本發(fā)明涉及的是生物制藥領(lǐng)域，尤其涉及一種用于治療病原體感染性皮膚病的外用藥物及其制備方法和應用。

背景技術(shù)：

病原體感染性皮膚病包括真菌感染性皮膚病、細菌感染性皮膚病和病毒感染性皮膚病，其中：皮膚真菌感染是指病原真菌入侵導致皮膚以及粘膜的感染。毛發(fā)和指甲等皮膚附屬器的一大類感染性疾病，在臨床上屬于多發(fā)性感染，常見的有手、足癬和股癬等，臨床表現(xiàn)主要為鱗屑型水皰，損害多發(fā)生于一側(cè)，最初為數(shù)量不一的小水皰，皰液干涸后脫屑，范圍日漸擴大，久之脫屑處皮膚粗糙增厚，皮紋寬深，失去正常的光澤和柔韌性，觸之有粗砂感。

手癬、足癬是最常見的淺部真菌病，在全世界廣泛流行，中國南方地區(qū)發(fā)病較北方多。夏秋季發(fā)病率高，常表現(xiàn)為夏重冬輕或夏病冬愈。根據(jù)臨床特點不同，手足癬可分為三型，水皰鱗屑型、角化過度型、浸漬糜爛型。

花斑癬是由糠秕馬拉色菌感染表皮角質(zhì)層引起的一種淺表真菌病。本病起初損害為圍繞毛孔的圓形點狀斑疹，以后逐漸增至甲蓋大小。皮疹無無炎性反應，偶有輕度瘙癢感，好發(fā)生于胸背部，一般以青壯年男性多見。病程慢性，冬季皮疹減少或消失，但夏天又可復發(fā)。

癬菌疹是由癬病皮損中的真菌引起過敏反應而發(fā)生皮疹的一種疾病。如果癬病皮損很活躍，局部紅腫明顯，真菌可侵入真皮通過局部血管進入血循環(huán)。若此時機體非常敏感會立即產(chǎn)生相應的抗體，并與皮膚上的真菌抗原相結(jié)合而發(fā)生過敏反應，使皮膚表現(xiàn)出各種皮疹。

細菌性感染皮膚?。涸谄つw表面普遍存在著金黃色和表皮葡萄球菌，因此皮膚最多見的感染系由葡萄球菌引起，如癤、毛囊炎等。嚴重的感染可發(fā)展到皮下組織形成蜂窩組織炎或癰等。其次可見大腸桿菌和產(chǎn)氣莢膜桿菌感染，除后者感染皮下有氣發(fā)展較快外，其他感染局部皮膚均有紅、腫、熱、漲、痛，或有膿腫形成，蜂窩組織炎會伴有發(fā)燒、畏寒、全身倦怠、頭痛或關(guān)節(jié)痛等，血液檢查時，血中白細胞會明顯的上升。

膿皰瘡是一種常見的急性化膿性皮膚病。具有接觸傳染和自體接種感染的特性，易在兒童中流行。病原菌主要為凝固梅陽性的金黃葡萄球菌或乙型溶血鏈球菌單獨或混合感染。夏、秋季節(jié)氣溫高、濕度大，皮膚浸漬等，都易使病菌侵入皮膚繁殖，為促發(fā)本病創(chuàng)造有利條件。

病毒性皮膚病是由病毒感染引起的，主要表現(xiàn)為皮膚粘膜損害的疾病，病毒感染后也可通過免疫機制引起病毒疹。常表現(xiàn)為：疣狀增生、水皰和發(fā)疹等三種類型。單純性皰疹亦稱為發(fā)熱性水皰，是由單純皰疹病毒所致的疼痛性感染，可在全身出現(xiàn)，水皰形成后，破損產(chǎn)生滲出液，其后產(chǎn)生黃白色的痂殼最終脫落。潰瘍通常持續(xù)7～10天。通常單純皰疹并不嚴重，但對于患有艾滋病或免疫系統(tǒng)因其他疾病或藥物受抑制時，這種感染可能是致命的。對于通常在分娩時接觸病毒的嬰兒來說，感染可能傳播到其他器官，會導致嚴重并發(fā)癥甚至死亡。

針對病原體感染的皮膚病，目前治療真菌皮膚病市場上流行使用復方苯甲酸軟膏、3％克霉唑霜、1％益康唑霜、2％咪康唑霜以及真菌抗生素等。細菌性皮膚用藥多采用0.5％新霉素軟膏、莫匹羅星軟膏、利福平軟膏或紅霉素軟膏，以及相應抗生素等。對于單純性皰疹一般使用冰塊及使用對癥藥物來減輕疼痛。找一些含有麻醉因子的藥物如酚及潤滑劑來減少破潰、軟化瘢痕。有些藥物長期使用具有毒副作用，并且治療效果單一，不具備廣譜性，治療真菌藥膏不能治療細菌和病毒皮膚病，反之亦然，因此，開發(fā)一種具有廣譜性，同時對細菌、真菌、病毒性皮膚病效果顯著，且無刺激無毒副作用的產(chǎn)品尤為重要。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供了一種用于治療病原體感染性皮膚病的外用藥物及其制備方法，以解決現(xiàn)有藥物治療效果單一、療程長、療效不夠理想、有刺激性和存在毒副作用等技術(shù)問題。

本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的：

本發(fā)明提供了一種用于治療病原體感染性皮膚病的外用藥物，所述外用藥物包括質(zhì)量百分比為20％-100％的NK細胞原液。

進一步地，所述外用藥物為一種液體制劑，命名為SNK液，所述SNK液的組分及其質(zhì)量百分比包括：NK細胞原液85.0-95.0％、甘油3.0-5.0％、硼砂0.05-0.08％、透明質(zhì)酸0.05-0.1％、羥苯乙酯0.01-0.03％，溶劑為水。

進一步地，所述外用藥物為一種膏狀制劑，命名為SNK膏，所述SNK膏的組分及其質(zhì)量百分比包括：NK細胞原液80.0-85.0％、卡波姆941為0.1-1.5％、甘油為1.0-2.0％、三乙醇胺1.0-2.5％、對羥基苯甲酸乙酯0.01-0.5％、余量為水。

本發(fā)明還提供了上述治療病原體感染性皮膚病的外用藥物的制備方法，包括以下步驟：

(1)取NK細胞進行擴增培養(yǎng)，獲得NK細胞原液；

(2)將NK細胞原液與外用藥物輔料混合，制備獲得所述外用藥物。

進一步地，若所述藥物為液體制劑時，所述NK細胞原液的質(zhì)量百分比為85.0-95.0％，所述輔料及其質(zhì)量百分比為：甘油3.0-5.0％、硼砂0.05-0.08％、透明質(zhì)酸0.05-0.1％、羥苯乙酯0.01-0.03％，溶劑為水；若所述藥物為膏狀制劑時，所述NK細胞原液的質(zhì)量百分比為80.0-85.0％，所述輔料及其質(zhì)量百分比包括：卡波姆941為0.1-1.5％、甘油為1.0-2.0％、三乙醇胺1.0-2.5％、對羥基苯甲酸乙酯0.01-0.5％、余量為水。

進一步地，所述NK細胞擴增培養(yǎng)的方法，包括以下步驟：

步驟一：取新鮮血液，提取血液中的外周血單核細胞(以下簡稱PBMC)；

步驟二：在RPMI-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入200U/ml的白介素IL-2、80U/ml的慶大霉素和10％重量百分比的胎牛血清，獲得NK細胞培養(yǎng)液；

步驟三：取3.0×10⁷-4.0×10⁷個PBMC于一細胞培養(yǎng)瓶中，加入20-30ml的NK細胞培養(yǎng)液和2ml的濃度為1.0×10⁷個/ml的NK擴增試劑，獲得起始培養(yǎng)液；

步驟四：將NK細胞接種于起始培養(yǎng)液中培養(yǎng)1-2天，培養(yǎng)期間根據(jù)細胞生長狀態(tài)添加NK細胞培養(yǎng)液；當培養(yǎng)至第3天時，將培養(yǎng)液離心，獲得的細胞沉淀中加入NK細胞培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)；

步驟五：當NK細胞數(shù)量達1.5×10⁸個/瓶以上時，加入2支NK擴增試劑和NK細胞培養(yǎng)液進行擴大培養(yǎng)，培養(yǎng)過程中根據(jù)細胞生長狀態(tài)增加NK細胞培養(yǎng)液并進行分袋培養(yǎng)，使細胞濃度在1.0×10⁶個/ml，當培養(yǎng)至第12天時，控制加液量，使細胞濃度為2.0×10⁶個/ml；

步驟六：繼續(xù)培養(yǎng)至第14天后，收集細胞培養(yǎng)液，獲得NK細胞原液。

本發(fā)明還提供了上述外用藥物在作為病原體感染性皮膚病治療藥物中的應用。

進一步地，將NK細胞原液與不同的外用藥物輔料混合，可制備獲得外用液體制劑和外用膏狀制劑，在使用上述外用藥物治療病原體感染性皮膚病時，先用外用液體制劑涂抹或噴液至患處，再用外用膏狀制劑涂抹患處，進行混合治療，可保持藥效能夠很好地讓皮膚吸收，達到最佳治療效果，混合使用數(shù)次后，癥狀即可減輕或消失。

本發(fā)明的原理為：NK細胞(natural killer cell，自然殺傷細胞)是機體重要的免疫細胞，不僅與抗腫瘤、抗病毒感染和免疫調(diào)節(jié)有關(guān)，而且在某些情況下參與超敏反應和自身免疫性疾病的發(fā)生。本生物制劑采用NK細胞原液治療病原體感染性皮膚病，NK細胞原液的主要成分是NK細胞分泌的生長因子，包括MIP-1α、MIP-1β、RANTES、單核細胞趨化蛋白、白介素、集落刺激因子、腫瘤壞死因子、干擾素以及穿孔素等。本生物制劑的治療機理之一是NK細胞分泌的各種因子可以直接與病原物真菌、細菌和病毒結(jié)合，從而抑制病原菌的繁殖。另外，NK細胞分泌的炎癥因子被皮膚吸收后，誘導機體產(chǎn)生體液免疫及細胞免疫反應，提高了皮膚自身的抵抗能力，并同時加快修復受損的組織和細胞，從而達到治療的效果。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點：

1、廣譜性，對淺部真菌皮膚病治療有非常顯著的療效，在花斑癬、癬菌疹治療上有顯著效果；由細菌引起的膿皰瘡、毛囊炎、癤腫，蜂窩組織炎等同樣非常有效；由病毒引起的單純皰疹也具有一定療效；

2、起效快：皮膚噴霧或涂抹給藥、吸收快速、殺菌迅速，效果明顯；

3、無刺激：毒理學表明，對皮膚、傷口無刺激性；

4、無毒副作用：藥理學表明，使用安全可靠，無毒副作用；

5、無抗藥性：由于細胞因子制品，使其無抗藥性，長期使用效果不減；

6、使用方便：藥物直接涂或噴于患處，操作方便等優(yōu)勢。

具體實施方式

實施例1

1、材料：

本實施例所用方法如無特別說明均為本領(lǐng)域的技術(shù)人員所知曉的常規(guī)方法，所用的試劑等材料，如無特別說明，均為市售購買產(chǎn)品。

2、方法

2.1制備NK細胞原液

步驟一：PBMC提?。?/p>

將新鮮血液于740g離心10分鐘，獲得上層淡黃色血漿和下層血細胞，將下層血細胞與生理鹽水按照體積比1：1混合，取50ml離心管，將稀釋的血細胞懸液鋪在15ml淋巴細胞分離液上，400g離心30分鐘。收集中間白色膜狀細胞層，加入生理鹽水洗滌，400g離心10分鐘，棄上清液，重復洗滌一次。最后用適量培養(yǎng)液重懸細胞沉淀，即獲得PBMC。

步驟二：NK細胞培養(yǎng)液的制備：

在Gibco RPMI Medium 1640basic培養(yǎng)液(購買于美國GIBCO公司)中加入200U/ml的白介素IL-2、80U/ml的慶大霉素和10％重量百分比的Gibco FBS(購買于美國GIBCO公司)，獲得NK細胞培養(yǎng)液。

步驟三：NK細胞起始培養(yǎng)液的制備：

取3.0×10⁷-4.0×10⁷個PBMC于一T75培養(yǎng)瓶中，加入20-30ml的NK細胞培養(yǎng)液和1支NK擴增試劑，其中，所述NK擴增試劑為一種CD8α-白介素21-CD137復合物(參見中國專利文獻CN102154207A)，可直接通過市場購買的方式獲得，本發(fā)明使用的NK擴增試劑的產(chǎn)品規(guī)格為2ml/支，濃度為1×10⁷個/ml。

步驟四：NK細胞起始培養(yǎng)：

將NK細胞接種于上述T75培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，其中：

第1、2天注意觀察細胞狀態(tài)。如果細胞密度無明顯變化，細胞狀態(tài)良好可不處理。細胞密度明顯加大，可加NK細胞培養(yǎng)液10ml。

第3天將培養(yǎng)液離心，獲得的細胞沉淀轉(zhuǎn)移至新的T75培養(yǎng)瓶中，并加入30ml的NK細胞培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。

第4天觀察細胞，若細胞狀態(tài)良好，細胞密度較小，可不做處理，如果細胞密度過大，可酌情加NK細胞培養(yǎng)液。

第5天，若第4天未處理，且細胞狀態(tài)良好，密度大，則加入NK細胞培養(yǎng)液20ml。

第6天觀察細胞，根據(jù)細胞密度添加培養(yǎng)液30-50ml。

步驟五：NK細胞擴大培養(yǎng)：

第7天計數(shù)，若細胞數(shù)量大于1.5×10⁸個/瓶，則加入2支NK擴增試劑，若細胞數(shù)量在30-60百萬，則長至第8天再添加NK擴增試劑。然后添加NK細胞培養(yǎng)液，使總細胞濃度在1.0×10⁶個/ml。隨培養(yǎng)體積逐步增大，可轉(zhuǎn)入T175培養(yǎng)方瓶擴大體積培養(yǎng)，培養(yǎng)液體積大于120ml或細胞數(shù)量大于2.0×10⁸個/瓶時，則可以轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)袋培養(yǎng)。

第8-11天每天觀察，使得細胞濃度在1.0×10⁶個/ml左右，通過計數(shù)添加培養(yǎng)液，使得細胞濃度在1.0×10⁶個/ml。

第12-14天每天觀察，當細胞數(shù)量大于3.0×10⁹個/袋，并且體積大于1200ml時，將細胞分為2袋。

步驟六：收集NK細胞原液：

當細胞生長至所需數(shù)量時即可進行收集使用或凍存。一般情況下，14或15天收集細胞，因為此時細胞處于對數(shù)生長期，狀態(tài)最好，越往后細胞狀態(tài)會緩慢下滑，此時細胞可到3×10⁹個以上，NK細胞(CD3-CD56+)純度可達到80％以上。

2.2制備SNK液：

按重量計，取NK細胞原液85.0％、甘油5.0％、硼砂0.08％、透明質(zhì)酸0.1％、羥苯乙酯0.03％，溶劑為無菌水，混勻后滅菌分裝，獲得所述SNK液。

2.3制備SNK膏：

按重量計，取NK細胞原液80.0％、卡波姆941為1.5％、甘油為2.0％、三乙醇胺3.0％、對羥基苯甲酸乙酯0.5％和無菌水，混勻后滅菌分裝，獲得所述SNK膏。

3、臨床驗證

將臨床實驗分成3組進行，具體為：

實驗組1：選若干患有淺部真菌性皮膚病患者、細菌性皮膚病患者和病毒性皮膚病患者，包括足癬8例、花斑癬5例、癬菌疹5例、膿皰瘡6例、毛囊炎6例、癤腫8例、蜂窩組織炎6例、單純皰疹5例，帶狀皰疹4例，用SNK液進行涂抹或噴液治療，每天使用2-3次，統(tǒng)計臨床治療結(jié)果。

實驗組2：選若干患有淺部真菌性皮膚病患者、細菌性皮膚病患者和病毒性皮膚病患者，包括足癬8例、花斑癬5例、癬菌疹5例、膿皰瘡6例、毛囊炎6例、癤腫8例、蜂窩組織炎6例、單純皰疹5例，帶狀皰疹4例，用SNK膏進行涂抹治療，每天使用2-3次，統(tǒng)計臨床治療結(jié)果。

實驗組3：選若干患有淺部真菌性皮膚病患者、細菌性皮膚病患者和病毒性皮膚病患者，包括足癬8例、花斑癬5例、癬菌疹5例、膿皰瘡6例、毛囊炎6例、癤腫8例、蜂窩組織炎6例、單純皰疹5例，帶狀皰疹4例，用SNK液和SNK膏進行混合治療，每天使用2-3次，統(tǒng)計臨床治療結(jié)果。

上述實驗組1-3中，對于淺部真菌性皮膚病，均進行刮取鱗屑及甲屑進行真菌直接鏡檢，并作出明確診斷后，作為實驗病例。

結(jié)果如下表1所示：

表1：SNK液和SNK膏臨床實驗結(jié)果統(tǒng)計表

臨床實驗可看出，本發(fā)明的SNK液和SNK膏均具有廣譜性，對多種淺部真菌性皮膚病和多種細菌性皮膚病具有顯著的治療效果，其中對于足癬(腳氣病)治療效果非常顯著，輕度患者連續(xù)用藥三至五天痊愈，重度患者均在七日內(nèi)痊愈；在花斑癬、癬菌疹治療上也有顯著效果等；由細菌引起的膿皰瘡、毛囊炎、癤腫，蜂窩組織炎等非常有效；而由病毒引起的單純皰疹和帶狀皰疹也同樣有效果，比如，由單純皰疹病毒引起的口腔潰瘍或生殖器皰疹等口腔或生殖器疾病，適用于本發(fā)明。3組實驗患者中均未出現(xiàn)任何副作用。其中：第一組和第二組分別為SNK液和SNK膏，SNK液和SNK膏中由于NK細胞原液的含量不同，療效稍微有差別，SNK液比膏效果好。當SNK液和SNK膏一起使用時(先涂SNK液，再涂SNK膏)，既可保證SNK液中的活性因子高效和持久被皮膚所吸收，又可提高療效，兩者聯(lián)合使用療效最佳。

實施例2

本實施例提供了一種SNK液，按重量計，所述SNK液由NK細胞原液95.0％、甘油3.0％、硼砂0.05％、透明質(zhì)酸0.05％、羥苯乙酯0.01％和適量的無菌水組成，其中，所述NK細胞原液的制備方法同實施例1。

選若干患有淺部真菌性皮膚病患者、細菌性皮膚病患者和病毒性皮膚病患者，包括手癬2例、毛囊炎3例、單純皰疹3例，用上述SNK液直接噴灑于患處進行治療，每天使用2-3次，統(tǒng)計臨床治療結(jié)果。

結(jié)果發(fā)現(xiàn)：上述SNK液對真菌引起的手癬治療效果非常顯著，嚴重患者5-6天即可痊愈；對細菌引起的毛囊炎治療效果也很好，輕度患者4-5天后可痊愈，重度患者7天內(nèi)明顯好轉(zhuǎn)；對病毒引起的單純皰疹也有一定效果，治療4-5天后，癥狀有明顯好轉(zhuǎn)。

實施例3

本實施例提供了一種SNK膏，按重量計，所述SNK膏由NK細胞原液85.0％、卡波姆941為0.1％、甘油為1.0％、三乙醇胺1.0％、對羥基苯甲酸乙酯0.01％和適量無菌水組成。

選若干患有淺部真菌性皮膚病患者、細菌性皮膚病患者和病毒性皮膚病患者，包括手癬2例、膿皰瘡1例、帶狀皰疹2例，用上述SNK膏直接涂抹于患處進行治療，每天使用2-3次，統(tǒng)計臨床治療結(jié)果。

結(jié)果發(fā)現(xiàn)，所述SNK膏對手癬的治療效果非常顯著，連續(xù)使用5天可痊愈，對膿包瘡的治療效果顯著，連續(xù)使用7天可痊愈，對帶狀皰疹有一定效果，連續(xù)使用10天癥狀明顯好轉(zhuǎn)。

實施例4

本實施例提供了一種SNK液，按重量計，所述SNK液由NK細胞原液20％，甘油5％和適量的無菌水組成，利用所述SNK液治療足癬、毛囊炎和單純皰疹，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該SNK液對上述三種疾病均有一定治療效果，患者使用7天后癥狀均有一定好轉(zhuǎn)。

實施例5

本實施例提供了一種SNK液，按重量計，所述SNK液由NK細胞原液50％，甘油5％和適量無菌水組成，利用所述SNK液治療手癬患者7天后，基本痊愈。

實施例6

本實施例提供了一種SNK液，所述SNK液為100％的NK細胞原液，利用所述SNK液治療足癬、毛囊炎和單純皰疹，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該SNK液對足癬的治療效果非常顯著，重度患者治療6天后痊愈，對毛囊炎治療效果顯著，重度患者治療5天后痊愈，對單純皰疹具有一定治療效果，重度患者治療5天后癥狀緩解。

理論上，藥物中的NK細胞原液的含量越高，活性因子含量越高，效果越好，但考慮到使用方便性和增加皮膚滲透性和保護性的情況下，需要在NK細胞原液基礎(chǔ)上添加了一些輔助成分，實施例6中采用100％的NK細胞原液進行治療，其臨床實驗結(jié)果與實施例1的SNK液及膏相比，在治療效果上并無很大差別。

以上為本發(fā)明一種詳細的實施方式和具體的操作過程，是以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進行實施，但本發(fā)明的保護范圍不限于上述的實施例。