本發(fā)明涉及一種具有pH和還原雙重敏感的兩親三嵌段共聚物及其制備方法；本發(fā)明同時還涉及該兩親性三嵌段共聚物的制備和作為藥物載體在制備抗腫瘤藥中的應(yīng)用，屬于高分子化學(xué)領(lǐng)域和生物醫(yī)藥應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

近年來隨著高分子化學(xué)和生物醫(yī)學(xué)的高速發(fā)展，生物降解性納米粒子在腫瘤治療中引起了高度重視。其具備生物可降解、生物相容和環(huán)境響應(yīng)的膠束已成為新的發(fā)展趨勢。它不同于過去放療和化療等治療方法（對機(jī)體正常的細(xì)胞產(chǎn)生嚴(yán)重的損傷），可有效的減少藥物對正常組織的傷害。

聚乙二醇（PEG）是一種是具有良好的生物相容性的藥物載體，不僅能夠降低藥物的毒副作用，還能夠有效地阻止蛋白的吸附，延長膠束在血液中的循環(huán)時間，提高藥物在體內(nèi)的穩(wěn)定性，同時增加藥物在腫瘤位點(diǎn)的積累，使藥效得到更好的發(fā)揮等特點(diǎn)，作為腫瘤靶向藥物載體已應(yīng)用于臨床。PEG的其結(jié)構(gòu)式如下：

聚己內(nèi)酯（PCL）具有很好的熱穩(wěn)定性、良好的生物相容性及優(yōu)異的通透性、無毒以及對許多藥物具有好的滲透性，并且在生理環(huán)境中可降解，所以被廣泛用作藥物控釋載體。聚己內(nèi)酯的結(jié)構(gòu)式如下：

3,3'-二硫代二丙酸，具羧基和二硫鍵，羧基可以與羥基或氨基反應(yīng)進(jìn)行化合物的改性，二硫鍵具有氧化還原特性，腫瘤部位的谷胱甘肽可使聚合物膠束中二硫鍵被還原，膠束剖壞從而藥物釋放。其結(jié)構(gòu)式如下：

因此，將含有還原劑敏感的二硫鍵的二硫代二丙酸、親水性的聚乙二醇與含有pH敏感縮醛鍵的疏水段的聚己內(nèi)酯通過一定的方式形成共聚物，使其抗腫瘤活性進(jìn)行疊加，以促進(jìn)聚合物藥物對腫瘤的抑制作用，同時體現(xiàn)出良好的生物相溶性，以減少對正常組織的傷害，有望為抗癌領(lǐng)域提供了更多的選擇。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種具有pH和還原雙重敏感的兩親三嵌段共聚物。

本發(fā)明的另一目的是提供一種制備上述具有pH和還原雙重敏感的兩親三嵌段共聚物的制備方法；

本發(fā)明還有一個更重要的目的，就是提供上述具有pH和還原雙重敏感的兩親三嵌段共聚物作為抗腫瘤藥物載體的應(yīng)用。

一、具有pH和還原雙重敏感的兩親三嵌段共聚物

本發(fā)明具有pH和還原雙重敏感的兩親三嵌段共聚物，其結(jié)構(gòu)如下：

。

該兩親三嵌段共聚物的制備方法，包括以下工藝步驟：

（1）含有還原劑敏感的二硫鍵親水段聚乙二醇-SS-COOH的制備：以N,N-二環(huán)己基碳二亞胺（DCC）和4-二甲基氨基吡啶（DMAP）為催化劑，二氯甲烷與四氫呋喃為混合溶劑，使聚乙二醇與3,3'-二硫代二丙酸于-5~0℃下反應(yīng)22~24 h；反應(yīng)完全后除去溶劑，沉淀、過濾、洗滌、干燥，得親水段聚乙二醇-SS-COOH；記為化合物；

底物聚乙二醇與二硫代二丙酸的摩爾比為1:3~1:4；

溶劑二氯甲烷與四氫呋喃的體積比為2:1~5:1；

催化劑N,N-二環(huán)己基碳二亞胺的用量為聚乙二醇與二硫代二丙酸總摩爾量的0.6~1倍；4-二甲基氨基吡啶的用量為聚乙二醇與二硫代二丙酸總摩爾量的0.4~0.75倍。

化合物的結(jié)構(gòu)式為：

。

（2）聚己內(nèi)酯制備：用甲苯作溶劑，4-羥基苯甲醛作為引發(fā)劑，辛酸亞錫作為催化劑，在100~110℃的油浴條件下使?-己內(nèi)酯（?-CL）開環(huán)聚合形成白色固體聚己內(nèi)酯（PCL）。記為化合物。

引發(fā)劑4-羥基苯甲醛與?-己內(nèi)酯（?-CL）的摩爾比為1:60~1:150；催化劑辛酸亞錫與?-己內(nèi)酯的摩爾比為1:300 ~1:350。

化合物的結(jié)構(gòu)式為：

。

（3）疏水段 HO-聚己內(nèi)酯-Acetal-OH的制備：以對甲基苯磺酸為催化劑，四氫呋喃為溶劑，使1,1,1-三（羥甲基）乙烷與化合物混合，在室溫下攪拌反應(yīng)48~72h，所得產(chǎn)物用乙酸乙酯和石油醚沉淀純化，抽濾，干燥，得HO-聚己內(nèi)酯-Acetal-OH，記為化合物。

1,1,1-三（羥甲基）乙烷與化合物的摩爾比為8:1~10:1；催化劑對甲基苯磺酸的用量為1,1,1-三（羥甲基）乙烷與化合物總摩爾量的0.14~0.18倍。

化合物的結(jié)構(gòu)式：

。

（4）目標(biāo)產(chǎn)物的制備：以二氯甲烷為溶劑，4-二甲基氨基吡啶和N,N-二環(huán)己基碳二亞胺為催化劑，將化合物和化合物混合后在-5~0℃下攪拌反應(yīng)22~24 h，產(chǎn)物經(jīng)乙醚和石油醚洗滌，抽濾，干燥，得到目標(biāo)產(chǎn)物三嵌段共聚物，記為化合物。

化合物與化合物的摩爾比為3:1~5:1；催化劑4-二甲基氨基吡啶的用量為化合物與化合物總摩爾量的0.6~1.3倍；N,N-二環(huán)己基碳二亞胺的用量為化合物與化合物總摩爾量的0.4~1倍。

化合物的結(jié)構(gòu)式為：

式中，m=41~23 mol%，n=18~54 mol%；數(shù)均分子量Mn=1.6~2.3×10⁴。

圖1為上述方法制備的具有pH和還原雙重敏感的兩親三嵌段共聚物的核磁共振氫譜。通過核磁共振氫譜分析可以得出，化學(xué)位移在3.63 ppm為親水段PEG上的H，化學(xué)位移在1.36 ppm、1.67 ppm、2.29 ppm和4.06 ppm左右會出現(xiàn)聚己內(nèi)酯（PCL）上的H。核磁共振氫譜說明制備的共聚產(chǎn)物與設(shè)計的共聚物結(jié)構(gòu)一致，表明成功合成了該共聚物。

二、兩親性三嵌段聚合物的抗腫瘤活性實驗

1、膠束的制備以及表征

（1）載藥聚合物膠束的制備

將上述兩親性三嵌段聚合物和阿霉素以2.5:1的質(zhì)量比溶解于THF中，攪拌2~4小時，在室溫滴加至去離子水中，繼續(xù)攪拌10~12 h，然后置于透析袋在pH 7.4的磷酸緩沖溶液中透析20~24小時，得到載藥膠束溶液。兩親性聚合物和阿霉素。

（2）膠束的表征

用納米粒徑儀對兩親性三嵌段聚合物載藥膠束的粒徑及粒徑分布進(jìn)行檢測，粒徑大約180 nm左右（見圖2）。采用透射電鏡TEM觀察了膠束的形貌為納米級的小球（見圖3）。

2、體外模擬的釋放實驗

通過紫外分光光度計測定阿霉素在482 nm處的吸光強(qiáng)度計算載藥膠束的藥物釋放率。取四份10mL載藥聚合物膠束，分別置于100 mL的pH 7.4 （100 mM）、含有10 mmol DTT的pH 7.4（100mM）、pH 5.0 （100 mM）和含有10 mmol DTT的 pH 5.0（100 mM）的緩沖溶液中，透析48小時，按照一定的時間間隔取樣，測紫外吸收，并與聚合物中包載的阿霉素進(jìn)行比較，最終釋放率分別為25.17%、92.05%、40.07%和95.36%（見圖4、5），說明了在10 mmol DTT和pH 5.0雙重響應(yīng)條件下釋放阿霉素更好。

綜上所述，本發(fā)明制備的三嵌段共聚物中，存在具有氧化還原響應(yīng)的二硫鍵和pH響應(yīng)的縮醛鍵，其和抗癌藥物可在水中自組裝形成球形結(jié)構(gòu)（圖3）的載藥膠束，并在癌細(xì)胞內(nèi)高還原的環(huán)境和微酸性條件下二硫鍵和縮醛鍵發(fā)生斷裂，使得膠束結(jié)構(gòu)被破壞，從而釋放出阿霉素（DOX）并進(jìn)入細(xì)胞核，殺死癌細(xì)胞；高分子載體PEG的存在，使共聚物體現(xiàn)出良好的生物相溶性，降低了抗癌藥物的毒性，從而減少了對正常組織的損傷，所以在制備抗腫瘤藥物方面具有很好的應(yīng)用前景。

附圖說明

圖1為本發(fā)明制備的具有pH和還原雙重敏感的兩親三嵌段共聚物的核磁共振氫譜。

圖2為本發(fā)明載藥膠束的粒徑分布圖。

圖3為本發(fā)明載藥膠束的透射電鏡圖。

圖4為本發(fā)明載藥膠束在pH 5.0、10 mmol DTT（A），pH 7.4、10 mmol DTT（B），pH 5.0（C）和pH 7.4（D）時阿霉素釋放的體外模擬曲線；各圖中，由上而下依次為透析1 h、2 h，4 h，7 h，12 h、24 h及48 h取樣的釋放率。

圖5為本發(fā)明載藥膠束在pH 7.4，pH 7.4、10 mmol DTT，pH 5.0和pH 5.0、10 mmol DTT時阿霉素釋放率。

具體實施方式

下面通過具體實施例對本發(fā)明兩親性三嵌段聚合物的合成及結(jié)構(gòu)表征作進(jìn)一步的說明。

實施例1

（1）含有還原劑敏感的二硫鍵親水段聚乙二醇-SS-COOH（化合物）的制備：在0℃條件下將3,3'-二硫代二丙酸的單體（0.42 g，2 mmol）溶解在30 mL THF-CH₂Cl₂混合溶劑（THF: CH₂Cl₂=1:5v/v）中，再將PEG（2 g，0.4 mmol）和DMAP（0.10g，0.8 mmol）在攪拌條件下置于混合溶液；然后加入DCC（0.41g，2 mmol），攪拌24 h。初產(chǎn)物用乙酸乙酯和石油醚沉淀、過濾、洗滌三次純化、干燥，得1.87 g的白色固體記即為化合物，產(chǎn)率78 %。

¹H NMR (400 MHz, CDCl₃, δ (ppm)):3.63(CH₃OCH₂CH₂O-), 3.43(CH₃OCH₂CH₂O-) , 2.93(-OOCCH₂CH₂SS-), 4.36(-OOCCH₂CH₂SS-)。

（2）聚己內(nèi)酯（化合物）的制備：在甲苯（20 mL）中加入?-己內(nèi)酯（1.8 g，15.77 mmol），4 -羥基苯甲醛（0.12 g, 0.1 mmol），辛酸亞錫（20 mg，0.05 mmol），在氮?dú)鈼l件、110℃的油浴下反應(yīng)24 h。產(chǎn)物冷卻后用冰甲醇沉淀提純，過濾、分離，在真空下干燥，形成白色固體1.55 g，即為化合物，產(chǎn)率: 81%。

¹H NMR (400 MHz, CDCl₃, δ (ppm)):9.99 (-OC₆H₄CHO), 7.90 (-OC₆H₄CHO), 4.06 (-OCH₂CH₂CH₂CH₂CH₂COO-), 2.29 (-OCH₂CH₂CH₂CH₂CH₂COO-), 1.67 (-OCH₂CH₂CH₂CH₂CH₂COO-),1.36(-OCH₂CH₂CH₂CH₂CH₂COO-)。

（3）含有pH敏感縮醛鍵的疏水段 HO-聚己內(nèi)酯-Acetal-OH（化合物）的制備：將對甲基苯磺酸（14 mg，0.08 mmol）和1,1,1-三（羥甲基）乙烷（63 mg，0.5 mmol）溶解在20mL THF中，在室溫下攪拌均勻之后，將化合物（1.2 g，0.05 mmol）置于該混合溶液，直到所有的固體溶解再加入20g 4?分子篩（具有微孔型立方晶格的硅鋁酸鹽，能吸附水），反應(yīng)3天。用乙酸乙酯和石油醚三次沉淀純化，所得產(chǎn)物0.97g，為化合物，產(chǎn)率：76.8%。

¹H NMR (400 MHz, CDCl₃, δ (ppm)): 4.06(-OCH₂CH₂CH₂CH₂CH₂COO-), 2.29 (-OCH₂CH₂CH₂CH₂CH₂COO-),1.67(-OCH₂CH₂CH₂CH₂CH₂COO-),1.36(-OCH₂CH₂CH₂CH₂CH₂COO-),5.43(-C₆H₄CH(OCH₂)OCH₂C(CH₃OH)CH₃), 3.65(-C₆H₄CH(OCH₂)OCH₂C(CH₃OH)CH₃),3.87(-C₆H₄CH(OCH₂)OCH₂C(CH₃OH)CH₃). 4.09(-C₆H₄CH(OCH₂)OCH₂C(CH₃OH)CH₃)。

（4）目標(biāo)化合物聚乙二醇-SS-聚己內(nèi)酯-Acetal-SS-聚乙二醇（化合物）的制備：將化合物（0.28 g，0.05 mmol）和化合物（0.5 g，0.02 mmol）溶解于10 mL CH₂Cl₂中，加入DMAP（10 mg，0.04 mmol）和DCC（5 mg，0.06 mmol）作為催化劑，在0℃左右攪拌24小時；混合產(chǎn)物經(jīng)乙醚和石油醚洗滌3次，得到產(chǎn)物0.55 g，即為化合物，產(chǎn)率：71%。

¹H NMR (400 MHz, CDCl₃, δ (ppm)):3.63(CH₃OCH₂CH₂O-), 3.43(CH₃OCH₂CH₂O-) , 4.06 (-OCH₂CH₂CH₂CH₂CH₂COO-), 2.29(-OCH₂CH₂CH₂CH₂CH₂COO-), 1.67(-OCH₂CH₂CH₂CH₂CH₂COO-), 1.36(-OCH₂CH₂CH₂CH₂CH₂COO-)。

該化合物的結(jié)構(gòu)式中，m=33.4mol%，n=33.1mol%；數(shù)均分子量Mn=2.3×10⁴。

實施例2

（1）含有還原劑敏感的二硫鍵親水段聚乙二醇-SS-COOH（化合物）的制備：3,3'-二硫代二丙酸單體的量為（0.5 g，2.4 mmol），THF-CH₂Cl₂混合溶劑中，THF: CH₂Cl₂=1:3v/v，PEG的量為（2.37 g，0.5 mmol），DMAP的量為（0.17 g，1.4 mmol），DCC的量為（0.29 g，1.4 mmol），其它與實施例1同。得1.87 g的白色固體記即為化合物，產(chǎn)率為78.7%；

（2）聚己內(nèi)酯（化合物）的制備：在甲苯（20 mL）中加入?-己內(nèi)酯（2.8 g，19.42 mmol），4 -羥基苯甲醛（0.336 g, 0.29 mmol），辛酸亞錫（26 mg，0.065 mmol），在氮?dú)鈼l件、110℃的油浴下反應(yīng)24 h。產(chǎn)物冷卻后用冰甲醇沉淀提純，過濾、分離，在真空下干燥，形成白色固體2.61g，即為化合物，產(chǎn)率: 83%。

（3）含有pH敏感縮醛鍵的疏水段 HO-聚己內(nèi)酯-Acetal-OH（化合物）的制備：對甲基苯磺酸的量為（0.15 g，0.88 mmol） ， 1,1,1-三（羥甲基）乙烷的量為（0.53 g，4.4 mmol），化合物的量為（2.5 g，0.44 mmol），4?分子篩的量為（40 g），其它與實施例1同。得化合物為2.38 g，產(chǎn)率為75%；

（4）目標(biāo)化合物聚乙二醇-SS-聚己內(nèi)酯-Acetal-SS-聚乙二醇（化合物）的制備：化合物的量為（0.5 g，0.09 mmol），化合物的量為（0.1 g，0.02mmol），DMAP的量為（0.01 g，0.06 mmol），DCC的量為（0.012 g，0.09 mmol），其它與實施例1同。化合物為0.23 g，產(chǎn)率為38%。該化合物的結(jié)構(gòu)式中，m=41 mol%，n=18 mol%；數(shù)均分子量Mn=1.6×10⁴。

實施例3

（1）含有還原劑敏感的二硫鍵親水段聚乙二醇-SS-COOH（化合物）的制備：3,3'-二硫代二丙酸單體的量為（0.4 g，1.9 mmol），DMF-CH₂Cl₂混合溶劑中，DMF: CH₂Cl₂=1:2v/v，PEG的量為（2.37 g，0.48 mmol），DMAP的量為（0.12 g，0.95 mmol），DCC的量為（0.29 g，1.43 mmol），其它與實施例1同。得2.11 g的白色固體記即為化合物,產(chǎn)率為76.4%；

（2）聚己內(nèi)酯（化合物）的制備：在甲苯（20 mL）中加入?-己內(nèi)酯（2.0 g，13.87 mmol），4 -羥基苯甲醛（0.18 g, 0.15 mmol），辛酸亞錫（18.72 g，0.046 mmol），在氮?dú)鈼l件、110℃的油浴下反應(yīng)24 h。產(chǎn)物冷卻后用冰甲醇沉淀提純，過濾、分離，在真空下干燥，形成白色固體1.74g，即為化合物，產(chǎn)率: 80%；

（3）含有pH敏感縮醛鍵的疏水段 HO-聚己內(nèi)酯-Acetal-OH（化合物）的制備：對甲基苯磺酸的量為（0.05 g，0.3 mmol） ， 1,1,1-三（羥甲基）乙烷的量為（0.15 g，1.31 mmol），化合物的量為（1.5 g，0.16 mmol），4?分子篩的量為（30 g），其它與實施例1同。得化合物為1.31 g，產(chǎn)率為77%；

（4）目標(biāo)化合物聚乙二醇-SS-聚己內(nèi)酯-Acetal-SS-聚乙二醇（化合物）的制備：化合物的量為（0.4 g，0.08 mmol），化合物的量為（ 0.18 g，0.02 mmol），DMAP的量為（ 0.01 g，0.06 mmol），DCC的量為（0.016 g，0.08 mmol），其它與實施例1同?；衔餅?.40 g，產(chǎn)率為59%。該化合物的結(jié)構(gòu)式中，m=37mol%，n=26 mol%；數(shù)均分子量Mn=1.9×10⁴。