本發(fā)明屬于藥物評價與篩選的
技術(shù)領(lǐng)域：
：，具體涉及一種簡便、經(jīng)濟(jì)、高通量的斑馬魚心肌損傷模型的應(yīng)用，尤其是用該斑馬魚模型評價心肌損傷誘導(dǎo)劑毒性與治療劑功效的方法。
背景技術(shù)：
：：隨著生活水平的提高和人口老齡化，同時受社會、環(huán)境等因素的影響，心血管疾病發(fā)病率逐年增加，已成為人類死亡率最高的疾病之一。在心肌梗死、缺血再灌注損傷等多種心血管疾病的發(fā)生發(fā)展過程中多伴有心肌損傷，進(jìn)而發(fā)生細(xì)胞凋亡，鈣超載等，引起心血管功能的紊亂。從心肌缺血損傷的最新檢測報告中可知，借助數(shù)十種機(jī)制治療心肌損傷，經(jīng)常使用的有緩解細(xì)胞能量代謝、剔除細(xì)胞氧自由基、保護(hù)血管、改善心肌細(xì)胞鈣超載情況、優(yōu)化細(xì)胞因子、控制炎性反應(yīng)、減緩細(xì)胞凋亡速度等。但現(xiàn)有的心肌損傷治療藥物存在著或療效不佳，或毒副作用較大或費(fèi)用高等問題，因此開發(fā)新的心肌損傷治療藥物顯得非常必要[1-2]。建立適當(dāng)?shù)膭游锬Ｐ?，不僅能為該病的發(fā)病機(jī)制和病理生理改變的研究奠定基礎(chǔ)，而且更重要的是促進(jìn)新藥的開發(fā)，推進(jìn)診斷和各種治療方法的進(jìn)步。目前心肌損傷模型的動物種類和造模方法較多，主要有：冠脈結(jié)扎法、冠脈夾閉法、微量直流電刺激法、冠脈局部滴敷藥物法、球囊堵塞法、血栓堵塞法、藥物造模法等。采用不同動物建立的心肌損傷模型具有不同特點(diǎn)，每一種動物模型和造模方法都有優(yōu)缺點(diǎn)。這些動物模型存在的不足主要有：神經(jīng)-體液等因素的干擾、造模操作復(fù)雜、技術(shù)要求高、手術(shù)創(chuàng)傷大、并發(fā)癥和死亡率高、不能精確的確定結(jié)扎部位，心率、應(yīng)激程度與心臟的前后負(fù)荷等影響梗死面積的一些重要因素難以控制[3-4]，不利于后續(xù)心肌損傷治療藥物的評價與篩選工作，且實(shí)驗(yàn)周期長、費(fèi)用高、工作量大。離體心肌損傷模型及細(xì)胞模型雖然操作簡單，但缺少藥物在生物整體的代謝轉(zhuǎn)化和體內(nèi)的循環(huán)分布，不能反映藥物在體內(nèi)的真實(shí)情況。因此建立一種能很好的模擬藥物在體內(nèi)的過程，又能快速方便的評價與篩選心肌損傷治療藥物的動物模型具有重要的應(yīng)用價值。與傳統(tǒng)的模式生物相比，斑馬魚在心血管疾病研究中有其獨(dú)特的優(yōu)勢，主要體現(xiàn)在以下幾個方面：(1)斑馬魚體外受精，體外發(fā)育，胚胎及幼魚身體透明，易于觀察及干預(yù)。斑馬魚胚胎和日齡較小的幼魚可以通過皮膚供氧，即使在循環(huán)系統(tǒng)完全無法運(yùn)作的情況下，斑馬魚胚胎仍可存活較長一段時間[5]，這在研究致死性心血管畸形及側(cè)枝動脈生成等方面有著小鼠無法替代的作用。此外，產(chǎn)卵量大、飼養(yǎng)密度高、養(yǎng)殖費(fèi)用低廉等也是斑馬魚相對于小鼠的優(yōu)勢[6-7]。(2)斑馬魚作為脊椎動物，其中樞神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)臟器官、血液以及視覺系統(tǒng)，在分子水平上與人類85％相似(果蠅僅為61％)，尤其是心血管系統(tǒng)，斑馬魚的早期發(fā)育[8]與人類極為相似。另外，斑馬魚具備與哺乳動物相似的免疫系統(tǒng)，包括相對完整的適應(yīng)性免疫系統(tǒng)和保守的先天性免疫系統(tǒng)[9]，這些都是果蠅、線蟲等所無法比擬的。(3)斑馬魚在研究心臟發(fā)育方面有著重要作用，被稱為“心臟發(fā)育研究的窗口”[10]，其優(yōu)勢體現(xiàn)在：快速發(fā)育期的心臟可被高分辨率地顯像；心臟形態(tài)與功能的顯著缺損易于在活體胚胎發(fā)現(xiàn)，微小的缺損可以經(jīng)分子生物學(xué)標(biāo)記識別；易于研究功能障礙的心臟；可以應(yīng)用遺傳學(xué)技術(shù)對影響心臟發(fā)育的相關(guān)基因進(jìn)行大規(guī)模的篩選等。目前，斑馬魚應(yīng)用于心血管疾病的研究，主要有心律失常、擴(kuò)張型心肌病、心力衰竭、等疾病，尚未見心肌損傷疾病的斑馬魚應(yīng)用的文獻(xiàn)報道。如，將斑馬魚應(yīng)用于人類長QT綜合癥[11,12]和短QT綜合癥[13]的研究，Burns等[14]將心肌細(xì)胞熒光標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因斑馬魚放入96孔板中，每個孔內(nèi)為不同濃度的實(shí)驗(yàn)藥物，斑馬魚的心率可被檢測系統(tǒng)自動檢測，通過這種方法可快速評價抗心律失常藥物的療效以及藥物對心率和心律的影響。如，Schonberger等發(fā)現(xiàn)[15]轉(zhuǎn)錄激活輔助因子EYA4基因的突變可導(dǎo)致人類家族性擴(kuò)張型心肌病[16]。如，Gerull等[17]報道了titin基因的突變可導(dǎo)致人類擴(kuò)張型心肌病，同年Xu等[18]發(fā)現(xiàn)titin基因突變也能使斑馬魚出現(xiàn)心肌病樣表現(xiàn)。又如，在人類擴(kuò)張型心肌病的患者中，層粘連蛋白a4基因和整合素耦聯(lián)激酶基因的突變率非常高，而研究發(fā)現(xiàn)上述基因的突變也可使斑馬魚發(fā)生心力衰竭[19]。又如，Huang等[20]發(fā)現(xiàn)馬兜鈴酸可使斑馬魚胚胎的心臟出現(xiàn)收縮功能障礙，Wang等[21]發(fā)現(xiàn)心臟特異性高表達(dá)Nip3α可使斑馬魚出現(xiàn)心臟發(fā)育異常及顯著的心功能不全。可見，前述現(xiàn)有文獻(xiàn)的報道，并未涉及有對心肌損傷疾病的斑馬魚模型研究；特別是如何用斑馬魚模型研究由化學(xué)類藥物誘導(dǎo)的心肌損傷疾病，并評價心肌損傷誘導(dǎo)劑毒性或治療劑功效的方法，未見文獻(xiàn)報道。綜上所述，如何建立一種斑馬魚心肌損傷模型，并用該模型評價心肌損傷誘導(dǎo)劑毒性與治療劑功效，是本領(lǐng)域技術(shù)人員急需解決的技術(shù)難題。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于：發(fā)明人建立了一種斑馬魚心肌損傷模型，并提供了一種利用該模型評價心肌損傷誘導(dǎo)劑毒性與治療劑功效的方法。為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采取了以下技術(shù)方案：內(nèi)容一：一種用斑馬魚評價心肌損傷誘導(dǎo)劑毒性的方法，包括如下步驟：(1)斑馬魚發(fā)育階段的確定取野生型AB品系斑馬魚親本交配、孵化，選擇不同發(fā)育階段的斑馬魚分別移入對應(yīng)的微孔板中；根據(jù)不同的發(fā)育階段將對應(yīng)的微孔板均設(shè)為2個實(shí)驗(yàn)組：1個為藥物處理組，該組中對斑馬魚進(jìn)行單濃度給藥處理，1個為正常對照組，該組中對斑馬魚不進(jìn)行任何處理；然后，各組均加入相同體積的養(yǎng)魚用水，在相同溫度下恒溫培養(yǎng)；當(dāng)藥物處理斑馬魚至實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)后，將2個實(shí)驗(yàn)組的斑馬魚置于心跳血流分析系統(tǒng)，分析斑馬魚心輸出量和血流速度，判斷并確定斑馬魚的最佳發(fā)育階段；所述不同發(fā)育階段的斑馬魚為受精后2天(2dpf)、受精后3天(3dpf)或受精后4天(4dpf)的斑馬魚；所述最佳發(fā)育階段的斑馬魚為受精后3天(3dpf)的斑馬魚；(2)誘導(dǎo)劑處理將步驟(1)確定的3dpf的斑馬魚移入微孔板中，設(shè)置正常對照組和不同給藥濃度的誘導(dǎo)劑處理組：正常對照組中對斑馬魚不進(jìn)行任何處理，誘導(dǎo)劑處理組中對斑馬魚按不同給藥濃度的誘導(dǎo)劑處理；然后，各組均加入相同體積的養(yǎng)魚用水，在相同溫度下恒溫培養(yǎng)；(3)通過心輸出量減少率和血流速度減少率來評價誘導(dǎo)劑毒性當(dāng)步驟(2)的誘導(dǎo)劑處理斑馬魚至實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)后，將實(shí)驗(yàn)組的斑馬魚置于心跳血流分析系統(tǒng)，統(tǒng)計、分析斑馬魚心輸出量和血流速度，計算誘導(dǎo)劑處理組的心輸出量減少率和血流速度減少率，與正常對照組比較、評價誘導(dǎo)劑對心肌損傷的毒性程度；計算公式如下：(4)通過心臟損傷誘導(dǎo)率來評價誘導(dǎo)劑毒性當(dāng)步驟(2)的誘導(dǎo)劑處理斑馬魚至實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)后，移除微孔板中的液體，各組中均加入濃度為3μg/mL的吖啶橙染色液，在相同溫度下恒溫培養(yǎng)后，清洗斑馬魚，用立體熒光顯微鏡對斑馬魚心臟位置拍照并保存；統(tǒng)計、分析斑馬魚心臟部位的損傷細(xì)胞熒光強(qiáng)度，計算誘導(dǎo)劑處理組的心臟損傷誘導(dǎo)率，與正常對照組比較、評價誘導(dǎo)劑對心肌損傷的毒性程度；計算公式如下：優(yōu)選的，恒溫培養(yǎng)條件為：微孔板置于恒溫培養(yǎng)箱中，在28℃下培養(yǎng)30min。優(yōu)選的，清洗斑馬魚條件為：使用養(yǎng)魚用水，清洗滴加吖啶橙染色液的斑馬魚，清洗次數(shù)為3次，每次5min。優(yōu)選的，步驟(1)中藥物處理組，對斑馬魚給藥的藥物為誘導(dǎo)劑或治療劑。更優(yōu)選的，誘導(dǎo)劑為能夠誘導(dǎo)心肌損傷的藥物或化學(xué)試劑，包括但不限于異丙腎上腺素、垂體后葉素、鏈脲佐菌素、阿霉素、維拉帕米、馬兜鈴酸、特非那定、阿司匹林、鹽酸氯米帕明、環(huán)磷酰胺、尼莫地平、奎尼丁、喹巴因、烏頭堿、氯化鈷、疊氮鈉、亞硫酸鈉、過氧化氫、氯化鎘、三氧化二砷。更優(yōu)選的，治療劑為能夠治療心肌損傷的藥物，包括但不限于地高辛、丹酚酸A、雷諾嗪、維生素C、維生素E、輔酶Q、甘露醇、1,6-二磷酸果糖、谷胱甘肽、硝苯吡啶、異博定、硫氮卓酮、阿米洛利、美托洛爾、依那普利、厄貝沙坦、LCZ696、氫氯噻嗪、芪藶強(qiáng)心膠囊、參麥注射液。進(jìn)一步的，當(dāng)誘導(dǎo)劑為異丙腎上腺素時，步驟(2)中各誘導(dǎo)劑處理組的誘導(dǎo)劑給藥濃度為20～50mg/ml，最佳誘導(dǎo)劑給藥濃度為50mg/ml；進(jìn)一步的，當(dāng)誘導(dǎo)劑為垂體后葉素時，步驟(2)中各誘導(dǎo)劑處理組的誘導(dǎo)劑給藥濃度為40～60C，最佳給藥濃度為60C。內(nèi)容二：一種用斑馬魚評價心肌損傷治療劑功效的方法，包括如下步驟：(1)斑馬魚發(fā)育階段的確定取野生型AB品系斑馬魚親本交配、孵化，選擇不同發(fā)育階段的斑馬魚分別移入對應(yīng)的微孔板中；根據(jù)不同的發(fā)育階段將對應(yīng)的微孔板均設(shè)為2個實(shí)驗(yàn)組：1個為藥物處理組，該組中對斑馬魚進(jìn)行單濃度給藥處理，1個為正常對照組，該組中對斑馬魚不進(jìn)行任何處理；然后，各組均加入相同體積的養(yǎng)魚用水，在相同溫度下恒溫培養(yǎng)；當(dāng)藥物處理斑馬魚至實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)后，將2個實(shí)驗(yàn)組的斑馬魚置于心跳血流分析系統(tǒng)，分析斑馬魚心輸出量和血流速度，判斷并確定斑馬魚的最佳發(fā)育階段；所述不同發(fā)育階段的斑馬魚為受精后2天(2dpf)、受精后3天(3dpf)或受精后4天(4dpf)的斑馬魚；所述最佳發(fā)育階段的斑馬魚為受精后3天(3dpf)的斑馬魚；(2)誘導(dǎo)劑給藥濃度的確定將步驟(1)確定的3dpf的斑馬魚移入微孔板中，設(shè)置正常對照組和不同給藥濃度的誘導(dǎo)劑處理組：正常對照組中對斑馬魚不進(jìn)行任何處理，誘導(dǎo)劑處理組中對斑馬魚按不同給藥濃度的誘導(dǎo)劑處理；然后，各組均加入相同體積的養(yǎng)魚用水，在相同溫度下恒溫培養(yǎng)；當(dāng)誘導(dǎo)劑處理斑馬魚至實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)后，將實(shí)驗(yàn)組的斑馬魚置于心跳血流分析系統(tǒng)，分析斑馬魚心輸出量和血流速度，判斷并確定誘導(dǎo)劑的最佳給藥濃度；(3)治療劑處理將步驟(1)確定的3dpf的斑馬魚移入微孔板中，設(shè)置正常對照組、模型對照組和不同給藥濃度的治療劑處理組：正常對照組中對斑馬魚不進(jìn)行任何處理，模型對照組中對斑馬魚按步驟(2)確定的最佳誘導(dǎo)劑給藥濃度處理，治療劑處理組中對斑馬魚按不同給藥濃度的治療劑處理；然后，各組均加入相同體積的養(yǎng)魚用水，在相同溫度下恒溫培養(yǎng)；(4)通過心輸出量增加率和血流速度增加率來評價治療劑功效當(dāng)步驟(3)的治療劑處理斑馬魚至實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)后，將實(shí)驗(yàn)組的斑馬魚置于心跳血流分析系統(tǒng)，統(tǒng)計、分析斑馬魚心輸出量和血流速度，計算治療劑處理組的心輸出量增加率和血流速度增加率，與模型對照組比較、評價治療劑對心肌損傷的治療效果；計算公式如下：(5)通過心臟損傷保護(hù)率來評價治療劑功效當(dāng)步驟(3)的治療劑處理斑馬魚至實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)后，移除微孔板中的液體，各組中均加入濃度為3μg/mL的吖啶橙染色液，在相同溫度下恒溫培養(yǎng)后，清洗斑馬魚，用立體熒光顯微鏡對斑馬魚心臟位置拍照并保存；統(tǒng)計、分析斑馬魚心臟部位的損傷細(xì)胞熒光強(qiáng)度，計算治療劑處理組的心臟損傷保護(hù)率，與模型對照組比較、評價治療劑對心肌損傷的治療效果；計算公式如下：優(yōu)選的，恒溫培養(yǎng)條件為：微孔板置于恒溫培養(yǎng)箱中，在28℃下培養(yǎng)30min。優(yōu)選的，清洗斑馬魚條件為：使用養(yǎng)魚用水，清洗滴加吖啶橙染色液的斑馬魚，清洗次數(shù)為3次，每次5min。優(yōu)選的，步驟(1)中藥物處理組，對斑馬魚給藥的藥物為誘導(dǎo)劑或治療劑。更優(yōu)選的，誘導(dǎo)劑為能夠誘導(dǎo)心肌損傷的藥物或化學(xué)試劑，包括但不限于異丙腎上腺素、垂體后葉素、鏈脲佐菌素、阿霉素、維拉帕米、馬兜鈴酸、特非那定、阿司匹林、鹽酸氯米帕明、環(huán)磷酰胺、尼莫地平、奎尼丁、喹巴因、烏頭堿、氯化鈷、疊氮鈉、亞硫酸鈉、過氧化氫、氯化鎘、三氧化二砷。更優(yōu)選的，治療劑為能夠治療心肌損傷的藥物，包括但不限于地高辛、丹酚酸A、雷諾嗪、維生素C、維生素E、輔酶Q、甘露醇、1,6-二磷酸果糖、谷胱甘肽、硝苯吡啶、異博定、硫氮卓酮、阿米洛利、美托洛爾、依那普利、厄貝沙坦、LCZ696、氫氯噻嗪、芪藶強(qiáng)心膠囊、參麥注射液。進(jìn)一步的，當(dāng)誘導(dǎo)劑為異丙腎上腺素時，步驟(2)中各誘導(dǎo)劑處理組的誘導(dǎo)劑給藥濃度為20～50mg/ml，最佳誘導(dǎo)劑給藥濃度為50mg/ml；進(jìn)一步的，當(dāng)誘導(dǎo)劑為垂體后葉素時，步驟(2)中各誘導(dǎo)劑處理組的誘導(dǎo)劑給藥濃度為40～60C，最佳給藥濃度為60C。本發(fā)明中，發(fā)明人建立斑馬魚心肌損傷模型，模型的重點(diǎn)在于斑馬魚最佳發(fā)育階段的確定，以及當(dāng)用于評價治療劑功效時，作為模型對照組的誘導(dǎo)劑最佳給藥濃度的確定。與傳統(tǒng)的動物模型相比，本模型具有如下優(yōu)點(diǎn)：(1)體內(nèi)：斑馬魚作為一種脊椎動物，其藥物篩選模型屬體內(nèi)模型，能夠真實(shí)反映藥物在體內(nèi)的吸收、分布、代謝與排泄，真正反映藥物的整體生物活性。(2)直觀：通過本模型，當(dāng)斑馬魚經(jīng)藥物處理后，借助心跳血流分析系統(tǒng)和熒光顯微鏡，可以無創(chuàng)傷地在實(shí)驗(yàn)設(shè)置的任何時間點(diǎn)實(shí)時動態(tài)斑馬魚心跳和血流情況，直觀反映藥物在斑馬魚體內(nèi)的活性；而哺乳動物根本不可能完成這一操作。(3)高通量：斑馬魚幼魚很小，只有1-4毫米，能夠在一個標(biāo)準(zhǔn)的6，12，24，48，96或384孔板(即“微孔板”)內(nèi)進(jìn)行分析和實(shí)驗(yàn)，周期短使斑馬魚成為一種能進(jìn)行高通量、自動化體內(nèi)藥物致敏性評價的理想模型。(4)經(jīng)濟(jì)：所需費(fèi)用低，以犬類為實(shí)驗(yàn)載體的篩選實(shí)驗(yàn)每只每天耗費(fèi)大于10美元，以豚鼠為實(shí)驗(yàn)載體的篩選實(shí)驗(yàn)每只每天耗費(fèi)大于1美元，而以斑馬魚為實(shí)驗(yàn)載體的篩選實(shí)驗(yàn)每只每天耗費(fèi)小于0.01美元。(5)化合物用量少：檢測化合物用量少，通常只需幾毫克，而傳統(tǒng)的篩選實(shí)驗(yàn)則需幾毫克以上的化合物。(6)簡便：實(shí)驗(yàn)過程操作簡單，斑馬魚經(jīng)藥物處理后，即可進(jìn)行定量、分析該藥物的致敏性，而傳統(tǒng)動物實(shí)驗(yàn)操作過程復(fù)雜，判斷指標(biāo)主觀，容易產(chǎn)生假陽性結(jié)果。(7)快速：實(shí)驗(yàn)周期短，可在1天內(nèi)完成；而豚鼠常需要數(shù)周到數(shù)月的時間，犬常需要數(shù)月至數(shù)年的時間。斑馬魚在第一個72小時以內(nèi)完成胚胎發(fā)育。多數(shù)的內(nèi)部器官，包括心血管系統(tǒng)、腸、肝臟和腎，在24～48小時內(nèi)快速成型，傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)載體老鼠和猴子則分別需要21天和9個月方可完成胚胎發(fā)育。(8)可靠的預(yù)測性：斑馬魚的基因與人類基因的相似度高達(dá)85％左右，其生物學(xué)功能與哺乳動物及人類高度相似，實(shí)驗(yàn)結(jié)果可比性強(qiáng)，預(yù)測性好。(9)穩(wěn)定性高、重復(fù)性好：本發(fā)明重復(fù)實(shí)驗(yàn)十幾次，得到的實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本相同。本發(fā)明中，發(fā)明人在建立了斑馬魚心肌損傷模型的基礎(chǔ)上，又提供了一種利用該模型評價心肌損傷誘導(dǎo)劑毒性與治療劑功效的方法，這是一種全新的藥物評價模型與評價方法，具有可靠、快速、高效、低廉、高性價比等優(yōu)點(diǎn)，既可用于評價已公開藥物(如已知的誘導(dǎo)劑、治療劑)的毒性或功效，還可用于篩選具有未公開藥物(如結(jié)構(gòu)全新、藥效不明的化合物，常用于first、me-better、me-too等等的新藥開發(fā))的毒性或功效，應(yīng)用廣泛，意義重大。附圖說明圖1是實(shí)施例1用異丙腎上腺素處理3dpf斑馬魚后的心輸出量分析。圖2是實(shí)施例1用異丙腎上腺素處理3dpf斑馬魚后的血流速度分析。圖3是實(shí)施例2用不同濃度異丙腎上腺素處理斑馬魚后的心輸出量減少率比較。圖4是實(shí)施例2用不同濃度異丙腎上腺素處理斑馬魚后的血流速度減少率比較。圖5是實(shí)施例2不同實(shí)驗(yàn)組對斑馬魚心臟損傷細(xì)胞染色后的比較。圖6是實(shí)施例2用不同濃度異丙腎上腺素處理斑馬魚后的心臟損傷誘導(dǎo)率比較。圖7是實(shí)施例3用不同濃度地高辛處理后斑馬魚后的心輸出量增加率比較。圖8是實(shí)施例3用不同濃度地高辛處理后斑馬魚后的血流速度增加率比較。圖9是實(shí)施例3不同實(shí)驗(yàn)組對斑馬魚心臟損傷細(xì)胞染色后的比較。圖10是實(shí)施例3用不同濃度地高辛處理斑馬魚后的心臟損傷保護(hù)率比較。圖11是實(shí)施例4用不同濃度垂體后葉素處理斑馬魚后的心輸出量減少率比較。圖12是實(shí)施例4用不同濃度垂體后葉素處理斑馬魚后的血流速度減少率比較。圖13是實(shí)施例4不同實(shí)驗(yàn)組對斑馬魚心臟損傷細(xì)胞染色后的比較。圖14是實(shí)施例4用不同濃度垂體后葉素處理斑馬魚后的心臟損傷誘導(dǎo)率比較。圖15是實(shí)施例5用不同濃度丹酚酸A處理后斑馬魚后的心輸出量增加率比較。圖16是實(shí)施例5用不同濃度丹酚酸A處理后斑馬魚后的血流速度增加率比較。圖17是實(shí)施例6用不同濃度鏈脲佐菌素處理斑馬魚后的心輸出量減少率比較。圖18是實(shí)施例6用不同濃度鏈脲佐菌素處理斑馬魚后的血流速度減少率比較。圖19是實(shí)施例6不同實(shí)驗(yàn)組對斑馬魚心臟損傷細(xì)胞染色后的比較。圖20是實(shí)施例6用不同濃度鏈脲佐菌素處理斑馬魚后的心臟損傷誘導(dǎo)率比較。上述圖1～圖20中，*指p<0.05，**指p<0.01，***指p<0.001。具體實(shí)施方式以下是本發(fā)明的具體實(shí)施例，對本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步的描述，但是本發(fā)明的保護(hù)范圍并不限于這些實(shí)施例。凡是不背離本發(fā)明構(gòu)思的改變或等同替代均包括在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。實(shí)驗(yàn)儀器：解剖顯微鏡(SMZ645，Nikon,Japan)，6孔板(NestBiotech)，精密電子天平(CP214，奧豪斯)，熒光顯微鏡(AZ100，尼康)，心跳血流分析系統(tǒng)(Zebralab3.3(PB2084C)，ViewPointLifeSciences，F(xiàn)rance)，實(shí)驗(yàn)試劑：吖啶橙染色液(即AO染料，Alorich，494-38-2)，鏈脲佐菌素(阿拉丁，37071)，異丙腎上腺素(TCI，PTAPE-LJ)，地高辛(阿拉丁，D102298)，垂體后葉素(南京新百藥業(yè)有限公司，20160517)，丹酚酸A(阿拉丁，S101316)。實(shí)施例1確定斑馬魚最佳發(fā)育階段1、斑馬魚選取取4～5對野生型AB品系斑馬魚親本交配，按照Westerfield[22]的方法孵化胚胎。將處于2dpf、3dpf、4dpf的斑馬魚置于解剖顯微鏡下觀察，挑取發(fā)育正常的斑馬魚分別移入三個6孔板中，每孔30尾。注：①本發(fā)明中的“dpf”＝daypostfertilization，即指斑馬魚受精后天數(shù)，如“3dpf”是指受精后五天的斑馬魚，下同。②本發(fā)明中的“微孔板”，包括但不限于前述的6孔板，其他諸如12、24、48、96或384孔板，均可，下同。③本發(fā)明中的“斑馬魚尾數(shù)”，包括但不限于前述的每孔30尾，可根據(jù)微孔板的不同規(guī)格，放入不同數(shù)量的斑馬魚。2、藥物處理設(shè)置3個實(shí)驗(yàn)組，每組分別為2dpf、3dpf、4dpf的斑馬魚)，每個實(shí)驗(yàn)組又包括1個藥物處理組和1個正常對照組。藥物處理組中，對斑馬魚水溶給予50mg/mL異丙腎上腺素處理；正常對照組中，對斑馬魚不進(jìn)行任何處理；然后，各實(shí)驗(yàn)組中均加入相同體積的養(yǎng)殖用水，并將微孔板置于恒溫培養(yǎng)箱中，在28℃下培養(yǎng)30min。3、判斷并確定斑馬魚的最佳發(fā)育階段當(dāng)用異丙腎上腺素處理斑馬魚至實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)后，將各實(shí)驗(yàn)組的斑馬魚置于心跳血流分析系統(tǒng)，錄制斑馬魚血流視頻，分析斑馬魚心輸出量和血流速度，判斷并確定斑馬魚的最佳發(fā)育階段。結(jié)果表明：2dpf階段：正常對照組的斑馬魚心輸出量平均值為0.15μL/s，血流速度為300mm/s，藥物處理組因血流速度太慢、心跳血流分析儀檢測靈敏度有偏差的原因，檢測不出斑馬魚心輸出量和血流速度的數(shù)據(jù)，因此模型不可行。3dpf階段：正常對照組的斑馬魚心輸出量平均值為0.22μL/s，血流速度為700mm/s，藥物處理組的斑馬魚心輸出量平均值為0.15μL/s，血流速度為460mm/s，心輸出量減少率為40％，血流速度減少率為28％，與正常對照組相比p均<0.001，證明模型建立成功(見圖1和圖2)。4dpf階段：正常對照組的斑馬魚因血流速度太快、心跳血流分析儀檢測靈敏度有偏差的原因，檢測不出斑馬魚心輸出量和血流速度的數(shù)據(jù)，因此模型不可行。實(shí)施例2評價心肌損傷誘導(dǎo)劑異丙腎上腺素的功效根據(jù)實(shí)施例1確定的斑馬魚最佳發(fā)育階段，建立斑馬魚心肌損傷模型，并評價心肌損傷誘導(dǎo)劑異丙腎上腺素的功效。1、斑馬魚選取將實(shí)施例1確定的處于3dpf的斑馬魚置于解剖顯微鏡下觀察，挑取發(fā)育正常的斑馬魚分別移入6孔板中，每孔30尾。2、誘導(dǎo)劑處理設(shè)置6個實(shí)驗(yàn)組：1個正常對照組、5個不同給藥濃度的誘導(dǎo)劑處理組。正常對照組中，對斑馬魚不進(jìn)行任何處理；誘導(dǎo)劑處理組中，對斑馬魚分別水溶給予不同濃度的異丙腎上腺素處理，其濃度分別為20mg/mL、30mg/mL、40mg/mL、50mg/mL和60mg/mL。然后，各實(shí)驗(yàn)組中均加入相同體積的養(yǎng)殖用水，并將微孔板置于恒溫培養(yǎng)箱中，在28℃下培養(yǎng)30min。3、通過心輸出量減少率和血流速度減少率來評價心肌損傷的損傷程度當(dāng)用異丙腎上腺素處理斑馬魚至實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)后，將實(shí)驗(yàn)組的斑馬魚置于心跳血流分析系統(tǒng)，錄制斑馬魚血流視頻，統(tǒng)計、分析斑馬魚心輸出量和血流速度，計算誘導(dǎo)劑處理組的心輸出量減少率和血流速度減少率；計算公式如下：利用GraphPadPrim5.0軟件對上述實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。統(tǒng)計學(xué)處理結(jié)果以±SE表示，多組間比較采用方差分析，兩組間比較采用Dunnett’sT-檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，p<0.05為差異性顯著。根據(jù)統(tǒng)計學(xué)處理結(jié)果，與正常對照組比較、評價誘導(dǎo)劑異丙腎上腺素對心肌損傷的損傷程度。結(jié)果表明，不同濃度的異丙腎上腺素對心肌損傷的毒性效果與程度不同(見圖3和圖4)：1)濃度為60mg/mL異丙腎上腺素處理組斑馬魚全部死亡。2)濃度為20mg/mL、30mg/mL、40mg/mL和50mg/mL的異丙腎上腺素誘發(fā)的心輸出量減少率分別為3％、10％、14％和37％，與正常對照組比較，20mg/mL、30mg/mL和40mg/mL組p>0.05，50mg/mL組p<0.001。3)濃度為20mg/mL、30mg/mL、40mg/mL和50mg/mL的異丙腎上腺素誘發(fā)的血流速度減少率分別為-1％、10％、16％和30％，與正常對照組比較，20mg/mL、30mg/mL和40mg/mL組p>0.05，50mg/mL組p<0.001。4、通過心臟損傷誘導(dǎo)率來評價心肌損傷的損傷程度當(dāng)用異丙腎上腺素處理斑馬魚至實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)后，移除微孔板中的液體，各組中均加入濃度為3μg/mL的吖啶橙染色液(即AO染料)，置于恒溫培養(yǎng)箱中，在28℃下培養(yǎng)30min后，用養(yǎng)魚用水清洗3次，每次5min，用立體熒光顯微鏡對斑馬魚心臟位置拍照并保存；統(tǒng)計、分析斑馬魚心臟部位的損傷細(xì)胞熒光強(qiáng)度，計算誘導(dǎo)劑處理組的心臟損傷誘導(dǎo)率；計算公式如下：同樣的，利用GraphPadPrim5.0軟件對上述實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，統(tǒng)計學(xué)處理結(jié)果為p<0.05表明差異性顯著。根據(jù)統(tǒng)計學(xué)處理結(jié)果，與正常對照組比較、評價誘導(dǎo)劑異丙腎上腺素對心肌損傷的損傷程度。結(jié)果表明，不同濃度的異丙腎上腺素對心肌損傷的毒性效果與程度不同(見圖5和圖6)：1)60mg/mL異丙腎上腺素處理組斑馬魚全部死亡。2)濃度為20mg/mL、30mg/mL、40mg/mL和50mg/mL的異丙腎上腺素誘發(fā)的心臟損傷誘導(dǎo)率分別為12％、22％、27％和47％，與正常對照組比較，20mg/mL、30mg/mL和40mg/mL組p>0.05，50mg/mL組p<0.001。因此，選用20～50mg/mL的異丙腎上腺素作為建立斑馬魚心肌損傷模型的誘導(dǎo)劑給藥濃度，并確定異丙腎上腺素的最佳給藥濃度為50mg/mL。實(shí)施例3評價心肌損傷治療劑地高辛的功效根據(jù)實(shí)施例1確定的斑馬魚最佳發(fā)育階段、及實(shí)施例2確定的誘導(dǎo)劑最佳給藥濃度，建立斑馬魚心肌損傷模型，并評價心肌損傷治療劑地高辛的治療功效。1、斑馬魚選取將實(shí)施例1確定的處于3dpf的斑馬魚置于解剖顯微鏡下觀察，挑取發(fā)育正常的斑馬魚分別移入6孔板中，每孔30尾。2、治療劑處理設(shè)置7個實(shí)驗(yàn)組：1個正常對照組、1個模型對照組、5個不同給藥濃度的治療劑處理組。正常對照組中，對斑馬魚不進(jìn)行任何處理；模型對照組中，對斑馬魚水溶給予按實(shí)施例2確定的50mg/mL異丙腎上腺素處理；治療劑處理組中，對斑馬魚分別水溶給予不同濃度的地高辛處理，其濃度分別為0.01μg/mL、0.05μg/mL、0.1μg/mL、0.5μg/mL和1.0μg/mL。然后，各實(shí)驗(yàn)組中均加入相同體積的養(yǎng)殖用水，并將微孔板置于恒溫培養(yǎng)箱中，在28℃下培養(yǎng)30min。3、通過心輸出量增加率和血流速度增加率來評價心肌損傷的治療效果當(dāng)?shù)馗咝撂幚戆唏R魚至實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)后，將實(shí)驗(yàn)組的斑馬魚置于心跳血流分析系統(tǒng)，統(tǒng)計、分析斑馬魚心輸出量和血流速度，計算治療劑處理組的心輸出量增加率和血流速度增加率；計算公式如下：同樣的，利用GraphPadPrim5.0軟件對上述實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，統(tǒng)計學(xué)處理結(jié)果為p<0.05表明差異性顯著。根據(jù)統(tǒng)計學(xué)處理結(jié)果，與模型對照組比較、評價治療劑地高辛對心肌損傷的治療效果。結(jié)果表明(見圖7和8)：1)濃度為0.01μg/mL、0.05μg/mL、0.1μg/mL、0.5μg/mL和1.0μg/mL的地高辛對異丙腎上腺素誘發(fā)的心肌損傷斑馬魚的心輸出量增加率分別為0％、35％、77％、46％和0％，與模型對照組比較，0.01μg/mL和1.0μg/mL組p>0.05，0.05μg/mL、0.1μg/mL和0.5μg/mL組p<0.05&p<0.001&p<0.01；2)濃度為0.01μg/mL、0.05μg/mL、0.1μg/mL、0.5μg/mL和1.0μg/mL的地高辛對異丙腎上腺素誘發(fā)的心肌損傷斑馬魚的血流速度增加率分別為4％、13％、79％、66％和18％，與模型對照組比較，0.01μg/mL、0.05μg/mL和1.0μg/mL組p>0.05，0.1μg/mL和0.5μg/mL組p<0.001&p<0.01。4、通過心臟損傷保護(hù)率來評價心肌損傷的治療效果當(dāng)?shù)馗咝撂幚戆唏R魚至實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)后，移除微孔板中的液體，各組中均加入濃度為3μg/mL的吖啶橙染色液(即AO染料)，置于恒溫培養(yǎng)箱中，在28℃下培養(yǎng)30min后，用養(yǎng)魚用水清洗3次，每次5min，用立體熒光顯微鏡對斑馬魚心臟位置拍照并保存；統(tǒng)計、分析斑馬魚心臟部位的損傷細(xì)胞熒光強(qiáng)度，計算治療劑處理組的心臟損傷保護(hù)率；計算公式如下：同樣的，利用GraphPadPrim5.0軟件對上述實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，統(tǒng)計學(xué)處理結(jié)果為p<0.05表明差異性顯著。根據(jù)統(tǒng)計學(xué)處理結(jié)果，與模型對照組比較、評價治療劑地高辛對心肌損傷的治療效果。結(jié)果表明(見圖9和10)：濃度為0.01μg/mL、0.05μg/mL、0.1μg/mL、0.5μg/mL和1.0μg/mL的地高辛對異丙腎上腺素誘發(fā)的心肌損傷斑馬魚的心臟損傷保護(hù)作用分別為9％、17％、22％、13％和10％，與模型對照組比較，0.01μg/mL、0.5μg/mL和1.0μg/mL組p>0.05，0.05μg/mL和0.1μg/mL組p<0.05&p<0.01。實(shí)施例4評價心肌損傷誘導(dǎo)劑垂體后葉素的功效根據(jù)實(shí)施例1確定的斑馬魚最佳發(fā)育階段，建立斑馬魚心肌損傷模型，并評價心肌損傷誘導(dǎo)劑垂體后葉素的功效。1、斑馬魚選取選取處于3dpf的斑馬魚，其余步驟與實(shí)施例2相同。2、誘導(dǎo)劑處理在誘導(dǎo)劑處理組中，對斑馬魚分別水溶給予不同濃度的垂體后葉素處理，其濃度分別為40C、50C、60C、70C和80C，其余步驟與實(shí)施例2相同。3、通過心輸出量減少率和血流速度減少率來評價心肌損傷的損傷程度當(dāng)用垂體后葉素處理斑馬魚至實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)后，其余步驟與實(shí)施例2相同，統(tǒng)計、分析斑馬魚心輸出量和血流速度，計算誘導(dǎo)劑處理組的心輸出量減少率和血流速度減少率；對計算結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，并與正常對照組比較、評價誘導(dǎo)劑垂體后葉素對心肌損傷的損傷程度。結(jié)果表明(見圖11和圖12)：1)濃度為70C和80C垂體后葉素處理組斑馬魚全部死亡。2)濃度為40C、50C和60C的垂體后葉素誘發(fā)的心輸出量減少率分別為2％、17％和34％，與正常對照組比較，40C和50C組p>0.05，60C組p<0.001。3)濃度為40C、50C和60C的垂體后葉素誘發(fā)的血流速度減少率分別為1％、10％和31％，與正常對照組比較，40C和50C組p>0.05，60C組p<0.001。4、通過心臟損傷誘導(dǎo)率來評價心肌損傷的損傷程度當(dāng)用垂體后葉素處理斑馬魚至實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)后，其余步驟與實(shí)施例2相同，統(tǒng)計、分析斑馬魚心臟部位的損傷細(xì)胞熒光強(qiáng)度，計算誘導(dǎo)劑處理組的心臟損傷誘導(dǎo)率；對計算結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，并與正常對照組比較、評價誘導(dǎo)劑垂體后葉素對心肌損傷的損傷程度。結(jié)果表明(見圖13和圖14)：1)濃度為70C和80C垂體后葉素處理組斑馬魚全部死亡。2)濃度為40C、50C和60C的垂體后葉素誘發(fā)的心臟損傷誘導(dǎo)率分別為2％、18％和32％，與正常對照組比較，40C和50C組p>0.05，60C組p<0.001。因此，選用40～60C的垂體后葉素作為建立斑馬魚心肌損傷模型的誘導(dǎo)劑給藥濃度，并確定垂體后葉素的最佳給藥濃度為60C。實(shí)施例5評價心肌損傷治療劑丹酚酸A的功效根據(jù)實(shí)施例1確定的斑馬魚最佳發(fā)育階段、及實(shí)施例4確定的誘導(dǎo)劑最佳給藥濃度，建立斑馬魚心肌損傷模型，并評價心肌損傷治療劑丹酚酸A的治療功效。1、斑馬魚選取選取處于3dpf的斑馬魚，其余步驟與實(shí)施例3相同。2、治療劑處理模型對照組中，對斑馬魚水溶給予按實(shí)施例4確定的60C的垂體后葉素處理；治療劑處理組中，對斑馬魚分別水溶給予不同濃度的丹酚酸A處理，其濃度分別為2.5μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、25μg/mL和50μg/mL，其余步驟與實(shí)施例3相同。3、通過心輸出量增加率和血流速度增加率來評價心肌損傷的治療效果當(dāng)?shù)し铀酇處理斑馬魚至實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)后，其余步驟與實(shí)施例3相同，統(tǒng)計、分析斑馬魚心輸出量和血流速度，計算治療劑處理組的心輸出量增加率和血流速度增加率；對計算結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，與模型對照組比較、評價治療劑丹酚酸A對心肌損傷的治療效果。結(jié)果表明(見圖15和16)：1)濃度為2.5μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、25μg/mL和50μg/mL的丹酚酸A對垂體后葉素誘發(fā)的心肌損傷斑馬魚的心輸出量增加率分別為9％、33％、66％、43％和0％，與模型對照組比較，2.5μg/mL和50μg/mL組p>0.05，5μg/mL、15μg/mL和25μg/mL組p<0.05&p<0.001&p<0.01。2)濃度為2.5μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、25μg/mL和50μg/mL的丹酚酸A對垂體后葉素誘發(fā)的心肌損傷斑馬魚的血流速度增加率分別為4％、13％、79％、66％和18％，與模型對照組比較，2.5μg/mL、5μg/mL和50μg/mL組p>0.05，10μg/mL和25μg/mL組p<0.001&p<0.01。實(shí)施例6評價心肌損傷誘導(dǎo)劑鏈脲佐菌素的功效根據(jù)實(shí)施例1確定的斑馬魚最佳發(fā)育階段，建立斑馬魚心肌損傷模型，并評價心肌損傷誘導(dǎo)劑鏈脲佐菌素的功效。1、斑馬魚選取選取處于3dpf的斑馬魚，其余步驟與實(shí)施例2相同。2、誘導(dǎo)劑處理在誘導(dǎo)劑處理組中，對斑馬魚分別水溶給予不同濃度的鏈脲佐菌素處理，其濃度分別為5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、40μg/mL和80μg/mL，其余步驟與實(shí)施例2相同。3、通過心輸出量減少率和血流速度減少率來評價心肌損傷的損傷程度當(dāng)用鏈脲佐菌素處理斑馬魚至實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)后，其余步驟與實(shí)施例2相同，統(tǒng)計、分析斑馬魚心輸出量和血流速度，計算誘導(dǎo)劑處理組的心輸出量減少率和血流速度減少率；對計算結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，并與正常對照組比較、評價誘導(dǎo)劑鏈脲佐菌素對心肌損傷的損傷程度。結(jié)果表明(見圖17和圖18)：1)濃度為5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、40μg/mL和80μg/mL的鏈脲佐菌素誘發(fā)的心輸出量減少率分別為8％、14％、18％、21％和35％，與正常對照組比較，5μg/mL和10μg/mL組p>0.05，20μg/mL、40μg/mL和80μg/mL組p<0.01&p<0.01&p<0.001.2)濃度為5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、40μg/mL和80μg/mL的鏈脲佐菌素誘發(fā)的血流速度減少率分別為-1％、10％、16％、23％和30％，與正常對照組比較，5μg/mL、10μg/mL和20μg/mL組p>0.05，40μg/mL和80μg/mL組p<0.01&p<0.001。4、通過心臟損傷誘導(dǎo)率來評價心肌損傷的損傷程度當(dāng)用鏈脲佐菌素處理斑馬魚至實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)后，其余步驟與實(shí)施例2相同，統(tǒng)計、分析斑馬魚心臟部位的損傷細(xì)胞熒光強(qiáng)度，計算誘導(dǎo)劑處理組的心臟損傷誘導(dǎo)率；對計算結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，并與正常對照組比較、評價誘導(dǎo)劑鏈脲佐菌素對心肌損傷的損傷程度。結(jié)果表明(見圖19和圖20)：濃度為5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、40μg/mL和80μg/mL的鏈脲佐菌素誘發(fā)的心臟損傷細(xì)胞不斷增多，心臟損傷細(xì)胞熒光強(qiáng)度不斷增強(qiáng)，心臟損傷誘導(dǎo)率分別為4％、12％、16％、27％和38％，與正常對照組比較，5μg/mL、10μg/mL和20μg/mL組p>0.05，40μg/mL和80μg/mL組p<0.01&p<0.001。參考文獻(xiàn)：[1]趙曲波.抗心肌損傷藥物的進(jìn)展研究[J].中國醫(yī)藥指南,2015(31):28-28.[2]王恒,沈祥春,余躍生,等.基于創(chuàng)新藥物研究的心肌損傷/心肌梗死生物模型[J].中國藥房,2012(37):3528-3530.[3]白玉花,辛穎.心肌損傷再灌注損傷模型建立方法的研究進(jìn)展[J].內(nèi)蒙古民族大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版,2015(3):251-256.[4]盧志強(qiáng),張艷軍,崔廣智,等.心肌損傷模型的制作方法研究進(jìn)展[J].中國藥理學(xué)通報,2012,28(8):1053-1057.[5]ZonLI,PetersonRT.Invivodrugdiscoveryinthezebrafish[J].DrugDiscovery.2005,4:35-44.[6]McGrathP,LiCQ.Zebrafish:apredictivemodelforassessingdrug-inducedtoxicity[J].DrugDiscoveryToday.2008,13:394-401.[7]BarrosTP,AldertonWK,ReynoldsHM,etal.Zebrafish:Anemergingtechnologyforinvivopharmacologicalassessmenttoidentifypotentialsafetyliabilitiesinearlydrugdiscovery[J].BritishJournalofPharmacology.2008,154:1400-1413.[8]ChicoTJ,InghamPW,CrossmanDC.Modelingcardiovasculardiseaseinthezebrafish[J].TrendsCardiovascMed,2008,18:150-155.[9]RenshawSA,LoynesCA,TrushellDM,etal.Atransgeniczebrafishmodelofneutrophilicinflammation[J].Blood,2006,108:3976-3978.[10]ChristoffelsVM,HoogaarsWMH,TessanA,eta1.T-boxtranscriptionfactorTbx2repressesdifferentiationandformationofthecardiacchambem[J].DevDyn,2004,229(4):763-770.[11]MilanDJ,MacraeCA.Zebrafishgeneticmodelsforarrhythmia[J].ProgBiophysMolBiol,2008,98(2-3):301-308.866-875.[12]MederB,ScholzEP,HasselD,etal.ReconstitutionofdefectiveproteintraffickingrescuesLong-QTsyndromeinzebrafish[J].BiochemBiophysResCommun,2011,408(2):218-224.[13]HasselD,ScholzEP,TranoN,etal.Deficientzebrafisheter-à-go-go-relatedgenechannelgatingcausesshort-QTsyndromeinzebrafishreggaemutants[J].Circulation,2008,117(7):866-875.[14]BurnsCG,MillanDJ,GrandeEJ,etal.High-throughputassayforsmallmoleculesthatmodulatezebrafishembryonicheartrate[J].NatChemBiol,2005,1:263-264.[15]SchonbergerJ,LevyH,GrunigE,etal.Dilatedcardiomyopathyandsensorineuralhearingloss:aheritablesyndromethatmapsto6q23-24[J].Circulation,2000,101:1812-1818.[16]SchonbergerJ,WangL,ShinJT,etal.MutationinthetranscriptionalcoactivatorEYA4causesdilatedcardiomyopathyandsensorineuralhearingloss[J].NatGenet,2005,37:418-422.[17]GerullB,GramlichM,AthertonJ,etal.MutationsofTTN,encodingthegiantmusclefilamenttitin,causefamilialdilatedcardiomyopathy[J].NatGenet,2002,30:201-204.[18]XuX,MeilerSE,ZhongTP,etal.Cardiomyopathyinzebrafishduetomutationinanalternativelysplicedexonoftitin[J].NatGenet,2002,30:205-209.[19]KnollR,PostelR,WangJ,etal.Lamininalpha4andintegrin-linkedkinasemutationscausehumancardiomyopathyviasimultaneousdefectsincardiomyocytesandendothelialcells[J].[20]SongY,ConeRD.Creationofageneticmodelofobesityinateleost[J].FasebJ,2007,21:2042-2049.[21]ChicoTJ,InghamPW,CrossmanD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