本公開涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體地涉及制備位點(diǎn)特異性蛋白質(zhì)-聚氨基酸環(huán)狀偶聯(lián)物的方法。
背景技術(shù)：
：蛋白質(zhì)藥物(如抗體、干擾素)已經(jīng)廣泛用于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，如靶向治療、臨床診斷等。相比于其他藥物，蛋白質(zhì)藥物特異性較好，見效快，毒性低。然而，其穩(wěn)定性差、血液循環(huán)時間短等缺點(diǎn)在一定程度上限制了此類藥物的藥效和應(yīng)用。目前，研究較多的提高蛋白質(zhì)穩(wěn)定性，延長其血液循環(huán)時間的體系是蛋白質(zhì)-高分子雜化體系。蛋白質(zhì)藥物往往由于體內(nèi)蛋白酶的降解致使其血液循環(huán)時間比較短暫，因此將水溶性較好的高分子材料接枝在蛋白質(zhì)表面，對蛋白質(zhì)有一定的保護(hù)作用，既可降低蛋白質(zhì)的免疫原性，也可以降低蛋白酶對蛋白質(zhì)類藥物的降解以延長其血液循環(huán)時間。舉例而言，干擾素-α2a是治療慢性丙型肝炎的藥物，在其表面接枝一條40kda的聚乙二醇鏈將會顯著延長其血液循環(huán)時間，干擾素-α2a-聚乙二醇雜化材料已應(yīng)用于臨床。然而，目前臨床中已應(yīng)用的蛋白質(zhì)-高分子雜化體系中主要使用聚乙二醇作為高分子片段。聚乙二醇具有免疫原性低、水溶性好等優(yōu)點(diǎn)，但隨著聚乙二醇在化妝品、食品、制藥等領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用，大部分人的體內(nèi)已產(chǎn)生聚乙二醇抗體，反而會加速聚乙二醇修飾的蛋白質(zhì)類藥物在血液中的清除。更嚴(yán)重的是聚乙二醇在人體內(nèi)不可降解，長期服用則會導(dǎo)致積累毒性。因此，尋找可降解、生物相容性好的高分子材料迫在眉睫。聚氨基酸是一類具有良好生物相容性的高分子材料，其主鏈的可降解性及側(cè)鏈的修飾便利性都使得它在蛋白質(zhì)改性方面具有廣泛的應(yīng)用。更重要的是聚氨基酸具有多肽主鏈結(jié)構(gòu)、生物相容性好、免疫原性低等特點(diǎn)，非常適合用于蛋白質(zhì)藥物的修飾。由此，本公開了提供了一種蛋白質(zhì)-聚氨基酸偶聯(lián)物及一種蛋白質(zhì)-聚氨基酸環(huán)狀偶聯(lián)物以克服本領(lǐng)域尚存在的不足之處。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：在本公開的一方面，提供了制備位點(diǎn)特異性蛋白質(zhì)-聚氨基酸環(huán)狀偶聯(lián)物的方法，包括：(1)利用引發(fā)劑引發(fā)n-羧基內(nèi)酸酐和甘氨酸的n-羧基內(nèi)酸酐聚合，得到c端具有苯基硫酯結(jié)構(gòu)、n端具有聚甘氨酸嵌段結(jié)構(gòu)的嵌段聚氨基酸；(2)將所得到的嵌段聚氨基酸與n端半胱氨酸、c端具有l(wèi)pxatg序列的蛋白質(zhì)混合，連續(xù)發(fā)生自然化學(xué)連接反應(yīng)和轉(zhuǎn)肽酶反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的環(huán)化，其中xa為任一氨基酸。根據(jù)本公開的一實(shí)施方案，在步驟(1)中，利用引發(fā)劑r5xy引發(fā)n-羧基內(nèi)酸酐和甘氨酸的n-羧基內(nèi)酸酐聚合，得到c端具有苯基硫酯結(jié)構(gòu)、n端具有聚甘氨酸嵌段結(jié)構(gòu)的嵌段聚氨基酸，如下所示：x表示硫或硒；y代表氫或三烷基硅基，其中三烷基硅基中的烷基為c1-c10烷基；r1每次出現(xiàn)時獨(dú)立地表示天然氨基酸側(cè)鏈或非天然氨基酸側(cè)鏈；r5表示取代或未取代的c1-c30烷基、取代或未取代的c2-c30烯基、取代或未取代的c2-c30炔基、取代或未取代的c3-c30環(huán)烷基、取代或未取代的c3-c30環(huán)烯基、取代或未取代的c1-c30雜烷基、取代或未取代的c2-c30雜烯基、取代或未取代的c2-c30雜炔基、取代或未取代的c1-c30雜環(huán)烷基、取代或未取代的c2-c30雜環(huán)烯基、取代或未取代的c6-c30芳基、取代或未取代的c5-c30雜芳基；n為選自10至200的整數(shù)；以及m為選自1至30的整數(shù)。根據(jù)本公開的又一實(shí)施方案，在步驟(1)中，利用引發(fā)劑r5xy引發(fā)n-羧基內(nèi)酸酐和另一種n-羧基內(nèi)酸酐聚合，得到c端具有苯基硫酯結(jié)構(gòu)、n端具有聚甘氨酸嵌段結(jié)構(gòu)的嵌段聚氨基酸，如下所示：其中：x表示硫或硒；y代表氫或三烷基硅基，其中三烷基硅基中的烷基為c1-c10烷基；r1每次出現(xiàn)時獨(dú)立地表示天然氨基酸側(cè)鏈或非天然氨基酸側(cè)鏈；r2每次出現(xiàn)時獨(dú)立地表示氫或c1-c10烷基、c2-c10烯基、c2-c10炔基；r5表示取代或未取代的c1-c30烷基、取代或未取代的c2-c30烯基、取代或未取代的c2-c30炔基、取代或未取代的c3-c30環(huán)烷基、取代或未取代的c3-c30環(huán)烯基、取代或未取代的c1-c30雜烷基、取代或未取代的c2-c30雜烯基、取代或未取代的c2-c30雜炔基、取代或未取代的c1-c30雜環(huán)烷基、取代或未取代的c2-c30雜環(huán)烯基、取代或未取代的c6-c30芳基、取代或未取代的c5-c30雜芳基；n為選自10至200的整數(shù)；以及m為選自1至30的整數(shù)。根據(jù)本公開的一實(shí)施方案，r5xy為三甲基硅基苯硫酚或三甲基硅基苯硒酚。根據(jù)本公開的又一實(shí)施方案，步驟(1)在非質(zhì)子性溶劑中且在室溫下進(jìn)行。根據(jù)本公開的再一實(shí)施方案，對步驟(1)中所得的聚氨基酸進(jìn)行后修飾，所述后修飾包括將所得的聚氨基酸與調(diào)節(jié)劑混合并在紫外燈照射下反應(yīng)，所述調(diào)節(jié)劑為巰基乙胺鹽酸鹽或巰基丙酸。根據(jù)本公開的一實(shí)施方案，在步驟(2)中，將步驟(1)得到的嵌段聚氨基酸與n端半胱氨酸、c端具有l(wèi)pxatg序列的蛋白質(zhì)混合，所述嵌段聚氨基酸與所述蛋白質(zhì)的氮端半胱氨酸發(fā)生連接反應(yīng)，然后在轉(zhuǎn)肽酶的作用下實(shí)現(xiàn)環(huán)化，如下所示：其中l(wèi)pxatg序列是轉(zhuǎn)肽酶的識別位點(diǎn)。在本公開的又一方面，提供了由上述方法制備的蛋白質(zhì)-聚氨基酸環(huán)狀偶聯(lián)物。在本公開的另一方面，提供了由上述方法制備的蛋白質(zhì)-聚氨基酸環(huán)狀偶聯(lián)物在制造蛋白質(zhì)類藥物中的用途。附圖說明在下文參考附圖來進(jìn)一步描述本文所例示的實(shí)施方案，但是所述附圖僅僅是為了讓本領(lǐng)域技術(shù)人員更好地理解本公開內(nèi)容，而不旨在限定該公開內(nèi)容的范圍。圖1為根據(jù)本公開一實(shí)施方案的位點(diǎn)特異性蛋白質(zhì)-聚氨基酸偶聯(lián)物示意圖；圖2為根據(jù)本公開一實(shí)施方案的蛋白質(zhì)-聚氨基酸環(huán)化反應(yīng)示意圖；圖3為根據(jù)實(shí)施例1的聚氨基酸p1的maldi-tof譜圖；圖4為根據(jù)實(shí)施例15的環(huán)狀偶聯(lián)物maldi-tof譜圖，其中o表示l-谷氨酸(乙二醇)3酯鏈段，g表示甘氨酸鏈段，角標(biāo)表示相應(yīng)鏈段的聚合度；圖5為根據(jù)實(shí)施例16的enlyfq-cys-egfp蛋白的uplc-ms譜圖；圖6為根據(jù)實(shí)施例18的cys-egfp蛋白的uplc-ms譜圖；圖7為根據(jù)實(shí)施例19的聚氨基酸p1(n＝7)-增強(qiáng)型綠色熒光蛋白偶聯(lián)物的電泳圖，其示出變性膠蛋白質(zhì)凝膠電泳(a)及非變性膠蛋白質(zhì)凝膠電泳(b)；圖8為根據(jù)實(shí)施例20的enlyfqc-增強(qiáng)型綠色熒光蛋白-聚乙二醇-聚甘氨酸偶聯(lián)物的電泳圖，其示出變性膠蛋白質(zhì)凝膠電泳(a)及非變性膠蛋白質(zhì)凝膠電泳(b)；圖9為根據(jù)實(shí)施例21的聚氨基酸p1(n＝7)-增強(qiáng)型綠色熒光蛋白-聚甘氨酸-聚乙二醇節(jié)點(diǎn)狀偶聯(lián)物的電泳圖，其示出變性膠蛋白質(zhì)凝膠電泳(a)及非變性膠蛋白質(zhì)凝膠電泳(b)；圖10為根據(jù)實(shí)施例22的增強(qiáng)型綠色熒光蛋白-聚氨基酸p2(n＝7,m＝3)-干擾素α啞鈴狀偶聯(lián)物的電泳圖，其示出變性膠蛋白質(zhì)凝膠電泳(a)及非變性膠蛋白質(zhì)凝膠電泳(b)；圖11為根據(jù)實(shí)施例23的環(huán)狀(增強(qiáng)型綠色熒光蛋白-聚氨基酸p2(n＝7,m＝3))偶聯(lián)物的表征：maldi-tof(a)，變性膠蛋白質(zhì)凝膠電泳(b)及免疫印跡分析(c)；圖12為根據(jù)實(shí)施例24的cys-增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(a)、聚氨基酸p2(n＝7,m＝3)-增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(b)和環(huán)狀(增強(qiáng)型綠色熒光蛋白-聚氨基酸p2(n＝7,m＝3))偶聯(lián)物(c)酶穩(wěn)定性的表征：圖a、b和c內(nèi)的方框?yàn)榈鞍踪|(zhì)或蛋白質(zhì)-聚氨基酸偶聯(lián)物原料；圖13為根據(jù)實(shí)施例26的蛋白-干擾素的uplc-ms譜圖；圖14為根據(jù)實(shí)施例27和28的聚氨基酸偶聯(lián)物的電泳圖；圖15為根據(jù)實(shí)施例29的環(huán)狀(聚氨基酸p2(n＝7或20,m＝3)-干擾素α-lpetgleh6)偶聯(lián)物的表征：a.環(huán)狀(聚氨基酸p2(n＝7,m＝3)-干擾素α-lpetgleh6)偶聯(lián)物的變性膠凝膠電泳；b.環(huán)狀(聚氨基酸p2(n＝7,m＝3)-干擾素α-lpetgleh6)偶聯(lián)物的免疫印跡分析；c.環(huán)狀(聚氨基酸p2(n＝20,m＝3)-干擾素α-lpetgleh6)偶聯(lián)物的變性膠凝膠電泳；d.環(huán)狀(聚氨基酸p2(n＝20,m＝3)-干擾素α-lpetgleh6)偶聯(lián)物的免疫印跡分析；圖16為示出根據(jù)實(shí)施例30的各蛋白質(zhì)樣品的tm值的柱形圖；圖17為示出根據(jù)實(shí)施例31的胰蛋白酶耐受性測試的結(jié)果的圖表；圖18為根據(jù)實(shí)施例32的wt-ifnα，聚氨基酸p1(n＝100,l型)-ifnα偶聯(lián)物與聚氨基酸p1(n＝100,d,l型)-ifnα偶聯(lián)物的圓二色譜表征；圖19為示出根據(jù)實(shí)施例34的聚氨基酸-干擾素偶聯(lián)物的血藥濃度的圖表；圖20a和b為示出根據(jù)實(shí)施例35的聚氨基酸-偶聯(lián)物與環(huán)狀聚氨基酸-偶聯(lián)物的體內(nèi)抗腫瘤活性的圖表；圖21為根據(jù)實(shí)施例37的聚氨基酸-抗體偶聯(lián)物的電泳圖。具體實(shí)施方式在下文中，將根據(jù)具體實(shí)施方案來進(jìn)一步闡述本公開的內(nèi)容。然而，所列舉的具體實(shí)施方案僅出于例示目的，而并不旨在限制本公開的內(nèi)容。本領(lǐng)域技術(shù)人員會認(rèn)識到，以下任一實(shí)施方案中的具體特征可以用于任何其他實(shí)施方案，只要其不背離本公開的主旨即可。定義在下文中，除非另外定義，本文使用的所有術(shù)語(包括技術(shù)術(shù)語和科學(xué)術(shù)語)均具有如本公開所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的相同含義。術(shù)語，諸如在常用詞典中定義的那些術(shù)語，應(yīng)解釋為具有與其在相關(guān)技術(shù)的上下文中的含義相符的含義，并且不會以理想化或過于正式的含義來解釋，除非本文明確如此定義。如本文所用，術(shù)語“c1-30”是指基團(tuán)的主鏈中具有1至30的范圍內(nèi)的任意整數(shù)值的碳原子，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、18、20、30個碳原子。如本文所用，術(shù)語“烷基”是指具有直鏈或支鏈的飽和脂肪族烴基。其非限制性實(shí)例包括甲基、乙基、丙基、正丁基、叔丁基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基等。如本文所用，術(shù)語“烯基”是指在沿著烷基的碳鏈的一個或多個位置處具有至少一個碳-碳雙鍵的烴基。其非限制性實(shí)例包括乙烯基、丙烯基、丁烯基等。如本文所用，術(shù)語“炔基”是指在沿著烷基的碳鏈的一個或多個位置處具有至少一個碳-碳叁鍵的烴基。其非限制性實(shí)例包括乙炔基、丙炔基等。如本文所用，術(shù)語“雜烷基”、“雜烯基”、“雜炔基”分別是指包含至少一個選自n、o、si、p和s的雜原子的烷基、烯基、炔基。如本文所用，術(shù)語“環(huán)烷基”是指單環(huán)飽和烴基。其非限制性實(shí)例包括環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基、環(huán)己基和環(huán)庚基。如本文所用，術(shù)語“雜環(huán)烷基”是指包含作為成環(huán)原子的至少一個選自n、o、si、p和s的雜原子的單碳環(huán)基團(tuán)。其非限制性實(shí)例包括四氫呋喃基和四氫噻吩基。如本文所用，術(shù)語“環(huán)烯基”是指在其環(huán)中具有碳原子和至少一個雙鍵的單環(huán)基團(tuán)，而且其不是芳香族的。其非限制性實(shí)例包括環(huán)戊烯基、環(huán)己烯基和環(huán)庚烯基。如本文所用，術(shù)語“雜環(huán)烯基”是指在其環(huán)中包括作為成環(huán)原子的至少一個選自n、o、si、p和s的雜原子和至少一個雙鍵的單碳環(huán)基團(tuán)。其非限制性實(shí)例包括4,5-二氫-1,2,3,4-噁三唑基、2,3-二氫呋喃基和2,3-二氫噻吩基。如本文所用，術(shù)語“芳基”是指包含碳環(huán)芳香族體系的基團(tuán)。其非限制性實(shí)例包括苯基、萘基、蒽基、菲基、芘基等。當(dāng)芳基包括多個環(huán)時，各自的環(huán)可以彼此稠合。如本文所用，術(shù)語“雜芳基”是指具有包含作為成環(huán)原子的至少一個選自n、o、si、p和s的雜原子的碳環(huán)芳香族體系的基團(tuán)。其非限制性實(shí)例包括吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、噠嗪基、三嗪基、喹啉基、異喹啉基等。當(dāng)雜芳基包括多個環(huán)時，各自的環(huán)可以彼此稠合。蛋白質(zhì)-聚氨基酸偶聯(lián)物在本公開的一實(shí)施方案，提供了蛋白質(zhì)-聚氨基酸偶聯(lián)物，其具有如通式1表示的結(jié)構(gòu)：其中：ptn表示蛋白質(zhì)；et當(dāng)與ptn的n端連接時，為而當(dāng)與ptn的除n端之外的位點(diǎn)連接時，為r1每次出現(xiàn)時獨(dú)立地表示天然氨基酸側(cè)鏈或非天然氨基酸側(cè)鏈；r2每次出現(xiàn)時獨(dú)立地表示氫或c1-c10烷基、c2-c10烯基、c2-c10炔基；n為選自1至300的整數(shù)。根據(jù)本公開的一實(shí)施方案，ptn是選自酶、激素、細(xì)胞因子、單克隆抗體和/或蛋白質(zhì)疫苗的蛋白質(zhì)。根據(jù)本公開的另一實(shí)施方案，ptn是蛋白質(zhì)類藥物，如多肽激素、單克隆抗體、干擾素、白介素、集落刺激因子、重組疫苗等。根據(jù)本公開的另一實(shí)施方案，ptn是干擾素α2b。可適用于本文的蛋白類藥物不受特別的限制，只要其能夠與et連接基團(tuán)連接即可。理論上，任何蛋白質(zhì)類藥物經(jīng)修飾后均可適用于本文。根據(jù)本公開的一實(shí)施方案，可用于本公開的酶包括但不限于：蛋白水解酶、淀粉酶、脂肪酶、纖維素酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、鏈激酶、尿激酶、纖溶酶、凝血酶、谷氨酰胺酶、精氨酸酶、絲氨酸脫水酶、苯丙氨酸氨解酶、亮氨酸脫氫酶、青霉素酶、超氧化物歧化酶、葡聚糖酶和/或右旋糖酐酶。根據(jù)本公開的一實(shí)施方案，可用于本公開的激素包括但不限于下丘腦激素、垂體激素、胃腸激素、胰島素、降鈣素。根據(jù)本公開的一實(shí)施方案，可用于本公開的細(xì)胞因子包括但不限于白細(xì)胞介素、干擾素、集落刺激因子、趨化因子和/或生長因子。根據(jù)本公開的一實(shí)施方案，可用于本公開的白細(xì)胞介素包括il-1、il-2、il-3、il-4、il-5、il-6、il-7、il-8、il-9、il-10、il-11、il-12、il-13、il-14、il-15、il-16、il-17、il-18、il-19、il-20、il-21、il-22、il-23、il-24、il-25、il-26、il-27、il-28、il-29、il-30、il-31和/或il-32。根據(jù)本公開的一實(shí)施方案，可用于本公開的干擾素包括但不限于ifn-α、ifn-β、ifn-γα、ifn-λ及其亞型。根據(jù)本公開的一實(shí)施方案，可用于本公開的集落刺激因子包括但不限于：粒細(xì)胞集落刺激因子、巨噬細(xì)胞集落刺激因子、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子、多能集落刺激因子、干細(xì)胞因子、白血病抑制因子和/或紅細(xì)胞生成素。根據(jù)本公開的一實(shí)施方案，可用于本公開的生長因子包括但不限于表皮細(xì)胞生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子、胰島素樣生長因子和/或神經(jīng)生長因子。根據(jù)本公開的一實(shí)施方案，可用于本公開的單克隆抗體包括但不限于：曲妥珠單抗、西妥昔單抗、達(dá)利珠單抗、他尼珠單抗、阿巴伏單抗、阿德木單抗、阿夫土珠單抗、阿侖單抗、培化阿珠單抗、阿麥妥昔單抗、阿泊珠單抗、巴維昔單抗、貝妥莫單抗、貝利木單抗、貝伐單抗、莫-比伐珠單抗、貝倫妥單抗-維多汀、莫-坎妥珠單抗、拉-坎妥珠單抗、卡羅單抗-噴地肽、卡妥索單抗、泊-西他珠單抗、西妥木單抗、可那木單抗、達(dá)西珠單抗、達(dá)洛珠單抗、地莫單抗、依美昔單抗、依決洛單抗、依洛珠單抗、恩司昔單抗、依帕珠單抗、厄馬索單抗、埃達(dá)珠單抗、法勒珠單抗、芬妥木單抗、加利昔單抗、吉妥珠單抗、吉妥珠單抗、吉瑞昔單抗、格萊木單抗-維多汀、替-伊莫單抗、伊戈伏單抗、拉-英達(dá)西單抗、英妥木單抗、伊珠單抗-奧佐米星、伊匹木單抗、伊妥木單抗、拉貝珠單抗、來沙木單抗、林妥珠單抗、莫-洛伏珠單抗、魯卡木單抗、魯昔單抗、馬帕木單抗、馬妥珠單抗、米拉珠單抗、米妥莫單抗、莫加珠單抗、他那可單抗、他那莫單抗、奈昔木單抗、尼妥珠單抗、納武單抗、奧法木單抗、奧納珠單抗、莫-奧珠單抗、奧戈伏單抗、帕尼單抗、帕曲土單抗、培妥珠單抗、普立木單抗、雷妥莫單抗、雷莫蘆單抗、利妥木單抗、利妥昔單抗、羅妥木單抗、奧馬珠單抗、西羅珠單抗、司妥昔單抗、帕-他莫單抗、替妥莫單抗、替妥木單抗、替西木單抗、曲美木單抗、替加珠單抗、托西莫單抗、西莫白介素單抗、烏瑞魯單抗、維妥珠單抗、伏洛昔單抗、伏妥莫單抗和扎蘆木單抗，包括其抗原結(jié)合片段。根據(jù)本公開的一實(shí)施方案，可用于本公開的蛋白質(zhì)疫苗包括但不限于白喉類毒素、破傷風(fēng)類毒素、炭疽分泌蛋白疫苗和/或乙型肝炎血源疫苗。根據(jù)本公開的一實(shí)施方案，r1每次出現(xiàn)時表示天然氨基酸側(cè)鏈，所述天然氨基酸選自甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、賴氨酸、精氨酸或組氨酸。根據(jù)本公開的另一實(shí)施方案，r1每次出現(xiàn)時表示非天然氨基酸側(cè)鏈，如經(jīng)人工修飾的上述天然氨基酸。根據(jù)本公開的又一實(shí)施方案，r1每次出現(xiàn)時表示經(jīng)寡聚乙二醇(聚合度為2-10，如二縮三乙二醇，oeg3)修飾、磷酸酯修飾、丙烯氧基芐酯修飾、烯丙基二縮三乙二醇修飾的酪氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸和/或谷氨酸的側(cè)鏈。根據(jù)本公開的再一實(shí)施方案，r1每次出現(xiàn)時表示經(jīng)二縮三乙二醇(oeg3)修飾的酪氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸和/或谷氨酸的側(cè)鏈。本文對r1沒有特別的限制，理論上，任何天然氨基酸可以直接地用于本公開的偶聯(lián)物，或者經(jīng)修飾后，再用于本公開的偶聯(lián)物，以便改善穩(wěn)定性。根據(jù)本公開的一實(shí)施方案，r2每次出現(xiàn)時表示氫或c1-c10烷基。根據(jù)本公開的另一實(shí)施方案，r2每次出現(xiàn)時表示氫、甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、叔丁基、戊基、己基。根據(jù)本公開的又一實(shí)施方案，r2表示氫或甲基。根據(jù)本公開的一實(shí)施方案，n表示選自1至200的整數(shù)。根據(jù)本公開的另一實(shí)施方案，n表示選自1至150的整數(shù)。根據(jù)本公開的又一實(shí)施方案，n表示選自1至100的整數(shù)。根據(jù)本公開的再一實(shí)施方案，n表示選自1至50的整數(shù)。在理論上，n可以為任何數(shù)值，只要所得的偶聯(lián)物穩(wěn)定存在即可，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)實(shí)際應(yīng)用，設(shè)定具體的n值，而且，這種選擇應(yīng)在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力范圍內(nèi)。根據(jù)本公開的一實(shí)施方案，提供了蛋白質(zhì)-聚氨基酸偶聯(lián)物，其具有如通式2表示的結(jié)構(gòu)：其中：ptn、et、r1和r2如上文對通式1所定義；n為選自1至200的整數(shù)；以及m為選自1至30的整數(shù)。根據(jù)本公開的一實(shí)施方案，n表示選自1至150的整數(shù)。根據(jù)本公開的另一實(shí)施方案，n表示選自1至100的整數(shù)。根據(jù)本公開的又一實(shí)施方案，n表示選自1至50的整數(shù)。根據(jù)本公開的一實(shí)施方案，m表示選自1至20的整數(shù)。根據(jù)本公開的另一實(shí)施方案，m表示選自1至10的整數(shù)。如上所述，n值和m值可以為任何數(shù)值，并不局限于本文所列舉的特定范圍，條件是所得的偶聯(lián)物可以穩(wěn)定存在。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)實(shí)際應(yīng)用，設(shè)定具體的n值和m值，而且，這種選擇應(yīng)在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力范圍內(nèi)。蛋白質(zhì)-聚氨基酸環(huán)狀偶聯(lián)物根據(jù)本公開的一實(shí)施方案，提供了蛋白質(zhì)-聚氨基酸環(huán)狀偶聯(lián)物，其具有如通式3表示的結(jié)構(gòu)：其中：ptn表示蛋白質(zhì)，其具有n端處的半胱氨酸殘基和c端處的lpxat序列，其中xa表示一種或多種氨基酸；paa(gly)m為具有通式4表示的結(jié)構(gòu)：其中：r1每次出現(xiàn)時獨(dú)立地表示天然氨基酸側(cè)鏈或非天然氨基酸側(cè)鏈；r2每次出現(xiàn)時獨(dú)立地表示氫或c1-c10烷基、c2-c10烯基、c2-c10炔基；n為選自10至300的整數(shù)；以及m為選自1至30的整數(shù)。根據(jù)本公開的一實(shí)施方案，ptn是上文所述蛋白質(zhì)類藥物，其中所述蛋白質(zhì)類藥物具有n端處的半胱氨酸殘基和c端處的lpxat序列，或可以經(jīng)修飾而具有n端處的半胱氨酸殘基和c端處的lpxat序列。根據(jù)本公開的另一實(shí)施方案，ptn是n端處具有半胱氨酸殘基且c端處具有l(wèi)pxat序列的干擾素α2b。根據(jù)本公開的又一實(shí)施方案，ptn是具有氨基酸序列seqidno.1的蛋白質(zhì)。根據(jù)本公開的再一實(shí)施方案，ptn如上文關(guān)于通式1所述。根據(jù)本公開的一實(shí)施方案，r1每次出現(xiàn)時表示天然氨基酸側(cè)鏈，所述天然氨基酸選自甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、賴氨酸、精氨酸或組氨酸。根據(jù)本公開的另一實(shí)施方案，r1每次出現(xiàn)時表示非天然氨基酸側(cè)鏈，如經(jīng)人工修飾的上述天然氨基酸側(cè)鏈。根據(jù)本公開的又一實(shí)施方案，r1每次出現(xiàn)時表示經(jīng)寡聚乙二醇(聚合度為2-10，如二縮三乙二醇，oeg3)修飾、磷酸酯修飾、丙烯氧基芐酯修飾、烯丙基二縮三乙二醇修飾的酪氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸和/或谷氨酸側(cè)鏈。根據(jù)本公開的再一實(shí)施方案，r1每次出現(xiàn)時表示經(jīng)二縮三乙二醇(oeg3)修飾的酪氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸和/或谷氨酸側(cè)鏈。根據(jù)本公開的一實(shí)施方案，xa可以是選自甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、賴氨酸、精氨酸或組氨酸中的一種或多種。根據(jù)本公開的一實(shí)施方案，r2每次出現(xiàn)時表示氫或c1-c10烷基。根據(jù)本公開的另一實(shí)施方案，r2每次出現(xiàn)時表示氫、甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、叔丁基、戊基、新戊基、己基。根據(jù)本公開的又一實(shí)施方案，r2表示氫。根據(jù)本公開的一實(shí)施方案，n表示選自10至200的整數(shù)。根據(jù)本公開的另一實(shí)施方案，n表示選自10至150的整數(shù)。根據(jù)本公開的又一實(shí)施方案，n表示選自10至100的整數(shù)。根據(jù)本公開的再一實(shí)施方案，n表示選自10至50的整數(shù)。根據(jù)本公開的一實(shí)施方案，m表示選自1至20的整數(shù)。根據(jù)本公開的另一實(shí)施方案，m表示選自1至10的整數(shù)。如上所述，n值和m值可以為任何數(shù)值，并不局限于本文所列舉的特定范圍，條件是所得的偶聯(lián)物可以穩(wěn)定存在。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)實(shí)際應(yīng)用，設(shè)定具體的n值和m值，而且，這種選擇應(yīng)在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力范圍內(nèi)。用于蛋白(環(huán)化)偶聯(lián)的聚氨基酸根據(jù)本公開的一實(shí)施方案，提供了用于蛋白(環(huán)化)偶聯(lián)的聚氨基酸，其具有如通式5所示的結(jié)構(gòu)：其中：x表示硫或硒；r1每次出現(xiàn)時獨(dú)立地表示天然氨基酸側(cè)鏈或非天然氨基酸側(cè)鏈；r2每次出現(xiàn)時獨(dú)立地表示氫或c1-c10烷基、c2-c10烯基、c2-c10炔基；r5表示取代或未取代的c1-c30烷基、取代或未取代的c2-c30烯基、取代或未取代的c2-c30炔基、取代或未取代的c3-c30環(huán)烷基、取代或未取代的c3-c30環(huán)烯基、取代或未取代的c1-c30雜烷基、取代或未取代的c2-c30雜烯基、取代或未取代的c2-c30雜炔基、取代或未取代的c1-c30雜環(huán)烷基、取代或未取代的c2-c30雜環(huán)烯基、取代或未取代的c6-c30芳基、取代或未取代的c5-c30雜芳基；以及n為選自1至200的整數(shù)。根據(jù)本公開的一實(shí)施方案，r1每次出現(xiàn)時表示天然氨基酸側(cè)鏈，所述天然氨基酸選自甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、賴氨酸、精氨酸或組氨酸。根據(jù)本公開的另一實(shí)施方案，r1每次出現(xiàn)時表示非天然氨基酸側(cè)鏈，如經(jīng)人工修飾的上述天然氨基酸側(cè)鏈。根據(jù)本公開的又一實(shí)施方案，r1每次出現(xiàn)時表示經(jīng)寡聚乙二醇(聚合度為2-10，如二縮三乙二醇，oeg3)修飾、磷酸酯修飾、丙烯氧基芐酯修飾、烯丙基二縮三乙二醇修飾的酪氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸和/或谷氨酸側(cè)鏈。根據(jù)本公開的再一實(shí)施方案，r1每次出現(xiàn)時表示經(jīng)二縮三乙二醇(oeg3)修飾的酪氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸和/或谷氨酸側(cè)鏈。根據(jù)本公開的一實(shí)施方案，r2每次出現(xiàn)時表示氫或c1-c10烷基。根據(jù)本公開的另一實(shí)施方案，r2每次出現(xiàn)時表示氫、甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、叔丁基、戊基、新戊基、己基。根據(jù)本公開的又一實(shí)施方案，r2表示氫。根據(jù)本公開的一實(shí)施方案，r5表示取代或未取代的c1-c10烷基、取代或未取代的c2-c10烯基、取代或未取代的c2-c10炔基、取代或未取代的c3-c10環(huán)烷基、取代或未取代的c3-c10環(huán)烯基、取代或未取代的c1-c10雜烷基、取代或未取代的c2-c10雜烯基、取代或未取代的c1-c10雜環(huán)烷基、取代或未取代的c2-c10雜環(huán)烯基、取代或未取代的c6-c18芳基、取代或未取代的c5-c18雜芳基。根據(jù)本公開的另一實(shí)施方案，r5表示取代或未取代的c1-c10烷基、取代或未取代的c3-c10環(huán)烷基、取代或未取代的c1-c10雜烷基、取代或未取代的c1-c10雜環(huán)烷基、取代或未取代的c6-c18芳基、取代或未取代的c5-c18雜芳基。根據(jù)本公開的一實(shí)施方案，用于取代r5的取代基選自鹵素、鹵代c1-3烷基、羥基、氨基、巰基、羰基、羧基、磺酸基、羧酸鹽、磺酸鹽、酯基、酰胺和/或鹵素。根據(jù)本公開的另一實(shí)施方案，r5選自以下結(jié)構(gòu)式，但不限于此：根據(jù)本公開的又一實(shí)施方案，r5表示甲基、乙基、丙基、正丁基、叔丁基、戊基、己基、環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基、環(huán)己基、苯基。根據(jù)本公開的再一實(shí)施方案，r5表示苯基。根據(jù)本公開的一實(shí)施方案，n表示選自1至200的整數(shù)。根據(jù)本公開的另一實(shí)施方案，n表示選自1至150的整數(shù)。根據(jù)本公開的又一實(shí)施方案，n表示選自1至100的整數(shù)。根據(jù)本公開的再一實(shí)施方案，n表示選自1至50的整數(shù)。在理論上，n可以為任何數(shù)值，只要所得的聚氨基酸穩(wěn)定存在即可，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)實(shí)際應(yīng)用，設(shè)定具體的n值，而且，這種選擇應(yīng)在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力范圍內(nèi)。根據(jù)本公開的一實(shí)施方案，提供了用于蛋白(環(huán)化)偶聯(lián)的聚氨基酸，其具有如通式6所示的結(jié)構(gòu)：其中：x、r1、r2和r5如上文對通式5所定義；n為選自10至200的整數(shù)；m為選自1至30的整數(shù)。根據(jù)本公開的一實(shí)施方案，n表示選自10至150的整數(shù)。根據(jù)本公開的另一實(shí)施方案，n表示選自10至120的整數(shù)。根據(jù)本公開的又一實(shí)施方案，n表示選自10至100的整數(shù)。根據(jù)本公開的再一實(shí)施方案，n表示選自10至80的整數(shù)。根據(jù)本公開的其他實(shí)施方案，n表示選自10至50的整數(shù)。根據(jù)本公開的一實(shí)施方案，m表示選自1至20的整數(shù)。根據(jù)本公開的另一實(shí)施方案，m表示選自1至10的整數(shù)。如上所述，n值和m值可以為任何數(shù)值，并不局限于本文所列舉的特定范圍，條件是所得的偶聯(lián)物可以穩(wěn)定存在。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)實(shí)際應(yīng)用，設(shè)定具體的n值和m值，而且，這種選擇應(yīng)在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力范圍內(nèi)。制備蛋白質(zhì)-聚氨基酸偶聯(lián)物的方法根據(jù)本公開的一實(shí)施方案，提供了制備本文所述的位點(diǎn)特異性蛋白質(zhì)-聚氨基酸偶聯(lián)物的方法，包括：(1)利用引發(fā)劑引發(fā)n-羧基內(nèi)酸酐聚合，得到具有碳結(jié)構(gòu)的聚氨基酸；(2)將所得到的聚氨基酸與含有1,2-巰基乙胺結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)混合，發(fā)生自然化學(xué)連接反應(yīng)，得到位點(diǎn)特異性蛋白質(zhì)-聚氨基酸偶聯(lián)物。根據(jù)本公開的一實(shí)施方案，步驟(1)包括：利用引發(fā)劑(r5xy)引發(fā)n-羧基內(nèi)酸酐聚合，得到含有碳結(jié)構(gòu)的聚氨基酸(paa-xr5)，如下所示：其中：x、r1、r5和n如上文對通式5所定義；y代表氫或三烷基硅基，其中三烷基硅基中的烷基優(yōu)選為c1-c10烷基，如甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基等。根據(jù)本公開的另一實(shí)施方案，當(dāng)y為三烷基硅基時，所得的聚氨基酸的氮端處的三烷基硅基氨基甲酸酯結(jié)構(gòu)在遇到空氣中的水分時很容易脫去，因此最終得到的聚氨基酸氮端為氨基。根據(jù)本公開的又一實(shí)施方案，步驟(1)包括：利用引發(fā)劑(r5xy)引發(fā)n-羧基內(nèi)酸酐聚合，得到含有碳結(jié)構(gòu)的聚氨基酸(paa-xr5)，如下所示：其中：x、r1、r2、r5和n如上文對通式5所定義；y代表氫或三烷基硅基，其中三烷基硅基中的烷基優(yōu)選為c1-c10烷基，如甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基等。根據(jù)本公開的一實(shí)施方案，以r5xy為三甲基硅基苯硫酚或三甲基硅基苯硒酚為例，反應(yīng)式為：其中x、r1和n如上文對通式5所定義。根據(jù)本公開的一實(shí)施方案，在步驟(1)中，于非質(zhì)子性溶劑，例如二甲基甲酰胺(dmf)、四氫呋喃(thf)、二氯甲烷(dcm)等溶劑中進(jìn)行聚合。根據(jù)本公開的另一實(shí)施方案，反應(yīng)溫度通常為室溫(25℃)，反應(yīng)時間則視單體和所意欲的聚合度而定，從幾十分鐘到幾十小時不等，如20分鐘、40分鐘、1小時、10小時、15小時、20小時、25小時、30小時等。根據(jù)本公開的一實(shí)施方案，可以將由步驟(1)獲得的含有碳結(jié)構(gòu)的聚氨基酸進(jìn)行后修飾，包括：將所得的聚氨基酸與調(diào)節(jié)劑混合并反應(yīng)，由此得到經(jīng)后修飾的聚氨基酸。根據(jù)本公開的另一實(shí)施方案，所述調(diào)節(jié)劑為巰基乙胺鹽酸鹽或巰基丙酸。根據(jù)本公開的又一實(shí)施方案，所述后修飾過程可在紫外燈照射下反應(yīng)一段時間，例如1小時、3小時、5小時、10小時等，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)具體反應(yīng)進(jìn)程而定。根據(jù)本公開的其他實(shí)施方案，后修飾在溶液中進(jìn)行，例如含非質(zhì)子性溶劑的溶液，如二甲基甲酰胺(dmf)、四氫呋喃(thf)、二氯甲烷(dcm)等，而且，所述溶液還可以包含光敏劑，以促進(jìn)反應(yīng)進(jìn)行，例如安息香二甲醚(dmpa)等。根據(jù)本公開的一實(shí)施方案，步驟(2)包括：將步驟(1)中得到的聚氨基酸與含有1,2-巰基乙胺結(jié)構(gòu)(如n端半胱氨酸，或者在c端或其他任意位置插入含有1,2-巰基乙胺結(jié)構(gòu)的非天然氨基酸)的蛋白質(zhì)混合，室溫下發(fā)生自然化學(xué)連接(nativechemicalligation)反應(yīng)，得到位點(diǎn)特異性蛋白質(zhì)-聚氨基酸偶聯(lián)物，如下所示：其中ptn、r1、r2和n如上文對通式1所定義。根據(jù)本公開的另一實(shí)施方案，步驟(2)包括：將步驟(1)中得到的聚氨基酸與含有1,2-巰基乙胺結(jié)構(gòu)(如n端半胱氨酸，或者在c端或其他任意位置插入含有1,2-巰基乙胺結(jié)構(gòu)的非天然氨基酸)的蛋白質(zhì)混合，室溫下發(fā)生自然化學(xué)連接反應(yīng)，得到位點(diǎn)特異性蛋白質(zhì)-聚氨基酸偶聯(lián)物，如下所示：其中ptn、r1和n如上文對通式1所定義。根據(jù)本公開的一實(shí)施方案，在步驟(2)中采用ph為6.5-7.0反應(yīng)溶液，通常會加入還原劑tcep(三(2-羧乙基)膦)，但也不是必要的。上述方法利用r5xy引發(fā)一種n-羧基內(nèi)酸酐聚合，得到含有碳結(jié)構(gòu)的聚氨基酸paa-xr5，paa-xr5再與含有1,2-巰基乙胺結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)混合，室溫下發(fā)生自然化學(xué)連接反應(yīng)，得到位點(diǎn)特異的蛋白質(zhì)-聚氨基酸偶聯(lián)物。以三甲基硅基苯硫酚引發(fā)n-羧基內(nèi)酸酐聚合為例，該過程如圖1所示。通過標(biāo)準(zhǔn)的分子克隆方法可以在蛋白質(zhì)的n端插入半胱氨酸-甘氨酸(n末端為半胱氨酸殘基，甘氨酸殘基作為連接增加n端的靈活性)，或者利用tag和琥珀酰氨酰合成酶/trna的方法(參見文獻(xiàn)nguyen,d.p.；elliott,t.；holt,m.；muir,t.w.；chin,j.w.,geneticallyencoded1,2-aminothiolsfacilitaterapidandsite-specificproteinlabelingviaabio-orthogonalcyanobenzothiazolecondensation.jamchemsoc2011,133(30),11418-21.)插入側(cè)鏈帶有1,2-巰基乙胺結(jié)構(gòu)的非天然氨基酸，以進(jìn)行后續(xù)的位點(diǎn)特異的蛋白質(zhì)-聚氨基酸偶聯(lián)反應(yīng)。制備蛋白質(zhì)-聚氨基酸環(huán)狀偶聯(lián)物的方法根據(jù)本公開的一實(shí)施方案，提供了制備本文所述的位點(diǎn)特異性蛋白質(zhì)-聚氨基酸環(huán)狀偶聯(lián)物的方法，包括：(1)利用引發(fā)劑引發(fā)n-羧基內(nèi)酸酐和甘氨酸的n-羧基內(nèi)酸酐聚合，得到c端具有苯基硫酯結(jié)構(gòu)、n端具有聚甘氨酸嵌段結(jié)構(gòu)的嵌段聚氨基酸；(2)將所得到的嵌段聚氨基酸與n端半胱氨酸、c端具有l(wèi)pxatg序列的蛋白質(zhì)混合，連續(xù)發(fā)生自然化學(xué)連接反應(yīng)和轉(zhuǎn)肽酶反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的環(huán)化。根據(jù)本公開的一實(shí)施方案，步驟(1)包括：利用引發(fā)劑(r5xy)引發(fā)n-羧基內(nèi)酸酐和甘氨酸的n-羧基內(nèi)酸酐聚合，得到c端具有苯基硫酯結(jié)構(gòu)、n端具有聚甘氨酸嵌段結(jié)構(gòu)的嵌段聚氨基酸，如下所示：其中r1、r5、x、y、m和n如上文對通式6所定義。根據(jù)本公開的另一實(shí)施方案，步驟(1)包括：利用引發(fā)劑(r5xy)引發(fā)n-羧基內(nèi)酸酐和另一種n-羧基內(nèi)酸酐聚合，得到c端具有苯基硫酯結(jié)構(gòu)、n端具有聚甘氨酸嵌段結(jié)構(gòu)的嵌段聚氨基酸，如下所示：其中x、r1、r2、r5、n和m如上文對通式6所定義；y代表氫或三烷基硅基，其中三烷基硅基中的烷基優(yōu)選為c1-c10烷基，如甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基等。根據(jù)本公開的一實(shí)施方案，步驟(2)包括：將步驟(1)得到的嵌段聚氨基酸(以h-(gly)mpaa-xr5為例)與n端半胱氨酸、c端具有l(wèi)pxatg(xa為任一氨基酸)序列的蛋白質(zhì)混合，連續(xù)發(fā)生自然化學(xué)連接反應(yīng)和轉(zhuǎn)肽酶反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的環(huán)化，如下所示：上述lpxatg序列是轉(zhuǎn)肽酶的識別位點(diǎn)，嵌段聚氨基酸與所述蛋白質(zhì)的氮端半胱氨酸發(fā)生連接反應(yīng)，然后在轉(zhuǎn)肽酶的作用下實(shí)現(xiàn)環(huán)化。為便于蛋白質(zhì)的后續(xù)純化，可以在反應(yīng)前的蛋白質(zhì)c末端加上多聚組氨酸標(biāo)簽(his-tag)，環(huán)化后通過鎳親和層析的方法純化。根據(jù)本公開的一個實(shí)施方案，通過質(zhì)粒構(gòu)建在egfp基因序列的n端插入煙草蝕紋病毒蛋白酶(tobaccoetchvirusprotease,tev)的酶切序列enlyfq，在其c端插入lpetg序列，以進(jìn)行tev催化的偶聯(lián)反應(yīng)，具體的蛋白質(zhì)氨基酸序列見序列表中seqidno：1。嵌段聚氨基酸c端通過自然化學(xué)連接與n端帶有半胱氨酸的蛋白質(zhì)進(jìn)行偶聯(lián)，其n端在轉(zhuǎn)肽酶的作用下與蛋白質(zhì)c端的lpetg偶聯(lián)，其反應(yīng)如圖2所示。根據(jù)本公開聚合而得的氨基酸序列可以由任意水溶性氨基酸組成，涵蓋天然、非天然、l型、d型氨基酸等，因此較生物表達(dá)的方式而言具有顯著的材料多樣性優(yōu)勢。同時，該聚合得到的α-聚氨基酸具有可控的分子量及分子量分布，因此可以根據(jù)實(shí)際需求來制備不同長度的多肽材料。根據(jù)本公開的方法可以原位賦予α-聚氨基酸c端的硫酯和n端的重復(fù)甘氨酸序列，它們可以通過非常高效的反應(yīng)與蛋白質(zhì)相連，由此使得蛋白質(zhì)修飾成本大大降低，有著廣闊的應(yīng)用前景。根據(jù)本公開的蛋白質(zhì)-高分子雜化材料不僅繼承了傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)-高分子雜化材料的優(yōu)點(diǎn)，如將具有特殊性質(zhì)(如熱響應(yīng)性、光響應(yīng)性等)的高分子于蛋白質(zhì)的連接，使得蛋白質(zhì)-高分子雜化材料具有一定的功能性和響應(yīng)性。此外，蛋白質(zhì)的降解通常是在c端或者n端發(fā)生，通過高分鏈將其兩端連接進(jìn)行環(huán)化可以降低蛋白質(zhì)被降解的速率，增加其穩(wěn)定性，延長其血液循環(huán)時間。因此，本公開為蛋白質(zhì)藥物提供了十分廣闊的應(yīng)用前景。實(shí)施例以下的實(shí)施例便于更好的理解本公開的內(nèi)容，而不旨在對其作出任何限定。下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法，所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到，所利用的質(zhì)粒均通過標(biāo)準(zhǔn)分子克隆的方法得到。實(shí)施例1：用于蛋白偶聯(lián)的聚氨基酸p1的合成在手套箱中將l-谷氨酸(乙二醇)3酯-n-羧基內(nèi)酸酐(n1,40.0mg,0.131mmol,20當(dāng)量)溶解于無水n,n-二甲基甲酰胺(1.0ml)中，并加入三甲基硅基苯硫酚的dmf溶液(13.6μl×0.5m，1.0當(dāng)量)，室溫攪拌25小時后將反應(yīng)液倒入40ml乙醚溶液中，析出的白色沉淀即為產(chǎn)品。離心得到固體產(chǎn)品，傾倒出上清液并再次用40ml乙醚沖洗產(chǎn)品，離心得到固體后傾倒上清液并用真空烘箱干燥，得到無色透明膠狀固體30mg(產(chǎn)率72％)，其保存于-20℃冰箱中。以與上述方法類似的方法合成平均聚合度為7的聚l-谷氨酸(乙二醇)3酯，只需將l-谷氨酸(乙二醇)3酯-n-羧基內(nèi)酸酐投料量改為13mg即可，反應(yīng)后加入乙酸酐(1.33mg,2.0當(dāng)量)封端，按照上述方法后處理，maldi-tof質(zhì)譜表征如圖3所示。實(shí)施例2：用于蛋白環(huán)化的嵌段聚氨基酸p2的合成在手套箱中將l-谷氨酸(乙二醇)3酯-n-羧基內(nèi)酸酐(n1,13.0mg,0.044mmol,7當(dāng)量)溶解于無水n,n-二甲基甲酰胺(1.0ml)中，并加入三甲基硅基苯硫酚的dmf溶液(13.1μl×0.5m，1.0當(dāng)量)，在室溫下攪拌25小時后加入甘氨酸-n-羧基內(nèi)酸酐(n2,2.0mg,0.0197mmol,3當(dāng)量)，繼續(xù)在室溫攪拌2小時，后處理方式與實(shí)施例1相同。實(shí)施例3：用于蛋白偶聯(lián)的聚氨基酸p4的合成在手套箱中將磷酸乙酯-l-酪氨酸n-羧基內(nèi)酸酐(n3,100mg,0.291mmol,20當(dāng)量)溶解于無水n,n-二甲基甲酰胺(2.0ml)中，并加入三甲基硅基苯硫酚的dmf溶液(29.1μl×0.5m，1.0當(dāng)量)，在室溫下攪拌25小時，后處理方式與實(shí)施例1相同。將上述聚氨基酸(p3,80mg,0.0133mmol,1.0當(dāng)量)溶解于二氯甲烷(1.5ml)中，并依次加入三乙胺(300μl,2.1mmol)和三甲基溴硅烷(360μl,2.7mmol)。將反應(yīng)液加熱至60℃并攪拌8小時，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上旋干溶劑后將產(chǎn)物溶解于去離子水中(4ml)，并加入edta(10mg)，用氫氧化鈉水溶液(1m)將ph調(diào)至中性，并用氯化鈉水溶液透析(1000damwco,3次)。溶液凍干后得到淡黃色固體p460mg(產(chǎn)率83％)。實(shí)施例4：用于蛋白偶聯(lián)的聚氨基酸p5的合成在手套箱中將l-谷氨酸-4-丙烯氧基芐酯-n-羧基內(nèi)酸酐(n4,300mg,0.952mmol,50當(dāng)量)溶解于無水n,n-二甲基甲酰胺(3.0ml)中，并加入三甲基硅基苯硫酚的dmf溶液(38.0μl×0.5m，1.0當(dāng)量)，室溫攪拌25小時，后處理方式與實(shí)施例1相同。最終得到無色透明膠狀固體200mg(產(chǎn)率69％)。實(shí)施例5：用于蛋白偶聯(lián)的聚氨基酸p6的合成將實(shí)施例4中制備的聚氨基酸(p5,50mg,0.173mmol,1.0當(dāng)量按雙鍵的物質(zhì)的量計算)溶解于n,n-二甲基甲酰胺(2.0ml)中；將巰基乙胺鹽酸鹽(118mg,1.04mmol,6.0當(dāng)量)溶解于去離子水中(200μl)；混合兩份溶液并加入安息香二甲醚(0.89mg,3.46×10-3mmol,0.02當(dāng)量)，搖勻后置于365nm紫外燈下反應(yīng)3小時。反應(yīng)結(jié)束后將溶液倒入異丙醇中(40ml)，離心收集沉淀。真空烘箱干燥后得到無色透明粘稠膠狀固體32mg(產(chǎn)率53％)。實(shí)施例6：用于蛋白偶聯(lián)的聚氨基酸p7的合成將實(shí)施例1中制備的聚氨基酸(p1,50mg,0.173mmol,1.0當(dāng)量按雙鍵的物質(zhì)的量計算)溶解于n,n-二甲基甲酰胺(2.0ml)中；將巰基丙酸(110mg,1.04mmol,6.0當(dāng)量)溶解于去離子水中(200μl)；混合兩份溶液并加入安息香二甲醚(0.89mg,3.46×10-3mmol,0.02當(dāng)量)，搖勻后置于365nm紫外燈下反應(yīng)3小時。后處理方式與實(shí)施例5相同，最終得到淡黃色透明膠狀固體33mg(產(chǎn)率51％)。實(shí)施例7：用于蛋白偶聯(lián)的聚氨基酸p8的合成在手套箱中將l-谷氨酸-丙烯基(乙二醇)3酯-n-羧基內(nèi)酸酐(n5,200mg,0.580mmol,50當(dāng)量)溶解于無水n,n-二甲基甲酰胺(2.0ml)中，并加入三甲基硅基苯硫酚的dmf溶液(23.2μl×0.5m，1.0當(dāng)量)，室溫攪拌25小時，后處理方式與實(shí)施例1相同，最終得到無色透明膠狀固體160mg(產(chǎn)率82％)。實(shí)施例8：用于蛋白偶聯(lián)的聚氨基酸的后修飾將實(shí)施例7中制備的聚氨基酸(p8,50mg,0.155mmol,1.0當(dāng)量)按雙鍵的物質(zhì)的量計算)溶解于n,n-二甲基甲酰胺(2.0ml)中；將巰基乙胺鹽酸鹽(113mg,0.94mmol,6.0當(dāng)量)溶解于去離子水中(200μl)；混合兩份溶液并加入安息香二甲醚(0.84mg,3.30×10-3mmol,0.02當(dāng)量)，搖勻后置于365nm紫外燈下反應(yīng)6小時。反應(yīng)結(jié)束后將溶液用去離子水稀釋至5ml，用脫鹽柱pd10分兩次處理，凍干后無色透明膠狀固體25mg(產(chǎn)率46％)。實(shí)施例9：用于蛋白偶聯(lián)的聚氨基酸p10的合成在手套箱中將n-甲基-n-羧基內(nèi)酸酐(n6,15.0mg,0.131mmol,20當(dāng)量)溶解于無水n,n-二甲基甲酰胺(1.0ml)中，并加入三甲基硅基苯硫酚的dmf溶液(13.6μl×0.5m，1.0當(dāng)量)，室溫攪拌25小時，后處理方式與實(shí)施例1相同。最終得到白色固體7mg(產(chǎn)率78％)。實(shí)施例10：用于蛋白偶聯(lián)的嵌段聚氨基酸p11的合成在手套箱中將l-芐氧羰基賴氨酸-n-羧基內(nèi)酸酐(n7,100.3mg,0.328mmol,50當(dāng)量)溶解于無水n,n-二甲基甲酰胺(1.0ml)中，并加入三甲基硅基苯硫酚的dmf溶液(13.1μl×0.5m，1.0當(dāng)量)，在室溫下攪拌25小時后加入l-谷氨酸芐酯-n-羧基內(nèi)酸酐(n8,86.1mg,0.328mmol,50當(dāng)量)，繼續(xù)在室溫攪拌25小時，后處理方式與實(shí)施例1相同。實(shí)施例11：用于蛋白偶聯(lián)的聚氨基酸p12的合成在手套箱中將l-芐氧羰基賴氨酸-n-羧基內(nèi)酸酐(n7,100.3mg,0.328mmol,50當(dāng)量)溶解于無水四氫呋喃(1.0ml)中，并加入三甲基硅基苯硫酚的四氫呋喃溶液(13.1μl×0.5m，1.0當(dāng)量)，在室溫下攪拌25小時，后處理方式與實(shí)施例1相同。由于在四氫呋喃中引發(fā)劑引發(fā)效率低，因此實(shí)際得到的聚合物聚合度偏大，理論聚合度為300。實(shí)施例12：用于蛋白偶聯(lián)的聚氨基酸p13的合成在手套箱中將l-谷氨酸(乙二醇)3酯-n-羧基內(nèi)酸酐(n1,13.0mg,0.131mmol,20當(dāng)量)溶解于無水n,n-二甲基甲酰胺(1.0ml)中，并加入三甲基錫基苯硒酚的dmf溶液(13.6μl×0.5m，1.0當(dāng)量)，在室溫下攪拌25小時，后處理方式與實(shí)施例1相同。實(shí)施例13：用于蛋白偶聯(lián)的聚氨基酸p14的合成在手套箱中將l-谷氨酸(乙二醇)3酯-n-羧基內(nèi)酸酐(n1,13.0mg,0.131mmol,20當(dāng)量)溶解于無水n,n-二甲基甲酰胺(1.0ml)中，并加入2-巰基乙烷磺酸鈉的dmf溶液(13.6μl×0.5m，1.0當(dāng)量)，在室溫下攪拌25小時，后處理方式與實(shí)施例1相同。實(shí)施例14：用于蛋白偶聯(lián)的聚氨基酸p15的合成在手套箱中將l-谷氨酸(乙二醇)3酯-n-羧基內(nèi)酸酐(n1,13.0mg,0.131mmol,20當(dāng)量)溶解于無水n,n-二甲基甲酰胺(1.0ml)中，并加入巰基丙酸的dmf溶液(13.6μl×0.5m，1.0當(dāng)量)，在室溫下攪拌25小時，后處理方式與實(shí)施例1相同。在以下表1中示出上述實(shí)施例中制備的聚合物的表征參數(shù)，并且所示出的實(shí)際測量值均是至少三次測量所得的數(shù)值的平均值。詳言之，所有聚合物的分子量及分子量分布系數(shù)(pdi)都由凝膠排阻色譜(gpc)結(jié)合9角度激光光散射儀測得，所用流動相為添加0.1m溴化鋰的無水n,n-二甲基甲酰胺。表1聚合物分子量及分子量分布聚合物編號理論聚合度實(shí)際聚合度實(shí)際分子量pdip1202056001.12p210922001.03p3201947001.05p55052173001.08p85049135001.06p10202015001.07p1110099239001.03p12300305670001.14p135050139001.08p145048134001.15p155046130001.06由上表可見，所有聚合物的實(shí)際分子量都與理論分子量接近，并且分子量分布很窄，說明聚合過程的可控性優(yōu)異。實(shí)施例15：環(huán)狀(多肽-聚氨基酸p2(n＝7,m＝3)偶聯(lián)物的制備將實(shí)施例2中制備的聚氨基酸p2(n＝7,m＝3)(3.8mg,1.72μmol,2.0當(dāng)量)與n端帶有半胱氨酸的多肽(cys-pep,1.8mg,0.86μmol,1.0當(dāng)量，序列為cgdakglpetghhhhhhk)溶解于超純水中，用氫氧化鈉水溶液(1.0m)調(diào)節(jié)ph至7.0，室溫反應(yīng)12小時。經(jīng)過ninta親和純化后，用脫鹽柱pd10處理后凍干得到自然化學(xué)連接產(chǎn)物白色粉末2.6mg(產(chǎn)率74％)。將自然化學(xué)連接產(chǎn)物溶解于含有氯化鈉(150mm)和氯化鈣(10mm)的tris-hcl緩沖液中(50mm,5.0ml,ph～7.4)，并加入轉(zhuǎn)肽酶(sortase)a(150μl×227μm,0.05當(dāng)量)，室溫反應(yīng)0.5小時后，環(huán)狀多肽-聚氨基酸偶聯(lián)物的粗產(chǎn)品用ninta提純(用緩沖液b洗脫，含有20mmtris-hcl,500mm氯化鈉,20mm咪唑,ph～8.0)。收集洗脫下來的組分并用脫鹽柱pd10處理。凍干后得到白色粉末環(huán)狀(多肽-聚氨基酸p2(n＝7,m＝3))偶聯(lián)物純品1.6mg，產(chǎn)率82％。產(chǎn)物經(jīng)過maldi-tof表征，分子量與理論值一致，如圖4所示。實(shí)施例16：enlyfqc-增強(qiáng)型綠色熒光蛋白-lpetgh6(enlyfq-cys-egfp-lpetgh6)的表達(dá)及純化將n端編碼有enlyfq和c端編碼有l(wèi)petghhhhhh的質(zhì)粒pet-tev-cys-egfp通過化學(xué)轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)入大腸桿菌(e.coli)bl21中。菌種在10ml添加有100μg/ml卡那霉素的lb培養(yǎng)基中復(fù)蘇10～12小時，然后1:100接種至1l添加有100μg/ml卡那霉素的lb培養(yǎng)基中，在250rpm，37℃的條件下?lián)u至od600＝0.8，加入終濃度為1mm的異丙基硫代半乳糖苷誘導(dǎo)細(xì)菌表達(dá)，培養(yǎng)條件改為250rpm，30℃。5小時后6500rpm，4℃離心40min收集菌體。用20ml的緩沖液a(20mmtris-hcl,500mmnacl,ph8.0)懸菌，在冰浴條件下超聲(130w,20khz,50％功率，超聲5秒，暫停10秒，超聲時間為10min)裂解。裂解液先后經(jīng)過6500rpm,40min和12000g,40min兩步4℃離心，收集上清液，用0.22μm濾膜過濾，經(jīng)ninta親和柱純化，其中，平衡緩沖液為50mmtris，500mmnacl，ph8.0，洗脫液為添加有300mmm咪唑的上述平衡液。最后得到48mg目的蛋白(其序列見序列表中seqidno：1)，并經(jīng)過uplc-ms進(jìn)行確認(rèn)(參見圖5)，計算值為31324，得到31333。分子量誤差(9道爾頓)在誤差允許范圍(10道爾頓)內(nèi)，因此可確認(rèn)所得到的蛋白為目的蛋白tev-增強(qiáng)型綠色熒光蛋白-lpetgh6。實(shí)施例17：含有1,2-巰基乙胺結(jié)構(gòu)位點(diǎn)特異的增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(egfp)的表達(dá)步驟1：1,2-巰基乙胺非天然氨基酸的合成將化合物1(233mg,1.00mmol,1.0當(dāng)量)溶解于無水四氫呋喃中(20ml)，加入n,n’-二環(huán)己基碳二亞胺(dcc,206mg,1.00mmol,1.0當(dāng)量)和n-羥基琥珀酰亞胺(nhs,115mg,1.00mmol,1.0當(dāng)量)，在室溫下攪拌3小時后過濾除去固體，濾液旋干后，經(jīng)柱色譜分離，洗脫劑為二氯甲烷∶乙酸乙酯＝5∶1(體積比)到純乙酸乙酯。得到白色固體化合物2(264mg,產(chǎn)率80％)。將化合物2(264mg,0.80mmol,1.0當(dāng)量)溶解于n,n-二甲基甲酰胺中(20ml)，加入boc-lys-oh(246mg,0.80mmol,1.0當(dāng)量)和三乙胺(0.2ml)，室溫攪拌3小時后旋干溶劑，經(jīng)柱色譜分離，洗脫劑為二氯甲烷到二氯甲烷∶甲醇＝10∶1(體積比)。得到無色油狀液體化合物3(221mg，產(chǎn)率60％)。將化合物3(221mg,0.48mmol,1.0當(dāng)量)溶解于氯化氫的二氧六環(huán)溶液中(10ml)，室溫攪拌過夜后產(chǎn)品析出，抽慮得到產(chǎn)品，即化合物4(1,2-巰基乙胺非天然氨基酸)，其經(jīng)ph調(diào)節(jié)后，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。步驟2：增強(qiáng)型綠色熒光蛋白的表達(dá)將蛋白質(zhì)基因序列的特定位點(diǎn)突變?yōu)閠ag的質(zhì)粒(原蛋白序列詳見序列表seqidno：2(c端帶有his6標(biāo)簽)，其第149位的天冬氨酸n對應(yīng)的密碼子突變?yōu)閠ag，得到特定位點(diǎn)突變的基因序列)和攜帶有琥珀酰氨酰合成酶/trna的質(zhì)粒通過化學(xué)轉(zhuǎn)化的方法同時轉(zhuǎn)入大腸桿菌(e.coli)bl21中。菌種在10ml添加有100μg/ml氨芐青霉素和34μg/ml氯霉素的lb培養(yǎng)基中復(fù)蘇10～12小時，然后接種至1l添加有100μg/ml氨芐青霉素和34μg/ml氯霉素的lb培養(yǎng)基中，在250rpm，37℃的條件下培養(yǎng)2小時后加入終濃度為2mm的非天然氨基酸4，搖至od600＝0.8，加入終濃度為1mm的異丙基硫代半乳糖苷誘導(dǎo)細(xì)菌表達(dá)，培養(yǎng)條件改為250rpm，30℃。12小時后6500rpm，4℃離心40min收集菌體。用20ml的緩沖液a(20mmtris-hcl,500mmnacl,ph8.0)懸菌，在冰浴條件下超聲裂解。裂解液先后經(jīng)過6500rpm,40min和12000g,40min兩步4℃離心，收集上清液，用0.22μm濾膜過濾，ninta純化方法同實(shí)施例16。實(shí)施例18enlyfqc-增強(qiáng)型綠色熒光蛋白-lpetgh6(enlyfq-cys-egfp-lpetgh6)的酶切在透析袋(mwco3000)中加入1ml蛋白質(zhì)溶液(12mg/ml)、5μl煙草蝕紋病毒蛋白酶(0.2mg/ml)和10μl10x緩沖液b(500mm磷酸鈉、5mmedta和10mmdtt)。將透析袋置于1l緩沖液b(50mm磷酸鈉、0.5mmedta和1mmdtt)中在室溫下透析酶切。酶切3小時后得到蛋白cys-egfp-lpetgh6(其氨基酸序列即序列表中seqidno：1去除n端的“menlyfq”后的序列)并經(jīng)過uplc-ms確認(rèn)(參見圖6)，計算值為30398，得到30404。分子量誤差(6道爾頓)在誤差允許范圍(10道爾頓)內(nèi)，因此可確認(rèn)所得到的酶切后的蛋白為目的蛋白cys-綠色熒光蛋白-lpetgh6。實(shí)施例19：cys-增強(qiáng)型綠色熒光蛋白-lpetgh6與聚氨基酸p1(n＝7)的自然化學(xué)連接反應(yīng)(蛋白質(zhì)n端偶聯(lián))1當(dāng)量的cys-增強(qiáng)型綠色熒光蛋白-lpetgh6與2當(dāng)量的聚氨基酸p1(n＝7)在50mmtris-hcl,2mm三(2-羧乙基)膦的溶液(ph～6.5)中進(jìn)行自然化學(xué)連接反應(yīng)，反應(yīng)10h后經(jīng)過快速蛋白液相色譜(fplc)純化，得到位點(diǎn)特異的蛋白質(zhì)高分子雜化材料，并經(jīng)過變性蛋白質(zhì)凝膠電泳(sds-pagegel)表征其分子量變化和非變性蛋白質(zhì)凝膠電泳(nativesds-pagegel)表征其純度。如圖7所示，在sds-pagegel中，聚氨基酸-增強(qiáng)型綠色熒光蛋白偶聯(lián)物條帶相對于原料蛋白質(zhì)向分子量大處遷移，說明聚氨基酸接枝成功，而變性和非變性凝膠電泳中聚氨基酸-增強(qiáng)型綠色熒光蛋白偶聯(lián)物都為均一的單條帶(二聚體為相同的單體蛋白在天然狀態(tài)下通過物理相互作用形成的)，說明產(chǎn)物純度較高，其中產(chǎn)率為50％～65％。實(shí)施例20：enlyfqc-增強(qiáng)型綠色熒光蛋白-lpetgh6與聚乙二醇-聚甘氨酸在轉(zhuǎn)肽酶介導(dǎo)下的偶聯(lián)(sortasemediatedligation，蛋白質(zhì)c端偶聯(lián))1當(dāng)量的enlyfqc-增強(qiáng)型綠色熒光蛋白-lpetgh6(1mg/ml，300μl)、5當(dāng)量的聚乙二醇-聚甘氨酸(10mm,53μl)和0.1當(dāng)量的轉(zhuǎn)肽酶(4.9mg/ml,52μl)加入到200μl含有150mmnacl和10mmcacl2的50mmtris-hclph7.4緩沖液中。室溫反應(yīng)30min,經(jīng)ninta親和純化，分離得到產(chǎn)物enlyfqc-增強(qiáng)型綠色熒光蛋白-聚乙二醇-聚甘氨酸偶聯(lián)物。平衡緩沖液為50mmtris，500mmnacl，ph8.0,上樣即開始收集流脫緩沖液，繼而用50mmtris，500mmnacl，20mm咪唑，ph8.0洗脫，得到溶解有產(chǎn)物的洗脫液，再用50mmtris，500mmnacl，300mm咪唑，ph8.0的緩沖液清洗樹脂，洗脫未反應(yīng)的蛋白質(zhì)原料。enlyfqc-增強(qiáng)型綠色熒光蛋白-聚乙二醇-聚甘氨酸偶聯(lián)物通過變性膠蛋白質(zhì)凝膠電泳(sds-pagegel)表征其分子量，非變性膠蛋白質(zhì)凝膠電泳(nativesds-pagegel)表征其純度。如圖8所示，在sds-pagegel中，enlyfqc-增強(qiáng)型綠色熒光蛋白-聚甘氨酸-聚乙二醇偶聯(lián)物條帶相對于原料蛋白質(zhì)向分子量大處遷移，說明聚氨基酸接枝成功，而在變性和非變性凝膠電泳中聚氨基酸-增強(qiáng)型綠色熒光蛋白偶聯(lián)物為均一的單條帶，說明產(chǎn)物純度較高，其中產(chǎn)率為56％。實(shí)施例21：聚氨基酸p1(n＝7)-增強(qiáng)型綠色熒光蛋白-聚甘氨酸-聚乙二醇節(jié)點(diǎn)狀偶聯(lián)物的制備以兩步驟，依次根據(jù)實(shí)施例19和20所述的反應(yīng)和純化方法，制備聚氨基酸p1(n＝7)-增強(qiáng)型綠色熒光蛋白-聚甘氨酸-聚乙二醇節(jié)點(diǎn)狀偶聯(lián)物。中間產(chǎn)物聚氨基酸p1(n＝7)-增強(qiáng)型綠色熒光蛋白和節(jié)點(diǎn)狀偶聯(lián)物均經(jīng)過變性和非變性蛋白質(zhì)凝膠電泳表征(參見圖9)。產(chǎn)物的分子量逐步向蛋白質(zhì)分子量高出位移說明高分子先后均接枝成功，且單一條帶表明產(chǎn)物純度較高。兩步產(chǎn)率分別為65％和50％。實(shí)施例22：增強(qiáng)型綠色熒光蛋白-聚氨基酸p2(n＝7,m＝3)-干擾素α啞鈴狀偶聯(lián)物的制備1當(dāng)量的增強(qiáng)型綠色熒光蛋白-lpetgh6(6.5mg)、10當(dāng)量的聚氨基酸p2(n＝7,m＝3)(6.6mg)和0.1當(dāng)量的轉(zhuǎn)肽酶(0.5mg)加入到1ml含有150mm氯化鈉和10mm氯化鈣的tris-hcl緩沖液(50mm,ph7.5)中,室溫反應(yīng)30min。參照實(shí)施例21的純化方法純化得到增強(qiáng)型綠色熒光蛋白-聚氨基酸p2(n＝7,m＝3)偶聯(lián)物，產(chǎn)率為55％。繼而將增強(qiáng)型綠色熒光蛋白-聚氨基酸p2(n＝7,m＝3)偶聯(lián)物與cys-干擾素α參照實(shí)施例21進(jìn)行自然化學(xué)連接得到增強(qiáng)型綠色熒光蛋白-聚氨基酸p2(n＝7,m＝3)-干擾素α啞鈴狀偶聯(lián)物，產(chǎn)率為50％。中間產(chǎn)物和啞鈴狀偶聯(lián)物均經(jīng)過變性和非變性蛋白質(zhì)凝膠電泳進(jìn)行分子量和純度的表征(參見圖10)。偶聯(lián)物分子量逐步向高分子量處位移，且增強(qiáng)型綠色熒光蛋白-聚氨基酸-干擾素α啞鈴狀偶聯(lián)物分子量根據(jù)蛋白質(zhì)分子量標(biāo)尺分布在43kda～55kda之間，符合預(yù)期的增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(～31kda)和干擾素α(～21kda)異質(zhì)雙蛋白分子量加和范圍(～52kda)，因此可確認(rèn)得到的是增強(qiáng)型綠色熒光蛋白-聚氨基酸-干擾素α異質(zhì)雙蛋白啞鈴狀偶聯(lián)物。通過單一條帶可確認(rèn)產(chǎn)物純度較高。實(shí)施例23：環(huán)狀(增強(qiáng)型綠色熒光蛋白-聚氨基酸p2(n＝7,m＝3))偶聯(lián)物的制備參照實(shí)施例19利用自然化學(xué)連接制備聚氨基酸p2(n＝7,m＝3)-增強(qiáng)型綠色熒光蛋白-lpetgh6偶聯(lián)物。將1當(dāng)量的聚氨基酸p2(n＝7,m＝3)-增強(qiáng)型綠色熒光蛋白-lpetgh6偶聯(lián)物(0.42mg)與0.1當(dāng)量的轉(zhuǎn)肽酶混合在含有150mm氯化鈉和10mm氯化鈣的50mmtris-hcl,ph7.5的緩沖液中，控制聚氨基酸p2(n＝7,m＝3)-增強(qiáng)型綠色熒光蛋白-lpetgh6偶聯(lián)物的終濃度為50mm，室溫反應(yīng)30min，反應(yīng)結(jié)束后參照實(shí)施例22進(jìn)行分離純化，產(chǎn)率約為42％。利用基質(zhì)輔助激光解離-飛行時間質(zhì)量分析器(maldi-tof)、變性膠蛋白質(zhì)凝膠電泳和免疫印跡分析(westernblot)來表征環(huán)狀(增強(qiáng)型綠色熒光蛋白-聚氨基酸p2(n＝7,m＝3))偶聯(lián)物。聚氨基酸p2(n＝7,m＝3)-增強(qiáng)型綠色熒光蛋白-lpetgh6偶聯(lián)物的碳端比環(huán)狀(增強(qiáng)型綠色熒光蛋白-聚氨基酸p2(n＝7,m＝3))偶聯(lián)物多出7個氨基酸(即，ghhhhhh)。因此利用maldi-tof分析，聚氨基酸p2(n＝7,m＝3)-增強(qiáng)型綠色熒光蛋白-lpetgh6偶聯(lián)物環(huán)化后的分子量整體低于環(huán)化前(理論是1160da，實(shí)際算的～1206da)，直接表明增強(qiáng)型綠色熒光蛋白-聚氨基酸p2(n＝7,m＝3)形成環(huán)狀偶聯(lián)物。此外，變性膠蛋白質(zhì)凝膠電泳(sds-pagegel)中，環(huán)狀(增強(qiáng)型綠色熒光蛋白-聚氨基酸p2(n＝7,m＝3))由于分子量減小和拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的變化，條帶位置會向分子量低處位移，免疫印跡分析表明組氨酸標(biāo)簽(his-tag)消失，進(jìn)一步表明成功得到了環(huán)狀(增強(qiáng)型綠色熒光蛋白-聚氨基酸p2(n＝7,m＝3))偶聯(lián)物，具體分析結(jié)果參見圖11。實(shí)施例24：cys-增強(qiáng)型綠色熒光蛋白、聚氨基酸p2(n＝7,m＝3)-增強(qiáng)型綠色熒光蛋白、環(huán)狀(增強(qiáng)型綠色熒光蛋白-聚氨基酸p2(n＝7,m＝3))偶聯(lián)物的羧肽酶穩(wěn)定性測試控制cys-增強(qiáng)型綠色熒光蛋白、聚氨基酸p2(n＝7,m＝3)-增強(qiáng)型綠色熒光蛋白和環(huán)狀(增強(qiáng)型綠色熒光蛋白-聚氨基酸p2(n＝7,m＝3))偶聯(lián)物在50mmph7.4的tris-hcl緩沖液中終濃度為4.0mg/ml，羧肽酶的終濃度為80μg/ml，當(dāng)量比為egfp的0.01當(dāng)量，37℃孵育。在設(shè)定的時間點(diǎn)，取樣(5μl)與上樣緩沖液混合，95℃煮樣10min，終止酶切反應(yīng)。待最后一個時間點(diǎn)完成取樣后，所有樣品同時跑膠，利用蛋白質(zhì)凝膠電泳進(jìn)行表征?？捡R斯亮藍(lán)染色和脫色完成后，利用typhoonflalaserscanner對蛋白質(zhì)進(jìn)行定量。如圖12所示，圖a、b、c分別為cys-增強(qiáng)型綠色熒光蛋白、聚氨基酸p2(n＝7,m＝3)-增強(qiáng)型綠色熒光蛋白和環(huán)狀(增強(qiáng)型綠色熒光蛋白-聚氨基酸p2(n＝7,m＝3))偶聯(lián)物在羧肽酶的作用下隨時間延長的降解情況。通過typhoonflalaserscanner根據(jù)染色后條帶的強(qiáng)度對蛋白進(jìn)行定量，在相同的羧肽酶比例下，野生型增強(qiáng)型綠色熒光蛋白在1小時內(nèi)基本全部降解，而聚氨基酸p2(n＝7,m＝3)-增強(qiáng)型綠色熒光蛋白在3小時處只剩20％左右完整的偶聯(lián)物，相比之下，環(huán)狀(增強(qiáng)型綠色熒光蛋白-聚氨基酸p2(n＝7,m＝3)偶聯(lián)物)則在7小時才開始觀察到一定程度的降解。因此，相比于線狀的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，環(huán)狀(增強(qiáng)型綠色熒光蛋白-聚氨基酸p2(n＝7,m＝3))在酶耐受性上表現(xiàn)出了極大的優(yōu)勢。實(shí)施例25：藥物蛋白enlyfqcg-干擾素-lpetgleh6(tev-cys-ifnα-lpetgh6)的表達(dá)及純化將n端編碼有menlyfqcg和c端編碼lpetglehhhhhh的質(zhì)粒pet-tev-cys-ifnα-lpetgleh6通過化學(xué)轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)入大腸桿菌(e.coli)origamib(de3)中。菌種在10ml添加有100μg/ml氨芐青霉素的lb培養(yǎng)基中復(fù)蘇10～12小時，然后接種至1l添加有100μg/ml氨芐青霉素的lb培養(yǎng)基中，在250rpm，37℃的條件下?lián)u至od600＝0.8，加入終濃度為1.0mm的異丙基硫代半乳糖苷誘導(dǎo)細(xì)菌表達(dá)，培養(yǎng)條件改為200rpm，30℃。過夜培養(yǎng)后6500rpm，4℃離心30min收集菌體。用20ml的緩沖液a(20mmtris-hcl,500mmnacl,ph8.0)重懸菌體，在冰浴條件下超聲裂解。裂解液先后經(jīng)過6500rpm,40min和12000g,40min兩步4℃離心，收集上清液，用0.22μm濾膜過濾，經(jīng)ninta親和柱純化得到98mg目標(biāo)蛋白，并經(jīng)過uplc-ms進(jìn)行確認(rèn)，計算的理論分子量為21918,得到21914。分子量誤差(4道爾頓)在誤差允許范圍(10道爾頓)內(nèi)，因此可確認(rèn)所得到的蛋白為目的蛋白tev-cys-ifnα-lpetgh6。實(shí)施例26：藥物蛋白enlyfqcg-干擾素-lpetgleh6(tev-cys-ifnα-lpetgleh6)的酶切在透析袋(mwco3000)中加入1ml蛋白質(zhì)溶液(12mg/ml)、5μl煙草蝕紋病毒蛋白酶(0.2mg/ml)和10μl10x緩沖液b(500mm磷酸鈉、5mmedta和10mmdtt)。將透析袋置于1l緩沖液b(50mm磷酸鈉、0.5mmedta和1mmdtt)中在室溫下透析酶切。酶切3小時后得到蛋白cys-egfp-lpetgh6并經(jīng)過uplc-ms確認(rèn)(參見圖13)，計算值為20991，得到20987。分子量誤差(6道爾頓)在誤差允許范圍(10道爾頓)內(nèi)，因此可確認(rèn)所得到的酶切后的蛋白為目的蛋白cys-干擾素α-lpetgh6。實(shí)施例27：藥物蛋白cys-干擾素-lpetgleh6與不同長度聚氨基酸的自然化學(xué)連接反應(yīng)1當(dāng)量的目的蛋白cys-ifnα-lpetgleh6與3當(dāng)量的聚氨基酸phs-p(oeg3-glu)100(l型，p1(n＝100))在50mmtris-hcl,2mmdtt的溶液(ph～7.4)中進(jìn)行自然化學(xué)連接反應(yīng)，反應(yīng)10小時后經(jīng)過快速蛋白液相色譜(fplc)純化，得到位點(diǎn)特異的p(oeg3-l-glu)100-ifnα偶聯(lián)物。聚氨基酸p1(n＝100)-干擾素α偶聯(lián)物通過15％變性膠蛋白質(zhì)凝膠電泳(sds-pagegel)表征其分子量和純度。如圖14所示，在sds-pagegel中，聚氨基酸p1(n＝100)-干擾素α偶聯(lián)物條帶相對于原料蛋白質(zhì)向分子量大處遷移，說明聚氨基酸接枝成功，且偶聯(lián)物為均一的單條帶，說明產(chǎn)物純度較高，其中產(chǎn)率為70％?；蛘?，以與上述相同的方法和條件，進(jìn)行藥物蛋白cys-干擾素α-lpetgleh6與聚氨基酸phs-p(oeg3-glu)100(d,l型氨基酸)和聚氨基酸p2(phs-p(oeg3-glu)n-gly3(n＝7或20,m＝3))自然化學(xué)連接反應(yīng)，得到的偶聯(lián)物經(jīng)fplc純化后，通過15％變性膠蛋白質(zhì)凝膠電泳表征。如圖14所示，聚氨基酸-干擾素α偶聯(lián)物條帶相對于原料蛋白質(zhì)均向分子量大處遷移，說明聚氨基酸接枝成功，其中產(chǎn)率為70％～80％。實(shí)施例28：cys-干擾素α-lpetg的n,c兩端分別與不同長度聚氨基酸的位點(diǎn)特異性偶聯(lián)采用實(shí)施例27中的產(chǎn)物聚氨基酸p1(n＝100)-干擾素α-lpetgleh6和聚氨基酸p2(n＝20,m＝3)在轉(zhuǎn)肽酶的作用下，在20mmtris-hcl,150mmnacl,10mmcacl2的緩沖液中進(jìn)行轉(zhuǎn)肽酶介導(dǎo)的轉(zhuǎn)肽反應(yīng)，反應(yīng)體系經(jīng)過ninta柱分離純化得到n,c兩端都位點(diǎn)特異偶聯(lián)聚氨基酸的產(chǎn)物聚氨基酸p1(n＝100)-干擾素α-lpet-聚氨基酸p2(n＝20,m＝3)。產(chǎn)物經(jīng)過15％變性膠蛋白質(zhì)凝膠電泳和免疫印跡分析表征。在免疫印跡分析中，如圖14所示，由于標(biāo)簽his-tag的離去，產(chǎn)物的抗his標(biāo)簽信號消失表明干擾素α的n,c兩均成功接枝聚氨基酸。實(shí)施例29：聚氨基酸p2(n＝7或20,m＝3)-干擾素α-lpetgleh6偶聯(lián)物的環(huán)化反應(yīng)聚氨基酸p2(n＝7或20,m＝3)-干擾素α-lpetgleh6偶聯(lián)物在轉(zhuǎn)肽酶的作用下，在20mmtris-hcl,150mmnacl,10mmcacl2的緩沖液中進(jìn)行環(huán)化反應(yīng)，經(jīng)過ninta柱分離純化得到環(huán)狀(聚氨基酸p2(n＝7或20,m＝3)-干擾素α-lpetgleh6)。如圖15所示，干擾素α與聚氨基酸的環(huán)狀拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的形成可通過sds-page膠中條帶相對與環(huán)化前的偶聯(lián)物像分子量低處位移，且其相對應(yīng)的免疫印跡分析中anti-his信號的消失來確認(rèn)。實(shí)施例30：聚氨基酸p1(n＝100)-ifnα與環(huán)狀(聚氨基酸p2(n＝7或20,m＝3)-ifnα)的熱穩(wěn)定性測試本實(shí)施例中，所采用的目的蛋白為重組人干擾素α，可以通過染料syproorange來測定蛋白質(zhì)融化溫度(tm值)，該種染料會結(jié)合隨溫度升高引起的蛋白構(gòu)象變化而暴露的疏水區(qū)，從而熒光發(fā)射強(qiáng)度有較大變化。野生型ifnα及各種與聚氨基酸的偶聯(lián)物的tm值。5μl200×寶石橙蛋白染料(thermo)和45μl(5μm)的待測蛋白混合在1×pbs緩沖液中，共50μl反應(yīng)體系，加到96孔板中，平行三個孔加樣，在熒光定量pcr儀中檢測，從37度以2.2℃/min的速度加熱到98℃，根據(jù)所得曲線計算各蛋白質(zhì)樣品的tm值。如圖16所示為各蛋白質(zhì)樣品的tm值，從中可判斷各種偶聯(lián)物的熱穩(wěn)定性，tm值越高則其熱穩(wěn)定性越好。其中聚氨基酸p1(n＝100)-干擾素α偶聯(lián)物和環(huán)狀(聚氨基酸p2(n＝7或20,m＝3)-干擾素α)表現(xiàn)出十分優(yōu)異的熱穩(wěn)定性，尤其環(huán)狀(聚氨基酸p2(n＝7或20,m＝3)-干擾素α)的熱穩(wěn)定性相比于目前各文獻(xiàn)和專利報道中最好的。實(shí)施例31：各種聚氨基酸-干擾素α偶聯(lián)物的胰蛋白酶耐受性測試本實(shí)施例中，以野生型重組人干擾素α為對照，對本公開的聚氨基酸-干擾素α偶聯(lián)物的胰蛋白酶耐受性進(jìn)行測試。37℃下，加入0.01當(dāng)量的胰蛋白酶處理樣品，在不同時間點(diǎn)取樣檢測剩余的完整蛋白比例，結(jié)果如圖17所示，根據(jù)蛋白條帶的強(qiáng)度進(jìn)行定量，得到的數(shù)據(jù)繪制成曲線圖(如圖17所示)，從曲線圖b、c中，可以發(fā)現(xiàn)隨著偶聯(lián)物所采用的聚氨基酸的分子量增大，所得到的偶聯(lián)物對胰蛋白酶的耐受性也隨之增強(qiáng)，且根據(jù)圖a所示，在相近分子量的偶聯(lián)物中，拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)為環(huán)狀的偶聯(lián)物的胰蛋白酶耐受性要明顯強(qiáng)于未環(huán)化的偶聯(lián)物。實(shí)施例32：野生型干擾素wt-ifnα與聚氨基酸p1(n＝100l型或n＝100d,l型)-ifnα偶聯(lián)物的圓二色譜測試本實(shí)施例中，使用的聚氨基酸p(oeg3-glu)n(l型)單獨(dú)具有明顯的以α螺旋為主的二級結(jié)構(gòu)，所以將其與ifnα偶聯(lián)后會對ifnα的二級結(jié)構(gòu)造成一定的影響。配成0.35mg/mlpbs蛋白溶液通過圓二色譜監(jiān)測二級結(jié)構(gòu)的變化，測試證明，ifnα-聚氨基酸偶聯(lián)物明顯增強(qiáng)了ifnα的二級結(jié)構(gòu)，結(jié)果如圖18所示。實(shí)施例33：野生型干擾素α與各種聚氨基酸-干擾素α偶聯(lián)物的體外活性測試本實(shí)施例中，采用對daudi細(xì)胞的生長抑制及其誘導(dǎo)a549細(xì)胞抗腦心肌炎病毒(emcv)的活性兩方面來分別判斷各種聚氨基酸-干擾素α的體外抗腫瘤及抗病毒活性的保留。采用對ifnα敏感的人b淋巴瘤細(xì)胞系daudi來作為實(shí)驗(yàn)細(xì)胞系，檢測各種聚氨基酸-干擾素α的體外抗腫瘤活性。具體實(shí)驗(yàn)步驟為：5000個細(xì)胞/孔鋪板至96孔板中，將蛋白質(zhì)及其與聚氨基酸的偶聯(lián)物稀釋至合適梯度加入到鋪有細(xì)胞的96孔板中，培養(yǎng)72小時之后，利用celltitercellviabilityassay(普洛麥格)檢測細(xì)胞活力，利用graphpadprism處理相關(guān)數(shù)據(jù)得到各樣品的半數(shù)抑制量ic50。實(shí)驗(yàn)證明，不同拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的聚氨基酸-ifnα偶聯(lián)物抗腫瘤活性有較大不同，具體數(shù)據(jù)表2所示。表2中，具有二級結(jié)構(gòu)的聚氨基酸與干擾素α偶聯(lián)后對其活性影響最小，且優(yōu)于已經(jīng)在臨床應(yīng)用中的干擾素α-聚乙二醇偶聯(lián)物佩樂能(peg-intron)，環(huán)狀偶聯(lián)物次之。由此可見，通過調(diào)整干擾素α-聚氨基酸偶聯(lián)物的二級結(jié)構(gòu)或者拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)可在增強(qiáng)其熱穩(wěn)定及酶耐受性的同時最大程度的保留其活性。本實(shí)驗(yàn)通過檢測聚氨基酸-干擾素α偶聯(lián)物刺激后的a549細(xì)胞抵抗腦心肌炎病毒(emcv)的活性來判斷其體外的抗病毒活性。具體測定步驟為：將a549細(xì)胞儀8000～10000個細(xì)胞/孔的密度鋪板至黑色不透明的96孔板中，24小時后，待細(xì)胞完全貼壁，加入梯度稀釋于10％fbs，dmem培養(yǎng)基中(10μg/ml,3倍比稀釋，共14個濃度點(diǎn))的聚氨基酸-干擾素偶聯(lián)物(100μl/孔)，與細(xì)胞共孵育24小時后，吸走蛋白液，加入一定濃度的emcv病毒液(稀釋至2％fbs，dmem培養(yǎng)基中，加入病毒的量須確保未加蛋白的細(xì)胞48小時后全部病變)，以未加蛋白和病毒的孔為細(xì)胞存活100％的對照，以未加蛋白只加病毒的孔為細(xì)胞存活0％的對照，48小時后利用celltiterluminescentcellviabilityassay(普洛麥格)檢測細(xì)胞活力，以判斷各種偶聯(lián)物的抗病毒活性。表2實(shí)施例34：wt-ifnα與各聚氨基酸-干擾素α偶聯(lián)物的血藥濃度測定本實(shí)施例中，采用sd雌性大鼠作為動物活體實(shí)驗(yàn)對象，對sd大鼠進(jìn)行頸靜脈插管手術(shù)，恢復(fù)48小時后，按150μg/kg的劑量通過靜脈插管注射待測樣品，每種藥物實(shí)驗(yàn)數(shù)量為3只，分別在1min,15min,30min,1h,3h,6h,9h,12h,24h,48h,72h小時取血。冰上保存半小時后，4000g離心取上清保存于-80℃。血清通過elisa方法檢測其中的ifnα含量，各蛋白質(zhì)樣品在血液中的濃度變化曲線如圖19所示，其中血藥濃度半衰期(t1/2)如表2所示。蛋白聚氨基酸偶聯(lián)物表現(xiàn)出遠(yuǎn)高于wt-ifnα2b的血藥濃度半衰期，并且偶聯(lián)有l(wèi)型聚氨基酸的偶聯(lián)物效果強(qiáng)(t1/2＝9.6h)與已在臨床應(yīng)用的佩樂能幾乎一致(t1/2＝9.8h)，強(qiáng)于與偶聯(lián)有d,l型聚氨基酸的偶聯(lián)物(t1/2＝7.8h)，證明聚氨基酸的二級結(jié)構(gòu)會調(diào)整蛋白聚氨基酸偶聯(lián)物整體的二級結(jié)構(gòu)從而改善其的各種生物學(xué)性質(zhì)與功能。而環(huán)狀的聚氨基酸-干擾素α偶聯(lián)物的血液循環(huán)時間(t1/2＝7.5h)長于其環(huán)化前的血液循環(huán)時間(t1/2＝6.5h)，說明聚氨基酸-干擾素α偶聯(lián)物的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)對其血液循環(huán)同樣具有較大影響。實(shí)施例35：wt-ifnα,聚氨基酸p2(n＝20,m＝3)-ifnα偶聯(lián)物與環(huán)狀(聚氨基酸p2(n＝20,m＝3)-ifnα)偶聯(lián)物的體內(nèi)抗腫瘤活性本實(shí)施例中，以人卵巢癌腫瘤細(xì)胞ovcar-3為研究的腫瘤細(xì)胞系，在六周齡的balb/c雌性裸鼠體內(nèi)構(gòu)建腫瘤模型。將細(xì)胞以107/200μl的密度懸浮在1640/基質(zhì)膠(1：1混合)中，200μl/只裸鼠注射入裸鼠右側(cè)前胸部皮下，三周后，腫瘤大小約為30mm3，將老鼠隨機(jī)分為四組，每組5只，分別注射pbs,wt-ifnα，聚氨基酸p2(n＝20,m＝3)-ifnα偶聯(lián)物與環(huán)狀(聚氨基酸p2(n＝20,m＝3)-ifnα)偶聯(lián)物，劑量為20μg干擾素α/只裸鼠，注射體積為100μl，給藥頻率為每周一次，每隔3天監(jiān)測一次腫瘤大小和裸鼠體重。實(shí)施例36：cys-人表皮生長因子受體2結(jié)合片段(cys-her2fab抗體)的表達(dá)及純化將攜帶有cys-her2fab(半胱氨酸插入到輕鏈的n端)抗體的質(zhì)粒通過化學(xué)轉(zhuǎn)化至top10大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，在10mllb培養(yǎng)基中37℃，250rpm活化過夜，按照1:100的比例接種至1ltb培養(yǎng)基中，在37℃,250rpm的條件下?lián)u至od600＝0.8左右，加入終濃度為0.2％的阿拉伯糖誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，30℃，200rpm表達(dá)16～20h。表達(dá)結(jié)束后，6500rpm離心30min,收集菌體。加入150ml裂解液(30mmtris,1mmedta,ph8.0,20％蔗糖)，室溫下輕輕攪拌半個小時，使菌體均勻分散在裂解液中，加入終濃度為0.2mg/ml的溶菌酶,2.5u/l全能核酸酶，37℃，250rpm搖30min，裂解液先后經(jīng)過6500rpm和12000g離心各30min，每次都保留上清液。將上清液過0.22μm濾膜，經(jīng)過proteing樹脂純化，上樣后用醋酸鈉緩沖液(ph4.5)沖洗4～5個柱體積，50mm,ph2.8甘氨酸溶液(5～8個柱體積)洗脫抗體，得到cys-her2fab抗體。經(jīng)二硫蘇糖醇還原后利用uplc-ms確認(rèn)蛋白的分子量。理論值抗體重鏈分子量為24305，輕鏈分子量為23674。經(jīng)儀器確認(rèn)所得抗體重鏈分子量為24310，輕鏈分子量為23682，分子量與理論計算值相符合(誤差在允許范圍內(nèi))。因此可確認(rèn)所得抗體為目標(biāo)抗體。實(shí)施例37：聚氨基酸p1(n＝7)與cys-her2fab抗體通過自然化學(xué)連接的偶聯(lián)反應(yīng)cys-her2fab(5mg/ml，50μl，1.0當(dāng)量)與聚氨基酸p1(n＝7)(30當(dāng)量)混合，室溫反應(yīng)10～12小時?；旌衔锝?jīng)過fplc純化，得到聚氨基酸p1(n＝7)-her2fab抗體偶聯(lián)物，經(jīng)過蛋白質(zhì)凝膠電泳表征其純度和分子量。經(jīng)二硫蘇糖醇還原后抗體的重鏈和輕鏈解開，得到分子量約減半的條帶，如圖21所示。純化后得到的產(chǎn)物相對于反應(yīng)前的抗體均向高分子量處位移且還原前條帶均一，說明聚氨基酸接枝成功，且產(chǎn)物純度較高，其中產(chǎn)物產(chǎn)率為26％。由上可見，本公開的蛋白質(zhì)-高分子雜化材料具有制備工藝簡單、可控性高等特點(diǎn)，從而大幅降低蛋白質(zhì)類藥物的修飾成本，并且使其體內(nèi)性質(zhì)變得更加穩(wěn)定，進(jìn)一步改善血液循環(huán)時間并有效地發(fā)揮生物學(xué)和藥理學(xué)效應(yīng)。盡管參考特定的實(shí)施例來描述本文所述的實(shí)施方案，但是應(yīng)當(dāng)理解，本領(lǐng)域技術(shù)人員會對其作出多種調(diào)整和改變，只要其不違背本公開的范圍和主旨即可。sequencelisting<110>北京大學(xué)<120>制備蛋白質(zhì)-聚氨基酸環(huán)狀偶聯(lián)物的方法<130>16c12158cn<160>3<170>patentinversion3.3<210>1<211>275<212>prt<213>人工序列<400>1metgluasnleutyrpheglncysleuasnaspilepheglualagln151015lysileglutrphisglumetvalserlysglyglugluleuphethr202530glyvalvalproileleuvalgluleuaspglyaspvalasnglyhis354045lyspheservalserglygluglygluglyaspalathrtyrglylys505560leuthrleulyspheilecysthrthrglylysleuprovalprotrp65707580prothrleuvalthrthrleuthrtyrglyvalglncyspheserarg859095tyrproasphismetlysglnhisaspphephelysseralametpro100105110gluglytyrvalglngluargthrilephephelysaspaspglyasn115120125tyrlysthrargalagluvallysphegluglyaspthrleuvalasn130135140argilegluleulysglyileaspphelysgluaspglyasnileleu145150155160glyhislysleuglutyrasntyrasnserhisasnvaltyrilemet165170175alaasplysglnlysasnglyilelysvalasnphelysilearghis180185190asnilegluaspglyservalglnleualaasphistyrglnglnasn195200205thrproileglyaspglyprovalleuleuproaspasnhistyrleu210215220serthrglnseralaleuserlysaspproasnglulysargasphis225230235240metvalleuleugluphevalthralaalagly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