本發(fā)明涉及一種體內(nèi)止血敷料的制備方法，特別涉及一種以谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶為交聯(lián)劑的體內(nèi)止血敷料的制備方法，屬于生物醫(yī)用材料領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

膠原蛋白是一種高分子蛋白，一般呈白色、不透明的纖維狀。它是生物體組成結(jié)構(gòu)的主要成分之一，廣泛地分布于動物的皮膚、骨骼和肌肉組織內(nèi)。膠原具有止血性能，一方面可加強血小板的黏附和聚集形成血栓，阻止血液流出。另一方面，通過激活和誘導(dǎo)各種凝血因子還可啟動內(nèi)源性的凝血途徑。但是膠原蛋白多來源于動物皮、筋腱等，可加工性差，在提取過程中會使蛋白部分生物活性喪失，而且其對人體而言屬于一種異源物，可引起過敏等不良反應(yīng)，應(yīng)用于人體非常容易產(chǎn)生排異反應(yīng)。因此需要尋找一種制備簡單、安全性高的膠原蛋白作為原料。

谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶是人體組織中本來就含有的一種酶，可與膠原蛋白發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)，谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶以肽鍵中谷氨酰胺殘基的γ-羧酰胺基作為?；墓w，以多肽鏈中賴氨酰殘基于氨基作為?；氖荏w，形成蛋白質(zhì)分子內(nèi)和分子間的ε-γ（-谷氨酰）賴氨酸異肽鍵。熱交聯(lián)是在真空條件下加熱，使膠原分子嚴重脫水，自由羧基和羥基發(fā)生酯化反應(yīng)以及羧基與氨基之間發(fā)生酰胺反應(yīng)，從而改善止血敷料的機械性能，而且還可以保持止血敷料的內(nèi)部孔狀結(jié)構(gòu)不變，使孔隙均勻完整。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種使用安全、可吸收、止血效果好的體內(nèi)止血敷料的制備方法。

本發(fā)明的實現(xiàn)過程如下：

一種體內(nèi)止血敷料的制備方法：以類人膠原蛋白為原料，加入注射用水?dāng)嚢枞芙夂?，向類人膠原蛋白溶液中加入谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶進行交聯(lián)后，通過控制降溫速率為4-8 ℃/min進行降溫預(yù)凍，真空冷凍干燥，Co60照射滅菌后得到體內(nèi)止血敷料。

上述的類人膠原蛋白為使用基因重組大腸桿菌高密度發(fā)酵生產(chǎn)的一種人源型膠原蛋白。

上述的類人膠原蛋白加入注射用水后的質(zhì)量濃度為1%-5%；谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶與類人膠原蛋白的比例為4-8U/g。

具體來說，上述的體內(nèi)止血敷料的制備方法，包括如下步驟：

（1）將類人膠原蛋白溶解于注射用水中，使溶液中類人膠原蛋白的質(zhì)量濃度為1%-5%；

（2）將溶液移入一次性無菌培養(yǎng)皿或模具中，每皿或每模具7-15 mL；

（3）加入谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶，谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶與類人膠原蛋白的比例為4-8U/g，反應(yīng)溫度為-4-0℃，交聯(lián)時間為24-48小時；

（4）預(yù)凍過程中，降溫速率控制為4-8 ℃/min；

（5）樣品凍干處理24-72 h，凍干好的樣品Co60照射滅菌10-30 h。

本發(fā)明具有以下優(yōu)點：

（1）本發(fā)明所涉及的膠原蛋白為基因工程菌高密度發(fā)酵的人源性膠原蛋白，它從根本上解決了動物提取膠原蛋白的水不溶性和病毒隱患等問題，具有生物相容性好、促細胞生長、無病毒隱患和免疫排異反應(yīng)低等優(yōu)點，提高了體內(nèi)止血敷料的安全性；

（2）本發(fā)明采用酶法交聯(lián)，具體使用谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶交聯(lián)膠原蛋白制備體內(nèi)止血敷料，可以改善止血敷料的機械強度，提高止血效果，而且谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶是人體組織中本身就含有的一種酶，其安全無毒，制備的止血敷料應(yīng)用于臨床時保證了其良好的生物安全性；

（3）本發(fā)明所制備的體內(nèi)止血敷料合成工藝簡單易實現(xiàn)，產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定、安全性高，工藝易放大且重現(xiàn)性能好，在醫(yī)用生物材料與組織工程等相關(guān)領(lǐng)域有著良好的應(yīng)用前景。

附圖說明

圖1為體內(nèi)止血敷料的外觀圖；

圖2為體內(nèi)止血敷料的SEM圖；

圖3為體內(nèi)止血敷料兔耳止血效果圖；

圖4為體內(nèi)止血敷料兔肝臟止血效果圖；

圖5為體內(nèi)止血敷料細胞毒性實驗圖；

圖6 為體內(nèi)止血敷料皮下植入圖。

具體實施方式

本發(fā)明技術(shù)方案不局限于以下所列舉具體實施方式，還包括各具體實施方式間的任意組合，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通過閱讀本發(fā)明說明書而對本發(fā)明技術(shù)方案采取的任何等效的變換，均為本發(fā)明的權(quán)利要求所涵蓋。

一種體內(nèi)止血敷料的制備方法，包括如下步驟：

（1）將類人膠原蛋白溶解于注射用水中，攪拌使其完全溶解，使溶液中類人膠原蛋白的質(zhì)量濃度為1%-5%，所述的類人膠原蛋白為使用基因重組大腸桿菌高密度發(fā)酵生產(chǎn)的一種人源型膠原蛋白；

（2）將溶液移入一次性無菌培養(yǎng)皿或模具中，每皿或每模具7-15 mL；

（3）加入谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶，加入谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶與類人膠原蛋白的比例為4-8U/g，反應(yīng)溫度為-4-0℃，交聯(lián)時間為24-48小時；

（4）使用程序冷凍儀預(yù)凍過程中控制降溫速率為4—8℃/min進行精確降溫，一直降至-40—-80℃；

（5）在真空冷凍干燥機中凍干樣品24-72 h；

（6）凍干好的樣品通過輻照滅菌10-30 h。

本發(fā)明采用類人膠原蛋白為主要原料制備體內(nèi)止血敷料，現(xiàn)有方法多采用超低溫冰箱直接預(yù)凍，蛋白溶液直接置于低溫，其中的液滴來不及反應(yīng)而導(dǎo)致形成的冰晶雜亂無章，大小不一，在凍干時，冰晶升華而形成眾多不均勻的孔，得到的體內(nèi)止血敷料表面凹凸不平，邊緣不整，機械強度差，止血功效低。而本發(fā)明中的預(yù)凍方法為按照設(shè)定的降溫規(guī)律進行程序冷凍，冰晶的形成比較規(guī)律，當(dāng)溫度下降到一定程度時，首先形成許多晶核，隨著溫度繼續(xù)下降，周圍小液滴吸附到這些晶核表面后結(jié)晶，由于溫度下降的速度恒定且一致，所有晶核的生長速率非常接近，最終形成形狀大小接近的冰晶，凍干后得到大小接近的孔徑，得到的體內(nèi)止血敷料表面平整，孔徑均一，機械強度大，在止血過程中不易被血流沖破而導(dǎo)致二次出血，大大提高了海綿的止血效果。

此外，對程序冷凍儀的降溫速率進行深入的研究，如果降溫速率大于10oC/min，溫度跳躍就會比較大，其冰晶的形成必然受到一定的影響，如果降溫速率小于3oC/min，富集在晶核上的液滴不能被快速的冷凍而有流動的可能，這樣所有的晶體大小形狀也都不規(guī)則。本發(fā)明的研究降溫速率控制在4-8℃/min，得到的材料物化性能和止血效果最佳。

實施例1

將類人膠原蛋白溶解于注射用水中，溶解后，加入谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶，攪拌使其完全溶解，使混合溶液中的類人膠原蛋白的質(zhì)量濃度為2.0%，谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶的質(zhì)量為4U每克蛋白，置于-4℃冰箱交聯(lián)反應(yīng)24 h，于程序冷凍儀中以-4℃/min的速度凍至-80℃，并保持2 h，迅速轉(zhuǎn)移至真空冷凍干燥機中凍干24 h，取出封裝進行Co60輻照滅菌24 h，獲得體內(nèi)止血敷料。制備的海綿孔隙率為92%，吸水率為1500%。

實施例2

將類人膠原蛋白溶解于注射用水中，溶解后，加入谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶，攪拌使其完全溶解，使混合溶液中的類人膠原蛋白的質(zhì)量濃度為2.5%，谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶的質(zhì)量為4U每克蛋白，置于-4℃冰箱交聯(lián)反應(yīng)30 h，于程序冷凍儀中以-4℃/min的速度凍至-80℃，并保持2 h，迅速轉(zhuǎn)移至真空冷凍干燥機中凍干30 h，取出封裝進行Co60輻照滅菌24 h，獲得體內(nèi)止血敷料。

實施例3

將類人膠原蛋白溶解于注射用水中，溶解后，加入谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶，攪拌使其完全溶解，使混合溶液中的類人膠原蛋白的質(zhì)量濃度為4.0%，谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶的質(zhì)量為6U每克蛋白，置于-4℃冰箱交聯(lián)反應(yīng)40 h，于程序冷凍儀中以-6℃/min的速度凍至-80℃，并保持2 h，迅速轉(zhuǎn)移至真空冷凍干燥機中凍干48 h，取出封裝進行Co60輻照滅菌24 h，獲得體內(nèi)止血敷料。

實施例4

將類人膠原蛋白溶解于注射用水中，溶解后，加入谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶，攪拌使其完全溶解，使混合溶液中的類人膠原蛋白的質(zhì)量濃度為5.0%，谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶的質(zhì)量為8U每克蛋白，置于-4℃冰箱交聯(lián)反應(yīng)48 h，于程序冷凍儀中以-8℃/min的速度凍至-80℃，并保持2 h，迅速轉(zhuǎn)移至真空冷凍干燥機中凍干48 h，取出封裝進行Co60輻照滅菌24 h，獲得體內(nèi)止血敷料。

實施例5

以下為本發(fā)明實施例1所制備的體內(nèi)止血敷料的相關(guān)性能測試：

1.體內(nèi)止血敷料外觀觀察

圖1中，a為控制降溫幅度預(yù)凍的酶法交聯(lián)類人膠原蛋白止血敷料的樣品外觀圖，b為超低溫冰箱自然預(yù)凍的酶法交聯(lián)類人膠原蛋白止血敷料的樣品外觀圖。從圖中可以看出相比于超低溫冰箱直接預(yù)凍的體內(nèi)止血敷料，采用程序降溫預(yù)凍的體內(nèi)止血敷料表面更加平整和均勻，褶皺也較少。

2. 體內(nèi)止血敷料掃描電鏡觀察

圖2中，a為控制降溫幅度預(yù)凍的酶法交聯(lián)類人膠原蛋白止血敷料的表面掃描電鏡圖，b為超低溫冰箱自然預(yù)凍的酶法交聯(lián)類人膠原蛋白止血敷料的表面掃描電鏡圖。從圖中可以看出相比于超低溫冰箱直接預(yù)凍的體內(nèi)止血敷料，采用控制降溫幅度預(yù)凍的體內(nèi)止血敷料形成的孔比較完整，而且大小均勻，可以有效的增加敷料與創(chuàng)面的接觸面積，提高止血效果。

3.體內(nèi)止血敷料止血效果的測定

兔耳止血：以新西蘭大白兔為動物止血模型，預(yù)先配好的2.5%戊巴比妥鈉2mL緩慢注射于耳靜脈，待兔子麻醉后將其固定在手術(shù)臺上，使用彎剪剪去兔中央動脈出的兔毛，然后用安爾碘消毒液在兔耳部要做創(chuàng)面的地方進行消毒，用75%的酒精反復(fù)擦洗而脫掉碘液顏色，然后用手術(shù)刀片將耳部中央動脈切斷，并將做的創(chuàng)面表皮撕下。動脈血大量流出時，快速用無菌醫(yī)用紗布吸去，然后快速將提前準(zhǔn)備好的一定大小海綿敷壓于切好的創(chuàng)面，并用手按壓止血。同時觀察海綿在創(chuàng)面的粘附情況，記錄完全止血時間，并對表面進行拍照。

兔肝臟止血：預(yù)先配好的2.5%戊巴比妥鈉2mL緩慢注射于耳靜脈，待麻醉后將其固定在手術(shù)臺上，采用手術(shù)刀片將兔腹部打開，直到肝臟暴露出來，用刀片在肝葉上做一個同樣大小的創(chuàng)面，大量的血液外流時，先用醫(yī)用無菌紗布吸收，然后快速使用準(zhǔn)備好的膠原蛋白海綿敷壓創(chuàng)面，并用手按壓止血，同時觀察海綿在創(chuàng)面的粘附情況，記錄完全止血時間，并對肝臟表面進行拍照。

圖3中，a為控制降溫幅度預(yù)凍的酶法交聯(lián)類人膠原蛋白止血敷料的兔耳止血圖，b為超低溫冰箱自然預(yù)凍的熱交聯(lián)類人膠原蛋白止血敷料的兔耳止血。圖4中，a為控制降溫幅度預(yù)凍的酶法交聯(lián)類人膠原蛋白止血敷料的兔子肝臟止血圖， b為超低溫冰箱自然預(yù)凍的酶法交聯(lián)類人膠原蛋白止血敷料的兔子肝臟止血圖。經(jīng)測定采用程序降溫預(yù)凍的體內(nèi)止血敷料的兔耳完全止血時間約為56s，肝臟完全止血時間為44s。從圖中可以看出相比于超低溫冰箱直接預(yù)凍的體內(nèi)止血敷料，采用控制降溫幅度預(yù)凍的體內(nèi)止血敷料的兔耳創(chuàng)面止血以及肝臟的止血速度均更快，止血效果更好，這是因為其表面的光滑平整結(jié)構(gòu)有利于其緊緊粘附于創(chuàng)面，內(nèi)部大小均勻的孔狀結(jié)構(gòu)有利于其與血液中血小板和凝血因子之間的作用，增強了體內(nèi)止血敷料的止血功效。

4. 體內(nèi)止血敷料的細胞毒性檢測

浸提液的制備方法：本實驗的所有操作均在生物安全柜內(nèi)完成。將滅菌過的海綿樣品以0.1g/mL的比例浸入RPMI1640培養(yǎng)液中，用封口膜封住并放置在37oC恒溫條件下浸提72±2 h，取出樣品后用0.2μm的無菌濾器過濾，以除去浸提液中的顆粒物質(zhì)。

細胞培養(yǎng)：將傳代后的BHK-21細胞經(jīng)過胰蛋白酶消化后，加入新鮮培養(yǎng)液，反復(fù)吹打使細胞均勻分布在培養(yǎng)液中，使用血細胞計數(shù)板在倒置顯微鏡下計數(shù)，將細胞懸浮液稀釋至10⁴~10⁵個細胞/mL，分別接種在96孔板上，每個孔100μL，并設(shè)置一組對照組。然后將接種好的96孔板置于37℃的CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，待細胞貼壁后，將原有培養(yǎng)液吸出，加入樣品浸提液，其中對照組和空白組中加入新鮮培養(yǎng)液，再放入生化培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

測定：分別于1, 3, 5和7天時取出一個孔板，每孔加入10μL的CCK-8液，37oC下繼續(xù)培養(yǎng)4h，使用酶標(biāo)儀測在450nm時的吸收值，通過下列計算相對增殖率（relative growth rate，RGR）：

RGR=A1/A2×100%

式中：A1：實驗組吸光度 A2：對照組吸光度

細胞毒性檢測使用CCK-8試劑盒進行。細胞毒性檢測試劑盒（Cell Counting Kit-8，CCK-8）是利用水溶性四唑鹽能夠被細胞內(nèi)線粒體中的脫氫酶還原成橙黃色的水溶性物質(zhì)Formazan的原理來檢測細胞的增殖的，生成Formazan的量與細胞的數(shù)量成正關(guān)系，即活細胞數(shù)量越多，顏色就越深，越少顏色就越淺，也就是對細胞的毒性越大，通過酶標(biāo)儀測定吸收值來間接分析細胞數(shù)量的變化。

圖5中顯示的是酶法交聯(lián)類人膠原蛋白止血敷料、熱交聯(lián)類人膠原蛋白止血敷料、酶法交聯(lián)動物膠原蛋白止血敷料和熱交聯(lián)動物膠原蛋白止血敷料浸提液對細胞生長的影響，從圖中可以看出酶法交聯(lián)動物膠原蛋白止血敷料和熱交聯(lián)動物膠原蛋白止血敷料的細胞毒性評價為2級，而酶法交聯(lián)類人膠原蛋白止血敷料和熱交聯(lián)類人膠原蛋白止血敷料的細胞毒性評價為1級，并且隨著細胞培養(yǎng)時間天數(shù)的增加，細胞存活率也隨之升高，這說明本發(fā)明制備的體內(nèi)止血敷料無病毒隱患，安全性高，生物相容性好，有促進細胞生長的作用，符合生物醫(yī)用材料的要求。

5. 體內(nèi)止血敷料的皮下植入

首先使用2.5%的麻醉劑在新西蘭兔耳靜脈注射2mL，然后將其固定在手術(shù)臺上，四塊手術(shù)布遮住其他地方只露出背部要植入的地方，用安爾碘對兔背部皮膚進行消毒，用75%酒精對手消毒。輕輕的用手夾起背部皮膚，然后用手術(shù)刀片輕輕的劃開一個長約10mm的小口，切口時，需要小心觀察兔子背部的毛細血管并避開，然后用鑷子夾起預(yù)先準(zhǔn)備好的樣品止血材料，放入皮下，注意盡量與切口保持至少5mm，再進行切口縫合，縫合之后用安爾碘再次涂抹手術(shù)傷口消毒。一周后，將新西蘭兔處死，觀察兔內(nèi)側(cè)皮膚是否出現(xiàn)紅腫、化膿以及潰爛等現(xiàn)象，來評價止血材料在生物體內(nèi)的生物相容性。

圖6中，a為1周后酶法交聯(lián)類人膠原蛋白止血敷料的皮下植入圖， b為酶法交聯(lián)動物膠原蛋白止血敷料的皮下植入圖。從圖中可以看出，動物膠原蛋白體內(nèi)止血敷料的皮下植入組織周圍有明顯的紅腫及化膿現(xiàn)象，而類人膠原蛋白體內(nèi)止血敷料的皮下植入組織周圍沒有出現(xiàn)紅腫、化膿和潰爛等現(xiàn)象，說明本發(fā)明體內(nèi)止血敷料無病毒隱患和生物排異性，安全性高，生物相容性好，是一種良好的生物醫(yī)用止血材料。

本發(fā)明的內(nèi)容不限于實施例所列舉，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通過閱讀本發(fā)明說明書而對本發(fā)明技術(shù)方案采取的任何等效的變換，均為本發(fā)明的權(quán)利要求所涵蓋。