此案是申請日為2006年5月2日、中國申請?zhí)枮?00680023775.4(國際申請?zhí)枮閜ct/us2006/017242)、發(fā)明名稱為“神經(jīng)代謝疾病的基因治療”的發(fā)明申請的分案申請。

依據(jù)us的35u.s.c§119(e)，本申請享有2005年5月2日申請的u.s.臨時申請no.60/677,057和2005年5月31日申請的u.s.臨時申請no.60/685,808的優(yōu)先權(quán)。

本發(fā)明涉及治療影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)(cns)特別是脊髓的疾病的組合物和方法。本發(fā)明進一步涉及包括病毒載體如腺相關(guān)病毒(aav)載體的組合物及其給藥方法。

背景技術(shù)：

一組稱為溶酶體貯積癥(lsd)的代謝疾病包括超過四十種的遺傳疾病，其中許多涉及各種溶酶體水解酶的遺傳缺陷。代表性的溶酶體貯積癥和相關(guān)的缺陷的酶列于表1中。

表1

*涉及cns

lsd的標(biāo)志性特征是溶酶體中代謝物的異常累積，這導(dǎo)致核周體中大量擴張的溶酶體的形成。治療lsd(與治療肝臟特異性酶病相反)的主要挑戰(zhàn)是需要逆轉(zhuǎn)多個分開組織中的溶酶體貯積病理。一些lsd可以通過靜脈內(nèi)灌輸缺少的酶得到有效的治療，稱為酶替代療法(ert)。例如，1型gaucher患者只具有內(nèi)臟疾病并很好地應(yīng)答使用重組葡糖腦苷脂酶(genzyme，corp.)的ert。然而，患有影響cns的代謝疾病(例如，2或3型gaucher疾病)的患者不應(yīng)答靜脈內(nèi)ert，因為替代的酶被血腦屏障(bbb)阻止進入大腦。此外，通過直接注射將替代酶引入大腦的嘗試已經(jīng)不成功，部分是由于高局部濃度的酶的細胞毒性(未公開的觀察)和大腦中有限的實質(zhì)擴散速率(pardridge，peptidedrugdeliverytothebrain(肽藥物至大腦的傳送)，ravenpress，1991)。

阿爾茨海默氏病(ad)是影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)(cns)的疾病，特征在于由于降低的aβ分解代謝的淀粉樣β-肽(aβ)累積。隨著aβ累積，其聚合成胞外斑，引起突觸功能的損傷和神經(jīng)元的喪失。病理導(dǎo)致癡呆、喪失協(xié)調(diào)和死亡。

基因治療是用于影響cns的疾病的新興治療形式，影響cns的疾病包括lsd和阿爾茨海默氏病。在該方法中，通過用攜帶健康形式或修飾形式基因的載體轉(zhuǎn)導(dǎo)受影響的細胞來產(chǎn)生正常代謝途徑的恢復(fù)和病理的逆轉(zhuǎn)。

通過產(chǎn)生能夠有效感染有絲分裂后的神經(jīng)元的病毒載體來促進cns基因治療。對于將基因傳送至cns的病毒載體的概述，參見davidson等(2003)naturerev.，4:353-364。認(rèn)為腺相關(guān)病毒(aav)載體對于cns基因治療是最佳的，因為它們具有適當(dāng)?shù)亩拘院兔庖咴蕴卣?，能夠轉(zhuǎn)導(dǎo)神經(jīng)細胞并能夠介導(dǎo)cns中的長期表達(kaplitt等(1994)nat.genet.，8:148-154；bartlett等(1998)hum.genether.，9:1181-1186和passini等(2002)j.neurosci.，22:6437-6446)。

治療性轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物，例如，酶，可以通過轉(zhuǎn)導(dǎo)的細胞分泌并隨后由其他細胞吸收，然后它將在其中緩解病理。將這種方法稱為交叉校正(neufeld等(1970)science，169:141-146)。然而，病理如lsd范圍中貯積病理的校正，由于注射的載體和分泌的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物的有限實質(zhì)擴散，通常限于注射位點緊靠的附近(taylor等(1997)nat.med.，3:771-774；skorupa等(1999)exp.neurol.，160:17-27)。因此，影響多個腦區(qū)域的神經(jīng)病理學(xué)需要廣泛分布的載體傳送，使用多個空間分布的注射，尤其在大的腦中如人腦中注射。這顯著增加了腦損傷的風(fēng)險。此外，一些腦區(qū)域是外科手術(shù)難以接近的。因此，cns內(nèi)除了擴散以外的其他載體運輸方式將是有益的。

在軸突末梢給藥時，一些病毒被納入并沿著軸突逆向運輸至核。一個腦區(qū)域中的神經(jīng)元通過軸突與遠側(cè)腦區(qū)域互相連接，因此提供了用于載體傳送的運輸系統(tǒng)。使用腺病毒、hsv和偽狂犬病病毒的研究已經(jīng)使用這些病毒將基因傳送至腦內(nèi)遠側(cè)結(jié)構(gòu)的運輸特征(soudas等(2001)fasebj.，15:2283-2285；breakefield等(1991)newbiol.，3:203-218和defalco等(2001)science，291:2608-2613)。

幾組已經(jīng)報道了通過avv血清型2(aav2)的腦轉(zhuǎn)導(dǎo)限于顱內(nèi)注射位點(kaplitt等(1994)nat.genet.，8:148-154；passini等(2002)j.neurosci.，22:6437-6446和chamberlin等(1998)brainres.，793:169-175)。一個最近的報道表明aav2的逆向軸突運輸也可以在正常大鼠腦的選定回路中發(fā)生(kaspar等(2002)mol.ther.，5:50-56)。然而，不知道是什么特定參數(shù)負責(zé)觀察到的軸突運輸，以及處于細胞機能障礙狀態(tài)的患病神經(jīng)元是否將產(chǎn)生足量而有效的軸突運輸。實際上，已經(jīng)報道了lsd神經(jīng)元中觀察到的損傷影響軸突運輸乃至阻斷軸突運輸(walkey(1998)brainpathol.，8:175-193的綜述)，表明疾病損害的神經(jīng)元不支持aav沿著軸突的運輸。

因此，本領(lǐng)域中存在產(chǎn)生用于治療影響cns的代謝疾病的新治療方法的需要。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供了用于治療或預(yù)防代謝疾病的方法和組合物，這些疾病如特征在于cns功能降低的風(fēng)險或與cns功能降低的風(fēng)險相關(guān)的溶酶體貯積病(lsd)或異常膽固醇貯積功能。

本發(fā)明提供了用于治療或預(yù)防影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)(cns)的疾病的方法和組合物，這些疾病如特征在于cns功能降低的風(fēng)險或與cns功能降低的風(fēng)險相關(guān)的阿爾茨海默氏病。

本發(fā)明進一步提供了將轉(zhuǎn)基因最低程度侵害性的靶向傳送至受影響患者腦中選定區(qū)域的方法。

本發(fā)明的其他優(yōu)勢將部分列于以下的描述中，部分將從說明書中理解，或可以通過本發(fā)明的實踐得知。

酸性神經(jīng)鞘磷脂酶(asm)敲除小鼠，niemann-picka型疾病的模型，通過單次顱內(nèi)注射進入腦的一個半球給藥攜帶人asm基因(aav-asm)的aav2載體。本發(fā)明是部分基于以下的發(fā)現(xiàn)和證明：高滴定度aav-asm注射至患病的腦導(dǎo)致aav-asm在多個遠側(cè)部位內(nèi)以與神經(jīng)支配注射位點的投射神經(jīng)元的形態(tài)構(gòu)造(topographicalorganization)相符的模式表達。本發(fā)明進一步部分基于以下的發(fā)現(xiàn)和證明：溶酶體貯積病理在aav-asm注射位點和運輸?shù)竭_并在其中表達asm的遠側(cè)部位的廣泛校正。

在另一個方面中，本發(fā)明提供了在asmko小鼠中深部小腦核內(nèi)單側(cè)或者雙側(cè)注射后的校正膽固醇貯積病理和啟動功能恢復(fù)的方法。

進一步提供的是上述方法，其中在選自aav2/1、aav2/2、aav2/5、aav2/7或aav2/8血清型的重組aav載體中傳送轉(zhuǎn)基因。只為了說明的目的，重組載體在小鼠模型中編碼功能性人asm蛋白質(zhì)。

因此，在一方面中，本發(fā)明提供了治療哺乳動物神經(jīng)代謝疾病的方法。通過本發(fā)明的方法治療的群體包括，但不限于，具有l(wèi)sd或處于產(chǎn)生lsd風(fēng)險中的患者，如表1中所列的疾病，特別地，如果這樣的疾病是影響cns的疾病。在說明性的實施方案中，疾病是niemann-picka疾病和/或通常與npa相關(guān)的繼發(fā)性膽固醇貯積病理。

在一方面中，公開的方法包括將攜帶編碼治療產(chǎn)物的轉(zhuǎn)基因的avv病毒載體給予受折磨患者的cns并允許轉(zhuǎn)基因在遠離給藥位點的cns內(nèi)以治療水平表達。此外，載體可以包括編碼有效治療cns疾病的生物活性分子的多核苷酸。這樣的生物活性分子可以包括肽，包括但不限于，天然或突變形式的全長蛋白質(zhì)、天然或突變形式的蛋白片段、合成的多肽、抗體和抗體片段如fab’分子。生物活性分子還可以包括核苷酸，包括單鏈或雙鏈dna多核苷酸和單鏈或雙鏈rna多核苷酸。對于可以用于在此公開的方法的實踐中的示例核苷酸技術(shù)的綜述，參見kurreck，(2003)j.，eur.j.biochem.270，1628-1644[反義技術(shù)]；yu等(2002)pnas99(9)，6047-6052[rna干擾技術(shù)]和elbashir等(2001)genesdev.，15(2):188-200[sirna技術(shù)]。

在說明性的實施方案中，通過將高滴定度aav載體溶液直接實質(zhì)內(nèi)注射至患病的腦中來實現(xiàn)給藥。此后以治療水平在給藥位點的遠側(cè)、對側(cè)或同側(cè)表達轉(zhuǎn)基因，離開給藥位點至少2、3、5、8、10、15、20、25、30、35、40、45或50mm。

在另一個方面中，本發(fā)明還提供了體內(nèi)傳送重組aav基因組至疾病損害神經(jīng)元的核的方法。在一些實施方案中，通過神經(jīng)元呈現(xiàn)的細胞病理是溶酶體貯積病，如表1中所列的疾病。在說明性的實施方案中，疾病是niemann-picka疾病。在另一個實施方案中，呈現(xiàn)的細胞病理為阿爾茨海默氏病的。將重組aav基因組傳送至疾病損害神經(jīng)元的核的方法包括將疾病損害的神經(jīng)元的軸突末梢接觸含有aav病毒顆粒的組合物，該aav病毒顆粒含有重組aav基因組，并使病毒顆粒被內(nèi)吞并沿著軸突逆向胞內(nèi)運輸至神經(jīng)元的核。組合物中載體的濃度至少為：(a)5、6、7、8、8.4、9、9.3、10、15、20、25或50(×10¹²gp/ml)；(b)5、6、7、8、8.4、9、9.3、10、15、20、25或50(×10⁹tu/ml)；或(c)5、6、7、8、8.4、9、9.3、10、15、20、25或50(×10¹⁰iu/ml)。在特定的實施方案中，神經(jīng)元是投射神經(jīng)元和/或軸突末梢至神經(jīng)元核的距離至少為2、3、5、8、10、15、20、25、30、35、40、45或50mm。

本發(fā)明提供了將轉(zhuǎn)基因傳送至患者的脊髓和/或腦干部位的方法和組合物，通過將含有轉(zhuǎn)基因的重組向神經(jīng)性病毒載體給藥至患者腦的深部小腦核(dcn)部位的至少一個部位。病毒傳送是在脊髓和/或腦干部位中轉(zhuǎn)基因有利表達的條件下進行。在說明性的實施方案中，疾病是niemann-picka疾病。在其他實施方案中，呈現(xiàn)的細胞病理是阿爾茨海默氏病的。

在另一方面中，本發(fā)明提供了將轉(zhuǎn)基因傳送至患者脊髓的方法和組合物，通過將含有轉(zhuǎn)基因的重組向神經(jīng)性病毒載體給藥至患者腦的運動神經(jīng)皮層區(qū)。病毒載體的傳送是在脊髓中轉(zhuǎn)基因有利表達的條件下進行。給藥于運動神經(jīng)皮層區(qū)的病毒載體通過運動神經(jīng)元通過它們的細胞體部分納入，且轉(zhuǎn)基因得到表達。然后表達的轉(zhuǎn)基因經(jīng)歷順行運輸至運動神經(jīng)元的軸突末梢部分，其存在于脊髓中。由于運動神經(jīng)皮層區(qū)的性質(zhì)，給藥于該腦部位的病毒載體還可以通過運動神經(jīng)元的軸突末梢納入。病毒載體還可以經(jīng)歷沿著運動神經(jīng)元軸突的逆向運輸并在運動神經(jīng)元的細胞體中得到表達。在說明性的實施方案中，疾病是niemann-picka疾病。在其他實施方案中，呈現(xiàn)出的細胞病理是阿爾茨海默氏病的。

在另一個方面中，本發(fā)明提供了將治療性轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物傳送至受神經(jīng)代謝疾病例如影響cns的lsd折磨的哺乳動物中cns的目標(biāo)細胞的方法，目標(biāo)細胞是神經(jīng)元或神經(jīng)膠質(zhì)細胞。該方法包括將神經(jīng)元的軸突末梢接觸含有aav載體的組合物，該載體攜帶至少部分編碼治療性轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物的基因，使病毒得到內(nèi)吞并沿著軸突胞內(nèi)逆向運輸至神經(jīng)元的核；使治療性轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物通過神經(jīng)元表達并分泌，并使得靶細胞吸收該治療性轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物，其中治療性轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物因此減輕目標(biāo)細胞中的病理。在特定的實施方案中，組合物中載體的濃度至少為：(a)5、6、7、8、8.4、9、9.3、10、15、20、25或50(×10¹²gp/ml)；(b)5、6、7、8、8.4、9、9.3、10、15、20、25或50(×10⁹tu/ml)；或(c)5、6、7、8、8.4、9、9.3、10、15、20、25或50(×10¹⁰iu/ml)。

在本發(fā)明的方法中，治療性轉(zhuǎn)基因編碼生物活性分子，其在cns中的表達導(dǎo)致至少部分神經(jīng)病理的校正。在一些實施方案中，治療性轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物是溶酶體水解酶。在說明性的實施方案中，溶酶體水解酶是asm。在其他實施方案中，治療性轉(zhuǎn)基因是金屬內(nèi)肽酶，例如，腦啡肽酶(neprilysin)。

具體地，本發(fā)明涉及如下各項：

1.一種方法，包括：在使得所述的被注射的aav載體轉(zhuǎn)導(dǎo)位于中樞神經(jīng)系統(tǒng)中遠側(cè)位點的細胞且所述的編碼的生物活性分子得到翻譯的條件下，將含有編碼生物活性分子的aav載體的組合物給藥于哺乳動物疾病損害的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的位點。

2.項1的方法，其中翻譯的生物活性分子然后得到表達。

3.項1的方法，其中哺乳動物患有溶酶體貯積病或異常膽固醇代謝。

4.項3的方法，其中溶酶體貯積病是niemannpicka疾病。

5.項1的方法，其中哺乳動物是人。

6.項1的方法，其中該遠側(cè)位點在給藥位點的對側(cè)。

7.項1的方法，其中該給藥位點在選自脊髓、腦干、海馬體、紋狀體、延髓、腦橋、中腦、小腦、丘腦、下丘腦、大腦皮層、枕葉、顳葉、頂葉或額葉的cns區(qū)域中。

8.項1的方法，其中給藥位點在海馬體中且遠側(cè)位點在選自對側(cè)齒狀回、對側(cè)ca3、內(nèi)側(cè)中隔或內(nèi)嗅區(qū)皮層的腦區(qū)域中。

9.項1的方法，其中給藥位點在選自紋狀體或小腦的腦區(qū)域中，且遠側(cè)位點在選自黑質(zhì)或延髓的腦區(qū)域中。

10.項9的方法，其中給藥位點在小腦的深部小腦核中。

11.項1的方法，其中aav載體具有aav血清型1衣殼。

12.項3或4的方法，其中aav載體具有aav血清型1衣殼。

13.項10的方法，其中aav載體具有aav血清型1衣殼。

14.項1的方法，其中aav載體是aav1或aav2/1。

15.項3或4的方法，其中aav載體是aav1或aav2/1。

16.項10的方法，其中aav載體是avv1或aav2/1。

17.項1的方法，進一步包括將組合物給藥于哺乳動物cns中的第二個位點，其中組合物包括含有編碼生物活性分子產(chǎn)物的多核苷酸的aav載體。

18.項17的方法，其中第二個給藥位點是在第一個給藥位點的對側(cè)。

19.項2的方法，其中生物活性分子是溶酶體水解酶。

20.項19的方法，其中溶酶體水解酶是表1中所列的溶酶體水解酶中的任何一種。

21.項20的方法，其中溶酶體水解酶是酸性神經(jīng)鞘磷脂酶。

22.項1的方法，其中給藥位點在深部小腦核中且遠側(cè)位點是脊髓。

23.項1的方法，其中給藥位點和遠側(cè)位點之間的距離為至少2mm。

24.項1的方法，其中組合物中aav載體的濃度為至少5×10¹²gp/ml。

25.一種方法，包括：在使得所述的被注射的aav載體轉(zhuǎn)導(dǎo)位于中樞神經(jīng)系統(tǒng)中遠側(cè)位點的細胞且所述編碼的金屬內(nèi)肽酶得到表達的條件下，將含有編碼金屬內(nèi)肽酶分子的aav載體的組合物給藥于患有阿爾茨海默氏病哺乳動物的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的位點。

26.項25的方法，其中金屬內(nèi)肽酶選自腦啡肽酶、insulysin或thimet寡肽酶。

27.項1或25的方法，其中aav載體選自aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7或aav8。

28.項25的方法，其中給藥位點和遠側(cè)位點之間的距離為至少2mm。

29.項25的方法，其中組合物中aav載體的濃度為至少5×10¹²gp/ml。

30.項29的方法，其中aav選自aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7或aav8。

31.項29的方法，其中aav是重組aav載體。

32.項29的方法，其中重組aav載體選自aav2/1、aav2/2、aav2/5、aav2/7或aav2/8血清型載體。

可以理解前面的概述和以下的詳述是示例性的，只是說明性的而不是所要求的本發(fā)明的限制。

附圖說明

圖1a描繪了在2μl高滴定度(9.3×10¹²gp/ml)aav-asm注射至海馬體后5或15周，asmko小鼠腦橫截面的圖。通過垂直線顯示注射位點；如通過原位雜交檢測的asmmrna表達是通過較小的圓圈表示；如通過免疫組織化學(xué)染色檢測的asm蛋白表達是通過較大的劃上陰影線的圓圈表示。表達模式導(dǎo)致腦兩個半球中海馬體和皮層部位中大范圍的病理逆轉(zhuǎn)(通過淡陰影表示)。

圖1b描繪了如圖1a中所示的高滴定度aav注射至海馬體后，aav至小鼠腦遠側(cè)部位的軸突運輸。注射至海馬體(10)導(dǎo)致病毒載體通過海馬體內(nèi)的回路軸突運輸至對側(cè)海馬體(20)并通過entorhinodentate回路運輸至內(nèi)嗅區(qū)皮層(30)。通過垂直線顯示注射位點。

圖1c是顯示了小鼠腦的海馬體內(nèi)和entorhinodentate回路連接的示意圖。注射至海馬體(10)導(dǎo)致位于海馬角(cornuammonis)區(qū)域3(ca3)和齒狀回小神經(jīng)膠質(zhì)細胞層(g)中的細胞體的感染和轉(zhuǎn)導(dǎo)。此外，注射的aav載體的亞群感染神經(jīng)支配注射位點的投射神經(jīng)元的軸突，經(jīng)歷逆向軸突運輸，并將轉(zhuǎn)基因傳送至海馬體(20)對側(cè)部位中的ca3區(qū)(ca3)和門(h)，和同側(cè)的內(nèi)嗅區(qū)皮層(30)中。

圖2a描繪了如圖1a中所述的高滴定度aav-asm海馬體內(nèi)注射后5或15周，asmko小鼠腦橫截面的圖。如通過原位雜交檢測的asmmrna表達是通過較小的圓圈表示；如通過免疫組織化學(xué)染色檢測的asm蛋白表達是通過較大的劃上陰影線的圓圈表示。注射導(dǎo)致在隔膜中檢測到asmmrna和蛋白質(zhì)。這種表達模式導(dǎo)致大范圍的病理逆轉(zhuǎn)(通過淡陰影表示)。

圖2b描繪了如圖1a中所示的高滴定度注射至海馬體后，aav至小鼠腦遠側(cè)部位的軸突運輸。注射至海馬體(10)導(dǎo)致病毒載體通過隔海馬(septohippocampal)回路從注射位點(通過垂直線表示)軸突運輸至中隔(40)。

圖2c是顯示隔海馬回路連接的示意圖。注射至海馬體導(dǎo)致轉(zhuǎn)導(dǎo)至位于ca3區(qū)域(11)中的細胞體。此外，aav載體的亞群感染神經(jīng)支配注射位點的投射神經(jīng)元的軸突末梢，經(jīng)歷逆向軸突運輸，并將轉(zhuǎn)基因傳送至內(nèi)側(cè)中隔(40)。

圖3描繪了高滴定度aav注射至小鼠腦的紋狀體(50)后，黑質(zhì)紋狀體回路中的aav軸突運輸。aav的軸突運輸從注射位點(通過垂直線表示)至黑質(zhì)(60)。

圖4描繪了高滴定度aav-asm注射至asmko小鼠腦的小腦(70)后，延髓小腦(medullocerebellar)回路中的aav軸突運輸。aav2的軸突運輸從注射位點(通過垂直線表示)至延髓(80)。

圖5描繪了同側(cè)海馬體(10)中aav7-asm高滴定度注射后，海馬體內(nèi)、黑質(zhì)紋狀體和entorhinodentate回路中的aav的軸突運輸。如通過原位雜交所測定的，檢測同側(cè)海馬體的aav7-asm注射后(通過垂直線表示)，沿著對側(cè)海馬體(90)、內(nèi)側(cè)中隔(40)和內(nèi)嗅區(qū)皮層(100)的整個吻-尾軸的轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞。

圖6a至6e顯示了將編碼人asm的不同aav血清型載體[(a)2/1、(b)2/2、(c)2/5、(d)2/7和(e)2/8]注射至asmko小鼠的深部小腦核后，矢狀小腦截面中的人asm免疫陽性染色。

圖7a至7e證明了hasm從深部小腦核運輸至脊髓。在用aav2/2-asm、aav2/5-asm、aav2/7-asm&aav2/8-asm處理的小鼠中觀察到的效果：(a)hasm10x放大倍數(shù)；(b)hasm40x放大倍數(shù)；(c)共焦hasm；(d)共焦chat和(e)共焦hasm&chat。

圖8顯示了將編碼人asm的不同aav血清型載體(2/1、2/2、2/5、2/7和2/8)注射至深部小腦核(n＝5/組)后的小腦組織勻漿水平。沒有通過相同字母連接的組是顯著(p<.0001)差異的。

圖9a至g顯示了將編碼人asm的不同aav血清型載體[(a)2/1、(b)2/2、(c)2/5、(d)2/7和(e)2/8]注射至asmko小鼠的深部小腦核中后，矢形小腦截面中的鈣結(jié)合蛋白免疫陽性染色。

圖10a和10b顯示了asmko(注射aav-βgal的)、wt和aav-asm處理的asmko小鼠(n＝8/組)的加速和搖擺旋轉(zhuǎn)表現(xiàn)(rotarodperformance)(在14周齡時)。沒有通過相同字母連接的組是顯著差異的。注射aav2/1-asm和aav2/8-asm的小鼠證明了在加速旋轉(zhuǎn)測試中延遲跌倒時間顯著長于注射aav2/1-βgal的asmko小鼠(p<.0009)。對于搖擺旋轉(zhuǎn)測試，注射aav2/1-asm的小鼠證明了延遲跌倒時間顯著長于注射aav2/1-βgal的小鼠(p<.0001)。

圖11a和11b顯示了asmko(n＝8)、wt(n＝8)和兩側(cè)aav-asm(n＝5/組)處理的小鼠(20周齡時)的旋轉(zhuǎn)表現(xiàn)。對于加速和搖擺測試，aav-asm處理的小鼠表現(xiàn)顯著(p<.001)好于asmkoaav2/1-βgal處理的小鼠。在加速和搖擺測試中，注射aav2/1-asm的小鼠的表現(xiàn)與野生型小鼠的是不可區(qū)分的。

圖12顯示了兩側(cè)注射aav1-βgal或編碼hasm的aav血清型1和2的asmko小鼠(20周齡時)的腦神經(jīng)鞘磷脂水平。將腦分成5個頭尾(rostrocaudal)區(qū)(s1＝最頭端和s5＝最尾端)。星號表示數(shù)據(jù)點是與asmko小鼠顯著不同的(p<0.01)。

圖13a說明了深部小腦核區(qū)(內(nèi)側(cè)、中間(interposed)、外側(cè))和脊髓部分(頸部、胸部、腰部和骶骨部)之間的連接。圖13b說明了深部小腦核區(qū)(內(nèi)側(cè)、中間(interposed)、外側(cè))和腦干區(qū)(中腦、腦橋、延髓)之間的連接。通過箭頭表示連接，其開始于神經(jīng)元的細胞體部分和結(jié)束于神經(jīng)元的軸突末梢部分。例如，dcn的三個區(qū)各自具有神經(jīng)元，該神經(jīng)元帶有發(fā)送終止于脊髓頸部的軸突的細胞體而脊髓的頸部具有發(fā)送終止于dcn內(nèi)側(cè)或中間區(qū)的軸突的細胞體。

圖14說明了編碼綠色熒光蛋白(gfp)的aav的dcn傳送后，腦干或上位運動神經(jīng)元中的綠色熒光蛋白分布。

圖15說明了編碼綠色熒光蛋白(gfp)的aav的dcn傳送后，脊髓部位中的綠色熒光蛋白分布。

圖16顯示了表達gfp的aav1載體兩側(cè)傳送至深部小腦核(dcn)后，小鼠腦內(nèi)的gfp分布。除了dcn，還在嗅球、大腦皮層、丘腦、腦干、小腦皮層和脊髓中觀察到gfp陽性染色。所有這些區(qū)域接受來自dcn的投射和/或發(fā)送投射至dcn。

具體實施方式

為了更容易地理解本發(fā)明，首先定義特定的術(shù)語。在整個詳述中列出其他定義。

術(shù)語“轉(zhuǎn)基因”指的是引入細胞中并能夠在合適條件下得到翻譯和/或表達并給予將其引入的細胞所需的特性或另外導(dǎo)致所需治療結(jié)果的多核苷酸。

術(shù)語“基因組顆粒(gp)”或“基因組等價物”，當(dāng)關(guān)于病毒滴定度所用時，指的是含有重組aavdna基因組的病毒粒子的數(shù)量，與感染力或功能性無關(guān)?？梢酝ㄟ^如在此實施例中所述的或例如在clark等(1999)hum.gene.ther.，10:1031-1039；veldwijk等(2002)mol.ther.6:272-278中所述的方法來測量特定載體制劑中的基因組顆粒的數(shù)量。

術(shù)語“感染單位(iu)”、“感染性顆?！被颉皬?fù)制單位”，當(dāng)關(guān)于病毒滴定度所用時，指的是感染性的并能夠復(fù)制的重組aav載體顆粒的數(shù)量，如通過感染性中心測試(infectiouscenterassay)所測量的，也稱為復(fù)制性中心測試(replicationcenterassay)，如描述于mclaughlin等(1988)j.virol.，62:1963-1973。

術(shù)語“轉(zhuǎn)導(dǎo)單位(tu)”，當(dāng)關(guān)于病毒滴定度所用時，指的是導(dǎo)致功能性轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物產(chǎn)生的感染性重組aav載體顆粒的數(shù)量，如在功能性測試中所測量的，如在此的實施例中所述的，或例如，在xiao等，(1997)exp.neurobiol.，144:113-124；或在fisher等(1996)j.virol.，70:520-532(lfu測試)中所述的。

術(shù)語“治療的”、“治療有效量”及其同源詞指的是導(dǎo)致患者癥狀的防止或發(fā)作延遲或緩解或獲得所需生物結(jié)果的化合物含量，所需的生物結(jié)果如神經(jīng)病理的校正，例如，與溶酶體貯積病相關(guān)的細胞病理，如在此所述的或walkley(1998)brainpathol.，8:175-193中所述的。術(shù)語“治療校正”指的是導(dǎo)致患者癥狀的防止或發(fā)作延遲或緩解的校正程度?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域公知的和隨后部分中描述的方法來測定有效量。

方法和組合物

asmko小鼠是公認(rèn)的a型和b型niemann-pick疾病的模型(horinouchi等(1995)nat.genetics，10:288-293；jin等(2002)j.clin.invest.，109:1183-1191和otterbach(1995)cell，81:1053-1061)。niemann-pick疾病(npd)歸類為溶酶體貯積病并且是遺傳的神經(jīng)代謝疾病，其特征在于酸性神經(jīng)鞘磷脂酶(asm；神經(jīng)鞘磷脂膽堿磷酸水解酶，ec3.1.3.12)的遺傳缺陷。功能性asm蛋白質(zhì)的缺乏導(dǎo)致整個腦內(nèi)神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞的溶酶體內(nèi)神經(jīng)鞘磷脂底物的累積。這導(dǎo)致核周體中大量擴張的溶酶體的形成，這是a型npd的標(biāo)志性特征和主要的細胞表型。擴張的溶酶體的存在與正常細胞功能的喪失和導(dǎo)致受影響個體幼年死亡的漸進性神經(jīng)惡化過程相關(guān)(themetabolicandmolecularbasesofinheriteddiseases(遺傳疾病的代謝和分子基礎(chǔ))，編輯scriver等，mcgraw-hill，newyork，2001，pp.3589-3610)。繼發(fā)性細胞表型(例如，另外的代謝異常)也與這種疾病相關(guān)，特別是溶酶體細胞器中膽固醇的高水平累積。神經(jīng)鞘磷脂對膽固醇具有強烈的親和性，其導(dǎo)致asmko小鼠和人患者的溶酶體中大量膽固醇的螯合(sequestering)(leventhal等(2001)j.biol.chem.，276:44976-44983；slotte(1997)subcell.biochem.，28:277-293和viana等(1990)j.med.genet.，27:499-504)。

本發(fā)明是部分基于以下的發(fā)現(xiàn)和證明：海馬體內(nèi)注射高滴定度aav-asm至asmko小鼠的患病腦中導(dǎo)致asmmrna和蛋白質(zhì)以與神經(jīng)支配注射位點的投射神經(jīng)元的形態(tài)構(gòu)造相一致的模式在遠離注射位點表達。除了在注射位點的強烈表達，在同側(cè)(注射的)海馬體外的幾個遠側(cè)部位中，特別地，在對側(cè)海馬體齒狀回和ca3，和內(nèi)側(cè)中隔和內(nèi)嗅區(qū)皮層中也檢測到asmmrna和蛋白質(zhì)。本發(fā)明進一步部分基于以下的發(fā)現(xiàn)和證明：遠側(cè)部位的溶酶體貯積病理的大范圍校正，因此通過較少數(shù)量的注射位點獲得較大體積的校正。

因此，在一方面中，本發(fā)明提供了治療哺乳動物神經(jīng)代謝疾病的方法。通過本發(fā)明的方法治療的群體包括但不限于，患有神經(jīng)代謝疾病或處于產(chǎn)生神經(jīng)代謝疾病風(fēng)險中的患者，例如，lsd，如表1中所列的疾病，特別地是如果這樣的疾病影響cns的疾病。在說明性的實施方案中，疾病是a型niemann-pick疾病。在特定的實施方案中，神經(jīng)代謝疾病可以排除阿爾茨海默氏病、帕金森病、亨廷頓病、taysachs病、leschnyan病和克雅(氏)病(creutzfeldt-jakob)病。然而，本發(fā)明使用金屬內(nèi)肽酶作為治療轉(zhuǎn)基因的方法，特別用于治療阿爾茨海默氏病和淀粉狀蛋白-相關(guān)疾病。

在一些實施方案中，治療神經(jīng)代謝疾病的方法包括給藥高滴定度的攜帶治療性轉(zhuǎn)基因的aav載體，使得轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物在cns內(nèi)遠離第一個位點的第二個位點以治療水平表達。在一些實施方案中，組合物的病毒滴定度是至少：(a)5、6、7、8、8.4、9、9.3、10、15、20、25或50(×10¹²gp/ml)；(b)5、6、7、8、8.4、9、9.3、10、15、20、25或50(×10⁹tu/ml)；或(c)5、6、7、8、8.4、9、9.3、10、15、20、25或50(×10¹⁰iu/ml)。在更多的實施方案中，通過直接實質(zhì)內(nèi)(intraparenchymal)注射高滴定度aav載體溶液至患病的腦來實現(xiàn)給藥，此后轉(zhuǎn)基因以治療水平在離給藥位點至少2、3、5、8、10、15、20、25、30、35、40、45或50mm的給藥位點遠側(cè)、對側(cè)或同側(cè)表達。

第一和第二個位點之間的距離定義為給藥位點(第一個位點)和遠側(cè)位點(第二個位點)可檢測轉(zhuǎn)導(dǎo)邊緣之間的最小距離區(qū)域，如使用本領(lǐng)域已知的或?qū)嵤├兴龅姆椒ㄋ鶞y量的，例如，原位雜交。較大哺乳動物cns中的一些神經(jīng)元可以通過它們的軸突投射跨越大的距離。例如，在人類中，一些軸突可以跨越1000mm或更長的距離。因此，在本發(fā)明的各種方法中，aav可以沿著整個軸突長度在這樣的距離上軸突運輸來達到并轉(zhuǎn)導(dǎo)母體細胞體。

基于所需的神經(jīng)病理目標(biāo)部位和所涉及的腦回路的形態(tài)來選擇cns內(nèi)的載體給藥位點，只要給藥位點和目標(biāo)區(qū)域具有軸突連接即可。例如，可以使用3-d立體定位坐標(biāo)來限定目標(biāo)區(qū)域。在一些實施方案中，選擇給藥位點使得注射載體總量的至少0.1、0.5、1、5或10％在至少1、200、500或1000mm³的目標(biāo)區(qū)域得到遠側(cè)傳送。給藥位點可以位于連接腦遠側(cè)區(qū)域的投射神經(jīng)元支配的區(qū)域內(nèi)。例如，黑質(zhì)和bventraltegmental區(qū)發(fā)送密集的投射至尾和殼核(總稱為紋狀體)?？梢园邢蚝谫|(zhì)和腹側(cè)背蓋區(qū)內(nèi)的神經(jīng)元用于通過注射至紋狀體后的aav的逆向運輸?shù)霓D(zhuǎn)導(dǎo)。作為另一個實施例，海馬體收到來自腦其他區(qū)域的邊界明確(well-defined)的、可預(yù)測的軸突投射。其他給藥位點可以位于，例如，脊髓、腦干(延髓和腦橋)、中腦、小腦(包括深部小腦核)、間腦(丘腦、下丘腦)、端腦(紋狀體、腦皮層，或，皮層內(nèi)，枕葉、顳葉、頂葉或額葉)或其組合。

對于人腦中結(jié)構(gòu)的鑒定，參見，例如，thehumanbrain:surface，three-dimensionalsectionalanatomywithmri，andbloodsupply(人腦：使用mri的表面三維斷層解剖，和供血)，第2版，編輯deuteron等，springervela，1999；atlasofthehumanbrain(人腦圖集)，編輯mai等，academicpress；1997和co-planarsterotaxicatlasofthehumanbrain:3-dimensiaonalproportionalsystem:anapproachtocerebralimaging(人腦的共面立體定向圖集：3-維比例系統(tǒng)：腦成像的方法)，編輯tamarack等，thymemedicalpub.，1988。對于小鼠腦中結(jié)構(gòu)的鑒定，參見，例如，themousebraininsterotaxiccoordinate(立體定位坐標(biāo)中的小鼠腦)，第2版，academicpress，2000。如果需要，可以將人腦結(jié)構(gòu)與另一種哺乳動物腦中的相似結(jié)構(gòu)相關(guān)連。例如，大部分哺乳動物，包括人和嚙齒動物，顯示出相似的內(nèi)嗅區(qū)-海馬體投射的形態(tài)構(gòu)造，側(cè)向和內(nèi)側(cè)內(nèi)嗅區(qū)皮層的側(cè)部中的神經(jīng)元投射至海馬體的背部或中隔極(septalpole)，而至腹側(cè)海馬體的投射主要源自內(nèi)嗅區(qū)皮層內(nèi)側(cè)區(qū)的神經(jīng)元(principlesofneuralscience(神經(jīng)科學(xué)原理)，第4版，編輯kandel等，mcgraw-hill，1991；theratnervoussystem(大鼠神經(jīng)系統(tǒng))，第2版，編輯paxinos，academicpress，1995)。此外，內(nèi)嗅區(qū)皮層的ii層細胞投射至齒狀回，且它們終止于齒狀回分子層的外側(cè)三分之二。來自iii層細胞的軸突雙側(cè)投射至海馬體的安蒙氏角區(qū)ca1和ca3，終止于層多孔分子層。

第二個(目標(biāo))位點可以位于含有投射至第一個(注射)位點的神經(jīng)元的cns任何區(qū)域中，包括腦和脊髓。在一些實施方案中，第二個位點是在選自黑質(zhì)體、延髓或脊髓的cns區(qū)域中。

為了將載體特異性地傳送至中樞神經(jīng)系統(tǒng)的特定區(qū)域，尤其是傳送至腦的特定區(qū)域，可以通過立體定向微注射來給藥。例如，在外科手術(shù)的那一天，患者將具有在適當(dāng)位置固定(旋入顱骨中)的立體定向框架基。使用高分辨率mri將帶有立體定向框架基的腦(具有fiduciary標(biāo)記的與mri相容的)成像。然后mri圖像將轉(zhuǎn)移至運行立體定向軟件的計算機。將一組冠狀、矢形和軸向圖像用于測定載體注射的目標(biāo)部位和軌跡。軟件直接將軌跡翻譯成適用于立體定向框架的3-維坐標(biāo)。在進入部位上鉆burrhole并用定位于立體定向裝置的針植入給定深度。然后注射藥物學(xué)上可接受介質(zhì)中的載體。然后通過直接注射至主要的目標(biāo)部位來給藥aav載體并通過軸突逆向運輸至遠側(cè)目標(biāo)位點?？梢允褂闷渌慕o藥途徑，例如，直接觀察下的表面皮層應(yīng)用，或其他非立體定向應(yīng)用。

通過本領(lǐng)域技術(shù)人員基于基因治療的已知方面來測定待給藥物質(zhì)的總體積，和待給藥的載體顆粒的總量。可以在合適的動物模型中測試治療有效性和安全性。例如，對于lsds存在多種公認(rèn)的動物模型，例如，如在此所述的或在watson等(2001)methodsmol.med.，76:383-403或jeyakumar等(2002)neuropath.appl.neurobiol.，28:343-357中所述的。

在實驗小鼠中，注射的aav溶液的總體積是例如，1至5μl。對于其他哺乳動物，包括人腦，適當(dāng)衡量體積和傳送速率。例如，已經(jīng)證明了在靈長類腦中可以安全地注射150μl的體積(janson等(2002)hum.gene.ther.，13:1391-1412)。治療包括每個注射位點的單次注射，或者如果需要，可以沿著注射道(tract)重復(fù)?？梢允褂枚鄠€注射位點。例如，在一些實施方案中，除了第一個給藥位點，將含有攜帶轉(zhuǎn)基因的aav的組合物給藥至另一個位點，其可以在第一個給藥位點的對側(cè)或同側(cè)。

在另一個方面中，本發(fā)明提供了體內(nèi)傳送重組aav基因組的方法，通過逆向軸突運輸至受疾病損害的神經(jīng)元的核。在一些實施方案中，神經(jīng)元呈現(xiàn)的細胞病理是lsd的細胞病理，如表1中所列的(參見，例如，walkley(1998)brainpathol.，8:175-193)。在說明性的實施方案中，疾病是niemann-picka疾病。傳送重組aav基因組至受疾病損害的神經(jīng)元的核的方法包括將疾病損害的神經(jīng)元的軸突末梢接觸含有aav病毒顆粒的組合物，該病毒顆粒含有重組aav基因組，并使病毒顆粒被內(nèi)吞且沿著軸突逆向胞內(nèi)運輸至神經(jīng)元的核，其中組合物中aav基因組的濃度為至少：(a)5、6、7、8、8.4、9、9.3、10、15、20、25或50(×10¹²gp/ml)；(b)5、6、7、8、8.4、9、9.3、10、15、20、25或50(×10⁹tu/ml)；或(c)5、6、7、8、8.4、9、9.3、10、15、20、25或50(×10¹⁰iu/ml)。在特定的實施方案中，神經(jīng)元是投射神經(jīng)元和/或軸突末梢至神經(jīng)元核的距離至少為2、3、5、8、10、15、20、25、30、35、40、45或50mm。在各種實施方案中，aav基因組沿著軸突的整個長度運輸，距離根據(jù)軸突長度而改變。在人類中，這些距離可以為1000mm或更長。

在另一個方面中，本發(fā)明提供了將轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物傳送至患有疾病例如表1中所列l(wèi)sd的哺乳動物的cns的目標(biāo)細胞的方法，目標(biāo)細胞是神經(jīng)元或神經(jīng)膠質(zhì)細胞。該方法包括將神經(jīng)元的軸突末梢接觸含有aav載體的組合物，該載體攜帶至少部分編碼治療性轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物的基因；使病毒顆粒被內(nèi)吞并沿著軸突逆向胞內(nèi)運輸至神經(jīng)元的核；使轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物通過神經(jīng)元表達和分泌；并使第二個細胞吸收轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物，其中轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物因此緩解第二個細胞中的病理。在一些實施方案中，組合物中aav載體的濃度為至少：(a)5、6、7、8、8.4、9、9.3、10、15、20、25或50(×10¹²gp/ml)；(b)5、6、7、8、8.4、9、9.3、10、15、20、25或50(×10⁹tu/ml)；或(c)5、6、7、8、8.4、9、9.3、10、15、20、25或50(×10¹⁰iu/ml)。例如，可以通過轉(zhuǎn)導(dǎo)的細胞分泌溶酶體水解酶并隨后通過甘露糖-6-磷酸受體介導(dǎo)的內(nèi)吞由另一個細胞吸收，第二個細胞是轉(zhuǎn)導(dǎo)的或非轉(zhuǎn)導(dǎo)的(sando等(1977)cell，12:619-627；taylor等(1997)nat.med.，3:771-774；miranda等(2000)genether.，7:1768-1776和jin等(2002)j.clin.invest.，109:1183-1191)。

在本發(fā)明的方法中，可以使用任何血清型的aav，只要載體能夠在疾病損害的腦中逆向軸突運輸。本發(fā)明特定實施方案中使用的病毒載體的血清型選自aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7和aav8(參見，例如，gao等(2002)pnas，99:11854-11859和viralvectorsforgenetherapy：methodsandprotocols(用于基因治療的病毒載體：方法和實驗方案)，編輯machida，humanapress，2003)。除了在此所列的那些，可以使用其他血清型。此外，假模標(biāo)本aav載體也可以用于在此公開的方法中。假模標(biāo)本aav載體是在第二個aav血清型的衣殼中含有一個aav血清型基因組的那些；例如，含有aav2衣殼和aav1基因組的aav載體或含有aav5衣殼和aav2基因組的aav載體。(auricchio等(2001)hum.mol.genet.，10(26):3075-81)。然而，aav5可以特異性地排除在本發(fā)明使用金屬內(nèi)肽酶例如腦啡肽酶作為治療性轉(zhuǎn)基因的方法之外。

aav載體源自對哺乳動物非致病的單鏈(ss)dna細小病毒(muzyscka(1992)curr.top.microb.immunol.，158:97-129中綜述)。簡而言之，基于aav的載體具有rep和cap病毒基因，占所除去的病毒基因組的96％，留下兩側(cè)145-堿基對(bp)的末端倒置重復(fù)序列(itrs)，其用來啟動病毒dna復(fù)制、包裝和整合。在輔助病毒不存在下，野生型aav整合至人宿主細胞基因組中，優(yōu)選在染色體19q13.3具有位點特異性，或其可以保持為表達的游離基因。單個aav顆?？梢匀菁{高達5kb的ssdna，因此留下約4.5kb用于轉(zhuǎn)基因和調(diào)控元件，這通常足夠了。然而，例如在美國專利no.6,544,785中所述的反式剪接系統(tǒng)幾乎使該極限加倍。

在說明性的實施方案中，aav是aav2或aav1。許多血清型的腺相關(guān)病毒，尤其是aav2，已經(jīng)得到廣泛研究并表征為基因治療載體。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉基于功能性aav的基因治療載體的制備。很多關(guān)于用于給藥于人患者的aav生產(chǎn)、純化和制備的各種方法可以在大量出版文獻的主要部分中找到(參見，例如，viralvectorsforgenetherapy：methodsandprotocols(用于基因治療的病毒載體：方法和實驗方案)，編輯machida，humanapress，2003)。此外，美國專利no.6,180,613和6,503,888中已經(jīng)描述了靶向cns細胞的基于aav的基因治療。

在本發(fā)明的特定方法中，載體包括可操作連接啟動子的轉(zhuǎn)基因。轉(zhuǎn)基因編碼生物活性分子，其在cns中的表達導(dǎo)致神經(jīng)病理的至少部分校正。在一些實施方案中，轉(zhuǎn)基因編碼溶酶體水解酶。在說明性的實施方案中，溶酶體水解酶是asm。人asm的基因組和功能性cdna序列已經(jīng)公開(參見，例如，美國專利no.5,773,278和6,541,218)。其他溶酶體水解酶可以用于合適的疾病，例如，如表1中所列的。

本發(fā)明進一步提供了治療哺乳動物包括人的阿爾茨海默氏病的方法。在這樣的方法中，轉(zhuǎn)基因編碼金屬內(nèi)肽酶。例如，金屬內(nèi)肽酶可以是淀粉狀蛋白-β降解酶腦啡肽酶(ec3.4.24.11；序列登錄號，例如，p08473(swiss-prot))，胰島素降解酶insulysin(ec3.4.24.56；序列登錄號，例如，p14735(swiss-prot))，或thimet寡肽酶(ec3.4.24.15；序列登錄號，例如，p52888(swiss-prot))。

很大程度上通過轉(zhuǎn)基因表達盒內(nèi)的轉(zhuǎn)錄啟動子來決定真核細胞中轉(zhuǎn)基因表達的水平。一些實施方案中使用顯示出長期活性并是組織甚至細胞特異性的啟動子。啟動子的非限制實例包括但不限于，巨細胞病毒(cmv)啟動子(kaplitt等(1994)nat.genet.，8:148-154)、cmv/人β3-珠蛋白啟動子(mandel等(1998)j.neurosci.，18:4271-4284)、gfap啟動子(xu等，(2001)genether.，8:1323-1332)、1.8-kb神經(jīng)元特異性烯醇酶(nse)啟動子(klein等(1998)exp.neurol.，150:183-194)、雞β-肌動蛋白(cba)啟動子(miyazaki(1989)gene，79:269-277)和β-葡糖苷酸酶(gusb)啟動子(shipley等(1991)genetics，10:1009-1018)。為了延長表達，可以將其他調(diào)控元件另外可操作地連接轉(zhuǎn)基因，例如，土撥鼠肝炎病毒后-調(diào)控元件(wpre)(donello等(1998)j.virol.，72，5085-5092)或牛生長激素(bgh)多腺苷酸化位點。

對于一些cns基因治療應(yīng)用，需要控制轉(zhuǎn)錄活性。為此，通過包括各種調(diào)控元件和藥物應(yīng)答性啟動子來獲得用aav載體的基因表達的藥物學(xué)調(diào)控，例如描述于habermaet等(1998)genether.，5:1604-16011和ye等(1995)science，283:88-91。

可以使用本領(lǐng)域已知的技術(shù)來生產(chǎn)高滴定度aav制劑，如美國專利no.5,658,776和viralvectorsforgenetherapy:methodsandprotocols(用于基因治療的病毒載體：方法和實驗方案)，編輯machida，humanapress，2003中所述的。

以下的實施例提供了本發(fā)明的說明性實施方案。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識到可以進行各種改進和改變而沒有改變本發(fā)明的精神或范圍。這樣的改進和改變包括于本發(fā)明的范圍內(nèi)。實施例不以任何方式來限制本發(fā)明。

實施例

重組載體的滴定

根據(jù)基因組拷貝數(shù)量(每微升的基因組顆粒)來測量aav載體滴定度?；蚪M顆粒濃度是基于載體dna的pcr，如之前報道的(clark等(1999)hum.genether.，10:1031-1039；veldwijk等(2002)mol.ther.，6:272-278)。簡而言之，用衣殼消化緩沖液(50mmtris-hclph8.0、1.0mmedta、0.5％sds、1.0mg/ml蛋白酶k)在50℃處理純化的aav-asm1小時來釋放載體dna。將dna樣品完成聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(pcr)，使用與載體dna中的特異性序列如啟動子片段、轉(zhuǎn)基因或多a序列退火的引物。然后通過實時軟件定量pcr結(jié)果，如perkinelmer-appliedbiosystems(fostercity，ca)prism7700序列檢測系統(tǒng)提供的。

可以使用感染力測試來滴定攜帶可檢測標(biāo)記基因如β-半乳糖苷酶或綠色熒光蛋白基因(gfp)的載體。用aav轉(zhuǎn)導(dǎo)易感細胞(例如，hela，或cos細胞)，并進行測試來測定基因表達，如用x-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-d-吡喃半乳糖苷)的β-半乳糖苷酶載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的細胞的染色或用于gfp轉(zhuǎn)導(dǎo)的細胞的熒光顯微鏡檢測。例如，如下進行測試：將4×10⁴hela細胞涂布于24-孔培養(yǎng)平板的每個孔中,使用通常的生長培養(yǎng)基。附著后，即大約24小時后，用多重性感染(moi)10的5型ad感染細胞并用連續(xù)稀釋的包裝載體轉(zhuǎn)導(dǎo)并在37℃孵育。一至三天后，在觀察大范圍細胞病理效應(yīng)之前，對細胞進行適當(dāng)?shù)臏y試(例如，x-gal染色或熒光顯微鏡觀察)。如果使用報告基因如β-半乳糖苷酶，將細胞固定于2％多聚甲醛、0.5％戊二醛中并使用x-gal對β-半乳糖苷酶活性染色。計數(shù)獲得很好分離的細胞的載體稀釋度。每個陽性細胞表示載體的1個轉(zhuǎn)導(dǎo)單位(tu)。

小鼠腦中l(wèi)sd病理的校正

十周齡的asmko小鼠在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中含有顯著的npd病理。通過pcr證實純合子隱性突變的鑒定。用異氟烷將十六只10周齡的asmko小鼠麻醉并安放在立體定向框架上，形成切口來暴露底下的顱骨，在每只小鼠的一個半球上形成單個鉆孔。將兩微升高滴定度(9.3×10¹²gp/ml)aav2-cmv-asm(targetedgenetics，seattle，wa)注射至海馬體中，最終立體定位坐標(biāo)為前鹵點吻端2.0mm、中線右側(cè)1.5mm和軟膜表面腹側(cè)2.0mm。該海馬體坐標(biāo)確保了aav2載體暴露于齒狀回和安蒙氏角區(qū)3(ca3)的神經(jīng)元，以及暴露于對側(cè)海馬體、內(nèi)側(cè)中隔和內(nèi)嗅區(qū)皮層的投射神經(jīng)元的軸突末梢。以0.2μl/分鐘的速率進行注射，總的1.86×10¹⁰基因組顆粒給藥至每個腦中。

使用本領(lǐng)域已知的和sleat等(2004)j.neurosci.24:9117-9126中再現(xiàn)的方法，通過smartrod(accuscan)上的加速和搖擺旋轉(zhuǎn)來測試小鼠的運動功能。圖10a/b和圖11a/b用圖表顯示了作為運動功能恢復(fù)的測量的旋轉(zhuǎn)測試的結(jié)果。

然后在注射(pi)后5(n＝8)或15(n＝8)周時將小鼠處死。分析八個腦(在pi后5和15周，各自n＝4)的asmmrna和蛋白質(zhì)分布，以及溶酶體中膽固醇的超生理(supraphysiologic)水平的降低。處理剩余的8個腦(在pi后5和15周，各自n＝4)用于組織病理學(xué)來分析累積的和擴張的溶酶體的校正，這是測定lsds的貯積病理逆轉(zhuǎn)的最直接和最精確的方法。

在pi后5和15周，注射(同側(cè))的海馬體中檢測到強烈的轉(zhuǎn)導(dǎo)。通過aav2載體大范圍地轉(zhuǎn)導(dǎo)了齒狀回的小神經(jīng)膠質(zhì)細胞層和門臍以及ca3的錐體細胞和oriens細胞層。這種給人深刻印象的轉(zhuǎn)導(dǎo)模式延伸至同側(cè)海馬體的其他部位，如海馬下托區(qū)(subiculum)和安蒙氏角區(qū)1(ca1)和2(ca2)。使用抗人asm單克隆抗體的免疫熒光證實了許多細胞中asm蛋白的存在。整體的蛋白模式與mrna模式相似，并具有一些其他定位分布的蛋白質(zhì)。

還在兩個時間點的同側(cè)海馬體外側(cè)區(qū)域檢測到人asmmrna和蛋白質(zhì)。對側(cè)齒狀回和ca3，和內(nèi)側(cè)中隔和內(nèi)嗅區(qū)皮層對于原位雜交和免疫熒光是陽性的(圖1a和2a)。在這些遠側(cè)位點的轉(zhuǎn)導(dǎo)模式與神經(jīng)支配注射位點的投射神經(jīng)元的形態(tài)構(gòu)造相一致(圖1b和2b)。這證明了aav2經(jīng)歷了asmko腦的內(nèi)海馬體、隔海馬和entorhinodentate回路中的逆向軸突運輸，以及運輸至軸突上后病毒載體靶向核(圖1c和2c)。轉(zhuǎn)導(dǎo)模式不支持實質(zhì)擴散，因為aav2運輸至這些遠側(cè)位點的原因。如果這樣的擴散已經(jīng)發(fā)生，注射和遠側(cè)位點之間的結(jié)構(gòu)將已經(jīng)暴露于遷移中的病毒。但是這些中間結(jié)構(gòu)對于原位雜交是陰性的。例如紋狀體，其對于aav2具有強烈的向性，盡管在海馬體和內(nèi)側(cè)中隔之間的直接通路中，而對于基因轉(zhuǎn)移是陰性的。因此，基因轉(zhuǎn)移至遠側(cè)位點必須通過逆向軸突運輸引起，這表明受影響的投射神經(jīng)元可以作為有效的高速運輸系統(tǒng)，用于通過患病腦的aav2移動。

另外研究了asm逆轉(zhuǎn)asmko腦中膽固醇異常的能力。菲律賓菌素是從菲律賓鏈霉菌(streptomycesfilipinensis)中分離的結(jié)合膽固醇復(fù)合物的自體熒光分子(leventhal等(2001)j.biol.chem.，276：44976-44983和sarna等(2001)eur.j.neurosci.，13：1-9)。由于這些大量的膽固醇復(fù)合物，未注射的asmko腦具有高水平的菲律賓菌素染色，而正常的小鼠腦沒有產(chǎn)生菲律賓菌素染色。

aav2-cmv-asm的注射導(dǎo)致pi后5和15周的asmko小鼠在整個同側(cè)和對側(cè)海馬體、中隔和內(nèi)嗅區(qū)皮層中完全失去菲律賓染色(圖1a和2a)。這與未注射的年齡相適的asmko對照完全相反，在對照中這些相同結(jié)構(gòu)中檢測到高水平的菲律賓菌素染色。aav2-注射的腦中菲律賓菌素染色的失去證明校正了asm疾病的繼發(fā)性細胞表型(例如，代謝缺陷)。這強烈表明了asm蛋白質(zhì)靶向溶酶體并與神經(jīng)鞘磷脂-膽固醇復(fù)合物相互作用。這種相互作用很可能導(dǎo)致膽固醇從神經(jīng)鞘磷脂釋放出來，隨后膽固醇進入其正常的生物途徑(如降解或轉(zhuǎn)運至質(zhì)膜(leventhal等(2001)j.biol.chem.，276:44976-44983))。

在內(nèi)海馬體、隔海馬和entorhinodentate回路的所有細胞層和亞區(qū)中觀察到菲律賓菌素染色的失去。膽固醇校正的區(qū)域比asm蛋白質(zhì)模式大得多且范圍更大。這表明aav2的逆向軸突運輸后，投射神經(jīng)元可以作為“酶泵”并將asm蛋白質(zhì)分泌至周圍組織中。重要地，只需要少量asm即可對asmko-影響的細胞內(nèi)的膽固醇累積具有治療效果，含量低于免疫熒光方法的檢測極限。

還評價了aav2-asm載體的軸突運輸是否導(dǎo)致了npd原發(fā)細胞表型的校正。一微米厚的組織病理學(xué)腦切片證明了pi后5周時aav2-cmv-asm注射的腦中累積的和擴張的溶酶體病理的顯著降低(表2)。導(dǎo)致部分或全部正常細胞構(gòu)造恢復(fù)的病理逆轉(zhuǎn)發(fā)生在同側(cè)和對側(cè)海馬體半球的所有區(qū)域中。內(nèi)側(cè)中隔和內(nèi)嗅區(qū)皮層也顯示出貯積損傷的實質(zhì)性減輕。與菲律賓菌素數(shù)據(jù)相似，校正的細胞數(shù)量比asm蛋白模式的大且更廣泛。病理的逆轉(zhuǎn)在已知投射至海馬體的區(qū)域內(nèi)是明顯的，包括內(nèi)海馬體、隔海馬和entorhinodentate回路?？傊?，校正的體積在對側(cè)海馬體中為30-35mm³或更多，在同側(cè)內(nèi)嗅區(qū)皮層中為5-8mm³或更多，對側(cè)內(nèi)嗅區(qū)皮層中為1-2mm³或更多，內(nèi)側(cè)中隔中為2-3mm³或更多。這進一步支持病毒載體的軸突運輸引起了這種治療效果，因為如果只是通過擴散介導(dǎo)病毒分布，附近的結(jié)構(gòu)(沒有參與這些回路)已經(jīng)應(yīng)該得到校正(參見，表2中的“同側(cè)紋狀體”和“對側(cè)紋狀體”)。

為了證明病理的逆轉(zhuǎn)是asm特異性的，將另一組asmko小鼠注射攜帶報告基因aav2-cmv-β-gal的對照載體(在pi后的5和15周各自n＝2)，并處理用于組織病理學(xué)。在所有四個腦中，細胞保持被擴張的溶酶體淹沒，并含有其他異常，如細胞質(zhì)腫脹和紊亂的細胞層。

表2

++++實際上所有細胞中高水平的病理

+++許多細胞中的病理，一些細胞中觀察到校正

++一些細胞中的病理，許多細胞中觀察到校正

+大部分細胞中很少或沒有病理，實際上每個細胞得到校正

因此，根據(jù)本發(fā)明，單次注射高滴定度aav2載體足以將asm基因轉(zhuǎn)移至支配asmko影響的海馬體的結(jié)構(gòu)。對aav2載體陽性的結(jié)構(gòu)的數(shù)量大于正常大鼠海馬體中最近研究證明的，其顯示了軸突運輸只在entorhinodentate回路中(kaspar等(2002)mol.ther.，5:50-56)。在此描述的結(jié)果證明了軸突運輸可以發(fā)生在受貯積病理侵害的投射神經(jīng)元中，并且這種運輸模式導(dǎo)致鄰近結(jié)構(gòu)和注射位點遠側(cè)的多個區(qū)域中貯積病理的清除。我們還證明了軸突運輸不限于只有那些與海馬體相連的回路。逆向軸突運輸發(fā)生在黑質(zhì)紋狀體(圖3)和延髓小腦(圖4)回路中。這證明了疾病損害的神經(jīng)元中aav2的軸突運輸是病毒載體的一般特性。

用1-4×10¹³gp/ml濃度的aav1-asm和8.4×10¹²gp/ml濃度的aav7-asm進行了相似的研究。盡管aav1沒有呈現(xiàn)出可檢測的逆向軸突運輸，aav7經(jīng)歷了逆向軸突運輸，與aav2相似，并在遠側(cè)區(qū)域中產(chǎn)生lsd病理的校正(參見圖5)。

注射aav至小腦

用異氟烷麻醉asmko小鼠并安置于立體定向框架上。定位前囟點作為參照點來測定注射至小腦的深部小腦核區(qū)域的鉆孔位置。一旦定位，形成切口來暴露底下的顱骨，并在顱骨中形成單個鉆孔而沒有刺穿腦表面。將漢密爾頓注射器通過孔放在腦中并將aav2-cmv-asm以0.5微升每秒的速率注射至深部小腦核中。對于1×10¹⁰基因組顆粒的總劑量注射三微升。在注射后7周將小鼠處死。評價腦和脊髓的asmmrna表達、asm蛋白表達、菲律賓菌素染色和鈣結(jié)合蛋白染色。

菲律賓菌素是結(jié)合膽固醇復(fù)合物的自體熒光分子。由于大量膽固醇復(fù)合物，其作為疾病的結(jié)果而累積，未治療的asmko小鼠具有高水平的菲律賓菌素染色。相反，正常小鼠腦沒有呈現(xiàn)菲律賓菌素染色。

鈣結(jié)合蛋白是浦肯野細胞的標(biāo)記，其在小腦中找到并涉及協(xié)同移動。在asmko小鼠中，浦肯野細胞隨著小鼠的年老而在這些小鼠中相繼死亡，導(dǎo)致降低的協(xié)同移動行為。在正常小鼠中沒有觀察到這種浦肯野細胞的失去和協(xié)同移動行為的相關(guān)丟失。

aav2注射至深部小腦核后，小腦對asmmrna、asm蛋白質(zhì)和鈣結(jié)合蛋白染色是陽性的。這些結(jié)果證明了注射至深部小腦核后aav2轉(zhuǎn)導(dǎo)小腦的能力。此外，小腦轉(zhuǎn)導(dǎo)和所得到的asm表達防止浦肯野細胞死亡，如通過治療過的小鼠中鈣結(jié)合蛋白染色的存在所證明的。在aav-asm治療的小鼠中，還在整個腦干、丘腦和mescencephalon觀察到hasm蛋白的表達。這些區(qū)域中的hasm蛋白表達與菲律賓菌素/膽固醇染色的清除的區(qū)域相重疊?？傊?，在小腦中，在asm蛋白水平、菲律賓菌素清除和浦肯野細胞存活之間存在正向關(guān)系。

還在小腦外側(cè)檢測到asmmrna和asm蛋白。特別地，脊髓對asmmrna表達是陽性的，如通過原位雜交所證明的。脊髓對asm蛋白也是陽性的，如通過asm-特異性免疫熒光所證明的。這些結(jié)果表明aav載體遠側(cè)注射至深部小腦核后脊髓得到轉(zhuǎn)導(dǎo)。這種轉(zhuǎn)導(dǎo)模式與支配深部小腦核區(qū)域的投射神經(jīng)元的形態(tài)構(gòu)造相一致。這些結(jié)果表明遠側(cè)脊髓細胞通過吸收aav2載體并對其進行表達。

阿爾茨海默氏病的治療

阿爾茨海默氏病(ad)是神經(jīng)退化疾病，特征在于由于降低的aβ分解代謝而導(dǎo)致的淀粉狀蛋白β-肽(aβ)的累積。隨著aβ累積，其聚集成胞外斑，引起突觸功能的損傷和神經(jīng)元的丟失。該病理導(dǎo)致癡呆、失去協(xié)調(diào)和死亡。

腦啡肽酶是97kd膜結(jié)合鋅金屬內(nèi)肽酶，是aβ正常降解中的限速酶。腦啡肽酶的引入通過在aβ聚集之前除去aβ集合而減緩了疾病的進展。實際上，腦啡肽酶顯示出降解aβ的寡聚形式，因此除去ad動物模型中存在的斑(kanemitsu等(2003)neurosci.lett.，350:113-116)。腦啡肽酶敲除小鼠呈現(xiàn)出高水平的aβ(iwata等(2001)j.neurosci.，24:991-998)。腦啡肽酶抑制劑，如thiorphan和磷酸阿米酮(phosphoramidon)，提高小鼠腦中的aβ水平(iwata等(2000)nat.med.，6:143-150)。此外，在人腦的高淀粉狀蛋白斑塊負荷區(qū)域內(nèi)發(fā)現(xiàn)降低的腦啡肽酶mrna水平，進一步證明了腦啡肽酶和ad之間的連接(yasojima等(2001)neurosci.lett.，297:97-100)。

腦的區(qū)域受ad影響最大的是海馬體、皮層、小腦、紋狀體和丘腦(參見，例如，iwata等(2001)上文；yasojima等(2001)上文)。這些是顯示出使用aav的有效逆向軸突運輸?shù)南嗤哪X區(qū)域。

因此，通過直接注射和隨后病毒通過腦回路運輸至我們的目標(biāo)部位，aav可以用于傳送治療性轉(zhuǎn)基因至高斑塊負荷的區(qū)域。病毒載體介導(dǎo)的腦啡肽酶基因轉(zhuǎn)移在ad小鼠模型的治療中是有效的(marr等(2003)j.neurosci.，23:1992-1996；marr等(2004)j.mol.neurosci.，22:5-11；iwata等(2004)j.neurosci.，24:991-998)。最近的報道表明aav5-腦啡肽酶從腦啡肽酶缺陷小鼠的海馬體突觸前末端除去aβ，減緩?fù)挥|的斑形成(iwata等(2004)上文)。在這篇報道中，在對側(cè)海馬體中發(fā)現(xiàn)腦啡肽酶，但這是歸功于病毒的逆向運輸或是表達的蛋白質(zhì)的順行運輸仍然是未知的。

膽固醇貯積病理的校正

以下的實施例，在被單側(cè)注射到深部小腦核后，評價了編碼人asm(hasm)的重組aav2/1、aav2/2、aav2/5、aav2/7和aav2/8血清型載體來表達hasm蛋白質(zhì)、校正膽固醇貯積病理、經(jīng)受運輸、拯救浦肯野細胞并啟動asmko小鼠中功能恢復(fù)的相對能力。另一組asmko小鼠接受了雙側(cè)注射至dcn，以便評定增加轉(zhuǎn)基因蛋白質(zhì)分布/表達是否將提高行為功能性恢復(fù)。

從雜合子交配(+/-)繁殖六十六只雄性純合(-/-)酸性神經(jīng)鞘磷脂酶敲除(asmko)小鼠和十六只雄性野生型同窩出生的對照小鼠。按照gal等(1975)nengljmed:293:632-636中所述的程序通過pcr測定小鼠的基因型。將來自最初克隆的小鼠回交c57/bi6株系。將動物在12:12小時亮:暗周期下飼養(yǎng)并無限制的提供食物和水。所有程序在實驗動物管理委員會(institutionalanimalcareandusecommittee)批準(zhǔn)的實驗方案下進行。

用異氟烷麻醉后，使用以下的aav血清型載體之一單側(cè)注射小鼠(～7周齡)至深部小腦核中(dcn)(a-p：離前囟點-5.75，m-l：離前囟點-1.8，d-v：離硬腦脊膜(dura)-2.6，門齒桿(incisorbar)：0.0)，(n＝8/載體)：aav1-cmv-βgal、aav1-cmv-asm、aav2-cmv-asm、aav5-cmv-asm、aav7-cmv-asm和aav8-cmv-asm。用安置于注射泵上的10μl漢密爾頓注射器以0.5μl/分鐘的速率傳送載體，用于每個腦總量為1.86×10¹⁰基因組顆粒。每個載體最終注射的體積是4μl。外科手術(shù)一小時之前和二十四小時之后，給予小鼠酮洛芬(5mg/kg；sc)，用于痛覺喪失。注射后7周(14周齡時)將小鼠處死。在處死時，給予小鼠過量euthasol(150mg/kg；ip)并快速斷頭(n＝5/組)或頸動脈灌注(n＝3/組)?？焖偃〕鰜碜詳囝^小鼠的腦，在液氮中快速冷凍，分成3個部分(右大腦半球，左大腦半球，和小腦)，勻漿并通過elisa分析hasm。將來自灌注小鼠的腦和脊髓處理，用于50μm震動(vibratone)切片上的人asm蛋白質(zhì)表達，通過菲律賓菌素染色所檢測的膽固醇累積，和使用鈣結(jié)合蛋白染色的浦肯野細胞存活。

使用相似的實驗方案，將asmko小鼠(～7周齡)兩側(cè)注射aav2/1-βgal(n＝8)，aav2/1-asm(n＝5)和aav2/2-asm(n＝5)并在20周齡時經(jīng)歷旋轉(zhuǎn)測試后處死。將腦在液氮中快速冷凍，在中線切分，然后使用小鼠腦基質(zhì)(asiinstruments，inc，mi)分成5個切片(s1、s2、s3、s4和s5)。切片1-4大約間隔2mm，s1為最頭端和s4為最尾端。切片5只含有小腦。右半球用于定量腦髓鞘磷脂水平和剩余的(left)hasm水平。

在具有sv40多腺苷酸化序列和雜交內(nèi)含子的人巨細胞病毒立即早期(cmv)啟動子控制下，將全長人asmcdna克隆至含有來自aav血清型2的itrs(aav2itr)的質(zhì)粒中。jin等(2002)jclininvest.109:1183-1191。使用一系列除了aav2型復(fù)制基因以外含有血清型特異性衣殼編碼結(jié)構(gòu)域的輔助質(zhì)粒通過三重轉(zhuǎn)染來產(chǎn)生雜交載體。該策略使aav2itr載體包裝至每個血清型特異性病毒粒子中，rabinowitz等(2002)jvirol.76:791-801。使用該方法，hasm重組基因組用來產(chǎn)生包括aav2/1、aav2/2、aav2/5、aav2/7和aav2/8各種血清型的系列raav-hasm載體。通過離子交換色譜(血清型2/1、2/2和2/5)(o’riordan等(2000)jgenemed2:444-54)或cscl離心(血清型2/8和2/7)(rabinowitz等(2002)j.urrol.76:791-801)來純化重組aav載體。通過cmv序列的taqmanpcr測定aav-asm病毒粒子的最終滴定度(dnase-抵抗顆粒)。clark等(1999)hum.genetherapy10:1031-1039。

人asm抗體是人特異性的并且不與小鼠asm交叉反應(yīng)。將稀釋于50mm碳酸鈉緩沖液(ph9.6)中的單克隆重組人asm(rhasm)抗體(2μg/ml)coster(corning，ny)包被9018平板(100μl/孔)，并在2-8℃孵育過夜。除去過量包被抗體并加入阻斷稀釋劑(kpl，inc.，md)在37℃孵育1h。用微量培養(yǎng)板洗滌器(moleculardevices，ca)將平板洗滌兩個循環(huán)。吸取雙份稀釋于標(biāo)準(zhǔn)稀釋緩沖液(pbs，0.05％吐溫，1％hp-bsa)中的標(biāo)準(zhǔn)、對照和樣品并使其在37℃孵育1h。如上所述將平板洗滌。將一百微升生物素化的重組人asm(rhasm)抗體(稀釋1:20k于標(biāo)準(zhǔn)稀釋緩沖液中)加入每個孔中，使其在37℃孵育1h，然后用微量培養(yǎng)板洗滌器除去。然后加入稀釋1:10k的抗生蛋白鏈菌素-hrp(piercebiotechnology，inc.，il)(100μl/孔)并使其在室溫孵育30分鐘。如上所述將平板洗滌，然后用surebluetmb(kpl，inc.，md)在36-38℃孵育15分鐘。用停止溶液(kpl，inc.，md)使反應(yīng)停止，然后用spectramax340平板閱讀器在450nm閱讀吸收值(moleculardevices，ca)。使用softmaxpro4.3軟件(moleculardevices，ca)完成數(shù)據(jù)分析。

用bca蛋白質(zhì)測試試劑盒(piercebiotechnology，inc.，il)測定每個樣品的蛋白質(zhì)濃度，使用牛血清白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)。

將小鼠經(jīng)頸動脈(transcardially)灌注在ph6.5的0.1m醋酸鈉緩沖液中含有2％多聚甲醛、0.03％戊二醛、0.002％cacl2的固定劑，接著用ph8.5的相同固定劑灌注。切開小鼠腦和脊髓并在ph8.5的無戊二醛的固定劑中4℃后固定過夜。將組織在ph7.4的0.1m磷酸鉀緩沖液中洗滌，包埋于3.5％的瓊脂中并用振動切片機切成50μm矢形切片。

以50μm的間隔將腦和脊髓用振動切片機切成矢形切片。用抗人asm的一抗(1：200)處理切片，用于免疫熒光。將切片孵育于含有10％驢血清、0.3％曲通x-100的pbs中1小時，接著用在含有2％驢血清、0.2％曲通x-100的pbs中的生物素化小鼠抗-人asm孵育72小時。洗滌后，使用tyramide信號擴大試劑盒(perkinelmer，bostonma)擴大信號。用nikon熒光顯微鏡觀察人asm蛋白質(zhì)，并用spot相機和adobephotoshop軟件捕獲圖像。

首先將菲律賓菌素復(fù)合物(sigma，st.louis，mo)稀釋于100％甲醇中，用作1mg/ml的儲備濃度。儲液在-20℃可穩(wěn)定4周。用pbs洗滌后，將切片在用pbs新鮮制得的含有10μg/ml菲律賓菌素溶液中在黑暗中孵育三小時。然后用pbs將切片洗滌三次。在熒光顯微鏡上的紫外線濾鏡下觀察膽固醇沉積。

使用抗鈣結(jié)合蛋白(鈣結(jié)合蛋白)的一抗處理腦，用于免疫熒光。用磷酸鉀緩沖液(kpb)洗滌切片，然后用磷酸鉀緩沖鹽水(kpbs)漂洗。然后將切片在含有5％驢血清、0.25％曲通x-100的kpbs中封閉切片高達3小時，然后在含有5％驢血清、0.2％曲通x-100和小鼠抗-鈣結(jié)合蛋白(1：2500，sigma，st.louis，mo)的kpbs中孵育。在4℃72小時后，用含有0.1％曲通x-100的kpbs將切片漂洗三次。在kpbs+0.1％曲通x-100中加入二抗：驢抗小鼠cy3(1：333，jacksonimmunoresearchlaboratories，westgrove，pa)，然后與切片室溫孵育90分鐘。用kpb將切片洗滌，然后安置于凝膠包被的載玻片上。在落射熒光顯微鏡(epifluorescence)下觀察鈣結(jié)合蛋白陽性細胞。為了定量小腦的浦肯野細胞，從每個動物選擇四個全斷面(full-faced)的內(nèi)側(cè)小腦切片。在熒光顯微鏡下觀察鈣結(jié)合蛋白免疫陽性浦肯野細胞并在20x的放大倍數(shù)計數(shù)細胞體。將每個葉分開計數(shù)。每個葉計數(shù)兩個分開的焦平面。只計數(shù)清晰的細胞來確保沒有細胞被計數(shù)兩次。

如上所述，首先用抗人asm的抗體處理五十(50)μm震動切片機的切片以用于免疫熒光。然后將切片在pbs中洗滌并用以上對于鈣結(jié)合蛋白概述的實驗方案對膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶染色(chat；兔多克隆，1：500，chemiconinternational，temecula，ca)。然而，不使用cy3二抗以外，而使用驢-抗-兔子fitc(1：200，jacksonimmunoresearchlaboratories，westgrove，pa)。首先在落射熒光顯微鏡下觀察染色，然后用共焦顯微鏡獲得圖像。

如下定量菲律賓菌素染色。使用裝備spot數(shù)碼相機的nikone600全視野立式落射熒光顯微鏡捕獲曝光正確的圖像。首先成像aav2/1-β-gal組，并用曝光來獲取所有其他圖像。每個分析的圖像表示通過每半個腦長度的內(nèi)側(cè)矢形面。用matamorph軟件(universalimagingcorporation)進行形態(tài)測量分析。aav2/1-β-gal圖像作為閾值；一旦建立，在所有的圖像中使用相同的閾值。通過使用者親自選擇以下的區(qū)域并分開分析：小腦、腦橋、延髓、中腦、腦皮層、海馬體、丘腦、下丘腦和紋狀體。在每個區(qū)域中測量綜合強度，將來自給定組動物的所有測量值(n＝3/組)用于產(chǎn)生平均值。然后，在經(jīng)治療動物中的膽固醇減少以同敲除β-gal的注射鼠相比較的整體強度的百分比減少進行計算。

在深部小腦核內(nèi)單側(cè)注射aav-asm后在整個小腦(圖6，表3)、腦橋、延髓和脊髓(圖7)中觀察陽性hasm免疫染色。

表3

作為aav血清型函數(shù)的陽性hasm染色的面積。*表示陽性hasm低于檢測極限，但是膽固醇病理的校正仍然發(fā)生。

在小腦內(nèi)用aav2/1-asm處理小鼠，并具有最廣泛(即，在相同矢形面內(nèi)的小葉之間分布)水平的hasm表達，而用aav2/2-asm處理的小鼠具有最有限水平的人asm蛋白質(zhì)表達。用aav2/5-asm、aav2/7-asm和aav2/8-asm處理小鼠中的人asm蛋白表達在這兩個組中間。在用血清型1&8處理的小鼠中矢形面之間的內(nèi)側(cè)-側(cè)面分布最大，而在用血清型2注射的小鼠中最小。血清型5&7啟動的內(nèi)側(cè)-側(cè)面分布模式在血清型1和2之間。用每種aav血清型轉(zhuǎn)導(dǎo)小腦的每層(即，分子，浦肯野細胞和小神經(jīng)膠質(zhì)細胞)；然而，對于分子層提高的親和性對于所有血清型是明顯的。浦肯野細胞轉(zhuǎn)導(dǎo)在血清型1和5治療的小鼠中是最大的。注射血清型7的小鼠具有最少數(shù)目的轉(zhuǎn)導(dǎo)浦肯野細胞。與血清型1、2、5&7相比較時，用血清型8處理的小鼠也具有少數(shù)轉(zhuǎn)導(dǎo)的浦肯野細胞，但在小神經(jīng)膠質(zhì)細胞層內(nèi)具有較低的asm表達。用asm轉(zhuǎn)導(dǎo)的浦肯野細胞似乎具有健康的細胞結(jié)構(gòu)。小腦組織勻漿中通過elisa的aav介導(dǎo)的hasm蛋白質(zhì)表達的定量分析支持我們的免疫組織化學(xué)發(fā)現(xiàn)。與所有其他小鼠比較時，注射血清型1和8的小鼠證明了顯著(p<.0001)高的小腦hasm蛋白質(zhì)水平(圖8)。來自注射血清型2、5&7小鼠的小腦hasm水平?jīng)]有高于wt水平(即，背景)。如所預(yù)期的，在野生型小鼠中沒有檢測到人asm—elisa中所用的hasm抗體是人特異性的。

功能性asm蛋白的不存在導(dǎo)致神經(jīng)鞘磷脂的溶酶體累積和隨后的繼發(fā)性代謝缺陷，如異常膽固醇運輸。sarna等eur.j.neurosci.13:1873-1880和leventhal等(2001)j.biol.chem.276:44976-4498。使用菲律賓菌素觀察asmko小鼠腦中的游離膽固醇累積，菲律賓菌素是一種從菲律賓鏈霉菌中分離的自體熒光分子。野生型小鼠腦對于菲律賓菌素沒有陽性染色。在所有aav處理的小鼠(除了aav2/1-βgal)中，菲律賓菌素染色的清除區(qū)域與hasm免疫染色陽性的區(qū)域重疊(表4)，表明每種血清型載體能夠產(chǎn)生功能性轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物。

表4

小腦內(nèi)注射編碼人asm的不同aav血清型(n＝3/血清型；2/1、2/2、2/5、2/7和2/8)至asmko小鼠的深部小腦核后，選定腦區(qū)域中與aav-βgal處理的asmko小鼠相比較的菲律賓菌素(即，膽固醇)清除的百分比降低。

如之前通過(passini等(2003)在“societyforneuroscience”neworleans，la)所證明的，在解剖學(xué)上與注射位點連接但對hasm沒有陽性染色的部位中也產(chǎn)生了菲律賓菌素清除。metamorph分析表明菲律賓菌素染色降低發(fā)生在整個吻尾(rostralcaudal)軸中。在小腦和腦干中，在用aav2/1-asm和aav2/8-asm處理的小鼠中菲律賓菌素得到最大降低，而在間腦和大腦皮層中，注射aav2/8-asm的小鼠具有最全面水平的菲律賓菌素清除(表4)。盡管如此，這些結(jié)果表明校正是asmko小鼠cns的膽固醇貯積病理需要的hasm水平是最小的(即，低于檢測的hasm免疫熒光極限)。

表5

組織學(xué)研究表明asmko小鼠小腦經(jīng)歷快速退化。更具體地，浦肯野細胞在8至20周年齡之間逐漸相繼而亡(sarna等(2001)eur.j.neurosci.13:1813-1880和stewart等(2002)在“societyforneuroscience”orland，fl中)。鈣結(jié)合蛋白是廣泛受影響的浦肯野細胞標(biāo)記。aav-asm處理小鼠中的陽性鈣結(jié)合蛋白染色將表明aav介導(dǎo)的hasm表達是治療性的?？傮w上我們的結(jié)果表明了小腦中aav介導(dǎo)的hasm表達防止了asmko小鼠中的浦肯野細胞死亡(表5，圖9)。如所預(yù)期的，在小葉i-iii中沒有發(fā)生浦肯野細胞存活；在7周齡時給小鼠注射，在8周之前，這些細胞的大部分已經(jīng)相繼而亡。在血清型1治療小鼠中，小葉iv/v中的浦肯野細胞存活最大。在小葉vi中，在aav處理的小鼠中沒有觀察到顯著的浦肯野細胞存活。在小葉vii中，只有用血清型5處理的小鼠顯示出顯著的浦肯野細胞存活。再在小葉viii中，用血清型5以及血清型2處理的小鼠顯示出顯著的浦肯野細胞存活。在小葉ix和x中，在wt和ko小鼠(或aav處理的小鼠之間)之間的浦肯野細胞計數(shù)不存在顯著差異。這是預(yù)期的，因為在14周齡時(即，處死時)，這些小葉中的浦肯野細胞在asmko小鼠中仍然是活的。跨越所有小葉，浦肯野細胞存活在用血清型1、2&5處理的小鼠中最大，在用血清型7&8處理的小鼠中最小。在注射血清型1的小鼠中，小腦前葉中的浦肯野細胞存活(基于鈣結(jié)合蛋白染色)最大。

小腦內(nèi)注射編碼人asm的不同aav血清型(n＝3/血清型；2/1、2/2、2/5、2/7和2/8)至asmko小鼠的深部小腦核后，wt和asmko小鼠中小腦小葉i-x中的浦肯野細胞計數(shù)。粗斜體顯示的數(shù)字是顯著不同于ko小鼠的(即，用aav2/1-βgal處理的小鼠)p≤.01。

在加速旋轉(zhuǎn)測試時，單側(cè)注射aav2/1-asm和aav2/8-asm的小鼠證明了延遲跌倒時間顯著(p<.0009)長于注射aav2/1-βgal的asmko小鼠(圖10)。注射血清型aa2/1-asm的小鼠沒有顯著不同于野生型小鼠。注射aav2/2-asm和aav2/5-asm的小鼠顯示出延遲跌倒時間長于注射aav2/1-βgal的asmko小鼠的趨勢；而注射aav2/7-asm的小鼠沒有。對于搖擺旋轉(zhuǎn)測試，只有注射aa2/1-asm的小鼠顯示了延遲跌倒時間顯著(p<.0001)長于注射aav2/1-βgal的asmko小鼠。在這種情況中，野生型小鼠表現(xiàn)顯著好于注射aa2/1-asm的小鼠(圖10)。對于加速和搖擺測試，接受兩側(cè)注射aav2/1-asm或aav2/2-asm的asmko小鼠表現(xiàn)顯著(p<.001)好于asmkoaav2/1-βgal處理的小鼠(圖11)。對于兩個測試，兩側(cè)注射aav2/1-asm的小鼠的表現(xiàn)與野生型小鼠相當(dāng)。

測定aav產(chǎn)生的hasm在asmkocns內(nèi)是否功能上活性的一種方式是測定其對膽固醇貯積病理(npa疾病的繼發(fā)性代謝缺陷)的影響。在所有aav處理的小鼠(除了aav2/1-βgal)中，膽固醇貯積病理的校正與hasm免疫染色陽性的區(qū)域重疊，表明每種血清型載體能夠產(chǎn)生功能性轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物。如之前所證明的，在解剖學(xué)上與注射位點相連的區(qū)域中，而且在對hasm沒有陽性染色的區(qū)域中，也發(fā)生了異常膽固醇代謝的校正，表明膽固醇貯積病理校正需要的hasm水平是最小的。與我們的hasm組織化學(xué)和生化結(jié)果相一致，用血清型1和8處理的小鼠證明了膽固醇貯積病理的顯著降低。用血清型2、5&7處理的小鼠還顯示出膽固醇貯積病理的降低，但是沒有降至與血清型1&8處理的小鼠相同的程度。

盡管膽固醇貯積病理改變是說明性的，hasm酶活性的更直接測量是通過神經(jīng)鞘磷脂水平的分析，神經(jīng)鞘磷脂是患有niemann-pick疾病的哺乳動物組織中累積的主要底物。測定接受兩側(cè)注射aav血清型1和2小鼠腦組織的神經(jīng)鞘磷脂(spm)水平(用于測定spm的組織均質(zhì)的方法與hasm的檢測不相容)。在血清型1和2處理的小鼠中觀察到小腦中spm組織含量的顯著降低(p<0.01)(圖12)。在注射血清型1的小鼠中的切片2、3和4(每個切片相互隔開2mm)中的spm組織含量水平也是顯著降低的，但是在注射血清型2的小鼠中沒有。

接受兩側(cè)小腦內(nèi)注射編碼hasm的aav血清型1和2的asmko小鼠顯示出小腦內(nèi)神經(jīng)鞘磷脂貯積的顯著降低。如用膽固醇貯積累積所觀察的，在aav1兩側(cè)處理的asmko小鼠中的小腦外側(cè)區(qū)域中也產(chǎn)生了神經(jīng)鞘磷脂貯積病理的顯著降低。

總之，這些結(jié)果表明在啟動酶表達、校正腦中的貯積病理、防止神經(jīng)退化(例如，通過防止浦肯野細胞死亡)和提高運動功能結(jié)果的相對能力中，相對于血清型2、5、7和8優(yōu)選aav1。此外，可以開發(fā)dcn作為注射位點來最大化在整個cns中的酶表達。

為了評價avv載體注射至dcn后轉(zhuǎn)基因表達的分布，將g93asod1(sod1^g93a突變小鼠，在此稱為sod1小鼠)注射編碼綠色熒光蛋白(gfp)的重組aav載體。一組小鼠注射編碼綠色熒光蛋白的aav血清型1(aav1-gfp)，而另一組注射編碼綠色熒光蛋白的aav血清型2(aav2-gfp)。

使用上述那些相似的方法將aav重組載體兩側(cè)注射至小鼠dcn中。劑量大約為每個位點注射2.0-10gc/ml(2.0e10gc/ml)。在出生后約110天將小鼠處死，并將它們的腦和脊髓用于gfp染色。

編碼綠色熒光蛋白(gfp)的aav的dcn傳送后，在腦干(參見圖14)和脊髓區(qū)域(參見圖15)中觀察到綠色熒光蛋白分布。還在dcn以及嗅球、大腦皮層、丘腦、腦干、小腦皮層和脊髓中觀察到gfp染色。所有這些區(qū)域接受來自dcn的投射和/或?qū)⑼渡浒l(fā)送至dcn(參見圖16)。

根據(jù)說明書內(nèi)引用的參考文獻的教導(dǎo)來最徹底地理解說明書。說明書內(nèi)的實施方案提供了本發(fā)明實施方案的說明并不應(yīng)當(dāng)認(rèn)為是限制本發(fā)明的范圍。本領(lǐng)域技術(shù)人員容易認(rèn)識到本發(fā)明包括許多其他實施方案。本公開中引用的所有出版物、專利和生物序列以其整體引入作為參考。對于引入作為參考的材料與本發(fā)明相抵觸或不一致的程度，本發(fā)明說明書將取代任何這樣的材料。在此任何參考文獻的引用不容許這樣的參考文獻是本發(fā)明的現(xiàn)有技術(shù)。

除非另外指出，說明書包括權(quán)利要求中所用的表達成分?jǐn)?shù)量、細胞培養(yǎng)物、處理條件等的所有數(shù)字理解為通過術(shù)語“約”在所有情況中是待改變的。因此，除非另外指出與此相反，數(shù)字參數(shù)是近似值并可以根據(jù)本發(fā)明探尋待獲得的所需特征而改變。除非另外指出，一系列要素前的術(shù)語“至少”理解為表示系列中的每個要素。本領(lǐng)域技術(shù)人員使用不超過常規(guī)的實驗將認(rèn)識到或者能夠確定在此所述的本發(fā)明特定實施方案的許多等價物。確定以下的權(quán)利要求包括這樣的等價物。