本發(fā)明屬于生物醫(yī)用材料領(lǐng)域，具體涉及一種膠原-羥基磷灰石人工骨的制備方法。

背景技術(shù)：

骨缺損是骨外科、頭頸外科、整形外科等的常見(jiàn)病癥之一，它們不但會(huì)導(dǎo)致患者生 理功能發(fā)生嚴(yán)重障礙，還會(huì)嚴(yán)重影響患者的外觀形象，給患者造成沉重的精神負(fù)擔(dān)，目前， 臨床工作中常采用骨移植進(jìn)行修復(fù)。為此，國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究了眾多的骨替代材料。 但是由于各方面的缺陷，這些材料不能完全滿(mǎn)足臨床修復(fù)的要求。

生物相容性和可降解性是衡量骨修復(fù)材料是否優(yōu)異的重要指標(biāo)。殼聚糖是天然的生物材料，帶正電荷，其結(jié)構(gòu)與細(xì)胞外基質(zhì)中的主要成分—糖胺聚糖十分類(lèi)似，其降解產(chǎn)物對(duì)人體無(wú)毒副作用，具有良好的生物降解性和生物相容性。聚乳酸是一種高分子材料，用聚乳酸良好的加工性和優(yōu)良的柔韌性和斷裂伸長(zhǎng)性可以彌補(bǔ)磷灰石的不足，是一種新型的生物降解材料。納米纖維素具有很多優(yōu)良的性能，如高純度、高結(jié)晶度、高楊氏模量，還具有高強(qiáng)度、高生物降解性和良好的生物相容性等，能夠彌補(bǔ)復(fù)合材料仍然存在機(jī)械性能差、孔隙率低、孔隙交通性能差的缺點(diǎn)。角蛋白是構(gòu)造頭發(fā)、羊毛、指甲等的結(jié)構(gòu)纖維狀蛋白，并已證明其對(duì)成纖維細(xì)胞和成骨細(xì)胞的生長(zhǎng)有促進(jìn)作用。此外，它們?cè)隗w外 (通過(guò)胰蛋白酶)和在體內(nèi)是可以生物降解的。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)不足，提供一種膠原-羥基磷灰石人工骨的制備方法。本發(fā)明將膠原蛋白、角蛋白、羥基磷灰石、納米纖維素和殼聚糖進(jìn)行復(fù)合，制得的膠原-羥基磷灰石人工骨具有良好的機(jī)械性能、可降解性和生物相容性，能更好地促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的黏附與增殖，為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞提供了更適于其生長(zhǎng)的空間結(jié)構(gòu)與環(huán)境。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

一種膠原-羥基磷灰石人工骨的制備方法，具體包括以下步驟：

（1）將聚乳酸用溶劑配制成1~3wt%的溶液；

（2）制備殼聚糖，并將制得的殼聚糖用稀醋酸配制成0.02~0.05wt%的溶液；

（3）用蒸餾水分別配制濃度為8~12g/L的膠原蛋白溶液和濃度為1~5g/L的角蛋白溶液；

（4）將羥基磷灰石加入到8~12g/L的膠原蛋白和1~5g/L的角蛋白的混合溶液中，用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至7.0，并加入1.5wt%的京尼平水溶液在4℃交聯(lián)2小時(shí)得混合溶液A，冷凍干燥制得膠原蛋白、角蛋白和羥基磷灰石質(zhì)量比為0.4~0.6:0.15~0.25:1的膠原蛋白/角蛋白/羥基磷灰石復(fù)合粉末，京尼平水溶液占混合溶液A總質(zhì)量的1~1.5wt%；

（5）將步驟（4）制得的膠原蛋白/角蛋白/羥基磷灰石復(fù)合粉末按照質(zhì)量比為1:10的比例分散到步驟（2）配制的殼聚糖溶液中，用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至7.0，隨后加入8~12g/L的膠原蛋白溶液和1~5g/L的角蛋白溶液，并加入1.5wt%的京尼平水溶液在4℃交聯(lián)12小時(shí)得混合溶液B；所述膠原蛋白溶液占混合溶液B總質(zhì)量的15~20wt%，所述角蛋白溶液占混合溶液B的6~10wt%，京尼平水溶液占混合溶液B總質(zhì)量的0.5~1wt%；

（6）將步驟（5）得到的混合溶液B冷凍干燥成復(fù)合粉末后，將所得復(fù)合粉末B與納米纖維素加入到步驟（1）配制的聚乳酸溶液中，攪拌共混后經(jīng)冷凍干燥、研磨后制得所述膠原-羥基磷灰石人工骨；所述復(fù)合粉末B、納米纖維素和聚乳酸溶液的質(zhì)量比為7~9:0.5~1:3~5。

步驟（1）所述溶劑為四氫呋喃。

步驟（2）中所述殼聚糖的制備方法，具體包括以下步驟：

（1）原料處理：取橡膠木犀金龜成蟲(chóng)，用水洗干凈后進(jìn)行冷凍干燥，粉碎并過(guò)25目篩得蟲(chóng)粉，備用；

（2）脫除無(wú)機(jī)鹽：將步驟（1）得到的蟲(chóng)粉加入到1mol/L的鹽酸溶液中，固液比為1:15， 40℃下攪拌6小時(shí)，隨后離心分離20min，將所得固體用蒸餾水洗滌至中性；

（3）脫除蛋白質(zhì)：將步驟（2）所得物料加入到8wt%的氫氧化鈉溶液中，固液比為1:10，充分?jǐn)嚢韬螅M(jìn)行微波處理，微波功率為750W，處理時(shí)間3min后，冷卻至室溫浸泡2h，隨后離心分離20min，將所得固體用蒸餾水洗滌至中性，得到甲殼素；

（4）脫色：將步驟（3）所得甲殼素加入高錳酸鉀進(jìn)行脫色處理，隨后將脫色后的固體用蒸餾水洗滌至中性；

（5）脫乙?；簩⒉襟E（4）所得物料加入到28wt%的氫氧化鈉溶液中，固液比為1:18，充分?jǐn)嚢韬螅M(jìn)行微波處理，微波功率為1350W，處理時(shí)間5min后取出，隨后離心分離15~20min，將所得固體用蒸餾水洗滌至中性；隨后將所得物料分散到50mM Tris-HCl的緩沖液中，固液比為1:50，調(diào)節(jié)溶液pH為7.5，隨后再加入占溶液總質(zhì)量0.2wt%的甲殼素脫乙酰酶，在溫度50℃下反應(yīng)8h，隨后離心分離20min，將所得固體用蒸餾水洗滌至中性，冷凍干燥制得殼聚糖。

本發(fā)明的有益效果在于：

（1）本發(fā)明將膠原蛋白、角蛋白、羥基磷灰石、納米纖維素和殼聚糖進(jìn)行復(fù)合，制得的膠原-羥基磷灰石人工骨具有良好的機(jī)械性能、可降解性和生物相容性，能更好地促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的黏附與增殖，為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞提供了更適于其生長(zhǎng)的空間結(jié)構(gòu)與環(huán)境；

（2）本發(fā)明的殼聚糖制備中的脫乙酰過(guò)程采用微波法與酶解法相結(jié)合，避免了使用高濃度堿液造成的污染及浪費(fèi)，通過(guò)微波先脫去部分乙?；瑫r(shí)使得化學(xué)鍵以及取代位點(diǎn)活化，隨后在甲殼素脫乙酰酶作用下發(fā)生發(fā)應(yīng)，大大提高了脫乙酰度，脫乙酰度高達(dá)96.7%，獲得了良好品質(zhì)的殼聚糖，其在本發(fā)明人工骨合成過(guò)程中起到了良好的分散作用，對(duì)羥基磷灰石的結(jié)晶起著電位互補(bǔ)作用。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明，但本發(fā)明不僅僅限于這些實(shí)施例。

實(shí)施例1

一種膠原-羥基磷灰石人工骨的制備方法，具體包括以下步驟：

（1）將聚乳酸用四氫呋喃配制成1wt%的溶液；

（2）制備殼聚糖，并將制得的殼聚糖用稀醋酸配制成0.02wt%的溶液；

（3）用蒸餾水分別配制濃度為8g/L的膠原蛋白溶液和濃度為1g/L的角蛋白溶液；

（4）將羥基磷灰石加入到8g/L的膠原蛋白和1g/L的角蛋白的混合溶液中，用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至7.0，并加入1.5wt%的京尼平水溶液在4℃交聯(lián)2小時(shí)得混合溶液A，冷凍干燥制得膠原蛋白、角蛋白和羥基磷灰石質(zhì)量比為0.4:0.15:1的膠原蛋白/角蛋白/羥基磷灰石復(fù)合粉末，京尼平水溶液占混合溶液A總質(zhì)量的1wt%；

（5）將步驟（4）制得的膠原蛋白/角蛋白/羥基磷灰石復(fù)合粉末按照質(zhì)量比為1:10的比例分散到步驟（2）配制的殼聚糖溶液中，用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至7.0，隨后加入8g/L的膠原蛋白溶液和1g/L的角蛋白溶液，并加入1.5wt%的京尼平水溶液在4℃交聯(lián)12小時(shí)得混合溶液B；所述膠原蛋白溶液占混合溶液B總質(zhì)量的15wt%，所述角蛋白溶液占混合溶液B的6wt%，京尼平水溶液占混合溶液B總質(zhì)量的0.5wt%；

（6）將步驟（5）得到的混合溶液B冷凍干燥成復(fù)合粉末后，將所得復(fù)合粉末B與納米纖維素加入到步驟（1）配制的聚乳酸溶液中，攪拌共混后經(jīng)冷凍干燥、研磨后制得所述膠原-羥基磷灰石人工骨；所述復(fù)合粉末B、納米纖維素和聚乳酸溶液的質(zhì)量比為7:0.5:3。

實(shí)施例2

一種膠原-羥基磷灰石人工骨的制備方法，具體包括以下步驟：

（1）將聚乳酸用四氫呋喃配制成3wt%的溶液；

（2）制備殼聚糖，并將制得的殼聚糖用稀醋酸配制成0.05wt%的溶液；

（3）用蒸餾水分別配制濃度為12g/L的膠原蛋白溶液和濃度為5g/L的角蛋白溶液；

（4）將羥基磷灰石加入到12g/L的膠原蛋白和5g/L的角蛋白的混合溶液中，用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至7.0，并加入1.5wt%的京尼平水溶液在4℃交聯(lián)2小時(shí)得混合溶液A，冷凍干燥制得膠原蛋白、角蛋白和羥基磷灰石質(zhì)量比為0.6:0.25:1的膠原蛋白/角蛋白/羥基磷灰石復(fù)合粉末，京尼平水溶液占混合溶液A總質(zhì)量的1.5wt%；

（5）將步驟（4）制得的膠原蛋白/角蛋白/羥基磷灰石復(fù)合粉末按照質(zhì)量比為1:10的比例分散到步驟（2）配制的殼聚糖溶液中，用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至7.0，隨后加入12g/L的膠原蛋白溶液和5g/L的角蛋白溶液，并加入1.5wt%的京尼平水溶液在4℃交聯(lián)12小時(shí)得混合溶液B；所述膠原蛋白溶液占混合溶液B總質(zhì)量的20wt%，所述角蛋白溶液占混合溶液B的10wt%，京尼平水溶液占混合溶液B總質(zhì)量的1wt%；

（6）將步驟（5）得到的混合溶液B冷凍干燥成復(fù)合粉末后，將所得復(fù)合粉末B與納米纖維素加入到步驟（1）配制的聚乳酸溶液中，攪拌共混后經(jīng)冷凍干燥、研磨后制得所述膠原-羥基磷灰石人工骨；所述復(fù)合粉末B、納米纖維素和聚乳酸溶液的質(zhì)量比為9:1:5。

實(shí)施例3

一種膠原-羥基磷灰石人工骨的制備方法，具體包括以下步驟：

（1）將聚乳酸用四氫呋喃配制成2wt%的溶液；

（2）制備殼聚糖，并將制得的殼聚糖用稀醋酸配制成0.03wt%的溶液；

（3）用蒸餾水分別配制濃度為10g/L的膠原蛋白溶液和濃度為3g/L的角蛋白溶液；

（4）將羥基磷灰石加入到10g/L的膠原蛋白和3g/L的角蛋白的混合溶液中，用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至7.0，并加入1.5wt%的京尼平水溶液在4℃交聯(lián)2小時(shí)得混合溶液A，冷凍干燥制得膠原蛋白、角蛋白和羥基磷灰石質(zhì)量比為0.5:0.2:1的膠原蛋白/角蛋白/羥基磷灰石復(fù)合粉末，京尼平水溶液占混合溶液A總質(zhì)量的1.2wt%；

（5）將步驟（4）制得的膠原蛋白/角蛋白/羥基磷灰石復(fù)合粉末按照質(zhì)量比為1:10的比例分散到步驟（2）配制的殼聚糖溶液中，用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至7.0，隨后加入10g/L的膠原蛋白溶液和3g/L的角蛋白溶液，并加入1.5wt%的京尼平水溶液在4℃交聯(lián)12小時(shí)得混合溶液B；所述膠原蛋白溶液占混合溶液B總質(zhì)量的18wt%，所述角蛋白溶液占混合溶液B的8wt%，京尼平水溶液占混合溶液B總質(zhì)量的0.8wt%；

（6）將步驟（5）得到的混合溶液B冷凍干燥成復(fù)合粉末后，將所得復(fù)合粉末B與納米纖維素加入到步驟（1）配制的聚乳酸溶液中，攪拌共混后經(jīng)冷凍干燥、研磨后制得所述膠原-羥基磷灰石人工骨；所述復(fù)合粉末B、納米纖維素和聚乳酸溶液的質(zhì)量比為8:0.7:4。

實(shí)施例1~3的步驟（2）中所述殼聚糖的制備方法，具體包括以下步驟：

（1）原料處理：取橡膠木犀金龜成蟲(chóng)，用水洗干凈后進(jìn)行冷凍干燥，粉碎并過(guò)25目篩得蟲(chóng)粉，備用；

（2）脫除無(wú)機(jī)鹽：將步驟（1）得到的蟲(chóng)粉加入到1mol/L的鹽酸溶液中，固液比為1:15， 40℃下攪拌6小時(shí)，隨后離心分離20min，將所得固體用蒸餾水洗滌至中性；

（3）脫除蛋白質(zhì)：將步驟（2）所得物料加入到8wt%的氫氧化鈉溶液中，固液比為1:10，充分?jǐn)嚢韬?，進(jìn)行微波處理，微波功率為750W，處理時(shí)間3min后，冷卻至室溫浸泡2h，隨后離心分離20min，將所得固體用蒸餾水洗滌至中性，得到甲殼素；

（4）脫色：將步驟（3）所得甲殼素加入高錳酸鉀進(jìn)行脫色處理，隨后將脫色后的固體用蒸餾水洗滌至中性；

（5）脫乙?；簩⒉襟E（4）所得物料加入到28wt%的氫氧化鈉溶液中，固液比為1:18，充分?jǐn)嚢韬螅M(jìn)行微波處理，微波功率為1350W，處理時(shí)間5min后取出，隨后離心分離15~20min，將所得固體用蒸餾水洗滌至中性；隨后將所得物料分散到50mM Tris-HCl的緩沖液中，固液比為1:50，調(diào)節(jié)溶液pH為7.5，隨后再加入占溶液總質(zhì)量0.2wt%的甲殼素脫乙酰酶，在溫度50℃下反應(yīng)8h，隨后離心分離20min，將所得固體用蒸餾水洗滌至中性，冷凍干燥制得殼聚糖。

膠原-羥基磷灰石人工骨性能測(cè)試實(shí)驗(yàn)

1. 機(jī)械性能測(cè)試

①根據(jù) GB1040-79 分別將羥基磷灰石顆粒（對(duì)比例），以及實(shí)施例1~3得到的膠原-羥基磷灰石人工骨制成彎曲強(qiáng)度測(cè)試試樣。用Instron1341材料試驗(yàn)機(jī)對(duì)試樣進(jìn)行彎曲性能測(cè)試，試樣檢測(cè)環(huán)境為：加載速度10mm/分鐘，室溫：25℃，濕度：65％，

計(jì)算公式：，

其中-彎曲強(qiáng)度，MPa；P-破壞載荷，N；L-試樣的跨距，mm；b-試樣寬度，mm；h-試樣厚度，mm。

②根據(jù) GB1040-79 分別將羥基磷灰石顆粒（對(duì)比例），以及實(shí)施例1~3得到的膠原-羥基磷灰石人工骨制成拉伸強(qiáng)度測(cè)試試樣。用Instron1341材料試驗(yàn)機(jī)對(duì)試樣進(jìn)行拉伸強(qiáng)度性能測(cè)試，試樣檢測(cè)環(huán)境為：加載速度10mm/分鐘，室溫：25℃，濕度：75％，

計(jì)算公式：，

其中-拉伸強(qiáng)度，MPa；P-破壞載荷，N；a-試樣的中間寬度，mm；h-試樣厚度，mm。

彎曲強(qiáng)度和拉伸強(qiáng)度的具體測(cè)試結(jié)果如表1所示：

表1 膠原-羥基磷灰石人工骨的機(jī)械強(qiáng)度

從表1可以看出，與對(duì)比例相比，本發(fā)明的膠原-羥基磷灰石人工骨彎曲強(qiáng)度和拉伸強(qiáng)度都有了顯著提高。

2. 體外降解實(shí)驗(yàn)

將實(shí)施例1~3的膠原-羥基磷灰石人工骨制成圓形樣品，所有樣品 (Φ10mm×13mm) 放入pH值為7的模擬體液SBF溶液中，于37℃的恒溫?fù)u床內(nèi)，低速搖動(dòng)，每隔7-10d取出，放于烘箱內(nèi)40℃干燥、稱(chēng)重。

溶脹過(guò)程中樣品的質(zhì)量損失率為：，

式中：m1為降解前的質(zhì)量；m2為降解后的質(zhì)量；結(jié)果表明材料的抗壓強(qiáng)度較高、3個(gè)月后質(zhì)量損失率較低，彌補(bǔ)了單用親水性的膠原蛋白、角蛋白和殼聚糖降解速度過(guò)快的缺點(diǎn)，滿(mǎn)足骨修復(fù)所達(dá)到的要求。

3. 生物相容性研究

當(dāng)膠原蛋白、角蛋白、羥基磷灰石、納米纖維素和殼聚糖復(fù)合時(shí)，能更好地促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的黏附與增殖，為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞提供了更適于其生長(zhǎng)的空間結(jié)構(gòu)與環(huán)境。

4. 殼聚糖脫乙酰度的測(cè)試實(shí)驗(yàn)

采用簡(jiǎn)單的滴定分析方法測(cè)定殼聚糖的脫乙酰度。稱(chēng)取制備的殼聚糖（mg），加入v₁ mL 0.1mol/L HCl溶液，溶解后用0.1 mol/L的NaOH溶液滴定過(guò)量的HCl溶液，消耗NaOH的體積v₂，根據(jù)下面的公式計(jì)算出殼聚糖脫乙酰度。

式中，c₁為HCl標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度，v₁為加入HCl的體積，c₂為NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度，v₂為加入NaOH的體積，m為殼聚糖的質(zhì)量，M_（-NH2）為-NH₂的質(zhì)量摩爾濃度，W_（-NH2）為-NH₂的質(zhì)量百分?jǐn)?shù)。

測(cè)試得本發(fā)明制得的殼聚糖的脫乙酰度為96.7%，粘度為342 mPa?S，說(shuō)明獲得了良好品質(zhì)的殼聚糖，其在本發(fā)明人工骨合成過(guò)程中起到了良好的分散作用，對(duì)羥基磷灰石的結(jié)晶起著電位互補(bǔ)作用。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，凡依本發(fā)明申請(qǐng)專(zhuān)利范圍所做的均等變化與修飾，皆應(yīng)屬本發(fā)明的涵蓋范圍。