本發(fā)明屬藥物制劑領(lǐng)域，涉及一種多肽修飾的靶向納米遞藥系統(tǒng)，具體地說是腫瘤穿透肽RGERPPR修飾的主動靶向多功能納米遞藥系統(tǒng)及制備方法和用途。

背景技術(shù)：

癌癥是世界上大多數(shù)國家面臨的主要公共衛(wèi)生問題，是全球第二大死亡原因。目前，化學(xué)療法仍然是臨床中治療癌癥的最有效的方法之一。然而，由于常規(guī)的化療藥物在體內(nèi)無法被實時示蹤，其在腫瘤組織的分布情況無法得知，因此無法為藥物的臨床有效性提供及時反饋。這也是腫瘤化療無法實現(xiàn)個體化治療的主要原因，被很多科學(xué)家認(rèn)為是目前傳統(tǒng)化療臨床上面臨的主要問題，急需一種有效技術(shù)加以解決。

診療一體化整合了癌癥診斷和癌癥治療的功能，已經(jīng)成為癌癥治療的新趨勢。隨著納米科學(xué)和納米技術(shù)的快速發(fā)展，納米醫(yī)學(xué)的建立和發(fā)展為癌癥等主要疾病的早期診斷和精準(zhǔn)治療提供了一個新的多功能平臺。新型納米探針可以整合診斷和治療的功能，可以同時實現(xiàn)腫瘤的成像和治療。

核磁共振成像(MRI)是一種無創(chuàng)傷性診斷技術(shù)，具有較高的空間分辨率，目前臨床上廣泛應(yīng)用于腫瘤成像。MRI造影劑通常用來增強正常組織和病變組織之間的對比度，從而提高診斷的準(zhǔn)確性。經(jīng)過多年來的發(fā)展，造影劑大致分為T1造影劑和T2造影劑，目前T1造影劑主要提供更明亮的圖像，而T2造影劑通常是產(chǎn)生更暗的圖像。雖然T1和T2造影劑的發(fā)展已經(jīng)取得了成功，但是這種單一模式的造影劑各有優(yōu)缺點，日益面臨著新的挑戰(zhàn)。因此，對T1-T2雙模式核磁共振成像造影劑的開發(fā)是極具吸引力的，因為兩個不同成像模式(T1和T2)可以同時利用，提供高度準(zhǔn)確的診斷信息。

阿霉素是常用的抗腫瘤藥物之一，抗瘤譜較為廣泛，屬于細(xì)胞周期非特異性藥物，對處于各生長周期的腫瘤細(xì)胞都會有殺傷作用。但是其臨床療效受制于嚴(yán)重的心毒性等副作用，故治療效果并不是太理想。靶向藥物遞送系統(tǒng)，尤其是配體修飾的腫瘤主動靶向遞藥系統(tǒng)，由于其精確的腫瘤靶向能力，增強了抗腫瘤功效和降低了全身毒副作用等優(yōu)點而受到越來越多的關(guān)注。靶向配體如肽，抗體及其片段，在腫瘤靶向中起關(guān)鍵作用，其通過與腫瘤組織中特異性表達的受體相互作用而介導(dǎo)納米遞藥系統(tǒng)的細(xì)胞內(nèi)吞。NPR-1是一種在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤和腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞表面均有高表達的受體。RGERPPR多肽，NPR-1的特異性配體，是一種腫瘤穿透肽，具有穿透腫瘤血管壁和腫瘤組織的能力。RGERPPR修飾的遞藥系統(tǒng)與腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞表面和腫瘤細(xì)胞表面NPR-1受體特異性結(jié)合，穿透腫瘤血管壁和腫瘤細(xì)胞，進入腫瘤細(xì)胞，發(fā)揮阿霉素的抗腫瘤生長作用，實現(xiàn)對膠質(zhì)母細(xì)胞瘤靶向治療的目的。并且可以提高遞藥系統(tǒng)的腫瘤選擇性，改善了藥動學(xué)行為，增加了耐受劑量，減少了副作用，并提高了抗腫瘤效果。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于針對遞藥系統(tǒng)在體內(nèi)缺少示蹤、療效差的問題，提供一種腫瘤穿透肽RGERPPR修飾的腫瘤靶向多功能納米遞藥系統(tǒng)，F(xiàn)e₃O₄/SiO₂/mSiO₂/DOX-(Gd-DTPA)-PEG-RGE用于腫瘤診斷和腫瘤治療的診療一體化。本發(fā)明的遞藥系統(tǒng)Fe₃O₄/SiO₂/mSiO₂/DOX-(Gd-DTPA)-PEG-RGE可以通過靜脈注射給藥，由RGERPPR介導(dǎo)作用和腫瘤EPR效應(yīng)靶向至腫瘤組織，殺死腫瘤細(xì)胞，另外，其將T1造影劑Gd-DTPA與T2造影劑Fe₃O₄同時利用，可以通過核磁共振成像示蹤納米藥物，提供高度準(zhǔn)確的診斷信息，從而實現(xiàn)腫瘤診斷和腫瘤治療的診療一體化。

本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的：

一種腫瘤靶向多功能納米遞藥系統(tǒng)，F(xiàn)e₃O₄/SiO₂/mSiO₂/DOX-(Gd-DTPA)-PEG-RGE，特點在于該遞藥系統(tǒng)由腫瘤穿透肽RGERPPR修飾的多功能納米粒及抗腫瘤藥物構(gòu)成，所述多功能納米粒為T1-T2雙模磁共振造影劑；所述抗腫瘤藥物為阿霉素或表阿霉素；其抗腫瘤藥物在系統(tǒng)中重量百分比為10％-35％。其結(jié)構(gòu)如下：

其中：遞藥系統(tǒng)為納米粒，粒徑在60-200nm，粒徑分布PDI為0.10-0.60，n為聚合度，n＝9-227。

一種上述納米遞藥系統(tǒng)的制備方法，該方法包括以下具體步驟：

步驟1：制備Fe₃O₄納米粒子

1.39-5.56g油酸鐵在30℃真空干燥箱靜置24小時后，加入0.24-0.96mL十八烯；混合物以升溫速率3.3℃min^-1加熱至320℃，然后保持在該溫度下反應(yīng)60分鐘。反應(yīng)后，冷卻至室溫，經(jīng)5-20mL正己烷和20-80mL丙酮洗滌、離心，得到Fe₃O₄納米粒子；

步驟2：制備Fe₃O₄/SiO₂納米粒子

3.4-13.6mg Fe₃O₄納米粒子和4-16mL Igepal CO-520溶解在85-340mL環(huán)己烷中，超生30分鐘。然后，滴加0.65-2.6mL氨水，得到透明的反相微乳液。再滴加0.75-3mLTEOS，在室溫下以600轉(zhuǎn)/分鐘反應(yīng)72小時。加入丙酮破乳，離心分離，經(jīng)甲醇洗滌，收集Fe₃O₄/SiO₂納米粒子；

步驟3：制備Fe₃O₄/SiO₂/mSiO₂納米粒子

1-4g CTAC和Fe₃O₄/SiO₂納米粒子溶解在10-40mL水中，超生30分鐘。然后，加入41-164μLTEA，80℃反應(yīng)60分鐘。再加入0.75-3mL TEOS，在室溫下以600轉(zhuǎn)/分鐘反應(yīng)60分鐘。加入丙酮破乳，離心分離，經(jīng)甲醇洗滌。再用1％NaCl甲醇溶液，在60℃回流3小時，離心分離，重復(fù)5次，移除CTAC，收集Fe₃O₄/SiO₂/mSiO₂納米粒子；

步驟4：制備Fe₃O₄/SiO₂/mSiO₂-NH₂納米粒子

25-100mg Fe₃O₄/SiO₂/mSiO₂溶解在25-100mL乙醇中，加入50-200μL APTES攪拌4小時，離心分離，收集Fe₃O₄/SiO₂/mSiO₂-NH₂納米粒子；

步驟5：制備Fe₃O₄/SiO₂/mSiO₂-(Gd-DTPA)納米粒子

25-100mg DTPA和Fe₃O₄/SiO₂/mSiO₂-NH₂溶解在10-40mL水中，40℃攪拌3小時，再加入50-200mgGdCl₃，攪拌12小時，用水洗滌，收集Fe₃O₄/SiO₂/mSiO₂-(Gd-DTPA)納米粒子。

步驟6：制備Fe₃O₄/SiO₂/mSiO₂-(Gd-DTPA)-PEG-RGE納米粒子

25-100mg RGERPPR-PEG-COOH和Fe₃O₄/SiO₂/mSiO₂-(Gd-DTPA)溶解在10-40mL乙醇中，40℃攪拌3小時，用乙醇和水洗滌，收集Fe₃O₄/SiO₂/mSiO₂-(Gd-DTPA)-PEG-RGE納米粒子。

步驟7：制備Fe₃O₄/SiO₂/mSiO₂/DOX-(Gd-DTPA)-PEG-RGE納米粒子

0.5-2mL溶度為0.33mg/mL的DOX PBS溶液和Fe₃O₄/SiO₂/mSiO₂-(Gd-DTPA)-PEG-RGE，攪拌12小時，收集Fe₃O₄/SiO₂/mSiO₂/DOX-(Gd-DTPA)-PEG-RGE納米粒子，該納米粒子為所述納米遞藥系統(tǒng)，其紫外測量DOX載藥量為10-35％。

所述RGERPPR-PEG-COOH中PEG分子量為400-10000。

所述離心分離的轉(zhuǎn)速為2000-12000轉(zhuǎn)/分鐘，5-30分鐘。

所述納米遞藥系統(tǒng)的應(yīng)用，特點在于該遞藥系統(tǒng)用于腦膠質(zhì)瘤治療藥物的靶向遞送。

對本發(fā)明的納米遞藥系統(tǒng)分別作了如下測定：

測定所述納米遞藥系統(tǒng)的粒徑；

測定所述納米遞藥系統(tǒng)弛豫率；

測定所述納米遞藥系統(tǒng)對U87MG細(xì)胞的攝??；

測定所述納米遞藥系統(tǒng)在腦膠質(zhì)瘤裸鼠體內(nèi)的核磁共振成像；

測定所述納米遞藥系統(tǒng)對腦膠質(zhì)瘤腫瘤生長的抑制作用。

測定結(jié)果表明，本發(fā)明的納米遞藥系統(tǒng)可用作腫瘤影像診斷示蹤藥物，也可用作抗腫瘤藥物的遞送，腫瘤診斷和腫瘤治療的一體化。

本發(fā)明的遞藥系統(tǒng)提供一種腫瘤穿透肽RGERPPR修飾的腫瘤靶向多功能納米遞藥系統(tǒng)，F(xiàn)e₃O₄/SiO₂/mSiO₂/DOX-(Gd-DTPA)-PEG-RGE用于腫瘤診斷和腫瘤治療的診療一體化。本發(fā)明的遞藥系統(tǒng)Fe₃O₄/SiO₂/mSiO₂/DOX-(Gd-DTPA)-PEG-RGE可以通過靜脈注射給藥，由RGERPPR介導(dǎo)作用和腫瘤EPR效應(yīng)靶向至腫瘤組織，殺死腫瘤細(xì)胞，另外，其將T1造影劑Gd-DTPA與T2造影劑Fe₃O₄同時利用，可以通過核磁共振成像示蹤納米藥物，提供高度準(zhǔn)確的診斷信息，從而實現(xiàn)腫瘤診斷和腫瘤治療的診療一體化。

附圖說明

圖1為本發(fā)明Fe₃O₄/SiO₂/mSiO₂/DOX-(Gd-DTPA)-PEG-RGE遞藥系統(tǒng)制備路線圖；

圖2為本發(fā)明Fe₃O₄/SiO₂/mSiO₂/DOX-(Gd-DTPA)-PEG-RGE透射電鏡圖；

圖3為本發(fā)明Fe₃O₄/SiO₂/mSiO₂/DOX-(Gd-DTPA)-PEG-RGE弛豫率實驗圖；

圖4為本發(fā)明Fe₃O₄/SiO₂/mSiO₂/DOX-(Gd-DTPA)-PEG-RGE細(xì)胞定性定量攝取實驗圖；

圖5為本發(fā)明Fe₃O₄/SiO₂/mSiO₂/DOX-(Gd-DTPA)-PEG-RGE核磁共振成像實驗圖；

圖6為本發(fā)明Fe₃O₄/SiO₂/mSiO₂/DOX-(Gd-DTPA)-PEG-RGE動物療效實驗圖。

具體實施方式

為了更好的理解本發(fā)明，下面用實施例來進一步闡明本發(fā)明，但本發(fā)明的內(nèi)容不僅僅局限于下面實施例。

實施例1

制備Fe₃O₄納米粒子

2.78g油酸鐵在30℃真空干燥箱靜置24小時后，加入0.48mL十八烯?；旌衔镆陨郎厮俾?.3℃min^-1加熱至320℃，然后保持在該溫度下反應(yīng)60分鐘。反應(yīng)后，冷卻至室溫，經(jīng)10mL正己烷和40mL丙酮洗滌、離心，得到Fe₃O₄納米粒子。

實施例2

制備Fe₃O₄/SiO₂納米粒子

6.8mg Fe₃O₄納米粒子和8mL Igepal CO-520溶解在170mL環(huán)己烷中，超生30分鐘。然后，滴加1.3mL氨水，得到透明的反相微乳液。再滴加1.5mLTEOS，在室溫下以600轉(zhuǎn)/分鐘反應(yīng)72小時。加入丙酮破乳，離心分離，經(jīng)甲醇洗滌，收集Fe₃O₄/SiO₂納米粒子。

實施例3

制備Fe₃O₄/SiO₂/mSiO₂納米粒子

2g CTAC和Fe₃O₄/SiO₂納米粒子溶解在20mL水中，超生30分鐘。然后，加入82μLTEA，80℃反應(yīng)60分鐘。再加入1.5mL TEOS，在室溫下以600轉(zhuǎn)/分鐘反應(yīng)60分鐘。加入丙酮破乳，離心分離，經(jīng)甲醇洗滌。再用1％NaCl甲醇溶液，在60℃回流3小時，離心分離，重復(fù)5次，移除CTAC，收集Fe₃O₄/SiO₂/mSiO₂納米粒子。

實施例4

制備Fe₃O₄/SiO₂/mSiO₂-NH₂納米粒子

50mg Fe₃O₄/SiO₂/mSiO₂溶解在50mL乙醇中，加入100μL APTES攪拌4小時，離心分離，收集Fe₃O₄/SiO₂/mSiO₂-NH₂納米粒子。

實施例5

制備Fe₃O₄/SiO₂/mSiO₂-(Gd-DTPA)納米粒子

50mg DTPA和Fe₃O₄/SiO₂/mSiO₂-NH₂溶解在20mL水中，40℃攪拌3小時，再加入100mgGdCl₃，攪拌12小時，用水洗滌，收集Fe₃O₄/SiO₂/mSiO₂-(Gd-DTPA)納米粒子。

實施例6

制備Fe₃O₄/SiO₂/mSiO₂-(Gd-DTPA)-PEG-RGE納米粒子

50mg RGERPPR-PEG-COOH和Fe₃O₄/SiO₂/mSiO₂-(Gd-DTPA)溶解在20mL乙醇中，40℃攪拌3小時，用乙醇和水洗滌，收集Fe₃O₄/SiO₂/mSiO₂-(Gd-DTPA)-PEG-RGE納米粒子。

實施例7

制備Fe₃O₄/SiO₂/mSiO₂/DOX-(Gd-DTPA)-PEG-RGE納米粒子

1mL溶度為0.33mg/mL的DOX PBS溶液和Fe₃O₄/SiO₂/mSiO₂-(Gd-DTPA)-PEG-RGE，攪拌12小時，收集Fe₃O₄/SiO₂/mSiO₂/DOX-(Gd-DTPA)-PEG-RGE納米粒子，紫外測量DOX載藥量為27.2％。

實施例8

將Fe₃O₄(圖2A)、Fe₃O₄/SiO₂(圖2B)、Fe₃O₄/SiO₂/SiO₂(圖2C)和Fe₃O₄/SiO₂/mSiO₂(圖2D)形態(tài)通過透射電子顯微鏡來觀察，具體如下：(1)滴一滴樣品溶液于銅網(wǎng)上，(2)空氣中干燥約10分鐘，用濾紙吸去多余的液體，(3)待樣品干燥后置于透射電鏡下觀察。圖2結(jié)果顯示納米粒形態(tài)均比較規(guī)則，呈球形。

實施例9

使用3T MRI測量不同Gd濃度下探針的T1弛豫時間和T2弛豫時間。以Gd濃度和馳豫時間1/T1的線性曲線的斜率計算相應(yīng)的r1，以Fe濃度和馳豫時間1/T2的線性曲線的斜率計算相應(yīng)的r2。Fe₃O₄/SiO₂/mSiO₂/DOX-(Gd-DTPA)-PEG-RGE稀釋在蒸餾水中，Gd濃度范圍為0.1-0.5mM。將樣品轉(zhuǎn)移到96孔板中，并用以下參數(shù)測量T1弛豫時間：TR＝7000ms，TE＝11ms，TI＝24，100，200，400，600，900，1200，2000，3000和5000ms，F(xiàn)OV＝120×85mm，average＝1。以下參數(shù)測量T2弛豫時間：TR＝3000ms，TE＝14.3ms，F(xiàn)OV＝87x280mm，matrix＝240x768，slice thickness＝5mm，average＝1。實驗結(jié)果如圖3所示，Gd-DTPA的r1弛豫率6.13mM^-1S^-1，F(xiàn)e₃O₄的r2弛豫率36.89mM^-1S^-1。

實施例10

體外細(xì)胞攝?。阂訳87MG細(xì)胞為模型，將細(xì)胞以3×10⁴cells/ml的密度種于24孔板中培養(yǎng)24小時，然后用載有熒光染料DIO的Fe₃O₄/SiO₂/mSiO₂/DOX-(Gd-DTPA)-PEG和Fe₃O₄/SiO₂/mSiO₂/DOX-(Gd-DTPA)-PEG-RGE藥物處理4h。加藥處理后用PBS洗滌三次，分別用激光共聚焦定性和流式細(xì)胞儀定量評價細(xì)胞攝取情況。用激光共聚焦定性分析需要將細(xì)胞核用Hochest染成藍色。流式細(xì)胞儀分析的細(xì)胞先用PBS洗滌三次，用用PBS洗滌，消化、離心，將沉淀重懸，流式細(xì)胞儀檢測。如圖4B所示，激光共聚焦結(jié)果定性觀察顯示，腫瘤穿透肽修飾的Fe₃O₄/SiO₂/mSiO₂/DOX-(Gd-DTPA)-PEG-RGE容易被細(xì)胞攝取。流式細(xì)胞儀定量考察結(jié)果也顯示，F(xiàn)e₃O₄/SiO₂/mSiO₂/DOX-(Gd-DTPA)-PEG-RGE納米粒子容易被細(xì)胞攝取。

實施例11

進行MR成像研究。在裸鼠接種U87MG細(xì)胞兩周后，通過腹膜內(nèi)注射戊巴比妥鈉(50μL，2.5％，50mg/kg)將小鼠(n＝3)麻醉。MR圖像在具有動物線圈的3T MRI掃描儀上獲得。通過尾靜脈以0.07mmol-Gd/kg體重的劑量注射Fe₃O₄/SiO₂/mSiO₂/DOX-(Gd-DTPA)-PEG-RGE(C T1和D T2)，并且用相同劑量的Fe₃O₄/SiO₂/mSiO₂/DOX-(Gd-DTPA)-PEG(A T1和B T2)作為對照。在不同時間點進行掃描。用于圖像采集的T1序列參數(shù)如下：TR＝400ms，TE＝14ms，α＝90°，F(xiàn)OV＝45(60，75％)mm，slice thickness＝1mm，image matrix＝256×256。T2的測量參數(shù)為：TR＝3500ms，TE＝71ms，F(xiàn)OV＝70(70，100％)mm，matrix＝256x256，slice thickness＝1.2mm。實驗結(jié)果如圖5所示，F(xiàn)e₃O₄/SiO₂/mSiO₂/DOX-(Gd-DTPA)-PEG-RGE在8小時有較好的造影效果，腫瘤穿透肽RGERPPR介導(dǎo)作用和腫瘤EPR效應(yīng)使Fe₃O₄/SiO₂/mSiO₂/DOX-(Gd-DTPA)-PEG-RGE在腫瘤部位富集，為腫瘤診斷和腫瘤治療的診療一體化提供了可行性。

實施例12

將U87MG細(xì)胞按常規(guī)條件(37℃，5％CO₂)培養(yǎng)，待細(xì)胞融合度達到80-90％時，用含EDTA的0.25％胰酶消化細(xì)胞并離心收集，用PH 7.4 PBS洗滌細(xì)胞兩次計數(shù)，制備成終濃度為5×10⁶個/mL的單細(xì)胞懸液，用1mL注射器將細(xì)胞接種到裸鼠的右肩皮下，每只裸鼠接種0.1mL，當(dāng)腫瘤長至100-120mm³時備用。當(dāng)腫瘤長至100-120mm³時(記作0天)，將荷瘤小鼠隨機分成4組，每組6只，分別設(shè)為生理鹽水對照組，DOX(5mg/kg)組，F(xiàn)e₃O₄/SiO₂/mSiO₂/DOX-(Gd-DTPA)-PEG(5mg/kg)組，F(xiàn)e₃O₄/SiO₂/mSiO₂/DOX-(Gd-DTPA)-PEG-RGE(5mg/kg)組，尾靜脈注射給藥,考察如下指標(biāo)：

腫瘤生長曲線：每兩天用游標(biāo)卡尺測量腫瘤的長徑和短徑，根據(jù)公式v＝1/2(長徑*短徑²)，計算腫瘤的體積，繪制腫瘤體積隨時間變化的生長曲線。

療效實驗結(jié)果如圖6所示，與生理鹽水對照組相比，F(xiàn)e₃O₄/SiO₂/mSiO₂/DOX-(Gd-DTPA)-PEG-RGE組表現(xiàn)出明顯的抑制腫瘤生長的效果。