本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種具有經(jīng)皮給藥功能的金納米棒-脂質(zhì)聚合物囊泡及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

透皮給藥系統(tǒng)(transdermal therapeutic system，TTS)是指在皮膚表面給藥，藥物以恒定速度依次穿透角質(zhì)層、表皮層、真皮層，最終進(jìn)入體循環(huán)，產(chǎn)生全身或局部治療作用的新興制劑。與口服和注射給藥相比，有以下3個(gè)優(yōu)點(diǎn)：1.給藥方式便捷，對(duì)人體影響較小并且在發(fā)生副作用時(shí)可以及時(shí)停止給藥；2.能夠避免肝臟產(chǎn)生的首過效應(yīng)，提高藥物生物利用度；3.有利于藥物在一段時(shí)間內(nèi)可控，緩慢的釋放。然而，角質(zhì)層在有效隔絕有害物質(zhì)的同時(shí)，也阻礙了藥物的經(jīng)皮滲透，研究發(fā)現(xiàn)，僅有一些小分子藥物能夠在沒有外界幫助的情況下穿透角質(zhì)層或者通過汗腺、毛孔等途徑直接進(jìn)入皮膚。大多數(shù)藥物，即使是劑量低、療效高的一些藥物，透皮速率也難以滿足治療需要，這成為研究開發(fā)TTS的最大障礙。如何保證足夠量的藥物透過皮膚進(jìn)入體內(nèi)達(dá)到治療劑量，是TTS研究的重點(diǎn)，高新技術(shù)及方法的應(yīng)用是解決問題的重要途徑。

黑色素瘤是皮膚腫瘤中惡性程度最高的一種，臨床上很難治愈。黑色素瘤極易發(fā)生轉(zhuǎn)移，化學(xué)藥物容易引起其耐藥，導(dǎo)致對(duì)化學(xué)藥物不敏感。黑色素瘤受到多種致癌基因的調(diào)控，與基因突變有著密切的聯(lián)系。所以基因治療黑色素瘤，可以從根源上改變黑色素瘤的基因表達(dá)。這種治療策略理論上可以取得更加理想的抗腫瘤效果。黑色素瘤通常發(fā)病于皮膚表皮層與真皮層之間，直接通過經(jīng)皮給藥的方式能夠直接將藥物靶向的傳遞到腫瘤部位，更加高效的發(fā)揮抗腫瘤效果。

在眾多促進(jìn)透皮的策略中，使用納米粒攜載藥物能夠有效提高透皮的效率。納米粒是指尺寸小于1000nm的顆粒。由于尺寸效應(yīng)，納米粒的顏色、磁性、光學(xué)、導(dǎo)熱等許多特性與整體狀態(tài)相比，均發(fā)生較大改變。近年來，針對(duì)這些納米粒的制備工藝、表面修飾等研究取得了長足的進(jìn)步，使納米粒越來越廣泛地應(yīng)用在藥物遞送、成像(MRI、光聲成像)以及診斷等生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。在透皮給藥方面，納米給藥技術(shù)提高了藥物在載體中的濃度，并能夠使其在皮膚中緩慢可控的釋放。納米粒還能夠攜載不同物理性質(zhì)的藥物(親水性和疏水性)，提高它們的溶解度與體內(nèi)生物利用度。使用納米粒攜載藥物也能夠促進(jìn)藥物的透皮效果，但是對(duì)于一些大分子藥物，例如多肽，蛋白質(zhì)，siRNA以及質(zhì)粒DNA，它們由于自身的親水性、較大的粒徑和分子量，幾乎無法穿透皮膚角質(zhì)層。近年來，有許多研究者報(bào)道了促進(jìn)這些大分子藥物穿透皮膚的方法。這些方法包括超聲波法、電離子導(dǎo)入法、微針和電穿孔法等。但是，絕大多數(shù)的此類研究都需要聯(lián)合超聲波或外加磁場來促進(jìn)透皮效率，才能夠達(dá)到理想的治療效果，一些化學(xué)促滲劑雖然也可以提高藥物的透皮效果，然而化學(xué)促滲劑往往會(huì)破壞皮膚的角質(zhì)層結(jié)構(gòu)，對(duì)皮膚產(chǎn)生一定的刺激性。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)上述不足，本發(fā)明提供了具有經(jīng)皮給藥功能的金納米棒-脂質(zhì)聚合物囊泡及其制備方法和應(yīng)用，該金納米棒-脂質(zhì)聚合物囊泡可以攜載基因藥物，促進(jìn)基因藥物進(jìn)入皮膚真皮層，且在皮膚酸性PH條件下仍具有良好的穩(wěn)定性和生物相容性，可以結(jié)合基因藥物進(jìn)行皮膚靶向經(jīng)皮給藥。

本發(fā)明解決技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案如下：一種具有經(jīng)皮給藥功能的金納米棒-脂質(zhì)聚合物囊泡，所述納米囊泡包括脂質(zhì)聚合物囊泡及附著在脂質(zhì)聚合物囊泡內(nèi)的金納米棒。

進(jìn)一步的，所述金納米棒的接枝率為1％-50％。

進(jìn)一步的，所述金納米棒的粒徑為1-20nm。

本發(fā)明還提供一種具有經(jīng)皮給藥功能的金納米棒-脂質(zhì)聚合物囊泡的制備方法，該方法包括如下步驟：

取濃度為0.1-1mg/mL的脂質(zhì)聚合物囊泡和濃度為0.1-1mg/mL的金納米棒按照質(zhì)量比1:1組成的混合物0.01-1重量份，加入到100重量份的濃度為1-10mg/mL十二烷基硫酸鈉水溶液中，在超聲作用下滴加水，滴加的水占滴加前的總體積百分分?jǐn)?shù)為1％-10％，進(jìn)行第一次乳化，隨后將所得到的乳化液在超聲作用下滴加到濃度為1-10mg/mL的聚乙烯醇水溶液中進(jìn)行第二次乳化，直到反應(yīng)溶液完全乳化并均勻分散在聚乙烯醇水溶液中，不出現(xiàn)分層，再放置于8000～14000Da透析袋中進(jìn)行透析，即得負(fù)載金納米棒-脂質(zhì)聚合物囊泡。

進(jìn)一步的，所述脂質(zhì)聚合物囊泡的制備過程如下：

在脈沖超聲下，將聚合物PSAA與超純水按照質(zhì)量比為1：1～1：10的比例混合攪拌，加入按任意比混合的二油酰磷脂酰乙醇胺和(2,3-二油?；?丙基)-三甲胺作為表面活性劑，表面活性劑與聚合物PSAA和超純水的混合溶液的質(zhì)量比為0.01％-1％，制備得脂質(zhì)聚合物囊泡。

進(jìn)一步的，所述聚合物PSAA的分子量為1KDa-100KDa。

進(jìn)一步的，所述聚合物PSAA制備過程如下：

將烯丙醇(AA)、過氧化二異丙苯(DCP)和苯乙烯(ST)加入到反應(yīng)器中，以氮?dú)鉃楸Ｗo(hù)劑，其中烯丙醇和苯乙烯作為反應(yīng)原料，兩者質(zhì)量配比為1:1～10:1，過氧化二異丙苯作為引發(fā)劑，加入量為反應(yīng)原料質(zhì)量的0.1％-10％，反應(yīng)溫度為50℃～150℃，反應(yīng)時(shí)間為1h-10h，最終制得聚合物PSAA。

本發(fā)明的另一目的是提供一種攜載藥物的金納米棒-脂質(zhì)聚合物囊泡，包括藥物和載體，所述載體為上述的金納米棒-脂質(zhì)聚合物囊泡，藥物包裹在囊泡中。

進(jìn)一步的，，所述金納米棒-脂質(zhì)聚合物囊泡的粒徑為50nm-200nm。

進(jìn)一步的，所述藥物為DNA、siRNA或miRNA基因類藥物，所述基因類藥物優(yōu)選為miRNA Let 7b、miRNA-221抑制基因、siRNA BRAF、siRNA VEGF、siRNAc-Myc、siRNA PGP中的一種或多種。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：

(1)本發(fā)明首次將金納米棒連接在脂質(zhì)聚合物囊泡中，在近紅外光的照射下，使其不僅可以促進(jìn)藥物釋放，還能夠加強(qiáng)納米載體的透皮效果。

(2)使用具有透皮效果的脂質(zhì)材料修飾了囊泡納米粒，脂質(zhì)材料對(duì)促進(jìn)納米粒透皮起到關(guān)鍵作用。

(3)基因藥物通常是大分子親水性藥物，幾乎不能穿透皮膚，而使用金納米棒-脂質(zhì)聚合物囊泡攜載基因藥物之后，使基因藥物穿透皮膚的能力顯著加強(qiáng)，高效的穿透了皮膚組織，實(shí)現(xiàn)皮膚的局部靶向給藥。

(4)為增強(qiáng)藥物的透皮效率和抗腫瘤效果，本發(fā)明使用具有光熱效應(yīng)的金納米棒對(duì)脂質(zhì)聚合物囊泡進(jìn)行了修飾，最終形成金納米棒-脂質(zhì)聚合物囊泡。金納米棒是一種具有較高光熱轉(zhuǎn)換效率的材料，將其涂抹在腫瘤部位，使其靶向聚集在腫瘤組織附近，并在近紅外光的照射下將光能轉(zhuǎn)化為熱能，熱能一方面可以促進(jìn)金納米棒-脂質(zhì)聚合物囊泡的透皮效果，另一方面可以促進(jìn)基因藥物從載體中釋放，并產(chǎn)生較高熱量殺死癌細(xì)胞。

(5)本發(fā)明得制備了金納米棒-脂質(zhì)聚合物囊泡這一種全新的非病毒基因載體，其表面的可修飾性、高載藥量、良好的生物相容性、并可以結(jié)合光熱治療使其成為了一種有創(chuàng)新的，有巨大應(yīng)用潛力的藥物載體，有望運(yùn)用在經(jīng)皮藥物遞送，抗腫瘤和基因治療等多個(gè)方面。目前為止，還未見金納米棒結(jié)合在脂質(zhì)聚合囊泡的設(shè)計(jì)，而將其運(yùn)用在透皮基因治療皮膚黑色素的研究也未見報(bào)道。

附圖說明

圖1為金納米棒-脂質(zhì)聚合物囊泡制備前，所用金納米棒的粒徑圖；

圖2為金納米棒-脂質(zhì)聚合物囊泡合成前，脂質(zhì)聚合物囊泡粒徑圖；

圖3為金納米棒-脂質(zhì)聚合物囊泡的粒徑圖；

圖4為得到金納米棒的TEM電鏡圖；

圖5為最終得到金納米棒-脂質(zhì)聚合物囊泡TEM電鏡圖；

圖6為Transwell實(shí)驗(yàn)考察金納米棒-脂質(zhì)聚合物囊泡攜載基因藥物之后對(duì)腫瘤細(xì)胞遷移能力的影響圖；

圖7為MTT實(shí)驗(yàn)考察金納米棒-脂質(zhì)聚合物囊泡攜載基因藥物之后抗腫瘤的效果圖；

圖8為激光共聚焦顯微鏡考察金納米棒-脂質(zhì)聚合物囊泡攜載綠色熒光基因藥物之后的透皮效果圖；

圖9為不同樣品給藥后，腫瘤的生長曲線圖；

圖10為結(jié)束給藥后，取出腫瘤后，對(duì)各個(gè)組腫瘤大小拍照；

圖11為對(duì)腫瘤組織進(jìn)行切片，使用TUNEL染色考察腫瘤內(nèi)部細(xì)胞凋亡情況圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例和附圖對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的說明。

實(shí)施例1：

金納米棒-脂質(zhì)聚合物囊泡的制備

(1)聚合物PSAA的制備

以高壓反應(yīng)釜為反應(yīng)器，將烯丙醇(AA)、過氧化二異丙苯(DCP)和苯乙烯(ST)加入到反應(yīng)器中，以氮?dú)鉃楸Ｗo(hù)劑，其中烯丙醇和苯乙烯作為反應(yīng)原料，兩者質(zhì)量分別0.5g與0.5g，過氧化二異丙苯作為引發(fā)劑，加入量為1mg，反應(yīng)溫度為50℃，反應(yīng)時(shí)間為1h，最終制得聚合物PSAA。

(2)脂質(zhì)聚合物囊泡的制備

在脈沖超聲下，將聚合物5gPSAA與5mL超純水混合攪拌，加入按任意比混合的二油酰磷脂酰乙醇胺和(2,3-二油?；?丙基)-三甲胺作為表面活性劑，表面活性劑的質(zhì)量為1mg，制備得脂質(zhì)聚合物囊泡。

(3)金納米棒的制備

當(dāng)光入射金納米棒時(shí)，金屬表面的自由電子與入射光的電磁場發(fā)生共振耦合，產(chǎn)生表面等離子體共振(SPR)。SPR可以導(dǎo)致了自由電子與金屬核的電荷分離，進(jìn)而使金納米棒對(duì)光產(chǎn)生較強(qiáng)的吸收和散射，其對(duì)光的吸收和散射是熒光分子的10⁵到10⁶倍，并將吸收的光能快速的轉(zhuǎn)化為熱量，使金納米棒本身產(chǎn)生較高的溫度。激光照射可以引發(fā)金納米棒產(chǎn)生光熱效應(yīng)，光熱治療的效果與激光照射功率和時(shí)間相關(guān)，激光照射功率為1w，時(shí)間為1min。

配制0.5mL 0.01mol/L的HAuCl₄溶液和9.5mL 0.1mol/L的CTAB溶液，將兩溶液混合攪拌，再加入1mL 0.01mol/L的NaBH₄溶液，于室溫下放置2h后，即得到金納米棒種子溶液；將2mL 0.01mol/L的HAuCl₄溶液、0.4mL 0.01mol/L的AgNO₃溶液以及10mL 0.1mol/L的CTAB溶液混合，依次加入0.1mL 0.01mol/L抗壞血酸和0.1mL 1.0mol/L的鹽酸，混合搖勻后，向其中加入已經(jīng)制備好的金納米棒種子溶液，將混合溶液均勻晃動(dòng)1s后，再靜置8h，即得金納米棒。

(4)金納米棒-脂質(zhì)聚合物囊泡的制備

取2mL濃度為0.1mg/mL的脂質(zhì)聚合物囊泡和2mL濃度為0.1mg/mL的金納米棒攪拌均勻，加入到4mL濃度為1mg/mL的十二烷基硫酸鈉水溶液中，在超聲作用下繼續(xù)滴加0.08mL超純水，進(jìn)行第一次乳化，隨后將所得到的乳化液在超聲作用下滴加到濃度為1mg/mL的聚乙烯醇水溶液中進(jìn)行第二次乳化，直到反應(yīng)溶液完全乳化并均勻分散在聚乙烯醇水溶液中，不出現(xiàn)分層，再放置于8000～14000Da透析袋中進(jìn)行透析，即得負(fù)載金納米棒-脂質(zhì)聚合物囊泡。

(5)金納米棒-脂質(zhì)聚合物囊泡的攜載基因藥物的方法

提前將100μg基因藥物混合在4mL濃度為1mg/mL十二烷基硫酸鈉水溶液中，所述基因藥物為DNA、siRNA或miRNA基因類藥物，所述基因類藥物優(yōu)選為miRNA Let 7b、miRNA-221抑制基因、siRNA BRAF、siRNA VEGF、siRNAc-Myc、siRNA PGP中的一種或多種。取2mL濃度為0.1mg/mL的脂質(zhì)聚合物囊泡和2mL濃度為0.1mg/mL的金納米棒攪拌均勻，加入到含有基因藥物的十二烷基硫酸鈉水溶液中，在超聲作用下繼續(xù)滴加0.08mL超純水，進(jìn)行第一次乳化，隨后將所得到的乳化液在超聲作用下滴加到濃度為1mg/mL的聚乙烯醇水溶液中進(jìn)行第二次乳化，直到反應(yīng)溶液完全乳化并均勻分散在聚乙烯醇水溶液中，不出現(xiàn)分層，再放置于8000～14000Da透析袋中進(jìn)行透析，即得攜載基因藥物的負(fù)載金納米棒-脂質(zhì)聚合物囊泡。

實(shí)施例2：

金納米棒-脂質(zhì)聚合物囊泡的制備

(1)聚合物PSAA的制備

以高壓反應(yīng)釜為反應(yīng)器，將烯丙醇(AA)、過氧化二異丙苯(DCP)和苯乙烯(ST)加入到反應(yīng)器中，以氮?dú)鉃楸Ｗo(hù)劑，其中烯丙醇和苯乙烯作為反應(yīng)原料，兩者質(zhì)量分別5g與0.5g，過氧化二異丙苯作為引發(fā)劑，加入量為550mg，反應(yīng)溫度為150℃，反應(yīng)時(shí)間為10h，最終制得聚合物PSAA。

(2)脂質(zhì)聚合物囊泡的制備

在脈沖超聲下，將聚合物5gPSAA與50mL超純水混合攪拌，加入按任意比混合的二油酰磷脂酰乙醇胺和(2,3-二油?；?丙基)-三甲胺作為表面活性劑，表面活性劑的質(zhì)量為550mg，制備得脂質(zhì)聚合物囊泡。

(3)金納米棒的制備

當(dāng)光入射金納米棒時(shí)，金屬表面的自由電子與入射光的電磁場發(fā)生共振耦合，產(chǎn)生表面等離子體共振(SPR)。SPR可以導(dǎo)致了自由電子與金屬核的電荷分離，進(jìn)而使金納米棒對(duì)光產(chǎn)生較強(qiáng)的吸收和散射，其對(duì)光的吸收和散射是熒光分子的10⁵到10⁶倍，并將吸收的光能快速的轉(zhuǎn)化為熱量，使金納米棒本身產(chǎn)生較高的溫度。激光照射可以引發(fā)金納米棒產(chǎn)生光熱效應(yīng)，光熱治療的效果與激光照射功率和時(shí)間相關(guān)，激光照射功率為5w，時(shí)間為10min。

配制0.5mL 0.05mol/L的HAuCl₄溶液和9.5mL 0.5mol/L的CTAB溶液，將兩溶液混合攪拌，再加入1mL 0.05mol/L的NaBH₄溶液，于室溫下放置2h后，即得到金納米棒種子溶液；將2mL 0.05mol/L的HAuCl₄溶液、0.4mL 0.05mol/L的AgNO₃溶液以及100mL 0.5mol/L的CTAB溶液混合，依次加入0.5mL 0.01mol/L抗壞血酸和1mL 1.0mol/L的鹽酸，混合搖勻后，向其中加入已經(jīng)制備好的金納米棒種子溶液，將混合溶液均勻晃動(dòng)10s后，再靜置8h，即得金納米棒溶液。

(4)金納米棒-脂質(zhì)聚合物囊泡的制備

取2mL濃度為1mg/mL的脂質(zhì)聚合物囊泡和2mL濃度為1mg/mL的金納米棒攪拌均勻，加入到40mL濃度為10mg/mL的十二烷基硫酸鈉水溶液中，在超聲作用下繼續(xù)滴加4.4mL超純水，進(jìn)行第一次乳化，隨后將所得到的乳化液在超聲作用下滴加到濃度為10mg/mL的聚乙烯醇水溶液中進(jìn)行第二次乳化，直到反應(yīng)溶液完全乳化并均勻分散在聚乙烯醇水溶液中，不出現(xiàn)分層，再放置于8000～14000Da透析袋中進(jìn)行透析，即得負(fù)載金納米棒-脂質(zhì)聚合物囊泡。

(5)金納米棒-脂質(zhì)聚合物囊泡的攜載基因藥物的方法

將1mg基因藥物混合在40mL濃度為10mg/mL十二烷基硫酸鈉水溶液中，所述基因藥物為DNA、siRNA或miRNA基因類藥物，所述基因類藥物優(yōu)選為miRNA Let 7b、miRNA-221抑制基因、siRNA BRAF、siRNA VEGF、siRNAc-Myc、siRNA PGP中的一種或多種。取2mL濃度為1mg/mL的脂質(zhì)聚合物囊泡和2mL濃度為1mg/mL的金納米棒攪拌均勻，加入到含有基因藥物的十二烷基硫酸鈉水溶液中，在超聲作用下繼續(xù)滴加4.4mL超純水，進(jìn)行第一次乳化，隨后將所得到的乳化液在超聲作用下滴加到濃度為10mg/mL的聚乙烯醇水溶液中進(jìn)行第二次乳化，直到反應(yīng)溶液完全乳化并均勻分散在聚乙烯醇水溶液中，不出現(xiàn)分層，再放置于8000～14000Da透析袋中進(jìn)行透析，即得攜載基因藥物的負(fù)載金納米棒-脂質(zhì)聚合物囊泡。

實(shí)施例3：

金納米棒-脂質(zhì)聚合物囊泡的驗(yàn)證

(1)對(duì)金納米棒-脂質(zhì)聚合物囊泡進(jìn)行粒徑測量

首先使用超純水將實(shí)施例1合成好的金納米棒調(diào)整至100μg/mL，在馬爾文激光粒徑儀下測量金納米棒的尺寸，結(jié)果如圖1所示。

使用超純水將實(shí)施例1合成好的脂質(zhì)聚合物囊泡調(diào)整至100μg/mL，在馬爾文激光粒徑儀下測量脂質(zhì)聚合物囊泡的尺寸，結(jié)果如圖2所示。

使用超純水將實(shí)施例1合成好的金納米棒-脂質(zhì)聚合物囊泡調(diào)整至100μg/mL，在馬爾文激光粒徑儀下測量金納米棒-脂質(zhì)聚合物囊泡的尺寸，結(jié)果如圖3所示。

(2)對(duì)金納米棒進(jìn)行形態(tài)觀察

取實(shí)施例1金納米棒溶液，滴加在專用銅網(wǎng)上，直接在透射電鏡下觀察粒子的大小和形態(tài)，結(jié)果如圖4所示。

(3)對(duì)空載的金納米棒-脂質(zhì)聚合物囊泡進(jìn)行形態(tài)觀察

取實(shí)施例1空載的金納米棒-脂質(zhì)聚合物囊泡，滴加在專用銅網(wǎng)上，直接在透射電鏡下觀察粒子的大小和形態(tài)，結(jié)果如圖5所示。

(4)考察金納米棒-脂質(zhì)聚合物囊泡攜載基因后對(duì)細(xì)胞遷移的影響

用Transwell培養(yǎng)板(直徑6.5mm，孔徑8μm)考察B16F10的體外遷移能力。將B16F10細(xì)胞，按照每孔5×10⁴個(gè)細(xì)胞的密度種在24孔板中，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時(shí)后，棄去培養(yǎng)液并用PBS洗兩遍，每孔加入500μL不含血清的DMEM高糖培養(yǎng)液。用5wt％蔗糖水溶液稀釋金納米棒-脂質(zhì)聚合物囊泡攜載基因后形成的復(fù)合物。分別取10μL、20μL、40μL已配置好的攜載基因藥物的負(fù)載金納米棒-脂質(zhì)聚合物囊泡(基因藥物的濃度為400μg/mL)，分別加入30μL、20μL、0μL 5wt％的蔗糖溶液進(jìn)行稀釋，使終體積為40μL，每孔加入40μL上述復(fù)合物，使基因藥物終濃度為4μg/mL、8μg/mL和12μg/mL。另取2μg游離的基因藥物，使用5wt％蔗糖水溶液稀釋至40μL后加入24孔板中。5wt％CO₂條件下轉(zhuǎn)染B16F10細(xì)胞，6小時(shí)后將每孔培養(yǎng)液替換成含10wt％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)后，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行饑餓處理：將不同藥物處理過細(xì)胞的上層培養(yǎng)液替換為不含血清培養(yǎng)液，孵育過夜。將饑餓處理過的細(xì)胞以每孔3×10⁴的濃度加入Transwell板的上層，下層加入600μL含有10wt％血清的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48h，取出上層插件，用棉簽輕輕擦去膜上層的細(xì)胞，遷移到下層的細(xì)胞用4wt％多聚甲醛固定20min，PBS洗三次，細(xì)胞用結(jié)晶紫染色。使用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞的遷移情況，結(jié)果如圖6所示。

(5)考察金納米棒-脂質(zhì)聚合物囊泡攜載基因后抗腫瘤效果

以每孔1×10⁴個(gè)細(xì)胞的密度將對(duì)數(shù)生長的B16F10細(xì)胞種在96孔板中，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時(shí)后，除去培養(yǎng)液并用PBS洗兩遍，每孔加入100μL不含血清的DMEM高糖培養(yǎng)液。用5wt％蔗糖水溶液稀釋裸基因藥物，空載金納米棒-脂質(zhì)聚合物囊泡載體，攜載不同濃度基因藥物的金納米棒-脂質(zhì)聚合物囊泡溶液。在37℃，5wt％CO₂條件下轉(zhuǎn)染B16F10細(xì)胞，6小時(shí)后將每孔培養(yǎng)液替換成含10wt％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)后，每孔加入20μL濃度為5mg/mL MTT溶液，孵育4h后除去培養(yǎng)液，每孔加入150μL DMSO，振搖使結(jié)晶完全溶解后，在酶標(biāo)儀上于570nm下測定各組OD值。結(jié)果如圖7所示。

(6)考察金納米棒-脂質(zhì)聚合物囊泡攜載基因后透皮效果

取6周齡的Babl/c雌性小鼠，在實(shí)驗(yàn)前約24h，用5wt％水合氯醛麻醉小鼠。用手術(shù)剪刀將小鼠背部毛小心減掉，不可剪破皮膚。隨后，用溫水將小鼠背部潤濕后，均勻涂抹脫毛膏，使整個(gè)背部與脫毛膏充分接觸。室溫下孵育10min，用溫水將小鼠背部脫毛膏清洗干凈，正常飼養(yǎng)。次日處死小鼠，取下背部皮膚，將皮膚剪至適合Franz透皮擴(kuò)散池的大小，固定在供給池與接收池之間。在供給池中加入0.5mL提前制備的FITC標(biāo)記的質(zhì)粒DNA和攜載FITC標(biāo)記的質(zhì)粒DNA的金納米棒-脂質(zhì)聚合物囊泡復(fù)合物。接收池加入PBS緩沖液(pH＝7.4)，透皮擴(kuò)散池維持在37℃的水溫，攪拌子轉(zhuǎn)速為250rpm。在透皮結(jié)束后，將每組皮膚取下，用棉簽小心擦去表面殘留液體，PBS洗2遍，將其固定在載玻片上，置于激光共聚焦下進(jìn)行豎直方向上的Z軸掃描，考察不同樣品處理皮膚后，F(xiàn)ITC標(biāo)記的質(zhì)粒DNA在皮膚中的分布。結(jié)果如圖8所示。

(7)考察金納米棒-脂質(zhì)聚合物囊泡攜載基因后的體內(nèi)抗腫瘤效果

建立荷皮膚黑色素瘤的裸鼠模型：將100μL含1×10⁶～1×10⁷個(gè)B16F10細(xì)胞的PBS溶液皮下注射在裸鼠右前側(cè)，待腫瘤生長至一定大小時(shí)，隨機(jī)分為4組。將載基因藥物的金納米棒-脂質(zhì)聚合物囊泡、載陰性對(duì)照基因的金納米棒-脂質(zhì)聚合物囊泡、空載金納米棒-脂質(zhì)聚合物囊泡提前制備好，使每只裸鼠每次的給藥劑量包含1～100μg的基因藥物，每次給藥10～100μL。每天測量腫瘤體積的變化和裸鼠體重變化情況。其體內(nèi)抗腫瘤結(jié)果如圖9所示。給藥結(jié)束后，取出腫瘤并拍照，腫瘤大小如圖10所示。

給藥結(jié)束后，取出腫瘤并制備成石蠟切片，使用TUNEL染色考察腫瘤內(nèi)部細(xì)胞的凋亡情況，結(jié)果如圖11所示。