本發(fā)明涉及一種基于聚乙二醇偶聯(lián)環(huán)形多肽irgd和薯蕷皂苷元靶向性載藥納米粒子的制備方法。

背景技術(shù)：

腫瘤是危害人類生命和健康最嚴重的一類疾病。全世界每年約有九百余萬人患惡性腫瘤。每年新發(fā)病例約1000萬，死亡約140余萬人，到2020年，可能還會繼續(xù)增長。腫瘤的預防與治療已經(jīng)成為重要課題。因此，如何預防和治療癌癥，依然是當今社會人類面臨的一大難題。薯蕷皂苷元（dgn）是一種有抗癌作用的天然藥物，但由于其水溶性很差，缺乏靶向性，在體內(nèi)的循環(huán)時間很短，載藥量低，在很大程度上限制了它的臨床應用。

在眾多的納米載藥體系中，聚合物納米粒子具有增大藥物的吸收、控釋藥物釋放、提高藥物靶向性與穩(wěn)定性、減少給藥次數(shù)和劑量、降低毒副作用等顯著優(yōu)勢，在癌癥治療中備受關(guān)注。此外，納米載體材料的選擇也非常重要。聚乙二醇（peg）安全、無毒，具有油水二親性，已被fda批準用于人體。peg與藥物相連，能夠增大藥物的相對分子質(zhì)量(mr)，減少腎消除，延長藥物的半衰期，增大藥物的水溶性，并且peg鏈包裹在藥物表面，能夠遮蔽藥物的抗原決定簇，降低藥物的免疫原性。經(jīng)過二十多年的發(fā)展，peg修飾藥物技術(shù)已經(jīng)進入了實用期。迄今，已有多個藥物通過美國fda批準進入市場，國內(nèi)此方面的研究也越來越多。irgd是一種新型環(huán)形腫瘤穿膜肽，通過對藥物及藥物載體進行修飾以改善藥物或載體向?qū)嶓w瘤深部的滲透能力。研究結(jié)果表明，在增加抗腫瘤藥物的腫瘤滲透能力及減少毒副作用方面，irgd的應用均顯示出良好的效果。

藥物的聚乙二醇修飾即聚乙二醇化，通常是將活化的聚乙二醇通過化學方法偶聯(lián)到蛋白質(zhì)、多膚、小分子藥物和脂質(zhì)體上。1977年abuchowski等首次將甲氧基聚乙二醇（methoxypo1yethyleneglyeol，mpeg）共價連接到蛋白質(zhì)上，獲得療效優(yōu)于未修飾原型藥物的mpeg-蛋白質(zhì)結(jié)合物之后，peg修飾技術(shù)逐漸受到重視，已成為目前藥物化學修飾的研究熱點。聚乙二醇修飾的藥物與未修飾的藥物相比，具有以下突出的優(yōu)點：(l)生物活性增強；(2)對腫瘤有更強的被動靶向作用；(3)半衰期延長；(4)最大血藥濃度降低；(5)血藥濃度波動較?。?6)酶降解作用減少；(7)免疫原性及抗原性減?。?8)毒性降低；(9)溶解性提高；(10)用藥頻率減少。

本研究選用薯蕷皂苷元為模型藥物制備納米藥物載體。主要是通過聚乙二醇將薯蕷皂苷元和irgd連接在一起，合成靶向性兩親偶聯(lián)物前藥irgd-peg-dgn，使藥物能夠準確靶向至腫瘤部位，大大提高了水溶性和載藥量，再通過自沉淀法制成內(nèi)部疏水，外部親水的納米粒子包裹另一種疏水性藥物羥基喜樹堿（hcpt），從而進一步提高了其治療效果。

隨著載藥納米粒子體系的發(fā)展，將在癌癥治療中體現(xiàn)其巨大的優(yōu)勢和良好的臨床應用前景。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是建立一種基于聚乙二醇偶聯(lián)環(huán)形多肽irgd和薯蕷皂苷元靶向性載藥納米粒子的制備方法：首先合成一種兩親性高分子載體聚乙二醇-薯蕷皂苷元偶聯(lián)物，再將聚乙二醇-薯蕷皂苷元偶聯(lián)物與irgd反應合成irgd-聚乙二醇-薯蕷皂苷元，最后將疏水性藥物10-羥基喜樹堿包封于內(nèi)部自組裝形成靶向載藥納米粒子。

所述的irgd-聚乙二醇-薯蕷皂苷元偶聯(lián)物為以下的結(jié)構(gòu)：

其中：

聚乙二醇一端通過馬來酰胺基團修飾另一端通過羧基修飾；

本發(fā)明的技術(shù)方案：

靶向性兩親高分子irgd-聚乙二醇-薯蕷皂苷元偶聯(lián)物的合成：

(2)靶向性載藥納米粒子的制備

沉淀法自組裝制備納米粒子。具體方法：將合成的irgd-聚乙二醇-薯蕷皂苷元偶聯(lián)物與疏水性藥物10-羥基喜樹堿分別溶于dmso中，然后逐滴加入到高速攪拌水溶液中，pbs透析3h；過濾后，冷凍干燥得到載藥納米粒子。

本發(fā)明的優(yōu)點：

(1)利用疏水性的小分子抗癌藥物薯蕷皂苷元代替?zhèn)鹘y(tǒng)的疏水惰性材料制備兩親性高分子載體，提高載藥量，并可以與其他抗癌藥物實現(xiàn)聯(lián)合治療，從而提高治療效果；

(2)利用新型環(huán)形多肽irgd向?qū)嶓w瘤深部的滲透能力，在合成的兩親性高分子載體材料聚乙二醇-薯蕷皂苷元上引入irgd，從而實現(xiàn)定向靶向至腫瘤部位；

(3)所形成的納米粒中包封模型藥物10-羥基喜樹堿，保證藥物在體循環(huán)中保持穩(wěn)定的同時實現(xiàn)了藥物在細胞內(nèi)的智能控制釋放和治療效果；

(4)制備工藝簡單，易于操作。

附圖說明

圖1為irgd-peg-dgn/hcpt納米粒子的tem示意圖；

圖2為純藥及納米粒子的細胞毒性。

具體實施方式

下面給出的實例對本發(fā)明進行具體描述，但不限制本發(fā)明，本發(fā)明的范圍由權(quán)利要求限定。

實施例1：

聚乙二醇-薯蕷皂苷元偶聯(lián)物的合成：向50ml干燥的三口瓶中持續(xù)通入n2；在n2的保護下將0.4g薯蕷皂苷元，2.4g聚乙二醇(mw20,000)溶于10mldcm中，添加0.11gedc，0.12gdmap，0°c下攪拌溶解，攪拌反應1h，然后室溫攪拌反應24h；待反應結(jié)束后，將溶劑蒸干，加入dcm溶解，過濾除去沉淀，溶液中加入100ml乙醚洗，過濾得到固體，用20mln,n-二甲基甲酰胺/異丙醇（1:4（v/v））重結(jié)晶，濾去不溶物，產(chǎn)物用100ml乙醚洗，過濾，將沉淀溶于pbs并透析6h，冷凍干燥，得到純度95%以上的聚乙二醇-薯蕷皂苷元偶聯(lián)物；

irgd-聚乙二醇-薯蕷皂苷元的制備：取0.48g偶聯(lián)物聚乙二醇-薯蕷皂苷元與0.026girgd溶解在20mlpbs中反應6h,含有游離巰基的irgd環(huán)形多肽與偶聯(lián)物聚乙二醇-薯蕷皂苷元中聚乙二醇一端的馬來酰胺基團發(fā)生連接。產(chǎn)物用pbs透析3h后冷凍干燥得到irgd-聚乙二醇-薯蕷皂苷元的偶聯(lián)物irgd-peg-dgn；

irgd-聚乙二醇-薯蕷皂苷元/10-羥基喜樹堿載藥納米粒子的制備：0.2girgd-聚乙二醇-薯蕷皂苷元偶聯(lián)物與0.05g10-羥基喜樹堿分別溶于0.5mldmso中，逐滴加入到3.0ml高速攪拌的水溶液中；然后將irgd-聚乙二醇-薯蕷皂苷元/10-羥基喜樹堿溶液移至透析袋中pbs透析3h，過濾后，冷凍干燥得到載藥納米粒子；

實施例2：

聚乙二醇-薯蕷皂苷元偶聯(lián)物的合成：向50ml干燥的三口瓶中持續(xù)通入n2；在n2的保護下將0.4g薯蕷皂苷元，0.9g聚乙二醇(mw7,500)溶于10mldcm中，添加0.05gedc，0.06gdmap，0°c下攪拌溶解，攪拌反應1h，然后室溫攪拌反應24h；待反應結(jié)束后，將溶劑蒸干，加入dcm溶解，過濾除去沉淀，溶液中加入100ml乙醚洗，過濾得到固體，用20mln,n-二甲基甲酰胺/異丙醇（1:4（v/v））重結(jié)晶，濾去不溶物，產(chǎn)物用100ml乙醚洗，過濾，將沉淀溶于pbs并透析6h，冷凍干燥，得到純度95%以上的聚乙二醇-薯蕷皂苷元偶聯(lián)物；

irgd-聚乙二醇-薯蕷皂苷元的制備：取0.18g偶聯(lián)物聚乙二醇-薯蕷皂苷元與0.026girgd溶解在20mlpbs中反應6h,含有游離巰基的irgd環(huán)形多肽與偶聯(lián)物聚乙二醇-薯蕷皂苷元中聚乙二醇一端的馬來酰胺基團發(fā)生連接，產(chǎn)物用pbs透析3h后冷凍干燥得到irgd-聚乙二醇-薯蕷皂苷元的偶聯(lián)物irgd-peg-dgn；

irgd-聚乙二醇-薯蕷皂苷元/10-羥基喜樹堿載藥納米粒子的制備：0.2girgd-聚乙二醇-薯蕷皂苷元偶聯(lián)物與0.1g10-羥基喜樹堿分別溶于0.5mldmso中，逐滴加入到3.0ml高速攪拌的水溶液中；然后將irgd-聚乙二醇-薯蕷皂苷元/10-羥基喜樹堿溶液移至透析袋中pbs透析3h，濾膜過濾后，冷凍干燥得到載藥納米粒子；

實施例3：

聚乙二醇-薯蕷皂苷元偶聯(lián)物的合成：向50ml干燥的三口瓶中持續(xù)通入n2；在n2的保護下將0.4g薯蕷皂苷元，1.6g聚乙二醇(mw10,000)溶于10mldcm中，添加0.08gedc，0.11gdmap，0°c下攪拌溶解，攪拌反應1h，然后室溫攪拌反應24h；待反應結(jié)束后，將溶劑蒸干，加入dcm溶解，過濾除去沉淀，溶液中加入100ml乙醚洗，過濾得到固體，用20mln,n-二甲基甲酰胺/異丙醇（1:4（v/v））重結(jié)晶，濾去不溶物，產(chǎn)物用100ml乙醚洗，過濾，將沉淀溶于pbs并透析6h，冷凍干燥，得到純度95%以上的聚乙二醇-薯蕷皂苷元偶聯(lián)物；

irgd-聚乙二醇-薯蕷皂苷元的制備：取0.24g偶聯(lián)物聚乙二醇-薯蕷皂苷元與0.026girgd溶解在20mlpbs中反應6h,含有游離巰基的irgd環(huán)形多肽與偶聯(lián)物聚乙二醇-薯蕷皂苷元中聚乙二醇一端的馬來酰胺基團發(fā)生連接。產(chǎn)物用pbs透析3h后冷凍干燥得到irgd-聚乙二醇-薯蕷皂苷元的偶聯(lián)物irgd-peg-dgn；

irgd-聚乙二醇-薯蕷皂苷元/10-羥基喜樹堿載藥納米粒子的制備：0.2girgd-聚乙二醇-薯蕷皂苷元與0.15g羥基喜樹堿分別溶于0.5mldmso中，逐滴加入到3.0ml高速攪拌的水溶液中；然后將irgd-聚乙二醇-薯蕷皂苷元/10-羥基喜樹堿溶液移至透析袋中pbs透析3h，濾膜過濾后，冷凍干燥得到載藥納米粒子；

實施例4：

聚乙二醇-薯蕷皂苷元偶聯(lián)物的合成：向50ml干燥的三口瓶中持續(xù)通入n2；在n2的保護下將0.4g薯蕷皂苷元，2.3g聚乙二醇(mw15,000)溶于10mldcm中，添加0.08gedc，0.12gdmap，0°c下攪拌溶解，攪拌反應1h，然后室溫攪拌反應24h；待反應結(jié)束后，將溶劑蒸干，加入dcm溶解，過濾除去沉淀，溶液中加入100ml乙醚洗，過濾得到固體，用20mln,n-二甲基甲酰胺/異丙醇（1:4（v/v））重結(jié)晶，濾去不溶物，產(chǎn)物用100ml乙醚洗，過濾，將沉淀溶于pbs并透析6h，冷凍干燥，得到純度95%以上的聚乙二醇-薯蕷皂苷元偶聯(lián)物；

irgd-聚乙二醇-薯蕷皂苷元的制備：取0.3g偶聯(lián)物聚乙二醇-薯蕷皂苷元與0.026girgd溶解在20mlpbs中反應6h,含有游離巰基的irgd環(huán)形多肽與偶聯(lián)物聚乙二醇-薯蕷皂苷元中聚乙二醇一端的馬來酰胺基團發(fā)生連接。產(chǎn)物用pbs透析3h后冷凍干燥得到irgd-聚乙二醇-薯蕷皂苷元的偶聯(lián)物irgd-peg-dgn；

irgd-聚乙二醇-薯蕷皂苷元/10-羥基喜樹堿載藥納米粒子的制備：0.2girgd-聚乙二醇-薯蕷皂苷元與0.2g10-羥基喜樹堿分別溶于0.5mldmso中，逐滴加入到3.0ml高速攪拌的水溶液中；然后將irgd-聚乙二醇-薯蕷皂苷元/10-羥基喜樹堿溶液移至透析袋中pbs透析3h，濾膜過濾后，冷凍干燥得到載藥納米粒子。