納米結(jié)晶片兩種，其中口服液以Phosal 50PG(磷脂酰膽堿，PEG，甘油一酯，甘油二酯、乙醇1.5％～2.5％，大豆脂肪酸和抗壞血酸棕櫚酸酯)為溶液，在人體內(nèi)的生物利用度約為14％，且具有明顯的個體差異?？诜涸诳诜o藥后，當(dāng)遇到水性介質(zhì)的消化道，藥物可從制劑的溶液中快速析出，在藥物被吸收以前，可形成較大的藥物固體粒子。這些粒子，可能形成的粒徑比較大，其本身很難通道消化道直接吸收，盡管溶液劑處方中存在大量的表面活性劑吐溫80，可以阻滯藥物在消化道水性介質(zhì)中析出，并可以在一定程度上促進(jìn)消化道對藥物粒子的吸收，但西羅莫司人體生物利用度還是偏低。與口服溶液相比，西羅莫司納米結(jié)晶片劑的生物利用度提高了約21％，這是由于西羅莫司納米顆粒(平均粒徑小于400nm)在胃腸道中的飽和溶解度較西羅莫司大顆粒高，溶出速率也快，這將促進(jìn)西羅莫司的吸收。但是該納米結(jié)晶片劑制備工藝繁瑣，先長時間采用濕法研磨技術(shù)，制備出均一納米混懸劑，然后再采取多層包衣技術(shù)將納米混懸劑噴灑在空白素片上，最后再包糖衣，導(dǎo)致整個生產(chǎn)成本較高，設(shè)備投資較大，關(guān)鍵控制點多，且不能做到均一穩(wěn)定連續(xù)生產(chǎn)。此外，納米結(jié)晶片由于是固體制劑，在兒童順應(yīng)性方面存在較大弊端。因此亟需開發(fā)一種制備工藝簡單、生產(chǎn)成本低、生物利用度高，且適合兒童服用的西羅莫司口服納米混懸劑。

關(guān)于西羅莫司納米研究的文獻(xiàn)大都是關(guān)于載藥納米粒、脂質(zhì)體、自乳化系統(tǒng)等，但沒有關(guān)于西羅莫司口服納米混懸劑的文獻(xiàn)報道。對于藥物納米混懸劑來說，其制備方法主要有研磨法、高壓均質(zhì)法和液相沉淀法，前兩種方法是采用物理方法，將原料大顆粒破碎成納米顆粒，存在耗時長、成本高、易金屬殘留、對設(shè)備要求高等問題，而反溶劑重結(jié)晶法為一種物理化學(xué)方法，先將藥物溶解在與水混溶的溶劑里，然后再與水溶液混合，通過控制相關(guān)條件就可以制備出納米混懸劑，整個過程簡單快捷、可連續(xù)生產(chǎn)，但也存在有機溶劑添加的問題，使得納米混懸劑需要進(jìn)一步后續(xù)處理去除有機溶劑，導(dǎo)致整個制備步驟繁瑣，生產(chǎn)成本陡增，難以放大和連續(xù)制備。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種一步制備西羅莫司納米混懸劑及其制備方法。

本發(fā)明的西羅莫司納米混懸劑，由活性成分西羅莫司、表面活性劑、助懸劑、甜味劑、防腐劑、乙醇、水制備而成，在制備過程中，各組分的含量如下：

西羅莫司的含量為0.05-0.3％，

表面活性劑的含量為0.1-5％，

助懸劑的含量為0.5-10％，

甜味劑的含量為1-20％，

防腐劑的含量0.05-0.5％，

乙醇的含量為1.5-2.5％，

其余為水，

其中所述含量中的百分比為質(zhì)量體積百分比，如：1g質(zhì)量的原料存在于100ml體積的溶液中。

所得西羅莫司納米混懸劑中，西羅莫司納米顆粒的平均粒徑小于400nm。

其中，所述表面活性劑選自：十二烷基硫酸鈉、十二烷基磺酸鈉、十二烷基苯磺酸鈉、甘膽酸鈉、油酸、油酸鈉、膽酸，膽酸鈉，去氧膽酸，去氧膽酸鈉、泊洛沙姆、吐溫、司盤、卵磷脂、豆磷脂、聚乙二醇的一種或幾種；

其中，所述助懸劑選自：甘油、甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、羧甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉、枸櫞酸鈉、海藻酸鈉、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇中的一種或幾種混合物；

其中，所述甜味劑選自：蔗糖、AK糖、糖精鈉、紐甜、甜蜜素、甜蜜糖、甜葉菊素、山梨醇、木糖醇中的一種或幾種；

其中，所述防腐劑選自：山梨酸、山梨酸鉀、苯甲酸、苯甲酸鈉、醋酸洗必泰、尼泊金甲酯、尼泊金甲酯鈉、尼泊金乙酯、尼泊金乙酯鈉、尼泊金丙酯、尼泊金丙酯鈉中的一種或幾種。

本發(fā)明的西羅莫司納米混懸劑的制備方法，步驟如下：

(1)將西羅莫司或與防腐劑一起溶于乙醇，形成藥物的乙醇溶液；

(2)將表面活性劑、助懸劑、甜味劑或與防腐劑一起溶解于水中，形成水溶液；

(3)將藥物的乙醇溶液加入到水溶液中混合，經(jīng)反溶劑重結(jié)晶后，得到西羅莫司納米混懸劑。

本發(fā)明的西羅莫司納米混懸劑的制備方法，采用反溶劑重結(jié)晶法，形成的納米混懸劑中乙醇含量低，無需乙醇再去除，簡單快捷，一步成型。本發(fā)明的技術(shù)核心是，在保證乙醇含量不高于2.5％的條件下，將乙醇溶液與不少于39倍體積量的水溶液混合，并控制結(jié)晶條件，如溫度、藥物濃度、表面活性劑與助懸劑濃度、混合方式與強度等，使藥物晶核快速形成，并使其生長受到抑制，得到粒徑小、粒度均一、分散穩(wěn)定性好的西羅莫司納米混懸劑。

經(jīng)過對制備條件和配方組成的篩選，本發(fā)明意外的發(fā)現(xiàn)本發(fā)明最優(yōu)選的西羅莫司納米混懸劑，各組分的含量如下：

將西羅莫司原料藥在室溫條件下溶于40mL乙醇，經(jīng)0.22μm濾膜過濾，得西羅莫司溶液。然后將油酸鈉、泊洛沙姆、聚乙烯醇、甜蜜素和山梨酸室溫下溶于1500mL水，再加水定容至1960mL水，經(jīng)0.22μm濾膜過濾，得輔料水溶液。最后將西羅莫司溶液倒入輔料水溶液中，高速勻漿機20000rpm攪拌一分鐘，即得西羅莫司納米混懸劑。以下通過實驗數(shù)據(jù)進(jìn)一步說明本發(fā)明的有益效果：

1、本發(fā)明的西羅莫司納米混懸劑藥代動力學(xué)特性

實驗介紹

SD大鼠，雄性，6-7周，分成西羅莫司原料藥混懸劑給藥組和納米混懸液給藥組，每組各6只?？诜辔附o藥，給藥體積mL/kg，給藥濃度2mg/mL，采用頸靜脈插管取血。給藥前及給藥后5、15、30min，以及1、2、4、9、24h。采血量300uL，用2.0％EDTA抗凝后，將血液以4000rpm離心10min，取血漿約150uL，HPLC分析。

實驗結(jié)果

西羅莫司藥代動力學(xué)特性結(jié)果如表1所示。結(jié)果表明，西羅莫司納米混懸劑較原料混懸劑，半衰期明顯增加，達(dá)峰時間有所延長，體內(nèi)暴露量提高了約2倍，血藥濃度詳見圖2。結(jié)果充分說明，西羅莫司納米混懸劑具有更高的生物利用度。

表1西羅莫司藥代動力學(xué)特性

2、本發(fā)明的西羅莫司納米混懸劑動物藥效實驗

EAE造模方法

首先將SJL/J成年雌性小鼠(6-8周齡，18-22克)分成空白對照組、EAE模型組、EAE模型組+實施例3給藥組、以及EAE模型組+西羅莫司原料藥混懸劑(濃度及輔料同實施例3)給藥組，每組各10只。造EAE模型：先將MOG35-55多肽溶于無菌PBS中，配制濃度為2mg/mL，再與等量含有4mg/mL結(jié)核桿菌的完全弗氏佐劑渦旋混勻，并用注射器反復(fù)抽打制成均勻分散的免疫抗原。實驗組每只小鼠頸部皮下注射免疫抗原100μL，左右后肢各皮下注射免疫抗原50μL，同時腹腔注射百日咳毒素0.2μg/只。造模第2天再次腹腔注射百日咳毒素0.2μg/只。

給藥方式

設(shè)定給藥量為100mg/kg/d，從免疫第0天開始每天灌胃給藥1次；空白對照組和EAE模型組每天灌服等體積的生理鹽水。連續(xù)給藥30天。

檢測指標(biāo)

一般行為學(xué)的觀察

每日觀察小鼠的一般行為學(xué)，并測定小鼠體重隨造模及給藥時間的變化。采用Kono 5分法評價標(biāo)準(zhǔn)：(1)不發(fā)病記為0分；(2)尾巴無力、脫垂行走，記為1分；(3)輕微四肢無力或單側(cè)后肢拖行，記為2分；(4)嚴(yán)重后肢麻痹或雙側(cè)后肢拖行，記為3分；(5)四肢麻痹，記為4分；(6)瀕臨死亡或死亡，記為5分。當(dāng)臨床癥狀介于兩個評分之間時，以較低分?jǐn)?shù)加0.5分表示；當(dāng)達(dá)到或超過1分時，為臨床EAE發(fā)病。

組織病理學(xué)的檢測

給藥30天后，處死小鼠，分別取各組小鼠腦和脊髓組織，置于4％的多聚甲醛中固定24小時。依次進(jìn)行石蠟切片、HE染色、Luxol fast blue(LFB)髓鞘染色后進(jìn)行觀察，并比較各組之間的差異。

免疫組織化學(xué)的檢測

采用SABC免疫組化染色法測定腦組織中SOD的表達(dá)情況。以5個視野每700平方微米的陽性細(xì)胞數(shù)計數(shù)的平均值來進(jìn)行定量分析。細(xì)胞凋亡程度的檢測

采用Tunel法，首先切片采用二甲苯脫蠟，復(fù)水后，用蛋白酶K(20μg/mL)在室溫下處理15min。然后用3％雙氧水淬火后，在末端脫氧核苷轉(zhuǎn)移酶的工作溶液中，用生物素偶聯(lián)的脫氧鳥苷三磷酸在37℃于加濕室中處理1小時。反應(yīng)停止后，在室溫下用stop或wash緩沖液處理10分鐘來終止反應(yīng)。采用抗地高辛偶聯(lián)物室溫處理30分鐘來檢測地高辛-11-dUTP的結(jié)合。最后，加入二氨基聯(lián)苯胺鹽酸鹽底物溶液來顯色，并對凋亡細(xì)胞包括細(xì)胞的DNA片段拍照。陰性對照組采用去離子水取代TdT，其余步驟保持不變，陽性對照組采用在室溫下用DNase I預(yù)處理10分鐘。最后，計算5個視野每700平方微米的陽性細(xì)胞數(shù)的百分比。

實驗結(jié)果

對EAE發(fā)病程度的影響

與正常對照組相比，EAE模型組發(fā)現(xiàn)精神萎靡、活動減少、尾巴無力、脫垂行走、后肢無力或單側(cè)后肢拖行、嚴(yán)重后肢麻痹或雙側(cè)后肢拖行、四肢麻痹、死亡等多種臨床表現(xiàn)。各組臨床評分結(jié)果如圖3所示，由結(jié)果可知，與原料藥混懸劑相比，納米混懸劑可明顯延遲EAE發(fā)病時間，并且降低發(fā)病嚴(yán)重程度。

對EAE小鼠脊髓組織的病例損傷的影響

與正常對照組相比，EAE模型組病灶處小血管周圍出現(xiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤，呈典型的“血管周袖套狀”改變。西羅莫司灌胃給藥后，小鼠病灶處的炎性細(xì)胞浸潤明顯減輕，病灶數(shù)量減少，其中納米混懸劑對EAE小鼠脊髓組織的病例損傷的減輕程度明顯好于原料藥混懸劑。對腦組織中SOD的表達(dá)的影響

由腦組織中SOD的表達(dá)情況的結(jié)果(表2)可明顯看出，與西羅莫司原料混懸劑相比，納米混懸劑灌胃給藥后，小鼠腦組織SOD的表達(dá)量明顯較大。

表2腦組織SABC免疫組化SOD表達(dá)量

對腦組織細(xì)胞凋亡的影響

腦組織細(xì)胞凋亡的定量結(jié)果如表3所示。結(jié)果表明，西羅莫司納米混懸劑灌胃給藥后，更好地均促進(jìn)了小鼠腦組織細(xì)胞凋亡。

表3腦組織細(xì)胞凋亡結(jié)果

綜上所述，與西羅莫司原料混懸劑相比，納米混懸劑具有更高的生物利用度，可較大程度減緩EAE發(fā)病程度，減輕脊髓組織的病理損傷，增加腦組織SOD的表達(dá)，促進(jìn)腦組織細(xì)胞的凋亡，對多發(fā)性硬化癥具有明顯的改善治療作用。

3、本發(fā)明制備過程中，對配方的組成、溶劑的種類、溶劑的濃度、制備溫度、攪拌時間，攪拌速度等工藝條件的篩選：

結(jié)果顯示攪拌時間對粒度影響不大，但攪拌速度對粒度影響很大，隨著攪拌速度的增加，混合強度變大，沉淀析出的納米顆粒粒度隨之減小。室溫情況下(15-25℃)，溫度對粒度影響很小，粒度變化范圍不大。在藥物含量不變的情況下，乙醇濃度對粒度影響很大，以2％效果最佳，隨著乙醇濃度升高，粒度會增大。

4、表面活性劑的選擇：

結(jié)果顯示表面活性劑的種類對粒度具有一定的影響，兩者不同類的表面活性劑混合的效果較好，泊洛沙姆+油酸鈉的效果最優(yōu)。

本發(fā)明的優(yōu)點在于：

1、納米混懸劑制備工藝簡單，成本低，只需將藥物乙醇溶液與水溶液混合，藥物重結(jié)晶后，乙醇不需要去除，可直接制備成可供口服的納米混懸劑。

2、納米混懸劑的制備可采用微通道設(shè)備，該設(shè)備為靜態(tài)混合設(shè)備，生產(chǎn)穩(wěn)定，易于控制，適宜納米混懸劑的連續(xù)生產(chǎn)。

3、納米混懸劑中乙醇濃度低，其濃度不高于市售西羅莫司口服溶液中的乙醇含量。

4、納米混懸劑中藥物顆粒粒徑小，粒度均勻，生物利用度高。

5、在順應(yīng)性方面，納米混懸劑更符合兒童患者的服用需求，對兒童用藥具有重要意義。

附圖說明：

圖1是本發(fā)明所涉及的西羅莫司原料藥及實施例3所制備納米顆粒的掃描電鏡圖。從圖可以看出通過本發(fā)明所述方法制備的納米平均粒徑為211nm，顆粒分布較窄，100-300nm，相比之下，原料藥顆粒較大，且粒度分布范圍較廣，1-20μm。

圖2是本發(fā)明所涉及的西羅莫司原料藥混懸劑及實施例3所制備納米混懸劑在大鼠體內(nèi)血藥濃度-時間圖。從圖可以看出通過本發(fā)明所述方法制備的納米混懸劑在大鼠體內(nèi)的暴露量明顯增加，具有較高的生物利用度。

圖3是本發(fā)明所涉及的西羅莫司原料藥混懸劑及實施例3所制備納米混懸劑的動物藥效對比圖。選擇實驗性過敏性腦脊髓炎模型(Experimental Allergic Encephalomyelitis model)，簡稱EAE模型，從圖可以看出通過本發(fā)明所述方法制備的納米混懸劑較原料藥混懸劑可明顯延遲EAE發(fā)病時間，并且降低發(fā)病嚴(yán)重程度。

具體實施方式

實施例1：低濃度西羅莫司納米混懸劑(0.5mg/mL)的制備

將西羅莫司原料藥在室溫條件下溶于40mL乙醇，經(jīng)0.22μm濾膜過濾，得西羅莫司溶液。然后將聚乙二醇4000、吐溫80、甲基纖維素、蔗糖和苯甲酸鈉在室溫下溶于2000mL水，再加水定容至2624mL，經(jīng)0.22μm濾膜過濾，得輔料水溶液。最后將西羅莫司溶液倒入輔料水溶液中，攪拌槳500rpm攪拌一分鐘，即得西羅莫司納米混懸劑。經(jīng)納米粒度儀測試，平均粒徑為249nm。

實施例2：高濃度西羅莫司納米混懸劑(3mg/mL)的制備

將西羅莫司原料藥和尼泊金甲酯在室溫條件下溶于80mL乙醇，經(jīng)0.22μm濾膜過濾，得西羅莫司溶液。然后將聚維酮K30、海藻酸鈉、羥丙基甲基纖維素和山梨醇在室溫下溶于2500mL水，再加水定容至3120mL水，經(jīng)0.22μm濾膜過濾，得輔料水溶液。最后將西羅莫司溶液倒入輔料水溶液中，高速勻漿機10000rpm攪拌一分鐘，即得西羅莫司納米混懸劑。經(jīng)納米粒度儀測試，平均粒徑為363nm。實施例3：中濃度西羅莫司納米混懸劑(2mg/mL)的制備

將西羅莫司原料藥在室溫條件下溶于40mL乙醇，經(jīng)0.22μm濾膜過濾，得西羅莫司溶液。然后將油酸鈉、泊洛沙姆、聚乙烯醇、甜蜜素和山梨酸室溫下溶于1500mL水，再加水定容至1960mL水，經(jīng)0.22μm濾膜過濾，得輔料水溶液。最后將西羅莫司溶液倒入輔料水溶液中，高速勻漿機20000rpm攪拌一分鐘，即得西羅莫司納米混懸劑。經(jīng)納米粒度儀測試，平均粒徑為211nm。該種情況下的納米顆粒與原料藥的顆粒形貌對比見圖1。

以上所述，僅是本發(fā)明的較佳實施例而已，并非對本發(fā)明作任何形式上的限制，本領(lǐng)域技術(shù)人員利用上述揭示的技術(shù)內(nèi)容做出些許簡單修改、等同變化或修飾，均落在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。