本發(fā)明涉及一種透明質酸寡糖修飾的礦化膠原仿生骨修復材料及其制備方法，屬于生物醫(yī)用材料技術領域。

背景技術：

由創(chuàng)傷、腫瘤、感染及病理因素等造成的骨缺損在臨床中十分常見，成為困擾人類健康生活的難題之一。骨移植已成為僅次于輸血的需求量最大的移植物，而且有逐年增加的趨勢。目前，臨床應用的骨修復材料包括自體骨、異體骨、異種骨、人工骨等，但都存在一定的問題，不能完全解決臨床對骨材料的巨大需求。盡管存在來源有限和二次創(chuàng)傷問題，但自體骨仍是目前臨床效果最好的骨植入材料，一直以來作為骨缺損治療的“金標準”。因此，模仿天然骨的成分和結構，國內外科學家通過體外人工合成的方法，仿生制備了膠原-羥基磷灰石不同形式的復合骨材料，并應用于臨床。但隨著研究的深入和臨床應用跟蹤，發(fā)現(xiàn)這些材料與自體骨相比存在生物活性不足或骨修復效果不足等缺點，難以取得理想的修復效果。另外，骨是一個高度血管化的組織，而現(xiàn)行組織工程骨的研究多忽略移植物的再血管化，對于大的骨缺損來說，周圍組織滲透營養(yǎng)、氧氣的范圍有限，而植入骨材料的內生血管形成較慢或難以血管化，最終導致移植骨的成骨活性顯著降低，甚至出現(xiàn)組織中央細胞壞死的情況。因此，傳統(tǒng)骨支架材料存在的生物活性不足及血管化問題等仍是組織工程骨研究的重點。

透明質酸(HA)是天然的細胞外基質，具有良好的生物相容性及理化性能，可影響細胞的增殖、遷移及分化，尤其是其寡糖oHA具有促血管化和創(chuàng)傷修復及免疫調節(jié)的生物活性。目前，透明質酸與膠原等蛋白結合用于組織材料構建的研究較多，但多集中于大分子量透明質酸的使用，至少也是5kD以上的寡聚糖。這主要是因為5kD以下的oHA制備困難且價格昂貴，且分子量越低其在材料設計中的難度也會相應加大。

中國專利文獻CN105903081A(申請?zhí)?01510926063.4)公開了一種新型雙層蛋白多糖基修復材料的制備方法，其中透明質酸與I型膠原(Col I)主要通過電荷及氫鍵作用進行結合，后續(xù)經(jīng)冷凍干燥及熱交聯(lián)處理得到三維網(wǎng)狀復合材料，該多糖與膠原的復合材料主要應用于軟組織的修復。

在組織工程骨中比較重要的一類基礎材料是膠原/羥基磷灰石復合材料，其制備工藝和成分也在不斷改善，由以往的鈣磷鹽與膠原的機械混合逐漸發(fā)展為無機顆粒在膠原等聚合物基體上的定向排列而實現(xiàn)無機成分與有機成分的有效復合，另外也通過引入其他成分來改善膠原力學性能差的缺陷。中國專利文獻CN101590293A(申請?zhí)?00910149959.0)公開了一種HA(此指羥基磷灰石)/膠原/殼聚糖互穿聚合物網(wǎng)絡支架的制備方法，該法將PVP為模板制得的羥基磷灰石溶膠分散在膠原和殼聚糖共混液中，經(jīng)兩步交聯(lián)后通過減壓、除氣等后處理得到復合支架，雖然該支架中無機顆粒在膠原/殼聚糖基體中分散良好，但整體來看操作過程較多，而且天然骨是以膠原為模板通過非膠原蛋白的調控或膠原與礦物相的相互作用實現(xiàn)鈣磷鹽的成核礦化，并以膠原的自組裝過程為基礎形成的分級結構，骨的這種由微觀到宏觀逐級形成的多級有序結構對骨的性能及功能十分重要，而該文獻中只是將單獨制備的羥基磷灰石交聯(lián)結合在聚合物基體上，并未實現(xiàn)骨的微結構仿生。

技術實現(xiàn)要素：

針對當前臨床骨移植的巨大需求及現(xiàn)有骨修復材料仍存在的缺陷，本發(fā)明克服現(xiàn)有技術的不足，提供一種透明質酸寡糖修飾的礦化膠原仿生骨修復材料及其制備方法。

本發(fā)明的技術方案如下：

一種透明質酸寡糖修飾的礦化膠原仿生骨修復材料，結構如下：

膠原-羥基磷灰石復合材料中的膠原通過C-N鍵連接透明質酸寡糖，獲得糖基化修飾的礦化膠原復合材料，透明質酸寡糖的分子量為776～5000Da。

根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述透明質酸寡糖修飾膠原的載糖質量百分比為0.909％～5.266％。

根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述膠原為I型膠原，膠原分子量為8～12KD。

上述透明質酸寡糖修飾的礦化膠原仿生骨修復材料的結構組裝過程如下：

透明質酸寡糖修飾的膠原分子自組裝形成膠原微纖維；糖基化膠原分子調控鈣磷鹽沿微纖維軸向取向排列，進一步組裝形成礦化膠原纖維；礦化膠原纖維進一步組裝形成取向排列的糖基化礦化膠原纖維束(如圖2所示)；通過靜電紡絲，將上述礦化材料組裝成納米纖維仿生骨修復材料(如圖1所示)。

一種透明質酸寡糖修飾的礦化膠原仿生骨修復材料的制備方法，包括如下步驟：

(1)將膠原、透明質酸和NaBH₃CN加入反應體系中，36～38℃避光條件下攪拌反應1～3天，然后加入醋酸溶液稀釋，超濾離心，沉淀干燥后，制得糖基化膠原蛋白；

所述反應體系為六氟異丙醇(HFP)或二甲基酰胺(DMF)溶劑之一與碳酸氫鈉的混合溶液，碳酸氫鈉的摩爾濃度為0.05～0.15M，六氟異丙醇或二甲基酰胺與碳酸氫鈉的體積比為3:(1～3)；

所述膠原加入反應體系后的質量濃度為18～22g/L，透明質酸加入反應體系后的質量濃度為4～6g/L，NaBH₃CN加入反應體系后的質量濃度為6g/L～18g/L；

(2)將步驟(1)制得的糖基化膠原蛋白加入鹽酸中，攪拌溶解，制得濃度為0.5～0.7mg/ml的糖基化膠原蛋白溶液，然后加入CaCl₂溶液，混合均勻，靜置8～15min，然后攪拌加入NaH₂PO₄溶液，調節(jié)pH至7，25～38℃靜置2～24h，固液分離，沉淀經(jīng)洗滌后，干燥，制得糖基化膠原礦化復合材料；

所述CaCl₂溶液的添加量為步驟(1)中每克膠原添加0.023～0.0913mol的CaCl₂；CaCl₂與NaH₂PO₄的摩爾比為(1.5～1.8)：1；

(3)將成型劑溶解于六氟異丙醇中，制得質量濃度為2～4％的溶液，然后加入步驟(2)制得的糖基化膠原礦化復合材料，糖基化膠原礦化復合材料劑與成型的質量比為(1～3)：1，混合均勻，靜電紡絲成多孔納米纖維形態(tài)，制得透明質酸寡糖修飾的礦化膠原仿生骨修復材料；

所述成型劑為膠原、聚乳酸或步驟(1)制得的糖基化膠原蛋白；

根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(1)中，碳酸氫鈉的摩爾濃度為0.1M，六氟異丙醇或二甲基酰胺溶劑與碳酸氫鈉的體積比為3:2；所述膠原為I型膠原，加入反應體系后的質量濃度為20g/L，透明質酸加入反應體系后的質量濃度為5g/L，NaBH₃CN加入反應體系后的質量濃度為6g/L。

根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(1)中，37℃避光條件下攪拌反應1天。

根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(1)中，醋酸溶液的質量濃度為5％，稀釋體積倍數(shù)為8倍。

根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(1)中，超濾離心的超濾管為30k，離心條件為：4000g/min，25min/次，超濾次數(shù)為3～8次。

根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(1)中，干燥為真空冷凍干燥。

根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(2)中，鹽酸的濃度為0.01M。

根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(2)中，糖基化膠原蛋白溶液的濃度為0.6mg/ml。

根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(2)中，pH調節(jié)劑為濃度為0.1～0.5M NaOH溶液。pH調節(jié)過程中，當pH接近或達到6時溶液開始出現(xiàn)渾濁，pH 6.2左右時變化波動較大，此時反應仍在進行，繼續(xù)攪拌并滴加NaOH溶液至體系pH為7，之后繼續(xù)攪拌2h。

根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(2)中，37℃靜置22～24h；優(yōu)選的，所述清洗過程為去離子水反復離心清洗3次，8000～10000r/min，離心8min。

根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(2)中，干燥為真空冷凍干燥。

根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(3)中，最終電紡液的質量濃度為8％；優(yōu)選的，所述成型劑為糖基化膠原蛋白。

根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(3)中，混合均勻為采用磁力攪拌混合5～10min后，400～500W超聲處理20min，繼續(xù)攪拌24h～48h；優(yōu)選的，所述紡絲電壓為15～20kv，速率為0.6～1.0mL/h，接收距離為8～15cm，接受裝置為鋁箔或置于鋁箔上的直徑為14mm的蓋玻片；

一種透明質酸寡糖修飾的礦化膠原仿生骨修復材料的生物相容性檢測方法，包括如下步驟：

a、將待檢測的透明質酸寡糖修飾的礦化膠原仿生骨修復材料經(jīng)固定交聯(lián)處理、干燥，制得預處理材料；

b、將預處理材料殺菌后，用質量濃度為70％的乙醇溶液浸泡2.5～3.5h，然后轉入滅菌的PBS緩沖浸泡2h，取出重復浸泡3～4次，然后用1640培養(yǎng)基或α-MEM培養(yǎng)基浸泡0.5h，制得預處理后樣品；

c、將內皮細胞PIEC或前體成骨細胞MC3T3-E1與步驟c制得的預處理后樣品共培養(yǎng)，細胞密度10³～10⁴個/cm²，37℃、5％CO₂條件下培養(yǎng)，分別于培養(yǎng)后的1d、3d、5d和7d檢測細胞的增殖情況，用掃描電子顯微鏡(SEM)觀察細胞培養(yǎng)3d、5d后在支架的黏附及生長形態(tài)，并對MC3T3-E1在培養(yǎng)過程中檢測其堿性磷酸酶ALP的表達情況，根據(jù)結果進行生物相容性評價。

上述生物相容性評價評價可采用本領域常規(guī)評價方法。如內皮細胞PIEC可參考《靜電紡絲制備膠原蛋白-殼聚糖納米纖維仿生細胞外基質》(陳宗剛；東華大學，2007.)中的相關方法；MC3T3-E1細胞可參考《改性聚(D,L-乳酸)與MC3T3-E1細胞的生物相容性》(鄭丹芳；重慶大學,2008.)中的相關方法。

根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟a中，固定交聯(lián)處理為采用25％戊二醛蒸汽處理24～36h或者采用含有EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽)的95％乙醇體系浸泡20～24h；優(yōu)選的，所述干燥為在真空干燥箱中靜置3～5天。

根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟c中，培養(yǎng)過程中每隔2～3天換培養(yǎng)基一次。

上述1640培養(yǎng)基和α-MEM培養(yǎng)基均為本領域常規(guī)市售培養(yǎng)基。內皮細胞PIEC和前體成骨細胞MC3T3-E1為本領域常規(guī)市售細胞。

有益效果

1、本發(fā)明首次利用希夫堿反應對膠原進行透明質酸寡糖修飾，可獲得共價結合的糖基化膠原，除了發(fā)揮低分子量HA利于細胞遷移、增殖和分化的功能外，在膠原空間構型及活性，分子識別、細胞通信、信號轉導等方面也具有潛在影響；本發(fā)明制得的糖基化膠原較現(xiàn)有利用物理方式實現(xiàn)小分子寡聚糖與膠原的交聯(lián)具有顯著的優(yōu)勢；此外，本發(fā)明用低分子量HA修飾膠原，方法簡單，成本低廉，且可用于后續(xù)礦化反應中鈣磷鹽沉積的模板，使其在硬組織的修復與再生研究中也有潛在應用；

2、本發(fā)明利用能促血管化的透明質酸寡糖片段修飾膠原仿生胞外基質，制得的材料在改善材料生物相容性的同時可賦予材料抗凝和促血管化功能，使支架移植體內后能長期存活，這為構建血管化組織工程骨及其他組織的促血管化支架提供了新的材料基礎和研究模式；

3、本發(fā)明設計的支架是基于仿生學原理和自組裝技術，首次提出利用糖基化膠原為模板實現(xiàn)鈣磷鹽的成核礦化，其成分與微結構更接近于天然骨組織，且有望在新生骨內促進血管生成，提高成骨效果，較現(xiàn)有單獨制備的羥基磷灰石溶膠分散在膠原/殼聚糖共混溶液中獲得無機顆粒在聚合物基體中定向排列的復合支架具有生物學活性特點；

4、本發(fā)明利用靜電紡絲技術對支架材料進行成型，不同于現(xiàn)有技術的無機粉末與高分子材料的簡單機械混合，該電紡體系的制備是先通過生物礦化實現(xiàn)鈣磷鹽在膠原上的成核礦化以獲得礦化復合材料，使無機/有機兩相間能形成緊密鍵和并具有一定取向關系，之后通過引入一定量膠原或聚乳酸等聚合物與凍干的礦化復合粉末形成均一混合體系進行電紡，從而獲得礦化材料的納米多孔纖維，更接近天然細胞外基質的形態(tài)，利于細胞的黏附及生長，且良好的孔連通性更易于細胞的內向遷移及營養(yǎng)物質的擴散；這種將聚合物先預沉淀化獲得復合材料再優(yōu)化條件進行電紡的方法可有效改善無機顆粒分散性差或機械混合體系中的相分離問題。

附圖說明

圖1為膠原Col、膠原/羥基磷灰石Col/HAP、糖基化膠原/羥基磷灰石Col/oHAs/HAP的紅外光譜；

圖2為反應靜置24h合成的膠原/oHAs/羥基磷灰石材料的TEM形貌；

圖3為Col/HAP-Col-3-1混紡纖維支架的SEM形貌；

圖4A為內皮細胞在Col/HAP-Col-3-1培養(yǎng)3天時的SEM形貌；

圖4B為內皮細胞在Col/HAP-PLA-3-1培養(yǎng)3天時的SEM形貌；

圖5為內皮細胞在各礦化膠原纖維支架上的增殖趨勢結果；

圖6A為內皮細胞在Col/HAP-Col-3-2上培養(yǎng)5天時的SEM形貌；

圖6B為內皮細胞在Col/oHAs/HAP-Col-3-2上培養(yǎng)5天時的SEM形貌；

圖6C為內皮細胞在Col/HA/HAP-Col-3-2上培養(yǎng)5天時的SEM形貌；

圖7為MC3T3-E1在Col/HAP-Col-3-2、Col/oHAs/HAP-3-2、Col/HA/HAP-Col-3-2支架上ALP檢測結果柱狀圖；

圖8為MC3T3-E1在Col/HAP-Col-3-2、Col/oHAs/HAP-Col/oHAs-3-2、Col/HA/HAP-Col/HA-3-2纖維支架上的增殖趨勢結果柱狀圖；

圖9為MC3T3-E1在Col/oHAs/HAP-Col/oHAs-3-2纖維支架上的SEM形貌。

具體實施方式

下面結合實施例及說明書附圖對本發(fā)明的技術方案做進一步闡述，但本發(fā)明的保護范圍并不僅限于這些實施例。

原料來源

透明質酸鈉原材料HA購自華熙福瑞達生物醫(yī)藥有限公司，分子量5kD；

膠原為購自成都市科樂生物技術有限公司的I型膠原，分子量10kD；

實施例1

糖基化膠原蛋白(Col/HA，HA為酶解前的透明質酸原材料)的制備：

反應體系的配制：稱取膠原80mg，HA(5K)20mg，重結晶處理的NaBH₃CN 30mg于25mL規(guī)格玻璃瓶中，加入配置好的反應體系(即HFP與0.1M NaHCO₃混合介質，體積比3:2)5mL，黑暗條件下，37℃，磁力攪拌24h；

反應樣品的清洗：反應結束后將反應液轉移至小燒杯中，加入5％醋酸進行8倍稀釋，分裝入6個30K的超濾管中，4000g/min，25min/次，超濾離心置換6次，之后收集樣品真空冷凍干燥；

反應樣品載糖量測定：利用咔唑-乙醇法對干燥后的Col/HA進行糖含量測定，測定載糖量為5.266％。

實施例2

糖基化膠原蛋白(Col/oHAs，oHAs為酶解后的寡糖)的制備：

如實施例1所述的制備方法，不同之處在于，膠原80mg，oHAs(776.5-2293.4)20mg，重結晶處理的NaBH₃CN 30mg，超濾離心置換4次。

利用咔唑-乙醇法對干燥后的Col/HA進行糖含量測定，測定載糖量為2.101％。

oHAs為采用透明質酸寡糖對膠原進行糖基化修飾，透明質酸寡糖為5k的玻尿酸鈉經(jīng)酶解、分離純化后得到的四糖、六糖、八糖、十糖、十二糖及其混合物，分子量范圍在776-2293Da。

透明質酸寡糖的制備步驟參見《透明質酸酶催化透明質酸水解反應的最適條件》(崔向珍，倪運杰，王鳳山等，中國生化藥物雜志[J].2007,25(3):62-64)。

實施例3

糖基化膠原礦化復合材料(Col/oHAs/HAP)的制備:

稱取實施例2制得的干燥的糖基化膠原蛋白(Col/oHAs)60mg于100mL HCl(濃度0.01M)溶液中，磁力攪拌溶解獲得Col/HA溶液，攪拌同時緩慢滴加CaCl₂(0.1M)溶液14mL，混勻后靜置10min，繼續(xù)攪拌緩慢滴加NaH₂PO₄(0.1M)溶液8.4mL(Ca:P＝1.66)，之后攪拌中緩慢滴加0.1M NaOH對該體系進行pH調節(jié)，當pH接近6時溶液開始出現(xiàn)渾濁，pH 6.2左右時波動較大，此時反應仍在進行，繼續(xù)滴加NaOH至體系pH為7，之后繼續(xù)攪拌2h并維持礦化體系pH不變；攪拌結束后37℃靜置24h，倒去上清，沉淀用去離子水洗滌，8000r/min離心3次(8min/次)，最后對樣品冷凍干燥，研磨獲得透明質酸修飾的礦化膠原復合材料粉末，用Col/oHAs/HAP表示，其中HAP為礦化形成的羥基磷灰石，對該粉末進行紅外分析，SEM、TEM觀察形貌。

由SEM圖觀察到糖基化膠原纖維表面有大量不規(guī)則無機顆粒覆蓋；FTIR結果如圖1所示，膠原發(fā)生礦化后代表蛋白質酰胺鍵的三個特征峰發(fā)生變化，特別是酰胺Ⅲ帶吸收峰明顯降低且接近消失，表明礦化過程中膠原上的羧基或羰基通過與Ca²⁺作用提供成核位點，使得反應形成的羥基磷灰石與模板結合形成礦化復合材料，另外磷酸根的引入也使得膠原經(jīng)礦化反應后在1024cm^-1、870cm^-1、603cm^-1和564cm^-1處有吸收峰的變化；圖2的Col/oHAs/HAP的低倍TEM照片顯示礦化后的糖基化膠原基本呈束狀結構。

實施例4

糖基化膠原礦化復合材料(Col/HA/HAP)的制備:

本實施例中利用分子量為5K的透明質酸對膠原進行修飾，參考實施例1制備糖基化膠原Col/HA，將干燥得到的Col/HA樣品溶解于HCl(0.01M)中，參考實施例3的具體礦化條件制備糖基化膠原礦化復合材料Col/HA/HAP。

實施例5

礦化膠原復合材料(Col/HAP-Col-3-1)納米纖維多孔支架的制備:

本實施例中所用的礦化膠原制備方法參考實施例3，不同處是將未經(jīng)任何處理的膠原直接溶解于HCl(0.01M)中，與糖基化膠原相比，未處理膠原更易溶解；經(jīng)礦化處理冷凍干燥后獲得膠原/納米羥基磷灰石復合材料，用Col/HAP表示：

①稱取膠原45mg，加入2mL HFP磁力攪拌10min溶解膠原，待膠原充分溶解后，加入研磨的Col/HAP粉末135mg，為了使該礦化膠原粉末更好地分散在電紡體系中，在加入該粉末后進行450W功率超聲處理20min，之后繼續(xù)磁力攪拌32h使電紡溶液達到良好的粘稠狀態(tài)；

②將電紡溶液轉移至1mL注射器中，調節(jié)紡絲參數(shù)，給液速率：0.9mL/h，紡絲電壓：20kv，接收距離：10cm，利用置于鋁箔上的直徑14mm的蓋玻片接收電紡纖維；制得透明質酸寡糖修飾的礦化膠原仿生骨修復材料；

③將收集的電紡纖維樣品置于真空干燥箱中2d以除去殘余的有機試劑，之后樣品表面噴金進行電鏡觀察，由圖3知，在礦化膠原與膠原按照3:1混紡的條件下仍能獲得多孔的納米纖維結構，但由于無機成分的存在，纖維上出現(xiàn)較多的bead結構和塊狀物質；

④電紡纖維的固定：將纖維樣品置于底部具有質量百分比濃度25％戊二醛水溶液的干燥器中，封閉條件下利用戊二醛蒸汽對其處理30h，之后取出樣品將其置于真空干燥箱中靜置幾天以除去有毒試劑；固定之后的纖維膜置于0.01M PBS(pH 7.4)緩沖液浸泡2d，移去液體置于真空干燥箱中干燥，根據(jù)掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)膠原混紡組材料發(fā)生一定溶脹，纖維直徑變粗，而聚乳酸組變化不大，材料的纖維形貌仍基本存在，并仍有較高孔隙率及良好的孔連通性。

實施例6

透明質酸寡糖修飾礦化膠原(Col/oHAs/HAP-Col-3-2)納米纖維支架的制備:

稱取膠原64mg，加入2mL HFP磁力攪拌溶解膠原，待膠原充分溶解后，加入研磨的實施例4制得的Col/oHAs/HAP粉末96mg，為了使該礦化膠原粉末更好地分散在電紡體系中，在加入該粉末后進行超聲處理20min，之后繼續(xù)磁力攪拌24h，在該電紡溶液達到良好的粘稠狀態(tài)后開始紡絲，后續(xù)具體操作參考實施例5中的步驟。

實施例7

PIEC在Col/HAP與膠原或聚乳酸按3:1混紡的支架上生長形態(tài)：

材料的預處理：Col/HAP-Col-3-1，Col/HAP-PLA-3-1，其中Col/HAP-PLA-3-1制備參考實施例5，不同之處是將聚乳酸代替膠原與制備的Col/HAP粉末混紡，得到的電紡纖維膜在使用前均要進行固定交聯(lián)。將上述材料每組3片放入24孔板中，紫外殺菌，另體積濃度70％乙醇浸泡3h，吸出乙醇，無菌PBS緩沖液浸泡4次，時間6h，后用未含血清的1640培養(yǎng)基(購自Hyclone)浸泡0.5h，具體操作在生物安全柜內完成；

細胞種植：將備好的PIEC細胞懸液于每孔中接種200uL，種植密度為1.9×10⁴個/cm²，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h后每孔補加400μL培養(yǎng)基，每隔2-3天給細胞換液；

形貌觀察：于培養(yǎng)后的3d取出各組材料-細胞樣品，無菌PBS清洗3次，后續(xù)經(jīng)質量濃度2.5％戊二醛常溫固定3h，梯度乙醇脫水，最后樣品真空冷凍干燥，噴金后觀察形貌。內皮細胞在材料上培養(yǎng)3天的SEM照片表明，細胞可在材料上充分伸展，能維持細胞正常的生長狀態(tài)，呈多角或菱形，細胞間能形成突起，部分區(qū)域還可觀察到細胞立體生長并向材料內部遷移的現(xiàn)象，說明該方法制備的材料具有較好的生物相容性，如圖4所示。

實施例8

PIEC與糖基化礦化膠原的生物相容性：

方法參考實施例7，不同之處在于，細胞初始種植密度為1.03×10⁴個/cm²，實驗組材料為Col/HAP-Col-3-2，Col/oHAs/HAP-Col-3-2，Col/HA/HAP-Col-3-2，關于細胞的增殖利用MTT法測定，形貌利用SEM觀察；

由細胞的增殖結果(見圖5)知，內皮細胞在培養(yǎng)3天之后的增殖速度開始加快，與未連糖組材料比，內皮細胞在糖基化材料組上的增殖幅度相對大些，尤其是寡糖修飾的礦化膠原材料組。而由細胞培養(yǎng)5天的SEM圖(見圖6)發(fā)現(xiàn)細胞在糖基化材料組部分區(qū)域有聚集成片生長的跡象，而在未連糖組未觀察到此類現(xiàn)象。

由此推測，在材料中引入低分子量透明質酸影響細胞的黏附、增殖等生長行為。

實施例9

MC3T3-E1在各材料上表達堿性磷酸酶ALP的情況：

方法參考實施例7，不同之處在于，培養(yǎng)細胞為MC3T3-E1，培養(yǎng)基為α-MEM，實驗組材料為Col/HAP-Col-3-2，Col/oHAs/HAP-Col-3-2，Col/HA/HAP-Col-3-2，檢測指標為細胞培養(yǎng)21，28，35天后在各材料上表達堿性磷酸酶活性的情況。

由圖7可以看出，與未連糖材料比，細胞在糖基化礦化材料上表達ALP活性相對較高。

實施例10

MC3T3-E1在各材料上的增殖及表達ALP情況：

方法參考實施例7，不同在于培養(yǎng)細胞為MC3T3-E1，實驗組材料為Col/HAP-Col-3-2，Col/oHAs/HAP-Col/oHAs-3-2，Col/HA/HAP-Col/HA-3-2。MC3T3-E1細胞種植密度為2.15×10⁴個/cm²，培養(yǎng)基為含10％胎牛血清的α-MEM液體培養(yǎng)基。

由圖8可以看出，與未連糖礦化材料比，細胞在糖基化礦化材料上的增殖相對較高，另外由ALP檢測結果知，MC3T3-E1在材料上培養(yǎng)7天時并未檢測到堿性磷酸酶活性，之后在培養(yǎng)的14、21、28d均檢測到其活性，且在各時間點中透明質酸寡糖修飾的材料組活性相對較高，說明上述材料特別是糖基化修飾的材料能促進MC3T3-E1逐漸分化為成熟的成骨細胞。

實施例11

MC3T3-E1在Col/oHAs/HAP-Col/oHAs混紡纖維支架上的生長形態(tài)：

方法參考實施例7，不同之處在于，MC3T3-E1細胞初始種植密度為1.6×10⁴個/cm²，于培養(yǎng)后的4d取出該材料-細胞樣品，無菌PBS清洗3次，后續(xù)固定及脫水后真空冷凍干燥，噴金后觀察形貌。由MC3T3-E1在材料上培養(yǎng)4天的SEM形貌可知，見圖9，該細胞可在材料上充分伸展、黏附，維持細胞正常的生長狀態(tài)，呈多角或梭形，細胞間形成突起使得細胞間及細胞與材料之間均能較好接觸，這為細胞的增殖、分化、信號間傳遞等生理行為提供了有力的條件。相比未糖基化材料組，在糖基化修飾材料組多觀察到MC3T3-E1細胞向材料內部遷移或長入材料內部的現(xiàn)象(如圖9中箭頭所指)，說明膠原經(jīng)糖基化修飾后能夠促進MC3T3-E1細胞的立體遷移，對細胞的生長行為有一定影響。