本發(fā)明屬于藥劑領(lǐng)域，涉及一種脂質(zhì)體及其制備方法和應(yīng)用，具體地，此脂質(zhì)體可以包載絕大部分結(jié)構(gòu)中含酚羥基的難溶性藥物。

背景技術(shù)：

眾所周知，藥物的水難溶性始終阻礙著藥物的有效傳遞。研究數(shù)據(jù)表明，高達(dá)40%的經(jīng)過(guò)高通量篩選出的、具有潛在應(yīng)用前景的備選化合物，由于難溶于水，阻礙了其開(kāi)發(fā)和應(yīng)用。難溶性藥物在疾病治療應(yīng)用中存在著諸多弊端，如：水溶性差會(huì)阻礙藥物的吸收，導(dǎo)致藥物生物利用度降低，尤其是口服藥物；難溶性藥物通過(guò)靜脈途徑給藥可能會(huì)發(fā)生血管阻塞，在局部組織發(fā)生沉積，引起多種疾病。然而，疏水性卻是許多活性物質(zhì)所固有的特性，因?yàn)槠溆H脂性有利于藥物穿透細(xì)胞膜，使更多的藥物到達(dá)細(xì)胞內(nèi)部，在特定靶點(diǎn)發(fā)揮治療作用。因此，提高難溶性藥物的溶解度同時(shí)保留藥物的治療活性是當(dāng)今藥劑學(xué)領(lǐng)域的一個(gè)難點(diǎn)和熱點(diǎn)。

目前，提高難溶性藥物溶解度的方法主要有：

一是加入酸或堿，調(diào)節(jié)藥物溶液的pH，使藥物形成可溶性的鹽類。專利文獻(xiàn)CN201010537215.9提供了一種加入有機(jī)胺增加藥物溶解度的方法，該方法簡(jiǎn)單易行，適合工業(yè)化生產(chǎn)。但是形成鹽類之后，藥物的治療活性可能會(huì)受到影響。而且，成鹽的藥物進(jìn)入人體后，由于溫度、pH、無(wú)機(jī)鹽、血漿蛋白等體內(nèi)環(huán)境因素，可能會(huì)使藥物的溶解度重新降低，有嚴(yán)重的安全隱患。

二是將難溶性藥物制成前體藥物。此方法雖然可以顯著提高藥物的穩(wěn)定性，使其進(jìn)入人體后不易發(fā)生變化，但同時(shí)會(huì)破壞藥物原有的結(jié)構(gòu)，可能會(huì)使其藥物活性發(fā)生改變。

三是將難溶性藥物制備成包合物、固體分散體、納米粒、脂質(zhì)體或乳劑等新型制劑。此方法的優(yōu)點(diǎn)是在增加藥物溶解度的同時(shí)，完整地保留了藥物的結(jié)構(gòu)，不會(huì)對(duì)藥物活性產(chǎn)生影響。而且某些劑型存在緩釋效果，提高了療效并降低了毒副作用。專利文獻(xiàn)CN201310165276.0提供了一種難溶性藥物固體分散體及其制備方法，該發(fā)明將難溶性的染料木素等多酚羥基類藥物通過(guò)熔融法與高分子材料制備成固體分散體，顯著提高了藥物的溶出速率和溶解度。專利文獻(xiàn)CN201010023013.2提供了一種水難溶性藥物微膠囊的制備方法，該微膠囊具有增加藥物溶解度、控制藥物釋放速率等優(yōu)點(diǎn)。專利文獻(xiàn)CN201510870096.1提供了一種包載難溶性藥物的納米骨架系統(tǒng)及制備方法，此納米骨架系統(tǒng)具有提高藥物溶解度、溶出度和生物利用度等優(yōu)點(diǎn)。

脂質(zhì)體是一種新型藥物制劑，主要成分是磷脂，可以作為難溶性藥物的載體。磷脂是人體內(nèi)源性成分，有良好的生物相容性和安全性。經(jīng)靜脈給藥后，脂質(zhì)體被體內(nèi)的網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)吞噬，使藥物主要分布在肺、肝、脾和骨髓等器官。粒徑不同，主要的分布器官也不一樣。此外，如果機(jī)體中長(zhǎng)有腫瘤，脂質(zhì)體也會(huì)通過(guò)EPR效應(yīng)滯留于腫瘤部位，從而實(shí)現(xiàn)被動(dòng)靶向。專利文獻(xiàn)CN200610021277.8提供了一種脂質(zhì)體的制備方法和應(yīng)用，此脂質(zhì)體可以將難溶性藥物和厚樸酚包載其中，用于腫瘤靶向治療。然而，目前絕大多數(shù)脂質(zhì)體都是以磷脂和膽固醇為基本材料，這種脂質(zhì)體能夠包載的難溶性藥物的種類和數(shù)量都非常有限，而且載藥脂質(zhì)體的穩(wěn)定性欠佳，往往幾天之內(nèi)就會(huì)有藥物析出，極大地限制了其應(yīng)用。

本發(fā)明旨在設(shè)計(jì)一種新型脂質(zhì)體，不以傳統(tǒng)的磷脂+膽固醇的組合為材料，此脂質(zhì)體可以將大多數(shù)或一大類難溶性藥物包載其中，增加藥物溶解度，同時(shí)具有優(yōu)秀的穩(wěn)定性，可以在一周之內(nèi)或更長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)無(wú)藥物析出且無(wú)明顯的粒徑變化。經(jīng)過(guò)一系列的篩選，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)以磷脂和15-羥基硬脂酸聚乙二醇酯（商品名：Kolliphor HS15）為材料制備的脂質(zhì)體，可以滿足上述需求。此外，發(fā)明人在研究過(guò)程中進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，此新型脂質(zhì)體可以將兩種難溶性藥物同時(shí)包載其中，且穩(wěn)定性極佳。眾所周知，聯(lián)合用藥是目前藥劑研究領(lǐng)域的一大熱門(mén)，有其特有的優(yōu)勢(shì)：一方面，聯(lián)合用藥可以讓多種藥物同時(shí)作用于同一病患部位，提高藥物靶向性；另一方面，利用藥物的互補(bǔ)特性，可以發(fā)揮協(xié)同或相加作用，可達(dá)到增效減毒的目的，從而更好地發(fā)揮藥效。此發(fā)現(xiàn)極大地拓展了本發(fā)明中新型脂質(zhì)體的應(yīng)用，研究人員可以自由選擇用其包載一種藥物或同時(shí)包載兩種藥物用于聯(lián)合用藥治療。此外，該脂質(zhì)體也具有一定緩釋效果，延長(zhǎng)藥物作用時(shí)間，降低毒副作用。而且，通過(guò)改變投料比可以得到不同粒徑的脂質(zhì)體，使其能夠分布到不同的器官。按照不同的病變器官選擇適宜粒徑的脂質(zhì)體，包載相應(yīng)的治療藥物，達(dá)到靶向精準(zhǔn)治療的目的。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的之一，提供一種新型脂質(zhì)體，此脂質(zhì)體不以普通脂質(zhì)體常用的磷脂+膽固醇的組合為材料。

本發(fā)明的目的之一，提供一種可以包載大多數(shù)或一大類難溶性藥物的脂質(zhì)體，增加難溶性藥物的溶解度，拓展脂質(zhì)體的應(yīng)用。

本發(fā)明的目的之一，提供一種可以同時(shí)將兩種難溶性藥物包載其中的脂質(zhì)體，能夠用作聯(lián)合用藥的載體。

本發(fā)明的目的之一，提供一種具有緩釋效果的脂質(zhì)體。

本發(fā)明的目的之一，提供一種具有被動(dòng)靶向效果的脂質(zhì)體。改變處方可以得到不同粒徑的脂質(zhì)體，被動(dòng)靶向到不同組織器官。

本發(fā)明人通過(guò)研究難溶性藥物的結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，含酚羥基結(jié)構(gòu)的難溶性藥物由于酚羥基的負(fù)電性質(zhì)，可以與磷脂中帶正電性的季胺氮產(chǎn)生作用力，使藥物與磷脂形成復(fù)合物。此外，酚羥基結(jié)構(gòu)也可以與磷脂的親水性頭部形成氫鍵，進(jìn)一步增加了用磷脂包載含酚羥基結(jié)構(gòu)的難溶性藥物的可能性。但是單獨(dú)使用磷脂無(wú)法穩(wěn)定地包載難溶性藥物。在進(jìn)行了多種表面活性劑的篩選之后，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，使用15-羥基硬脂酸聚乙二醇酯與磷脂合用制備的脂質(zhì)體，能將大多數(shù)含酚羥基結(jié)構(gòu)的難溶性藥物包載其中，且穩(wěn)定性極佳。因而創(chuàng)造性地發(fā)明了這一載藥能力更強(qiáng)的新型脂質(zhì)體，此脂質(zhì)體具有載藥種類多、穩(wěn)定性好及應(yīng)用廣等優(yōu)勢(shì)。

本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)，此脂質(zhì)體可以同時(shí)包載兩種或兩種以上含酚羥基結(jié)構(gòu)的難溶性藥物，具有載藥能力強(qiáng)、可用于聯(lián)合給藥等優(yōu)勢(shì)。

本發(fā)明提供了一種以磷脂和15-羥基硬脂酸聚乙二醇酯為材料的脂質(zhì)體；磷脂和15-羥基硬脂酸聚乙二醇酯質(zhì)量比優(yōu)選為20:1~1:20，15-羥基硬脂酸聚乙二醇酯比例越大，脂質(zhì)體粒徑越小。單獨(dú)使用磷脂或15-羥基硬脂酸聚乙二醇酯無(wú)法將藥物穩(wěn)定地包載到其中。

所述的脂質(zhì)體，其粒徑優(yōu)選為40nm~200nm。

所述的脂質(zhì)體，其載藥量為0.1%~20%，優(yōu)選為2%~10%。

本發(fā)明的目的之一，提供上述脂質(zhì)體的應(yīng)用。此脂質(zhì)體不但可以用于包載含酚羥基結(jié)構(gòu)的難溶性藥物，還可以用于聯(lián)合用藥、藥物緩釋、腫瘤等組織的被動(dòng)靶向治療等。

本發(fā)明的目的之一，提供上述脂質(zhì)體的制備方法。

作為具體的實(shí)施方案之一，本發(fā)明的脂質(zhì)體的制備方法如下：

（1）將磷脂、15-羥基硬脂酸聚乙二醇酯和藥物按照一定質(zhì)量比例混合溶于有機(jī)溶劑，置于圓底燒瓶中；

（2）旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)成膜，加水水化，探頭超聲或高壓均質(zhì)，即得。

優(yōu)選地，所述水包括去離子水、注射用水、生理鹽水和5%葡萄糖溶液等。

步驟（1）中的磷脂選自商業(yè)來(lái)源不同規(guī)格的天然大豆磷脂、天然蛋黃磷脂、氫化磷脂以及合成磷脂，可以選自德國(guó)Lipoid公司磷脂S45、S75、S100、SPC、E80、EPCS、EPG、SPC-3、DSPE、DPPA、DSPA、DMPC等，日本丘比株式會(huì)社磷脂PC98-T、

PL-100M、HSPC、PGE、PGSH等，韓國(guó)斗山公司磷脂DS-PL95E等，優(yōu)選磷脂E80、S100、PC98-T、EPCS等常用市售磷脂。

步驟（1）中的有機(jī)溶劑優(yōu)選為乙醇、甲醇、二氯甲烷、氯仿、丙酮等及其混合溶劑。

步驟（1）中磷脂和15-羥基硬脂酸聚乙二醇酯質(zhì)量比優(yōu)選為20:1~1:20。

步驟（1）中的載藥量?jī)?yōu)選為2%~10%。適用于本發(fā)明的含酚羥基的難溶性藥物包括但不限于如下：

抗腫瘤藥物，包括但不限于，姜黃素及其衍生物、白藜蘆醇、和厚樸酚、替尼泊苷、替莫泊芬、柔紅霉素、去甲柔紅霉素、二乙氧二酰氧柔紅霉素、佐柔比星、伊達(dá)比星、阿柔比星、氨柔比星、吡柔比星、流柔比星、美多比星、美諾立爾、奈莫柔比星、羅多比星、地托比星、依索比星、阿霉素、表阿霉素、阿克拉霉素、諾拉霉素、司替霉素、米托蒽醌、吡咯蒽醌、依托泊苷、蘭瑞肽、伐普肽、依多曲肽、橄欖霉素、安曲霉素、羥基喜樹(shù)堿、考布他丁A-4等。

其他藥物，包括但不限于，左旋多巴、多巴酚丁胺、水飛薊賓、羥基香豆素、門(mén)冬托星、伐普肽、氯喹那多、氯胺羥喹、氯碘羥喹、雙碘喹啉、替布喹、甲羥喹、甲溴羥喹、異煙腙、曲格列酮、羥布宗、對(duì)乙酰氨基酚、沙丁胺醇等。

優(yōu)選和厚樸酚、姜黃素、水飛薊賓、白藜蘆醇、吡柔比星或替尼泊苷等。

可以同時(shí)包載兩種藥物的組合，包括但不限于，姜黃素及其衍生物+和厚樸酚，白藜蘆醇+和厚樸酚，替尼泊苷+和厚樸酚，柔紅霉素+和厚樸酚，阿霉素+和厚樸酚，羥基喜樹(shù)堿+和厚樸酚，水飛薊賓+和厚樸酚，姜黃素及其衍生物+白藜蘆醇，替尼泊苷+水飛薊賓，白藜蘆醇+阿霉素，水飛薊賓+白藜蘆醇等。

優(yōu)選以下組合：和厚樸酚+替尼泊苷，姜黃素+白藜蘆醇，阿霉素+白藜蘆醇，和厚樸酚+白藜蘆醇，和厚樸酚+姜黃素等。

有益效果

（1）本發(fā)明的脂質(zhì)體，載藥量大，穩(wěn)定性好，有很好的安全性和生物相容性。

（2）本發(fā)明的脂質(zhì)體，粒徑多樣，可以通過(guò)控制投料比例得到粒徑40nm~200nm的脂質(zhì)體，滿足不同的靶向需求。

（3）本發(fā)明的脂質(zhì)體，可以將含酚羥基結(jié)構(gòu)的這一大類難溶性藥物包載其中，載藥種類多，應(yīng)用范圍廣。

（4）本發(fā)明的脂質(zhì)體，可以同時(shí)將兩種含酚羥基結(jié)構(gòu)的難溶性藥物包載其中，載藥能力強(qiáng)，適用于聯(lián)合給藥。

（5）本發(fā)明的脂質(zhì)體具有被動(dòng)靶向性。不同粒徑的脂質(zhì)體可以選擇性地被動(dòng)靶向到骨髓、肝臟、脾臟、腫瘤和肺等器官。

（6）本發(fā)明的脂質(zhì)體具有一定的緩釋效果。

（7）本發(fā)明脂質(zhì)體的制備工藝簡(jiǎn)單、易控，適合工業(yè)化生產(chǎn)。

附圖說(shuō)明

以下，結(jié)合附圖來(lái)詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)施方案，其中：

圖1表示實(shí)施例1中脂質(zhì)體的透射電鏡圖（放大倍數(shù)為8萬(wàn)倍）。

圖2表示實(shí)施例1中脂質(zhì)體的體外釋放實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

圖3表示DiD標(biāo)記脂質(zhì)體的腫瘤細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

圖4表示DiD標(biāo)記脂質(zhì)體的體內(nèi)分布結(jié)果。

圖5表示本發(fā)明脂質(zhì)體的安全性評(píng)價(jià)結(jié)果。

圖6表示本發(fā)明脂質(zhì)體用于聯(lián)合用藥的藥效結(jié)果。

圖7表示本發(fā)明脂質(zhì)體與常用脂質(zhì)體的穩(wěn)定性對(duì)比結(jié)果。

圖8表示本發(fā)明脂質(zhì)體與常用脂質(zhì)體的體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)對(duì)比結(jié)果。

具體實(shí)施方式

以下實(shí)施例是對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步說(shuō)明，但絕不是對(duì)本發(fā)明范圍的限制。下面參照實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)闡述本發(fā)明，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明并不限于這些實(shí)施例以及使用的制備方法。而且，本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的描述可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行等同替換、組合、改良或修飾，但這些都將包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。

實(shí)施例1

將40mg磷脂E80、25mg 15-羥基硬脂酸聚乙二醇酯和6mg和厚樸酚溶于乙醇置于圓底燒瓶中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)成膜，加入生理鹽水水化，探頭超聲即得和厚樸酚脂質(zhì)體，粒徑84nm，靜脈注射用于腫瘤靶向治療。

實(shí)施例2

將100mg磷脂S100、5mg 15-羥基硬脂酸聚乙二醇酯和3mg姜黃素溶于二氯甲烷置于圓底燒瓶中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)成膜，加入生理鹽水水化，高壓均質(zhì)即得姜黃素脂質(zhì)體，粒徑200nm，靜脈注射緩釋用于炎癥治療。

實(shí)施例3

將5mg磷脂SPC、100mg 15-羥基硬脂酸聚乙二醇酯和2mg水飛薊賓溶于丙酮置于圓底燒瓶中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)成膜，加入5%葡萄糖溶液水化，探頭超聲即得水飛薊賓脂質(zhì)體，粒徑40nm，靜脈注射用于肝纖維化治療。

實(shí)施例4

將50mg磷脂E80、15mg 15-羥基硬脂酸聚乙二醇酯和3mg白藜蘆醇溶于乙醇置于圓底燒瓶中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)成膜，加入生理鹽水水化，高壓均質(zhì)即得白藜蘆醇脂質(zhì)體，粒徑85nm，靜脈注射用于腫瘤靶向治療。

實(shí)施例5

將60mg磷脂S45、60mg 15-羥基硬脂酸聚乙二醇酯和3mg吡柔比星溶于氯仿置于圓底燒瓶中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)成膜，加入生理鹽水水化，探頭超聲即得吡柔比星脂質(zhì)體，粒徑68nm，靜脈注射用于腫瘤靶向治療。

實(shí)施例6

將40mg磷脂S75、25mg 15-羥基硬脂酸聚乙二醇酯和2mg替尼泊苷溶于甲醇和丙酮的混合溶劑置于圓底燒瓶中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)成膜，加入生理鹽水水化，探頭超聲即得替尼泊苷脂質(zhì)體，粒徑78nm，靜脈注射用于腫瘤靶向治療。

實(shí)施例7

將20mg磷脂E80、40mg 15-羥基硬脂酸聚乙二醇酯和3mg白藜蘆醇溶于二氯甲烷置于圓底燒瓶中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)成膜，加入5%葡萄糖溶液水化，高壓均質(zhì)即得白藜蘆醇脂質(zhì)體，粒徑65nm，靜脈注射用于腫瘤靶向治療。

實(shí)施例8

將80mg磷脂S100、10mg 15-羥基硬脂酸聚乙二醇酯和6mg姜黃素溶于甲醇置于圓底燒瓶中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)成膜，加入5%葡萄糖溶液水化，探頭超聲即得姜黃素脂質(zhì)體，粒徑110nm，靜脈注射用于腫瘤靶向或炎癥治療。

實(shí)施例9

將50mg磷脂EPCS、10mg 15-羥基硬脂酸聚乙二醇酯和7mg和厚樸酚溶于乙醇置于圓底燒瓶中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)成膜，加入生理鹽水水化，高壓均質(zhì)即得和厚樸酚脂質(zhì)體，粒徑86nm，靜脈注射用于腫瘤靶向治療。

實(shí)施例10

將10mg磷脂PC98-T、100mg 15-羥基硬脂酸聚乙二醇酯和4mg水飛薊賓溶于乙醇置于圓底燒瓶中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)成膜，加入生理鹽水水化，探頭超聲即得水飛薊賓脂質(zhì)體，粒徑50nm，靜脈注射用于肝纖維化治療。

實(shí)施例11

將15mg磷脂E80、60mg 15-羥基硬脂酸聚乙二醇酯和3mg吡柔比星溶于氯仿置于圓底燒瓶中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)成膜，加入生理鹽水水化，探頭超聲即得吡柔比星脂質(zhì)體，粒徑60nm，靜脈注射用于腫瘤靶向治療。

實(shí)施例12

將70mg磷脂EPG、7mg 15-羥基硬脂酸聚乙二醇酯和2mg替尼泊苷溶于甲醇和丙酮的混合溶劑置于圓底燒瓶中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)成膜，加入5%葡萄糖溶液水化，高壓均質(zhì)即得替尼泊苷脂質(zhì)體，粒徑78nm，靜脈注射用于腫瘤靶向治療。

實(shí)施例13

將4mg磷脂E80、48mg 15-羥基硬脂酸聚乙二醇酯和5mg姜黃素溶于甲醇置于圓底燒瓶中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)成膜，加入生理鹽水水化，探頭超聲即得姜黃素脂質(zhì)體，粒徑48nm，靜脈注射用于腫瘤靶向或炎癥治療。

實(shí)施例14

將15mg磷脂PL-100M、75mg 15-羥基硬脂酸聚乙二醇酯和4mg和厚樸酚溶于丙酮置于圓底燒瓶中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)成膜，加入生理鹽水水化，高壓均質(zhì)即得和厚樸酚脂質(zhì)體，粒徑57nm，靜脈注射用于腫瘤靶向治療。

實(shí)施例15

將75mg磷脂E80、5mg 15-羥基硬脂酸聚乙二醇酯和4mg白藜蘆醇溶于乙醇置于圓底燒瓶中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)成膜，加入5%葡萄糖溶液水化，探頭超聲即得白藜蘆醇脂質(zhì)體，粒徑150nm，靜脈注射用于腫瘤靶向治療。

實(shí)施例16

將60mg磷脂S100、10mg 15-羥基硬脂酸聚乙二醇酯和7mg水飛薊賓溶于二氯甲烷置于圓底燒瓶中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)成膜，加入生理鹽水水化，高壓均質(zhì)即得水飛薊賓脂質(zhì)體，粒徑90nm，靜脈注射用于肝纖維化治療。

實(shí)施例17

將6mg磷脂E80、90mg 15-羥基硬脂酸聚乙二醇酯和3mg吡柔比星溶于氯仿置于圓底燒瓶中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)成膜，加入生理鹽水水化，探頭超聲即得吡柔比星脂質(zhì)體，粒徑45nm，靜脈注射用于腫瘤靶向治療。

實(shí)施例18

將12mg磷脂EPCS、96mg 15-羥基硬脂酸聚乙二醇酯和4mg替尼泊苷溶于甲醇和丙酮的混合溶劑置于圓底燒瓶中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)成膜，加入生理鹽水水化，高壓均質(zhì)即得替尼泊苷脂質(zhì)體，粒徑55nm，靜脈注射用于腫瘤靶向治療。

實(shí)施例19

將72mg磷脂E80、6mg 15-羥基硬脂酸聚乙二醇酯和5mg白藜蘆醇溶于甲醇置于圓底燒瓶中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)成膜，加入5%葡萄糖溶液水化，探頭超聲即得白藜蘆醇脂質(zhì)體，粒徑130nm，靜脈注射用于腫瘤靶向治療。

實(shí)施例20

將90mg磷脂S100、5mg 15-羥基硬脂酸聚乙二醇酯和4mg和厚樸酚溶于丙酮置于圓底燒瓶中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)成膜，加入5%葡萄糖溶液水化，高壓均質(zhì)即得和厚樸酚脂質(zhì)體，粒徑180nm，靜脈注射用于腫瘤靶向治療。

實(shí)施例21

將40mg磷脂E80、25mg 15-羥基硬脂酸聚乙二醇酯、3mg和厚樸酚和3mg替尼泊苷溶于甲醇和丙酮的混合溶劑置于圓底燒瓶中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)成膜，加入生理鹽水水化，探頭超聲即得和厚樸酚-替尼泊苷共載藥脂質(zhì)體，粒徑90nm，靜脈注射用于腫瘤靶向協(xié)同給藥治療。

實(shí)施例22

將50mg磷脂S100、15mg 15-羥基硬脂酸聚乙二醇酯、4mg姜黃素和4mg白藜蘆醇溶于乙醇置于圓底燒瓶中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)成膜，加入生理鹽水水化，高壓均質(zhì)即得姜黃素-白藜蘆醇共載藥脂質(zhì)體，粒徑100nm，靜脈注射用于腫瘤靶向協(xié)同給藥治療。

實(shí)施例23

將60mg磷脂EPCS、20mg 15-羥基硬脂酸聚乙二醇酯、4mg阿霉素和3mg白藜蘆醇溶于乙醇置于圓底燒瓶中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)成膜，加入5%葡萄糖溶液水化，探頭超聲即得阿霉素-白藜蘆醇共載藥脂質(zhì)體，粒徑95nm，靜脈注射用于腫瘤靶向協(xié)同給藥治療。

實(shí)施例24

將100mg磷脂E80、30mg 15-羥基硬脂酸聚乙二醇酯、5mg和厚樸酚和5mg白藜蘆醇溶于乙醇置于圓底燒瓶中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)成膜，加入生理鹽水水化，高壓均質(zhì)即得和厚樸酚-白藜蘆醇共載藥脂質(zhì)體，粒徑110nm，靜脈注射用于腫瘤靶向協(xié)同給藥治療。

實(shí)施例25

將70mg磷脂PC98-T、20mg 15-羥基硬脂酸聚乙二醇酯、4mg和厚樸酚和3mg姜黃素溶于丙酮置于圓底燒瓶中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)成膜，加入生理鹽水水化，高壓均質(zhì)即得和厚樸酚-姜黃素共載藥脂質(zhì)體，粒徑105nm，靜脈注射用于腫瘤靶向協(xié)同給藥治療。

實(shí)驗(yàn)例1磷脂E80和15-羥基硬脂酸聚乙二醇酯的投料比與脂質(zhì)體粒徑的關(guān)系

控制磷脂E80和15-羥基硬脂酸聚乙二醇酯（表格中用HS15表示）的投料比例，可以得到不同粒徑的脂質(zhì)體，滿足不同給藥需求，如表1所示。結(jié)果表明，15-羥基硬脂酸聚乙二醇酯比例越大，脂質(zhì)體粒徑越小。

表1. 投料比與粒徑的關(guān)系

實(shí)驗(yàn)例2磷脂E80和15-羥基硬脂酸聚乙二醇酯聯(lián)合使用的重要性

發(fā)明人考察了單獨(dú)使用磷脂E80或15-羥基硬脂酸聚乙二醇酯（表格中用HS15表示）來(lái)制備載藥脂質(zhì)體，如表2所示。結(jié)果表明，單獨(dú)使用磷脂E80或15-羥基硬脂酸聚乙二醇酯制備的脂質(zhì)體粒徑和PDI較大，且非常不穩(wěn)定。因此，磷脂E80和15-羥基硬脂酸聚乙二醇酯必須在一定比例下聯(lián)合使用才能制備出符合發(fā)明人要求的脂質(zhì)體。

表2. 單獨(dú)使用磷脂E80或15-羥基硬脂酸聚乙二醇酯制備載藥脂質(zhì)體

實(shí)驗(yàn)例3載藥脂質(zhì)體穩(wěn)定性考察

本發(fā)明選擇實(shí)施例1中的和厚樸酚脂質(zhì)體作為模型，研究此新型脂質(zhì)體包載一種難溶性藥物時(shí)的穩(wěn)定性；選擇實(shí)施例21中的共載藥脂質(zhì)體作為模型，研究此新型脂質(zhì)體同時(shí)包載兩種難溶性藥物時(shí)的穩(wěn)定性。將制備出的脂質(zhì)體，分別放置于4°C、室溫和37°C下保存，每隔一定時(shí)間取樣測(cè)粒徑，記錄粒徑的變化，如表3、表4所示。

表3. 單獨(dú)包載一種藥物的脂質(zhì)體的穩(wěn)定性考察

表4. 同時(shí)包載兩種藥物的脂質(zhì)體的穩(wěn)定性考察

結(jié)果表明，本發(fā)明的脂質(zhì)體包載一種或兩種藥物均有出色的穩(wěn)定性，10天之內(nèi)粒徑?jīng)]有明顯變化，也無(wú)藥物析出，且溫度對(duì)脂質(zhì)體的保存無(wú)明顯影響。

實(shí)驗(yàn)例4脂質(zhì)體的形態(tài)、粒徑測(cè)定

將實(shí)施例1中和厚樸酚脂質(zhì)體的濃度（藥物+輔料）稀釋成1mg/ml，于透射電鏡下觀察脂質(zhì)體的形態(tài)和粒徑大小。

圖1為和厚樸酚脂質(zhì)體的透射電鏡圖。結(jié)果表明，和厚樸酚脂質(zhì)體外觀圓整，粒徑均一。在此實(shí)施例下，和厚樸酚脂質(zhì)體的粒徑約為80~100nm。

實(shí)驗(yàn)例5和厚樸酚脂質(zhì)體的體外釋放

將2ml和厚樸酚原藥溶液（0.5mg/ml）和2ml實(shí)施例1中的和厚樸酚脂質(zhì)體混懸液（0.5mg/ml，按和厚樸酚濃度計(jì)算）分別置于透析袋中（分子截留量為1000Da）。將透析袋置于含100ml PBS（pH7.4）的棕色廣口瓶中，于37°C恒溫?fù)u床（100rpm）中振搖。每隔一段時(shí)間取5.0ml透析袋外的透析液測(cè)定紫外吸收值，同時(shí)向廣口瓶中補(bǔ)加5.0ml新鮮PBS。將紫外吸收值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出和厚樸酚的濃度，進(jìn)而計(jì)算出和厚樸酚原藥與和厚樸酚脂質(zhì)體在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的釋放度（n=3）。

圖2為實(shí)施例1中和厚樸酚脂質(zhì)體的體外釋放實(shí)驗(yàn)結(jié)果。結(jié)果表明，和厚樸酚脂質(zhì)體在體外比和厚樸酚原藥有更好的緩釋效果，本發(fā)明的脂質(zhì)體可以用于藥物緩釋。

實(shí)驗(yàn)例6腫瘤細(xì)胞攝取試驗(yàn)

用親脂性熒光染料DiD標(biāo)記脂質(zhì)體，對(duì)脂質(zhì)體進(jìn)行示蹤，制備方法與實(shí)施例1相似，具體為：將40mg磷脂E80、25mg 15-羥基硬脂酸聚乙二醇酯和0.6mg DiD溶于乙醇置于圓底燒瓶中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)成膜，加入生理鹽水水化，探頭超聲即得DiD標(biāo)記的脂質(zhì)體（DiD-Lip），粒徑82nm。

將小鼠黑色素瘤細(xì)胞（B16F10）接種于12孔板中，每孔1×10⁵個(gè)細(xì)胞，用RPMI-1640培養(yǎng)基（含10%胎牛血清，50U/ml青霉素，50U/ml鏈霉素）在37°C、5%CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜，使細(xì)胞的單層覆蓋率達(dá)到80%。吸去培養(yǎng)基，每孔分別加入1ml DiD原藥溶液和DiD-Lip混懸液（用培養(yǎng)基將濃度稀釋成0.5μg/ml，按DiD濃度計(jì)算）。原藥組和脂質(zhì)體組各做三個(gè)復(fù)孔，另設(shè)三孔作為對(duì)照。繼續(xù)培養(yǎng)2h后，棄去培養(yǎng)基，PBS洗兩遍，用胰酶消化細(xì)胞。1min后終止消化，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至2ml離心管中離心，棄去上清，加入300μl PBS重懸，用流式細(xì)胞儀測(cè)定DiD的熒光強(qiáng)度。

圖3為DiD-Lip的腫瘤細(xì)胞攝取結(jié)果（**：p<0.01）。結(jié)果表明，腫瘤細(xì)胞對(duì)脂質(zhì)體的攝取要明顯高于DiD原藥，本發(fā)明的脂質(zhì)體有作為腫瘤靶向藥物載體的潛力。

實(shí)驗(yàn)例7體內(nèi)分布研究

將6周齡的C57小鼠腋下接種B16F10細(xì)胞（每只給予2×10⁶個(gè)細(xì)胞，分散在0.2ml PBS中）。待腫瘤長(zhǎng)至約200mm³時(shí)（接種14天后）將小鼠分為2組：DiD原藥組和DiD-Lip組（制備方法同實(shí)驗(yàn)例6），每組3只。分別靜脈注射原藥和脂質(zhì)體后（給藥劑量為10μg/kg，按DiD濃度計(jì)算），于2h后處死，取心、肝、脾、肺、腎、腫瘤，洗凈，用活體成像儀對(duì)各器官進(jìn)行半定量，測(cè)定器官中的DiD含量。

圖4為DiD-Lip的體內(nèi)分布結(jié)果。結(jié)果表明，脂質(zhì)體在腫瘤組織中的分布要明顯高于原藥組，進(jìn)一步證明本發(fā)明的脂質(zhì)體可作為腫瘤靶向治療的載體。

實(shí)驗(yàn)例8安全性評(píng)價(jià)

將10只雄性SD大鼠隨機(jī)分為2組，每組5只。兩組分別靜脈注射生理鹽水和脂質(zhì)體（不載藥，處方同實(shí)施例1，濃度為50 mg/kg），每2天注射一次，連續(xù)注射4周。在給藥期間觀察大鼠進(jìn)食、活動(dòng)、精神狀態(tài)等生活情況，于末次給藥24h后取血測(cè)定血液學(xué)指標(biāo)，包括白細(xì)胞計(jì)數(shù)（WBC）、紅細(xì)胞計(jì)數(shù)（RBC）和血小板數(shù)（Plt）。處死大鼠后取出心、肝、脾、肺、腎等各器官，4%多聚甲醛固定后，經(jīng)石蠟包埋切片和蘇木精-伊紅染色后在光學(xué)顯微鏡下做病理組織學(xué)檢查，觀察兩組大鼠的各個(gè)器官的病理變化情況。

圖5為脂質(zhì)體的安全性評(píng)價(jià)結(jié)果（a：血常規(guī)指標(biāo)；b：各主要器官的病理切片，刻度代表200μm）。結(jié)果顯示，脂質(zhì)體組的血液學(xué)指標(biāo)與生理鹽水組無(wú)明顯區(qū)別，表明脂質(zhì)體對(duì)骨髓造血無(wú)影響。此外，脂質(zhì)體對(duì)各主要器官?zèng)]有明顯毒性，進(jìn)一步表明了本發(fā)明的脂質(zhì)體安全性好。

實(shí)驗(yàn)例9脂質(zhì)體用于聯(lián)合用藥

發(fā)明人選取替尼泊苷與和厚樸酚兩種抗腫瘤藥物，將其分別單獨(dú)包載于脂質(zhì)體和同時(shí)包載于同一脂質(zhì)體中，比較聯(lián)合用藥與單獨(dú)用藥的抗腫瘤效果，探索此脂質(zhì)體在聯(lián)合用藥領(lǐng)域的應(yīng)用前景。

將6周齡的C57小鼠腋下接種B16F10細(xì)胞（每只給予2×10⁶個(gè)細(xì)胞，分散在0.2ml PBS中）。待腫瘤長(zhǎng)至約50mm³時(shí)（接種8天后）將小鼠分為5組：生理鹽水組（a）、替尼泊苷脂質(zhì)體組（b）、和厚樸酚脂質(zhì)體組（c）、替尼泊苷脂質(zhì)體+和厚樸酚脂質(zhì)體組（d）和替尼泊苷+和厚樸酚共載藥脂質(zhì)體組（e），每組3只。每組分別給與對(duì)應(yīng)的制劑，此后每隔1天給藥一次，6次給藥后停止給藥，接種21天后停止實(shí)驗(yàn)。最后一次給藥后解剖小鼠，將腫瘤取出后觀察各組腫瘤大小。各組制劑制備過(guò)程如下：

a組：生理鹽水；

b組：將替尼泊苷按照實(shí)施例1下的處方量包載到脂質(zhì)體中，給藥劑量為10mg/kg；

c組：將和厚樸酚按照實(shí)施例1下的處方量包載到脂質(zhì)體中，給藥劑量為10mg/kg；

d組：按照實(shí)施例1下的處方量分別制備替尼泊苷脂質(zhì)體與和厚樸酚脂質(zhì)體，然后將兩種脂質(zhì)體按體積比1:1混合后共給藥，給藥劑量按總藥量計(jì)算，為10mg/kg；

e組：將替尼泊苷與和厚樸酚按照實(shí)施例21下的處方量按質(zhì)量比1:1共同包載到同一脂質(zhì)體中，給藥劑量按總藥量計(jì)算，為10mg/kg。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6所示。結(jié)果表明，脂質(zhì)體包載兩種藥物聯(lián)合用藥的治療效果明顯優(yōu)于使用單一藥物脂質(zhì)體進(jìn)行治療。而且，將兩種藥物包載于同一脂質(zhì)體中進(jìn)行治療比混合兩種單一藥物脂質(zhì)體進(jìn)行治療效果更優(yōu)。因此，本發(fā)明的脂質(zhì)體有極大的用于聯(lián)合用藥的潛力。

對(duì)比實(shí)驗(yàn)

為了進(jìn)一步體現(xiàn)本發(fā)明的脂質(zhì)體相比于目前常用的脂質(zhì)體的優(yōu)越性，發(fā)明人設(shè)置了對(duì)比實(shí)驗(yàn)。專利文獻(xiàn)CN200610021277.8提供了一種脂質(zhì)體，此脂質(zhì)體以常用的磷脂和膽固醇為材料進(jìn)行制備，并添加了PEG化的磷脂，而且也包載了和厚樸酚，符合我們的對(duì)比需求。因此，本發(fā)明人以專利文獻(xiàn)CN200610021277.8中的脂質(zhì)體作為對(duì)比制劑。

包載藥物種類對(duì)比

發(fā)明人選擇了幾種有代表性的難溶性藥物，分別用本發(fā)明的脂質(zhì)體與專利文獻(xiàn)CN200610021277.8中的脂質(zhì)體包載，比較兩者的包載能力。本發(fā)明的脂質(zhì)體按照本發(fā)明實(shí)施例1下的處方量進(jìn)行制備；對(duì)比脂質(zhì)體按照專利文獻(xiàn)CN200610021277.8中實(shí)施例1下的方法進(jìn)行制備，結(jié)果如表5所示。

可以看出，本發(fā)明的脂質(zhì)體可以將所有選擇的藥物包載其中，粒徑和PDI較小，外觀較好；而對(duì)比脂質(zhì)體只能將和厚樸酚較好地包載其中，對(duì)其他選擇的藥物無(wú)法很好地包載。結(jié)果表明，本發(fā)明的脂質(zhì)體能包載種類更多的難溶性藥物，包載能力強(qiáng)。

表5. 包載藥物種類對(duì)比

2.脂質(zhì)體穩(wěn)定性對(duì)比

分別按照本發(fā)明實(shí)施例1下的處方和專利文獻(xiàn)CN200610021277.8中實(shí)施例1下的處方制備和厚樸酚脂質(zhì)體，于室溫下保存，每隔一定時(shí)間取樣測(cè)粒徑。用取樣粒徑與初始粒徑的比值表征粒徑的變化，考察兩種脂質(zhì)體各自的穩(wěn)定性，結(jié)果如圖7所示。

可以看出，本發(fā)明的脂質(zhì)體在10天之內(nèi)粒徑幾乎沒(méi)有變化；而對(duì)比脂質(zhì)體粒徑一直在增加，10天之后粒徑從100nm左右增加到了300nm左右。結(jié)果表明，本發(fā)明的脂質(zhì)體具有更好的穩(wěn)定性。

脂質(zhì)體體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)對(duì)比

分別按照本發(fā)明實(shí)施例1下的處方和專利文獻(xiàn)CN200610021277.8中實(shí)施例1下的處方制備和厚樸酚脂質(zhì)體。將9只健康雄性Wistar大鼠（180±20g）隨機(jī)分為和厚樸酚原藥組、對(duì)比脂質(zhì)體組和本發(fā)明的脂質(zhì)體組三組，每組3只，分別給予各制劑，給藥劑量按和厚樸酚計(jì)算為20mg/kg。給藥后每隔一段時(shí)間，眼眶取血300μl于含有1%肝素鈉的EP管中，6000rpm離心5min。取100μl上清，加400ul甲醇沉淀蛋白，渦旋10min后水浴超聲10min，13000rpm離心10min，取上清，用HPLC測(cè)定各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的血漿藥物濃度，結(jié)果如圖8所示。

結(jié)果表明，在沒(méi)有使用PEG化磷脂的情況下，本發(fā)明脂質(zhì)體的長(zhǎng)循環(huán)效果還要略優(yōu)于處方中含有PEG化磷脂的對(duì)比脂質(zhì)體，體現(xiàn)了本脂質(zhì)體在長(zhǎng)循環(huán)方面的優(yōu)越性，而且制備成本更加廉價(jià)。