本發(fā)明屬于納米生物醫(yī)藥材料領(lǐng)域，涉及一種同時(shí)負(fù)載納米銀和姜黃素的納米抗菌劑的制備方法及其在增強(qiáng)抗菌活性中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

近年來，多藥耐藥細(xì)菌的快速出現(xiàn)已成為一個(gè)日益嚴(yán)重的全球性問題，世界衛(wèi)生組織將其認(rèn)定為人類健康的三大威脅之一。因此，探索具有良好安全性和強(qiáng)抗菌活性且不會(huì)產(chǎn)生細(xì)菌耐藥性的新抗菌劑是當(dāng)務(wù)之急。為此，人們廣泛研究了各種抗菌材料，如抗菌肽、陽(yáng)離子聚合物、碳基納米材料、聚合物和無機(jī)納米粒子，以提高抗菌性能。然而，單一療法已不足以完全應(yīng)對(duì)復(fù)雜的細(xì)菌感染。例如，醫(yī)生常會(huì)使用兩種或更多種抗菌藥物來增加對(duì)結(jié)核分支桿菌患者的治療效果。因此，對(duì)新型高效的聯(lián)合治療的開發(fā)正成為治療細(xì)菌感染的關(guān)鍵。

被普遍用于消費(fèi)產(chǎn)品的銀納米粒子，由于其廣譜抗菌活性、有限的細(xì)菌耐藥性和對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞相對(duì)較低的毒性，被認(rèn)為是最好的抗菌劑之一。銀納米粒子可以增加細(xì)菌膜的通透性，從而滲透到細(xì)菌的細(xì)胞質(zhì)中，使其蛋白變性并干擾DNA復(fù)制，最終導(dǎo)致細(xì)菌死亡。因此，研究者們做出了巨大努力，通過將銀納米粒子與常規(guī)抗生素（如氨芐青霉素、青霉素G、紅霉素、卡那霉素和萬(wàn)古霉素等）結(jié)合，以實(shí)現(xiàn)針對(duì)革蘭氏陰性和革蘭氏陽(yáng)性菌的協(xié)同抗菌效果。然而，這些方法也可能存在一些問題，如銀納米粒子的聚集、較高的成本以及抗生素的副作用等。

大量研究表明，使用適當(dāng)?shù)妮d體材料，包括季銨化合物、二氧化硅納米粒子、氧化石墨烯、碳納米管和聚合物結(jié)構(gòu)，可以有效負(fù)載銀納米粒子并阻止其急劇降低抗菌效率的聚集。在各種各樣可選擇的模板中，由兩親性嵌段共聚物自組裝形成的聚合物膠束是一個(gè)值得推薦的銀納米粒子載體，因?yàn)樗哂卸喙δ苄钥烧{(diào)的組成和在生物醫(yī)藥應(yīng)用中獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。此外，聚合物膠束也為同時(shí)遞送不同治療藥物提供了機(jī)會(huì)。

姜黃素是一種天然多酚化合物，可以從草本植物姜黃的根莖中提取。它是一種高效、無毒、廉價(jià)的藥物，具有廣泛的生物活性，如抗癌、抗HIV、抗氧化、抗炎和抗菌。近期研究表明，當(dāng)姜黃素結(jié)合其它試劑（包括乳鐵蛋白，N-乙酰半胱氨酸和抗生素）使用時(shí)，它可以發(fā)揮協(xié)同抗菌的效果。但因姜黃素水溶性差、生物利用度低，其臨床發(fā)展極其有限。幸運(yùn)的是，聚合物膠束可以作為合適的納米載體克服這些問題。因此，利用聚合物膠束制備一種同時(shí)負(fù)載納米銀和姜黃素的納米抗菌劑是一種非常具有前途聯(lián)合抗菌方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種同時(shí)負(fù)載納米銀和姜黃素的聚合物膠束及其制備方法。并對(duì)本發(fā)明用于發(fā)揮納米銀和姜黃素的協(xié)同抗菌能力進(jìn)行評(píng)估。

本發(fā)明的聚合物膠束體系將具備以下一些優(yōu)勢(shì)：1）能夠克服納米銀自身容易聚集的缺點(diǎn)，提高其在水體系中的分散性和穩(wěn)定性；2）提高疏水性姜黃素在水中的溶解性和生物利用度；3）組成聚合物膠束的嵌段共聚物具有良好的生物相容性和生物可降解性；4）同時(shí)負(fù)載納米銀和姜黃素，能夠根據(jù)兩者的不同機(jī)制發(fā)揮協(xié)同抗菌的作用，增強(qiáng)抗菌效果；5）價(jià)廉易得的原料可以為以后的實(shí)際應(yīng)用提供方便。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明公開了如下的技術(shù)內(nèi)容：

一種同時(shí)負(fù)載納米銀和姜黃素的納米抗菌劑，其特征在于： 它是以兩親性嵌段共聚物PCL-b-PAsp在水溶液中自組裝形成PCL-b-PAsp聚合物膠束PM，利用親水性殼層中PAsp的負(fù)電性吸附帶正電的Ag⁺離子并通過還原劑將其原位還原成納米銀，再利用疏水性內(nèi)核PCL包裹天然無毒的抗菌成分姜黃素，從而形成既攜帶納米銀又同時(shí)負(fù)載姜黃素的聚合物膠束PM-Ag-Cur；其中PCL-b-PAsp聚合物膠束PM： 納米銀：姜黃素的重量份數(shù)比為10：1：2。

該納米抗菌劑具有良好的生物相容性和生物可將降解性，并且能夠克服納米銀自身容易聚集和姜黃素水溶性差的缺點(diǎn)，提高兩者的穩(wěn)定性和生物利用度，并根據(jù)各自不同的抗菌機(jī)制發(fā)揮協(xié)同抗菌的作用，增強(qiáng)抗菌效果。同時(shí)，價(jià)廉易得的原料和簡(jiǎn)單易行的制備方法使得這種納米抗菌劑易于推廣應(yīng)用。

本發(fā)明進(jìn)一步公開了同時(shí)負(fù)載納米銀和姜黃素的納米抗菌劑的制備方法，其特征在于步驟如下：

1）將5.0 mg PCL-b-PAsp溶解于1 mL DMF中，再將此聚合物溶液在電磁攪拌下，逐滴緩慢加入到9 mL磷酸鹽緩沖液，1 mM，pH=7.4中，然后將溶液在室溫下攪拌4 h使膠束穩(wěn)定，之后將溶液透析三天以完全除去體系中的DMF溶劑，得到PCL-b-PAsp聚合物膠束PM；

2）將100 μL 5 mg/mL AgNO₃溶液在冰水浴攪拌下逐滴緩慢加入到PCL-b-PAsp聚合物膠束PM，在黑暗環(huán)境下輕輕攪拌30 min后，快速加入100 μL 15 mg/mL 新鮮NaBH₄溶液，溶液迅速變色，繼續(xù)攪拌4 h，然后透析兩天得到PM-Ag溶液；

3）將1.0 mg姜黃素溶解于5 mL無水DMF中，并在磁力攪拌下逐滴加入到PM-Ag溶液中，在室溫下攪拌2 h后，將溶液透析兩天以除去體系中的DMF，最終得到同時(shí)負(fù)載納米銀和姜黃素的聚合物膠束PM-Ag-Cur。

其中聚環(huán)己內(nèi)酯-b-聚天冬氨酸（PCL-b-PAsp）的制備步驟如下：

1）將0.16 g N-(叔丁氧羰基)乙醇胺（1 mmol）和10.0 g ε-CL（87.8 mmol）加入到干燥的50 mL茄形瓶中混合，然后用20 mL重蒸的甲苯溶解均勻，加入一滴Sn(Oct)₂（0.1% wt/wt）；

2）液氮冷凍，抽真空，通氮?dú)猓鈨?，重?fù)此過程三次，之后在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，于110°C的油浴中反應(yīng)12 h；

3）反應(yīng)結(jié)束后冷至室溫，加入冰乙醚沉淀，靜置使其沉淀完全，經(jīng)抽濾洗滌，真空干燥后得到白色固體 PCL-NHBoc；

4）將上述3）中所得的PCL-NHBoc溶于三氟乙酸和二氯甲烷的混合溶劑（1/1，V/V）中，然后在室溫下攪拌12 h，反應(yīng)結(jié)束后，用冰乙醚沉淀，在冰箱中靜置過夜，抽濾洗滌，干燥得白色固體；

5）將4）中白色固體在三乙胺和二氯甲烷的混合溶劑（1/1，V/V）中室溫?cái)嚢?2 h，再用冰乙醚沉淀，抽濾，放入真空干燥箱中干燥得到大分子引發(fā)劑PCL-NH₂；

6）將2.0 g上述5）中得到的 PCL-NH₂（0.2 mmol）和2.5 g BLA-NCA（10 mmol）加入到干燥的茄形瓶中，加入15 mL二氯甲烷將其溶解均勻，然后液氮冷凍，抽真空，通氮?dú)?，解凍，重?fù)三次，之后在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，于30°C的油浴中反應(yīng)24 h；

7）反應(yīng)完成后，加入適量的二氯甲烷稀釋并用十倍體積的冰乙醚沉淀，抽濾洗滌，真空干燥后得到白色固體PCL-b-PBLA；

8）將1.0 g上述7）中得到的白色固體置于25 mL圓底燒瓶中， 用10 mL三氟乙酸溶解，然后依次加入1 mL苯甲醚和1 mL三氟甲磺酸，在0℃冰浴下攪拌2 h，之后用冰乙醚沉淀，抽濾洗滌，真空干燥得到嵌段共聚物PCL-b-PAsp。

本發(fā)明更進(jìn)一步公開了同時(shí)負(fù)載納米銀和姜黃素的納米抗菌劑在增強(qiáng)抗菌活性藥物方面的應(yīng)用；所述的增強(qiáng)抗菌活性指的對(duì)致病細(xì)菌有很好的協(xié)同殺滅效果。

本發(fā)明同時(shí)也公開了同時(shí)負(fù)載納米銀和姜黃素的納米抗菌劑在提高對(duì)銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌協(xié)同抗菌效率方面的應(yīng)用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與單獨(dú)負(fù)載納米銀或姜黃素的聚合物膠束相比，同時(shí)負(fù)載納米銀和姜黃素的納米抗菌劑具有更好的協(xié)同抗菌效果。

本發(fā)明更加詳細(xì)的描述如下：

（1）聚合物膠束：一種同時(shí)負(fù)載納米銀和姜黃素的聚合物膠束，以兩親性嵌段共聚物聚環(huán)己內(nèi)酯-b-聚天冬氨酸（PCL-b-PAsp）在水溶液中自組裝形成的膠束PM為基礎(chǔ)，親水性PAsp殼層中含有的大量羧基（-COOH）使膠束表面帶有負(fù)電荷，可以吸引帶正電的Ag⁺離子，隨后加入還原劑（如NaBH₄）將其原位還原為納米銀，而疏水性的PCL內(nèi)核可以包裹疏水性的姜黃素，從而形成既攜帶納米銀又同時(shí)負(fù)載姜黃素的聚合物膠束。

（2）同時(shí)負(fù)載納米銀和姜黃素的聚合物膠束的制備方法：

1）將5.0 mg PCL-b-PAsp用 1 mL DMF溶解均勻，再將此聚合物溶液在快速的電磁攪拌下，逐滴緩慢加入到9 mL磷酸鹽緩沖液（1 mM，pH=7.4）中，然后將溶液在室溫下勻速攪拌4 h使膠束穩(wěn)定，之后將溶液透析三天以完全除去體系中的DMF溶劑，得到PCL-b-PAsp膠束溶液；

2）在冰水浴攪拌下，將100 μL 5 mg/mL AgNO₃溶液逐滴緩慢加入到PCL-b-PAsp膠束溶液中，在黑暗環(huán)境下勻速攪拌30 min后，快速加入100 μL 15 mg/mL 新鮮NaBH₄溶液，溶液迅速變色，繼續(xù)攪拌4 h，然后透析兩天得到PM-Ag溶液；

3）將1.0 mg姜黃素用5 mL無水DMF溶解均勻，并在磁力攪拌下逐滴加入到PM-Ag溶液中，在室溫下攪拌2 h后，將溶液透析兩天以除去體系中的DMF，最終得到同時(shí)負(fù)載納米銀和姜黃素的聚合物膠束PM-Ag-Cur。

進(jìn)一步所述的聚環(huán)己內(nèi)酯-b-聚天冬氨酸（PCL-b-PAsp）的制備步驟如下：

1）將0.16 g N-(叔丁氧羰基)乙醇胺和10.0 g ε-CL加入到干燥的50 mL茄形瓶中混合，然后加入20 mL重蒸的甲苯溶解均勻，再加入一滴Sn(Oct)₂；

2）通過液氮冷凍，抽真空，通氮?dú)?，解凍，重?fù)此過程三次，之后在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，于110°C的油浴中反應(yīng)12 h；

3）反應(yīng)結(jié)束后將反應(yīng)瓶冷至室溫，然后加入冰乙醚沉淀，靜置使其沉淀完全，經(jīng)抽濾洗滌，真空干燥后得到白色固體 PCL-NHBoc；

4）將上述3）中所得的PCL-NHBoc均勻溶于三氟乙酸和二氯甲烷的混合溶劑中，然后在室溫下勻速攪拌12 h，反應(yīng)結(jié)束后，用冰乙醚沉淀，在冰箱中靜置過夜，抽濾洗滌，干燥得白色固體；

5）將4）中白色固體在三乙胺和二氯甲烷的混合溶劑中室溫?cái)嚢?2 h，再用冰乙醚沉淀，抽濾，放入真空干燥箱中干燥得到大分子引發(fā)劑PCL-NH₂；

6）將2.0 g上述5）中得到的 PCL-NH₂和2.5 g BLA-NCA加入到干燥的茄形瓶中，加入15 mL二氯甲烷將其溶解均勻，然后液氮冷凍，抽真空，通氮?dú)?，解凍，重?fù)三次，之后在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，于30°C的油浴中反應(yīng)24 h；

7）反應(yīng)完成后，加入適量的二氯甲烷稀釋并用十倍體積的冰乙醚沉淀，抽濾洗滌，真空干燥后得到白色固體PCL-b-PBLA；

8）將1.0 g上述7）中得到的白色固體置于25 mL圓底燒瓶中， 用10 mL三氟乙酸溶解，然后依次加入1 mL苯甲醚和1 mL三氟甲磺酸，在0°C冰浴下攪拌2 h，之后用冰乙醚沉淀，抽濾洗滌，真空干燥得到嵌段共聚物PCL-b-PAsp。

本發(fā)明更進(jìn)一步公開了所述的聚合物膠束對(duì)能夠分泌脂肪酶的銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌的抗菌能力的評(píng)估，步驟如下：

1）分別從含有銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌菌落的固體LB瓊脂平板上挑取單菌落于5 mL的液體LB培養(yǎng)基中，在37℃的搖床中孵育過夜；

2）將細(xì)菌懸液用LB培養(yǎng)基稀釋至10⁵ CFU/ml，然后與等體積的預(yù)先設(shè)定好濃度的不同聚合物膠束溶液混合，于37 ℃下孵育12 h；

3）使用多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)不同濃度溶液于600 nm檢測(cè)波長(zhǎng)下的光密度值OD₆₀₀，其中對(duì)照組樣品用超純水處理，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，然后通過數(shù)據(jù)處理比較得到PM-Ag-Cur的抗菌能力。

本發(fā)明公開的同時(shí)負(fù)載納米銀和姜黃素的納米抗菌劑及其制備方法與現(xiàn)有技術(shù)相比所具有的積極效果在于：

本發(fā)明利用兩親性嵌段共聚物形成的聚合物膠束作為納米載體，同時(shí)負(fù)載廣泛應(yīng)用的抗菌劑納米銀和天然無毒的植物化學(xué)成分姜黃素，用以增強(qiáng)抗菌活性，有如下的優(yōu)勢(shì)：1）制備簡(jiǎn)單；2）原料具有良好的生物相容性和生物可降解性，并且價(jià)廉易得，容易向臨床方向轉(zhuǎn)化；3）納米銀的使用可以降低細(xì)菌的耐藥性；4）聚合物膠束的脂溶性內(nèi)核PCL能夠被細(xì)菌分泌的脂肪酶降解，從而快速釋放出核內(nèi)的姜黃素，表現(xiàn)出細(xì)菌脂肪酶響應(yīng)性；5）與單獨(dú)負(fù)載納米銀或姜黃素相比，具有良好的協(xié)同抗菌能力。綜上，本發(fā)明的膠束體系具有很好的應(yīng)用前景。

附圖說明

圖1為同時(shí)負(fù)載納米銀和姜黃素的聚合物膠束的制備及作用機(jī)制示意圖；

圖2為制備的四種聚合物膠束（PM、PM-Cur、PM-Ag和PM-Ag-Cur）的物理化學(xué)性質(zhì)表征(A.四種聚合物膠束溶液的數(shù)碼照片；B.四種聚合物膠束的表面電位；C. 四種聚合物膠束的紫外吸收光譜；D.四種聚合物膠束的熒光光譜)；

圖3為制備的四種聚合物膠束的粒徑分布和透射電鏡（TEM）照片（A.沒有任何負(fù)載的聚合物膠束；B.單獨(dú)負(fù)載姜黃素的聚合物膠束；C. 單獨(dú)負(fù)載納米銀的聚合物膠束；D.同時(shí)負(fù)載納米銀和姜黃素的聚合物膠束）；

圖4為負(fù)載姜黃素的聚合物膠束在脂肪酶刺激下的響應(yīng)性釋放；

圖5為四種聚合物膠束在不同濃度下抗菌能力的比較（A. 銅綠假單胞菌；B.金黃色葡萄球菌）。

具體實(shí)施方式

下面通過具體的實(shí)施方案敘述本發(fā)明。除非特別說明，本發(fā)明中所用的技術(shù)手段均為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的方法。另外，實(shí)施方案應(yīng)理解為說明性的，而非限制本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的實(shí)質(zhì)和范圍僅由權(quán)利要求書所限定。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，在不背離本發(fā)明實(shí)質(zhì)和范圍的前提下，對(duì)這些實(shí)施方案中的物料成分和用量進(jìn)行的各種改變或改動(dòng)也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明所用原料N-(叔丁氧羰基)乙醇胺、辛酸亞錫（Sn(Oct)₂）、三氟乙酸、ε-己內(nèi)酯（ε-CL）、L-天冬氨酸-4-芐酯-N-羧基環(huán)內(nèi)酸酐（BLA-NCA）、三氟甲磺酸、甲苯、二氯甲烷、N,N-二甲基甲酰胺（DMF）、硝酸銀（AgNO₃）、硼氫化鈉（NaBH₄）、姜黃素均有市售。

實(shí)施例1

一種同時(shí)負(fù)載納米銀和姜黃素的納米抗菌劑，它是以兩親性嵌段共聚物PCL-b-PAsp在水溶液中自組裝形成PCL-b-PAsp聚合物膠束PM，利用親水性殼層中PAsp的負(fù)電性吸附帶正電的Ag⁺離子并通過還原劑將其原位還原成納米銀，再利用疏水性內(nèi)核PCL包裹天然無毒的抗菌成分姜黃素，從而形成既攜帶納米銀又同時(shí)負(fù)載姜黃素的聚合物膠束PM-Ag-Cur；其中PCL-b-PAsp聚合物膠束PM： 納米銀：姜黃素的重量份數(shù)比為10：1：2。

納米抗菌劑的制備方法：

1）將5.0 mg PCL-b-PAsp溶解于1 mL DMF中，再將此聚合物溶液在電磁攪拌下，逐滴緩慢加入到9 mL磷酸鹽緩沖液，1 mM，pH=7.4中，然后將溶液在室溫下攪拌4 h使膠束穩(wěn)定，之后將溶液透析三天以完全除去體系中的DMF溶劑，得到PCL-b-PAsp聚合物膠束PM；

2）將100 μL 5 mg/mL AgNO₃溶液在冰水浴攪拌下逐滴緩慢加入到PCL-b-PAsp聚合物膠束PM，在黑暗環(huán)境下輕輕攪拌30 min后，快速加入100 μL 15 mg/mL 新鮮NaBH₄溶液，溶液迅速變色，繼續(xù)攪拌4 h，然后透析兩天得到PM-Ag溶液；

3）將1.0 mg姜黃素溶解于5 mL無水DMF中，并在磁力攪拌下逐滴加入到PM-Ag溶液中，在室溫下攪拌2 h后，將溶液透析兩天以除去體系中的DMF，最終得到同時(shí)負(fù)載納米銀和姜黃素的聚合物膠束PM-Ag-Cur。

其中聚環(huán)己內(nèi)酯-b-聚天冬氨酸（PCL-b-PAsp）的制備步驟如下：

1）將0.16 g N-(叔丁氧羰基)乙醇胺（1 mmol）和10.0 g ε-CL（87.8 mmol）加入到干燥的50 mL茄形瓶中混合，然后用20 mL重蒸的甲苯溶解均勻，加入一滴Sn(Oct)₂（0.1% wt/wt）；

2）液氮冷凍，抽真空，通氮?dú)?，解凍，重?fù)此過程三次，之后在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，于110°C的油浴中反應(yīng)12 h；

3）反應(yīng)結(jié)束后冷至室溫，加入冰乙醚沉淀，靜置使其沉淀完全，經(jīng)抽濾洗滌，真空干燥后得到白色固體 PCL-NHBoc；

4）將上述3）中所得的PCL-NHBoc溶于三氟乙酸和二氯甲烷的混合溶劑（1/1，V/V）中，然后在室溫下攪拌12 h，反應(yīng)結(jié)束后，用冰乙醚沉淀，在冰箱中靜置過夜，抽濾洗滌，干燥得白色固體；

5）將4）中白色固體在三乙胺和二氯甲烷的混合溶劑（1/1，V/V）中室溫?cái)嚢?2 h，再用冰乙醚沉淀，抽濾，放入真空干燥箱中干燥得到大分子引發(fā)劑PCL-NH₂；

6）將2.0 g上述5）中得到的 PCL-NH₂（0.2 mmol）和2.5 g BLA-NCA（10 mmol）加入到干燥的茄形瓶中，加入15 mL二氯甲烷將其溶解均勻，然后液氮冷凍，抽真空，通氮?dú)?，解凍，重?fù)三次，之后在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，于30°C的油浴中反應(yīng)24 h；

7）反應(yīng)完成后，加入適量的二氯甲烷稀釋并用十倍體積的冰乙醚沉淀，抽濾洗滌，真空干燥后得到白色固體PCL-b-PBLA；

8）將1.0 g上述7）中得到的白色固體置于25 mL圓底燒瓶中， 用10 mL三氟乙酸溶解，然后依次加入1 mL苯甲醚和1 mL三氟甲磺酸，在0°C冰浴下攪拌2 h，之后用冰乙醚沉淀，抽濾洗滌，真空干燥得到嵌段共聚物PCL-b-PAsp。

實(shí)施例2：

（一）聚環(huán)己內(nèi)酯-b -聚天冬氨酸（PCL-b-PAsp）的制備，步驟如下：

1）將0.16 g N-(叔丁氧羰基)乙醇胺（1 mmol）和10.0 g ε-CL(ε-己內(nèi)酯) （87.8 mmol）加入到干燥的50 mL茄形瓶中混合均勻，然后加入20 mL重蒸的甲苯，再加入一滴Sn(Oct)₂（0.1% wt/wt）；

2）通過液氮冷凍，抽真空，通氮?dú)?，解凍，重?fù)此過程三次，然后在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，將反應(yīng)瓶置于110°C的油浴中反應(yīng)12 h；

3）待反應(yīng)結(jié)束后將反應(yīng)瓶冷至室溫，再加入冰乙醚沉淀，靜置使其沉淀完全，通過抽濾洗滌，真空干燥后得到白色固體 PCL-NHBoc；

4）將上述3）中所得的PCL-NHBoc溶解于三氟乙酸和二氯甲烷的混合溶劑（1/1，V/V）中，然后在室溫下勻速攪拌12 h，反應(yīng)結(jié)束后，利用冰乙醚沉淀，在冰箱中靜置過夜，抽濾洗滌，干燥得白色固體；

5）將4）中白色固體在三乙胺和二氯甲烷的混合溶劑（1/1，V/V）中室溫?cái)嚢?2 h，再利用冰乙醚沉淀，抽濾，放入真空干燥箱中干燥，從而得到大分子引發(fā)劑PCL-NH₂；

6）將2.0 g上述5）中得到的 PCL-NH₂（0.2 mmol）和2.5 g BLA-NCA（L-天冬氨酸-4-芐酯-N-羧基環(huán)內(nèi)酸酐）（10 mmol）加入到干燥的茄形瓶中，加入15 mL二氯甲烷將其溶解均勻，然后液氮冷凍，抽真空，通氮?dú)?，解凍，重?fù)此過程三次，之后在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，置于30℃的油浴中反應(yīng)24 h；

7）待反應(yīng)完成后，向反應(yīng)瓶中加入適量的二氯甲烷稀釋，并用十倍體積的冰乙醚沉淀，抽濾洗滌，真空干燥后得到白色固體PCL-b-PBLA；

8）將1.0 g上述7）中得到的白色固體置于25 mL圓底燒瓶中， 用10 mL三氟乙酸溶解，然后依次加入1 mL苯甲醚和1 mL三氟甲磺酸，將其置于0℃冰浴下攪拌2 h，之后用冰乙醚沉淀，抽濾洗滌，真空干燥得到嵌段共聚物PCL-b-PAsp。

（二）四種不同聚合物膠束的制備，步驟如下：

1）將5.0 mg PCL-b-PAsp溶解于1 mL DMF中，再將此聚合物溶液在磁力磁攪拌下，緩慢加入到9 mL磷酸鹽緩沖液（1 mM，pH=7.4）中，然后將溶液在室溫下攪拌4 h，之后將溶液透析三天以除去體系中的DMF溶劑，得到PCL-b-PAsp聚合物膠束，簡(jiǎn)稱PM；

2）將1.0 mg姜黃素與PCL-b-PAsp聚合物的DMF溶液混合均勻，然后將溶有姜黃素的聚合物溶液在電磁攪拌下，逐滴緩慢加入到9 mL磷酸鹽緩沖液（1 mM，pH=7.4）中，后續(xù)步驟同上述1）中相同，得到負(fù)載姜黃素的聚合物膠束，簡(jiǎn)稱PM-Cur；

3）在冰水浴攪拌下，將100 μL 5 mg/mL AgNO₃溶液逐滴緩慢加入到PCL-b-PAsp膠束溶液中，然后在黑暗環(huán)境下勻速攪拌30 min，再快速加入100 μL 15 mg/mL 新鮮NaBH₄溶液，溶液顏色迅速由黃色變?yōu)樽厣^續(xù)攪拌4 h，然后透析兩天得到負(fù)載納米銀的聚合物膠束，簡(jiǎn)稱PM-Ag；

4）將1.0 mg姜黃素溶解于5 mL DMF中，并在磁力攪拌下逐滴加入到PM-Ag溶液中，在室溫下攪拌2 h后，將溶液在超純水中透析兩天，最終得到同時(shí)負(fù)載納米銀和姜黃素的聚合物膠束，簡(jiǎn)稱PM-Ag-Cur。

參見附圖2和附圖3，給出了制備的四種聚合物膠束（PM、PM-Cur、PM-Ag和PM-Ag-Cur）的物理化學(xué)性質(zhì)表征結(jié)果，步驟如下：

1）將（二）中制備得到的四種聚合物膠束用超純水定容到0.5 mg/mL，圖2A即顯示的不同聚合物膠束溶液的外觀，其中純膠束PM為無色透明，PM-Cur為黃色，說明負(fù)載了姜黃素，而攜帶銀的PM-Ag和PM-Ag-Cur為棕色；

2）用ZetaPALS來測(cè)定不同聚合物膠束的zeta電位，圖2B顯示四種聚合物膠束表面均帶負(fù)電荷，且PM表面負(fù)電最強(qiáng)，PM-Cur和PM-Ag稍低，PM-Ag-Cur最弱，由此可以間接表明膠束對(duì)Ag和Cur的同時(shí)負(fù)載；

3）用UV-2550型紫外可見分光光度計(jì)來測(cè)量四種膠束波長(zhǎng)在300-600 nm范圍內(nèi)的紫外吸收，如圖2C所示，PM無明顯吸收，PM-Cur和PM-Ag分別在425 nm和400 nm處存在Cur和Ag的最大吸收峰，而PM-Ag-Cur在400 nm處出現(xiàn)高于PM-Ag的吸收峰，這正是Ag受Cur影響產(chǎn)生的，由此證明膠束的成功制備；

4）采用F-4600型熒光分光光度計(jì)在420 nm的激發(fā)波長(zhǎng)下掃描得到四種聚合物膠束的熒光光譜，如圖2D所示， PM-Cur得到一個(gè)較寬的發(fā)射光譜，其中520 nm為最大發(fā)射波長(zhǎng)，而PM-Ag-Cur的熒光強(qiáng)度大大降低，這是Ag納米粒作用的效果，由此進(jìn)一步證明膠束的成功制備；

5）將約1 mL的不同樣品溶液經(jīng)0.45 μm的親水性Millipore濾膜（針式過濾器）過濾至準(zhǔn)備好的無塵光散射樣品瓶中，然后利用光散射測(cè)定不同溶液的粒徑及粒徑分布，圖3顯示了通過動(dòng)態(tài)光散射在散射角為90°時(shí)測(cè)定的四種聚合物膠束的流體力學(xué)直徑分布圖，其流體力學(xué)直徑D_h均在90-95 nm左右，且粒徑分布都比較窄；

6）在室溫條件下，將10 μL的不同樣品溶液滴于300目的碳支持膜銅網(wǎng)上，靜置10 min，用濾紙吸去多余的樣品，待銅網(wǎng)自然晾干后，真空干燥12 h后用Philips T20ST電子顯微鏡（加速電壓為100 kV）檢測(cè)，從圖3中TEM照片可以清楚地看出，這些膠束均為規(guī)整的球形結(jié)構(gòu)，粒徑與光散射的結(jié)果比較接近。

附圖4給出了負(fù)載姜黃素的聚合物膠束PM-Cur和PM-Ag-Cur在有無脂肪酶（Lipase）刺激下對(duì)姜黃素的釋放效果，步驟如下：

1）分別將2 mL含有或不含銅綠假單胞菌脂肪酶的負(fù)載姜黃素的膠束溶液封裝在截留分子量為3500 Da的透析袋中，其中脂肪酶終濃度為1.0 mg/mL，然后將透析袋浸入20 mL磷酸鹽緩沖溶液（10 mM，pH=7.4）中，于37℃恒溫振蕩器中進(jìn)行體外釋放實(shí)驗(yàn)；

2）于相同時(shí)間間隔點(diǎn)，取出1 mL透析液用于測(cè)定其姜黃素濃度，同時(shí)補(bǔ)加1 mL新鮮的緩沖液；

3）取樣后用UV-2550型紫外可見分光光度計(jì)來檢測(cè)各個(gè)樣品于425 nm檢測(cè)波長(zhǎng)下的紫外吸收值，換算成相應(yīng)姜黃素濃度，然后計(jì)算各個(gè)時(shí)間點(diǎn)姜黃素的累計(jì)釋放率；

4）圖4即為實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次后得到的負(fù)載姜黃素的聚合物膠束在有或無脂肪酶刺激下姜黃素累積釋放曲線，相比于無Lipase下的緩慢釋放，在含有Lipase的條件下，姜黃素的釋放速度明顯加快，且48 h后超過95%的姜黃素得到釋放，由此證明Lipase可以使膠束疏水性內(nèi)核PCL降解，從而釋放出包裹在其內(nèi)部的姜黃素。

附圖5通過四種聚合物膠束對(duì)銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌的殺滅比較，來評(píng)估同時(shí)負(fù)載納米銀和姜黃素的聚合物膠束PM-Ag-Cur的抗菌能力，步驟如下：

1）分別從含有銅綠假單胞菌P. aeruginosa菌落和金黃色葡萄球菌S. aureus菌落的固體LB瓊脂平板上挑取單菌落于5 mL的液體LB培養(yǎng)基中，在37 ℃的搖床中孵育過夜；

2）將細(xì)菌懸液用LB培養(yǎng)基稀釋至10⁵ CFU/ml，然后與等體積的預(yù)先設(shè)定好濃度的四種聚合物膠束的不同溶液混合，于37℃下孵育12 h；

3）使用多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)不同濃度溶液于600 nm檢測(cè)波長(zhǎng)下的光密度值OD₆₀₀，其中對(duì)照組樣品用超純水處理，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，然后通過數(shù)據(jù)處理比較得到PM-Ag-Cur的抗菌能力；

4）銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌分別作為革蘭氏陰性和革蘭氏陽(yáng)性的模型代表，結(jié)果如圖5所示，可能由于載藥量低的緣故，PM-Cur在濃度低于250 μg/mL的情況下，對(duì)細(xì)菌的生長(zhǎng)沒有表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制能力，圖中表明攜帶銀的PM-Ag和PM-Ag-Cur對(duì)兩種菌均有較強(qiáng)的抗菌活性，呈現(xiàn)明顯的濃度依賴性，而且PM-Ag-Cur具有更強(qiáng)的抑菌能力，同時(shí)PM-Ag-Cur較PM-Ag攜帶Ag的量更少，可見同時(shí)負(fù)載納米銀和姜黃素的聚合物膠束能夠更好地發(fā)揮協(xié)同抗菌效應(yīng)。