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一種透明質(zhì)酸寡糖修飾的礦化膠原仿生骨修復(fù)材料及其制備方法與流程

文檔序號:12667079閱讀:來源:國知局

技術(shù)特征:

1.一種透明質(zhì)酸寡糖修飾的礦化膠原仿生骨修復(fù)材料,結(jié)構(gòu)如下:

膠原-羥基磷灰石復(fù)合材料中的膠原通過C-N鍵連接透明質(zhì)酸寡糖,獲得糖基化修飾的礦化膠原復(fù)合材料,透明質(zhì)酸寡糖的分子量為776~5000Da。

2.如權(quán)利要求1所述的礦化膠原仿生骨修復(fù)材料,其特征在于,所述透明質(zhì)酸寡糖修飾膠原的載糖質(zhì)量百分比為0.909%~5.266%;

優(yōu)選的,所述膠原為I型膠原,膠原分子量為8~12KD。

3.一種透明質(zhì)酸寡糖修飾的礦化膠原仿生骨修復(fù)材料的制備方法,其特征在于,包括如下步驟:

(1)將膠原、透明質(zhì)酸和NaBH3CN加入反應(yīng)體系中,36~38℃避光條件下攪拌反應(yīng)1~3天,然后加入醋酸溶液稀釋,超濾離心,沉淀干燥后,制得糖基化膠原蛋白;

所述反應(yīng)體系為六氟異丙醇(HFP)或二甲基酰胺(DMF)溶劑之一與碳酸氫鈉的混合溶液,碳酸氫鈉的摩爾濃度為0.05~0.15M,六氟異丙醇或二甲基酰胺與碳酸氫鈉的體積比為3:(1~3);

所述膠原加入反應(yīng)體系后的質(zhì)量濃度為18~22g/L,透明質(zhì)酸加入反應(yīng)體系后的質(zhì)量濃度為4~6g/L,NaBH3CN加入反應(yīng)體系后的質(zhì)量濃度為6g/L~18g/L;

(2)將步驟(1)制得的糖基化膠原蛋白加入鹽酸中,攪拌溶解,制得濃度為0.5~0.7mg/ml的糖基化膠原蛋白溶液,然后加入CaCl2溶液,混合均勻,靜置8~15min,然后攪拌加入NaH2PO4溶液,調(diào)節(jié)pH至7,25~38℃靜置2~24h,固液分離,沉淀經(jīng)洗滌后,干燥,制得糖基化膠原礦化復(fù)合材料;

所述CaCl2溶液的添加量為步驟(1)中每克膠原添加0.023~0.0913mol的CaCl2;CaCl2與NaH2PO4的摩爾比為(1.5~1.8):1;

(3)將成型劑溶解于六氟異丙醇中,制得質(zhì)量濃度為2~4%的溶液,然后加入步驟(2)制得的糖基化膠原礦化復(fù)合材料,糖基化膠原礦化復(fù)合材料劑與成型的質(zhì)量比為(1~3):1,混合均勻,靜電紡絲,制得透明質(zhì)酸寡糖修飾的礦化膠原仿生骨修復(fù)材料;

所述成型劑為膠原、聚乳酸或步驟(1)制得的糖基化膠原蛋白。

4.如權(quán)利要求3所述的制備方法,其特征在于,所述步驟(1)中,碳酸氫鈉的摩爾濃度為0.1M,六氟異丙醇或二甲基酰胺溶劑與碳酸氫鈉的體積比為3:2;所述膠原為I型膠原,加入反應(yīng)體系后的質(zhì)量濃度為20g/L,透明質(zhì)酸加入反應(yīng)體系后的質(zhì)量濃度為5g/L,NaBH3CN加入反應(yīng)體系后的質(zhì)量濃度為6g/L;

優(yōu)選的,所述步驟(1)中,37℃避光條件下攪拌反應(yīng)1天;

優(yōu)選的,所述步驟(1)中,醋酸溶液的質(zhì)量濃度為5%,稀釋體積倍數(shù)為8倍;

優(yōu)選的,所述步驟(1)中,超濾離心的超濾管為30k,離心條件為:4000g/min,25min/次,超濾次數(shù)為3~8次;

優(yōu)選的,所述步驟(1)中,干燥為真空冷凍干燥。

5.如權(quán)利要求3所述的制備方法,其特征在于,所述步驟(2)中,鹽酸的濃度為0.01M;

優(yōu)選的,所述步驟(2)中,糖基化膠原蛋白溶液的濃度為0.6mg/ml。

6.如權(quán)利要求3所述的制備方法,其特征在于,所述步驟(2)中,pH調(diào)節(jié)劑為濃度為0.1~0.5M NaOH溶液;

優(yōu)選的,所述步驟(2)中,37℃靜置22~24h;優(yōu)選的,所述清洗過程為去離子水反復(fù)離心清洗3次,8000~10000r/min,離心8min;

優(yōu)選的,所述步驟(2)中,干燥為真空冷凍干燥。

7.如權(quán)利要求3所述的制備方法,其特征在于,所述步驟(3)中,最終電紡液的質(zhì)量濃度為8%;

優(yōu)選的,所述成型劑為糖基化膠原蛋白;

優(yōu)選的,所述步驟(3)中,混合均勻為采用磁力攪拌混合5~10min后,400~500W超聲處理20min,繼續(xù)攪拌24h~48h;優(yōu)選的,所述紡絲電壓為15~20kv,速率為0.6~1.0mL/h,接收距離為8~15cm,接受裝置為鋁箔或置于鋁箔上的直徑為14mm的蓋玻片。

8.一種透明質(zhì)酸寡糖修飾的礦化膠原仿生骨修復(fù)材料的生物相容性檢測方法,其特征在于,包括如下步驟:

a、將待檢測的透明質(zhì)酸寡糖修飾的礦化膠原仿生骨修復(fù)材料經(jīng)固定交聯(lián)處理、干燥,制得預(yù)處理材料;

b、將預(yù)處理材料殺菌后,用質(zhì)量濃度為70%的乙醇溶液浸泡2.5~3.5h,然后轉(zhuǎn)入滅菌的PBS緩沖浸泡2h,取出重復(fù)浸泡3~4次,然后用1640培養(yǎng)基或α-MEM培養(yǎng)基浸泡0.5h,制得預(yù)處理后樣品;

c、將內(nèi)皮細(xì)胞PIEC或前體成骨細(xì)胞MC3T3-E1與步驟c制得的預(yù)處理后樣品共培養(yǎng),細(xì)胞密度103~104個/cm2,37℃、5%CO2條件下培養(yǎng),分別于培養(yǎng)后的1d、3d、5d和7d檢測細(xì)胞的增殖情況,用掃描電子顯微鏡(SEM)觀察細(xì)胞培養(yǎng)3d、5d后在支架的黏附及生長形態(tài),并對MC3T3-E1在培養(yǎng)過程中檢測其堿性磷酸酶ALP的表達(dá)情況,根據(jù)結(jié)果進(jìn)行生物相容性評價。

9.如權(quán)利要求8所述的生物相容性檢測方法,其特征在于,所述步驟a中,固定交聯(lián)處理為采用25%戊二醛蒸汽處理24~36h或者采用含有EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽)的95%乙醇體系浸泡20~24h;優(yōu)選的,所述干燥為在真空干燥箱中靜置3~5天。

10.如權(quán)利要求8所述的生物相容性檢測方法,其特征在于,所述步驟b中,培養(yǎng)過程中每隔2~3天換培養(yǎng)基一次。

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