本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，尤其涉及一種脂肪填充物及其制備方法。
背景技術(shù)：
：各種先天性的和外傷繼發(fā)的軟組織缺損一直是困擾整形外科醫(yī)生的難題之一，引起軟組織缺損的原因有嚴重?zé)齻⒏腥?、各種外傷及先天性疾病等；對于軟組織缺失，常用的治療方法包括皮瓣移植、假體植入、軟組織填充等。其中軟組織填充具有創(chuàng)傷小，效果佳，可塑性強的優(yōu)點，臨床常用的填充物有硅膠、膠原蛋白和玻璃酸鈉等，但是存在排異反應(yīng)或術(shù)后療效不能持久的缺點。脂肪組織為軟組織填充物的選擇開辟了新方向。脂肪具有生物相容性好、獲取方便、來源豐富、填充效果好和創(chuàng)傷小等優(yōu)勢，可以達到調(diào)配脂肪、雕塑體型的目的。然而，移植后的脂肪易被吸收，存活率較低，一般為30%-60%,甚至發(fā)生脂肪組織液化、壞死、鈣化和纖維化等問題，限制了脂肪移植的臨床應(yīng)用，極大影響了脂肪移植的遠期療效。研究表明，脂肪組織是一種高度血管化的組織，血液供應(yīng)和毛細血管的密度是骨骼肌的2-3倍，血管生成與脂肪形成密切相關(guān)，導(dǎo)致移植脂肪組織高吸收率的關(guān)鍵原因之一是移植區(qū)的血供不足，尤其是移植組織中央?yún)^(qū)不能獲得充足的氧和營養(yǎng)，從而影響移植長期的存活率。因此，如何恢復(fù)和重建移植體內(nèi)部的血供，提高移植體存活率，是脂肪移植研究中的熱點。種子細胞、生物材料、細胞與生物材料的整合是組織工程的三個關(guān)鍵因素?？紤]到細胞成分在組織工程中的重要作用。近幾年，單純脂肪移植的改進方法-細胞輔助的脂肪移植（cell-assistedlipotransfer，CAL）技術(shù)得以發(fā)展。它是將新抽取的脂肪分為兩份：一份用來提取基質(zhì)血管組分（stromalvascularfractioncells,SVF），包括間質(zhì)細胞、血管內(nèi)皮細胞和血管壁細胞等；另一份作為細胞外基質(zhì)，兩部分聯(lián)合作為移植物注射于移植區(qū)。專利（CN104548204A）中將脂肪前體細胞和脂肪進行混合，由于SVF細胞只是進行了提取，并沒有經(jīng)過擴增，而且細胞成分沒有經(jīng)過固定，不能停留在移植局部，導(dǎo)致移植物內(nèi)細胞數(shù)量成分的不足，從而造成移植效果不佳；專利（CN103961743A）中干性脂肪顆粒和油性脂肪顆粒加入胰島素后混合，并沒有解決移植脂肪血管化的問題，其脂肪存活率并不會得到改善。脂肪移植早期，細胞處于缺氧狀態(tài)，可誘導(dǎo)細胞分泌VEGF細胞因子，VEGF家族是一大類具有重要血管生長調(diào)節(jié)作用的生長因子。但是脂肪移植中生長因子含量有限，而外源性添加的VEGF因子在體內(nèi)正常生理條件下，半衰期較短，不足1小時。有人曾考慮使用VEGF基因轉(zhuǎn)染及加用緩釋系統(tǒng)的方法，但轉(zhuǎn)染的方法可控性較差，緩釋系統(tǒng)容易帶入雜質(zhì)；前述這兩種方法臨床可操作性較差。綜上所述，研究一種穩(wěn)定性好，存活率高的脂肪填充物，對于修復(fù)軟組織缺損顯得尤為重要。技術(shù)實現(xiàn)要素：針對上述問題，本發(fā)明提供一種脂肪填充物及其制備方法，該填充物可以有效提高移植脂肪的穩(wěn)定性，有利于脂肪填充技術(shù)的發(fā)展。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供的脂肪填充物，由以下成分組成：細胞支架、細胞成分、生長因子、和抗疤痕因子，其體積用量比例為109-115：15-30：4：0.5。所述細胞支架為洗滌脂肪、可注射水凝膠、玻尿酸、纖連蛋白或?qū)诱尺B蛋白中的一個或組合。所述細胞成分為自體或異體的脂肪干細胞、SVF組分、臍帶干細胞、臍血干細胞、胎盤干細胞或骨髓干細胞中的一個或組合。所述生長因子為VEGF、HGF、EGF、TGF-α、富含血小板的血漿（PRP）、肝素、前列腺素E1或前列腺素E2中的一個或組合。所述抗疤痕因子為CD26的抑制劑、CD26的阻斷劑或CD26的單克隆抗體中的一個或組合。優(yōu)選為，所述細胞支架為洗滌脂肪和可注射水凝膠；所述細胞成分為臍帶干細胞、脂肪干細胞及SVF組分；所述生長因子為VEGF、HGF和富含血小板的血漿（PRP）；所述抗疤痕因子為CD26單克隆抗體。為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供上述脂肪填充物的制備方法，具體包括以下步驟。步驟1、細胞成分的提取、培養(yǎng)和制備。步驟2、將細胞支架和步驟1制備的細胞成分充分混合，再加入生長因子和抗疤痕因子，混合均勻，即得脂肪填充物。優(yōu)選地，所述的脂肪填充物的制備方法，具體包括以下步驟。步驟1、初次提取SVF組分。步驟2、對SVF組分中的脂肪干細胞進行低氧培養(yǎng)、冷凍保存。步驟3、臍帶干細胞的制備、低氧培養(yǎng)和冷凍保存。步驟4、采集脂肪，提取SVF和制備洗滌脂肪，備用。步驟5、復(fù)蘇步驟2中的脂肪干細胞和步驟3中的臍帶間充質(zhì)干細胞備用。步驟6、提取PRP。步驟7、將洗滌脂肪100ml、可注射水凝膠9-15ml、SVF5-10ml、脂肪干細胞5-10ml和臍帶間充質(zhì)干細胞5-10ml,充分混合，再加入VEGF0.5ml、HGF0.5ml、PRP3ml和CD26單克隆抗體0.5ml，混合均勻，即得脂肪填充物。所述的干細胞低氧培養(yǎng)的條件為氧氣10%、二氧化碳5%、氮氣85%。所述步驟2和步驟3的干細胞培養(yǎng)時使用無血清培養(yǎng)體系，并添加5%的無血清添加劑。所述步驟4中提取SVF在提取時使用注射用水對紅細胞進行裂解。所述步驟7洗滌脂肪、可注射水凝膠、SVF、脂肪干細胞和臍帶間充質(zhì)干細胞的優(yōu)選體積比例為10：1：1：1：1，臍帶間充質(zhì)干細胞和脂肪干細胞的數(shù)量為1:1,數(shù)量為1×106-1×107/ml，優(yōu)選1×106/ml；SVF的細胞數(shù)量為1×105-106/ml，優(yōu)選1×105/ml。所述PRP的加入量為109-1010/ml，優(yōu)選109/ml。所述VEGF和HGF加入的量分別為1000-10000pg/ml，優(yōu)選1000pg/ml。本發(fā)明的有益效果。本發(fā)明中，通過模擬組織工程的方法構(gòu)建脂肪填充物，各有效成分的組合，細胞支架部分提供移植物細胞成分的支架，可注射凝膠有利于細胞的粘附，減少移植細胞的損失；此外移植的脂肪干細胞、臍帶間充質(zhì)干細胞及SVF細胞組分的額外補充，這些細胞成分不僅可以分化為脂肪細胞，同時可以分化為血管內(nèi)皮細胞，其分泌的各類因子對于移植微環(huán)境的維持，血管的生成等均有益處；臍帶間充質(zhì)干細胞的使用更方便脂肪移植，不再需要事先對脂肪干細胞進行培養(yǎng)，尤其在緊急情況下，例如外傷，可立即復(fù)蘇臍帶干細胞與脂肪合并移植。臍帶間充質(zhì)干細胞的加入可增加細胞成分，添加的生長因子可提供細胞移植后，短時間內(nèi)細胞因子的需要，待作用消失后，通過干細胞和PRP持續(xù)不斷分泌的細胞因子，可滿足移植脂肪組織修復(fù)、血管生成、炎癥趨化等功能活動的需要。在脂肪移植過程中，無論是抽脂區(qū)還是填充區(qū)，都有可能造成傷疤。傷疤主要由膠原蛋白組成，這是一種由皮膚成纖維細胞分泌的纖維蛋白。研究發(fā)現(xiàn)底層皮膚的成纖維細胞表達一種稱為CD26的蛋白，參與了傷口愈合的最初修復(fù)步驟，阻斷CD26的活性，可以減少疤痕數(shù)量。CD26單抗的加入，極大減弱了移植脂肪纖維化的發(fā)展，保證了移植物的彈性和功能。本發(fā)明可有效提高移植脂肪的穩(wěn)定性，減輕脂肪移植后的吸收，減少移植物纖維化不良反應(yīng)的發(fā)生，細胞輔助的脂肪移植具有成本低、操作簡單無免疫排斥反應(yīng)，術(shù)后形體自然，無手術(shù)瘢痕等優(yōu)點，臨床效果良好且持久。附圖說明圖1為臍帶間充質(zhì)干細胞原代細胞的生長狀態(tài)圖。具體實施方式下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進一步的說明。實施例1。一種脂肪填充物，包括：細胞支架部分、細胞成分、生長因子、抗疤痕因子；所述細胞支架部分包括：洗滌脂肪和可注射水凝膠；所述細胞成分包括：培養(yǎng)的臍帶間充質(zhì)干細胞和脂肪干細胞及SVF組分；所述生長因子包括：VEGF、HGF和PRP；所述抗疤痕成分包括：CD26單克隆抗體。上述脂肪填充物的制備方法，包括以下步驟。步驟1、基質(zhì)血管組分（SVF）的制備。（1）洗滌脂肪：將100ml抽取的脂肪裝入脂肪采集瓶中，取50ml脂肪分裝到一個T175培養(yǎng)瓶中；用10ml移液管，去吸頭，先吸取T175培養(yǎng)瓶上層黃色油脂棄掉，再吸取下層紅色液體棄掉；向T175培養(yǎng)瓶中加入100ml氯化鈉注射液，劇烈晃動3min，充分洗滌脂肪組織，靜止3-5min，吸去下層水相；重復(fù)洗滌脂肪組織操作三次，直至下層水相液清澈，記錄T175培養(yǎng)瓶中剩余洗滌脂肪組織的終體積。（2）膠原酶I消化：在步驟（1）的T175培養(yǎng)瓶中加入與步驟（1）終體積等體積的膠原酶I溶液（濃度為0.05%），封口膜封口后，劇烈晃動培養(yǎng)瓶5-10s，置于氣浴恒溫震蕩器中，在37℃、70rpm條件下，消化60min，消化過程中每隔15min劇烈晃動培養(yǎng)瓶5-10s，直到脂肪組織看起來較為平滑。（3）分離基質(zhì)血管組分（SVF）：將步驟（2）消化后的組織，用無菌輸血器濾網(wǎng)過濾，將過濾后的液體分裝到50ml的離心管中，400g離心10min；用移液管自上而下，除去細胞沉淀上層的油脂和膠原酶溶液；用10ml生理鹽水重懸細胞沉淀，將細胞用移液管吹散，細胞過100目濾網(wǎng)，離心處理10min（室溫，400g），吸去上清液，得到基質(zhì)血管組分細胞（SVF）。步驟2、對SVF組分中的脂肪干細胞進行培養(yǎng)、凍存。（1）原代培養(yǎng)培養(yǎng)（P0）：使用10ml無血清培養(yǎng)體系（無血清培養(yǎng)液(Lonza，12-725F):無血清添加劑(PALL，15950-017)=50:1），重懸步驟1制備的基質(zhì)血管組分細胞沉淀，細胞吹散后，補加8ml無血清培養(yǎng)體系；將細胞平均接種到3個T-75培養(yǎng)瓶中，每個培養(yǎng)瓶均補加無血清培養(yǎng)體系4ml；將培養(yǎng)瓶水平放入37℃，氧氣10%、二氧化碳5%、氮氣85%的培養(yǎng)箱中，進行低氧培養(yǎng)。（2）細胞換液：原代培養(yǎng)24h后，進行全量換液；此后，每隔3天全量換液一次，放置在二氧化碳恒溫恒濕（37℃，95%濕度）培養(yǎng)箱中，進行氧氣10%、二氧化碳5%、氮氣85%低氧培養(yǎng)。（3）細胞收集：培養(yǎng)到第8天時，原代培養(yǎng)細胞融合度達到80%-90%時，消化收獲細胞；將培養(yǎng)瓶中的無血清培養(yǎng)體系收集到50ml規(guī)格的離心管中，離心處理10min（室溫，400g）；用20ml的生理鹽水清洗T-75培養(yǎng)瓶1次，倒掉生理鹽水，在T-75培養(yǎng)瓶中加入37℃預(yù)熱的0.25%的胰酶2ml；在顯微鏡下觀察，直至有80%的細胞變圓，并脫落漂浮，即用離心后的無血清培養(yǎng)體系終止消化，消化過程在37℃條件下，消化時間4min；將終止的細胞懸液收集到一個50ml離心管中，用10-20ml的生理鹽水清洗一遍T-75培養(yǎng)瓶，洗液也倒入50ml離心管中，300g離心處理10min，棄上清，吹散離心后的細胞沉淀，加生理鹽水稀釋至40ml，300g離心10min，得到細胞沉淀。（4）凍存：用1.5ml無血清培養(yǎng)體系稀釋步驟（3）得到的細胞沉淀，混合均勻；緩慢加入在4℃條件下預(yù)冷30min的凍存液（體積：20%DMSO(Sigma,D5879)，80%無血清培養(yǎng)體系）1.5ml，混合均勻；將3ml混合均勻后細胞懸液加入到3個凍存管中，每管1ml；使用程序降溫儀冷凍(降溫至-80℃)細胞后(需90min），再放入液氮罐保存(-196℃)，備用。步驟3、臍帶間充質(zhì)干細胞的制備、培養(yǎng)和凍存。（1）臍帶的采集：經(jīng)產(chǎn)婦知情同意，采集新鮮無菌臍帶，4℃保存，24h內(nèi)進行處理，同時對臍帶血進行傳染病篩查。（2）臍帶的清潔和消毒：取篩查合格的臍帶，先用0.9%的氯化鈉注射液進行臍帶表面清洗，然后浸泡在75%酒精內(nèi)2min，用0.9%的氯化鈉注射液再次清洗，去除殘余酒精和血漬。（3）臍帶的原代制備：將臍帶剪成2-3cm的小段后，剔除外側(cè)羊膜和內(nèi)部血管后，得到華通氏膠并剪成2mm3的組織小塊；用0.9%的氯化鈉注射液清洗2次，得到無血漬的華通氏膠組織小塊并離心洗滌，加入10ml無血清培養(yǎng)體系，放置在CO2培養(yǎng)箱內(nèi)37℃、5.0%CO2濃度下培養(yǎng)24h后，進行第一次全量換液，去除培養(yǎng)皿內(nèi)的細胞碎片，在培養(yǎng)至第8天時，進行第二次全量換液。不同氧濃度下臍帶間充質(zhì)干細胞擴增時間和流式檢測結(jié)果，見表1。表1：不同氧濃度下臍帶充質(zhì)干細胞擴增時間和流式檢測結(jié)果。由表1可知，不同氧濃度下臍帶間充質(zhì)干細胞在細胞表面標(biāo)志物的流式檢測上沒有差別，在10%氧氣的低氧條件下，原代培養(yǎng)時間最短，故本實施例使用10%氧氣的低氧條件。（4）臍帶間充質(zhì)干細胞的傳代和收集：當(dāng)細胞融合率達到70%以上時，使用0.125%胰酶10ml消化收集原代細胞，按照5000-6000個/cm2的細胞密度進行傳代培養(yǎng)，待培養(yǎng)到細胞融合率達80%以上時，對細胞進行收集。臍帶間充質(zhì)干細胞生長狀態(tài)如圖1所示。檢測不同低氧條件分泌蛋白水平的不同情況，見表2。表2：不同氧濃度下臍帶間充質(zhì)干細胞分泌因子含量測定（單位：pg/mL）。由表2可知，對選取的5個細胞分泌因子進行含量測定，可知在10%氧氣的低氧條件下，臍帶間充質(zhì)干細胞分泌細胞因子含量最高，且提高了2-4倍，故本實施例全程(包括原代和傳代培養(yǎng))使用10%氧氣的低氧條件培養(yǎng)細胞，可大幅提高獲取細胞因子的產(chǎn)量，尤其是血管內(nèi)皮生長因子。（5）凍存：用1.5ml無血清培養(yǎng)體系稀釋步驟(4)得到的細胞沉淀，并混合均勻；往細胞懸液中加入1.5ml4℃預(yù)冷30min凍存液（體積比：20%DMSO,80%無血清培養(yǎng)體系），并混合均勻；將3ml細胞懸液加入到3個凍存管中，每管1ml；使用程序降溫儀冷凍(降溫至-80℃)細胞90min后，置液氮罐（-196℃）保存，備用。步驟4、基質(zhì)血管組分（SVF）的純化和洗滌脂肪的制備。（1）基質(zhì)血管組分（SVF）的純化：重復(fù)操作步驟1，將得到的基質(zhì)血管組分細胞沉淀加入10mL注射用水，裂解紅細胞，用移液管快速吹打組織塊及紅細胞沉淀，裂解2min后，加入生理鹽水至45mL，300g離心10min去除破碎的紅細胞，將細胞沉淀收集，得到基質(zhì)血管組分（SVF），備用。采用傳統(tǒng)方法(索萊寶，R1010)與本實施例注射用水裂解方法的紅細胞殘留情況，見表3。表3：紅細胞殘留表。方法例數(shù)平均紅細胞殘留傳統(tǒng)方法51.0×105個/mL注射用水裂解72.3×103個/mL由表3可知，使用注射用水后可明顯減少紅細胞，平均紅細胞殘留達到103數(shù)量級，培養(yǎng)8天后單位面積獲得的細胞數(shù)量是裂解前的三倍。本實施例使用注射用水對紅細胞進行裂解，可以減少紅細胞在原代培養(yǎng)過程中造成的干擾，加快組織貼壁，細胞游離加快，減少脂肪移植物的纖維化。此外，由于只使用注射用水，而不使用其他化學(xué)試劑，既降低了成本，也減少了對細胞的損傷，有效增加了臨床應(yīng)用的安全性。（2）制備洗滌脂肪：取抽脂脂肪轉(zhuǎn)移到一個T175培養(yǎng)瓶中，用10ml的移液管（去吸頭），于脂肪采集瓶中先吸取脂肪層上層的油脂棄掉，再吸取脂肪層下層的紅色液體棄掉。向T175培養(yǎng)瓶中加入100ml氯化鈉注射液，劇烈晃動3min以充分洗滌脂肪組織，靜止5min，吸去下層水相；重復(fù)洗滌脂肪組織操作三次，直到下層液較為清澈，得到洗滌脂肪，備用。步驟5、干細胞的復(fù)蘇：開啟電熱恒溫水槽，使水溫保持在40.0℃；將步驟2的脂肪干細胞和步驟3中臍帶間充質(zhì)干細胞放入電熱恒溫水槽3min，使細胞快速復(fù)溫；將凍存管中細胞移入50ml離心管，加10ml的4℃預(yù)冷的氯化鈉注射液到50ml離心管，吹打均勻；加氯化鈉注射液定容到40ml，混合均勻，300g離心10min，棄上清，再次用氯化鈉注射液洗滌一次，備用。步驟6、富含血小板的血漿（PRP）的制備：取9ml靜脈血置于裝有1ml枸櫞酸葡萄糖溶液抗凝劑的真空采血管中；2000rpm離心10min，將血液分為3層，最底層為紅細胞，頂層為主要是纖維蛋白原等血漿成分的貧血小板血漿（PPP），中間層為血小板濃縮物（PC）；吸取全部上清直至頂層與中間層交界面以下3mm處，并將其移至另一離心管，2000rpm離心10min，離心管中液體分為2層，上層上清液為PPP，下層為PC，吸取約1/3上清液，棄之，剩余約3ml液體即為富含血小板的血漿。步驟7、脂肪填充物的制備：將洗滌脂肪100ml、脂肪干細胞(10ml,106/ml)、臍帶間充質(zhì)干細胞(10ml,106/ml)、SVF(10ml,105ml)、可注射水凝膠（上海其勝生物制劑有限公司，992-803）10ml充分混合，加入VEGF(0.5ml,1000pg/ml)（美國PeproTech公司，AF-100-20）、HGF(0.5ml,1000pg/ml)（佰柯生物科技有限公司，BBOF-04343）、PRP(3ml,109/ml)、CD26單克隆抗體（美國進口ThermoScientific，PA128302）(0.5ml,50μg/ml)，再次充分混勻，即得。為了進一步驗證本發(fā)明的有益效果，本發(fā)明提供以下實驗案例。一、實驗方法：移植區(qū)常規(guī)消毒鋪巾，局部浸潤麻醉或局部神經(jīng)阻滯麻醉成功后，用10ml注射器針頭于相對隱蔽部位作皮膚穿刺，用16號單孔針頭沿穿刺點進行脂肪注射；回抽無血后，在標(biāo)記范圍內(nèi)作多隧道、多層次、多點、少量的注射，避免路線重復(fù)，邊退邊注射脂肪填充物于乳房皮下；注射完成后進行局部按摩塑形，使填充物均勻分布于整個受區(qū)并與周圍自然銜接；注射層次一般在皮下組織深層、SMAS筋膜淺層，注射量以填充部位稍高于周圍組織為宜，應(yīng)避免損傷局部神經(jīng)和血管；術(shù)后僅包扎注射針孔處，囑患者術(shù)后24h內(nèi)間斷性的冰敷；移植后減少或避免移植區(qū)周圍肌肉的活動1周，防止移植脂肪中新生血管的損傷。二、實驗結(jié)果：術(shù)后定期隨訪、照相，與術(shù)前進行對比。（1）大體觀察：查體并參照術(shù)前術(shù)后照片，移植區(qū)外表無凹凸不平感，組織柔軟度好，局部無硬塊和囊腫。（2）影像學(xué)評價結(jié)果：采用磁共振成像或是超聲影像技術(shù)，作為評價術(shù)后填充物體積的一種量化方法。采用三維數(shù)字成像技術(shù)，精準(zhǔn)定量地計算出患者自體脂肪填充中前后的效果。a.MRI測量乳房體積。術(shù)前、術(shù)后6、12個月行雙側(cè)乳房平掃，由放射科3位專業(yè)技師對所得影像資料進行體積測量，反復(fù)3次，取平均值，按公式（移植后體積/(移植前體積＋移植物體積)）計算存留率，結(jié)果見表4。表4：移植前后體積變化及存留率表。由表4可知，在移植100ml的移植物后，單純移植脂肪者6個月和12個月后的存留率均較本發(fā)明方法低，說明本發(fā)明能較好的保證移植物的存活，可以延長移植物的存活時間。b、評價乳房MRI影像的變化。6個月以后觀察，并無結(jié)節(jié)、囊腫或鈣化。特別說明，出于人道主義角度考慮，脂肪填充物移植者更傾向于采集自體干細胞制備脂肪填充物，滿足自身需求。但是，在實際臨床中，有些移植者身體消瘦或者身體狀況不佳，脂肪干細胞活性不理想，導(dǎo)致自體脂肪制備的填充物效果不理想，移植者會積極地選擇來源于異體的備用的抽脂脂肪。上述實施例僅為說明本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思及特點，其目的在于讓本
技術(shù)領(lǐng)域：
的人員了解本發(fā)明的內(nèi)容并局限于此，并不能以此限制本發(fā)明的保護范圍。凡根據(jù)本發(fā)明技術(shù)方案所作的等效變化，都應(yīng)覆蓋在本法的保護范圍之內(nèi)。當(dāng)前第1頁1 2 3