本發(fā)明屬于生物綴合領域。更具體地，本發(fā)明涉及用于癌癥、尤其是表達癌胚抗原(cea)的腫瘤的患者的靶向治療的抗體藥物綴合物。

背景技術：

1、一種有前途的腫瘤靶向治療方法需要將大量(2至8個)高毒性有效載荷與單克隆抗體綴合，從而產生抗體-藥物綴合物(adc)。adc在本領域中是眾所周知的，例如由chari等人，angew.chem.int.ed.2014，53，3796和beck等人，nat.rev.drug?discov.2017，16，315–37所述。從機制上講，該抗體旨在以高特異性結合與健康組織相比過度表達的腫瘤相關受體。adc被認為在與受體結合后內化到腫瘤細胞中，然后在抗體和/或接頭在溶酶體中降解時釋放毒性有效載荷。

2、目前的adc類通常通過各種綴合技術制備(總結在圖1中)，所述綴合技術主要基于馬來酰亞胺與半胱氨酸側鏈或活化酯與賴氨酸側鏈的綴合。為了基于天然參與二硫鍵的天然半胱氨酸產生adc，可以通過將抗體經受合適的還原劑(諸如tcep或dtt)，然后用馬來酰亞胺-官能化接頭-藥物處理來釋放側鏈中的巰基。萬一僅總共八個游離巰基未完全烷基化，則所得adc通常由位置異構體的混合物組成。備選地，為了產生位點特異性adc，可以通過將序列中限定位置處的一個或多個氨基酸突變?yōu)榘腚装彼醽懋a生抗體，該半胱氨酸的側鏈可以被選擇性地釋放以通過還原-氧化序列進行烷基化。用于位點特異性綴合的常用半胱氨酸是lc-41c(輕鏈41c)、hc-41c(重鏈41c)、lc-80c、hc-118c、hc-265c、hc-140c、lc-149c、lc-124c、lc-180c、hc-190c、hc-160c、lc-183c、hc-290c、lc-205c、hc-220c、hc-239c、hc-442c。序列中還可以插入額外的半胱氨酸，例如hc-i239c。除了馬來酰亞胺作為烷化劑外，也已報道半胱氨酸側鏈與鹵代乙酰胺或乙烯基苯衍生物的反應。除了與天然氨基酸側鏈反應外，還可以將特定的非天然(非規(guī)范)氨基酸設計到抗體的氨基酸序列中，從而為化學綴合提供獨特的手柄，例如酮、乙炔、疊氮化物、環(huán)炔或環(huán)烯烴，以分別與肟、疊氮化物、炔或四嗪反應。然而，后一種方法的缺點是必須重新設計抗體的天然序列，這除了耗時且昂貴之外，還可能導致不穩(wěn)定問題。

3、通過氧化-連接序列、通過聚糖的綴合是本領域已知的并且例如已由hamann等人(bioconjugate?chem.2002，13，47–58)描述。通過聚糖的化學酶綴合是本領域已知的，并且已經由boons等人，angew.chem.int.ed.2014，53，7179描述了使用唾液酸轉移酶，以及由zhu等人，mabs?2014，6，1和cook等人，bioconjugate?chem.2016，27，1789描述了使用突變型半乳糖基轉移酶。

4、通過聚糖的化學酶綴合(包括首先對聚糖進行修剪)是本領域已知的，并且已經由van?geel等人，bioconjugate?chem.2015，26，2233描述，并且示意性地描繪在圖2中。簡而言之，用內切糖苷酶處理單克隆抗體，將聚糖修剪至核心glcnac(直接連接到asn-297)，然后在糖基轉移酶的作用下轉移疊氮基修飾的糖。udp-疊氮糖的各種結構如圖3所示。一種特別合適的組合涉及在突變型半乳糖基轉移酶galt(y289l)的作用下轉移galnaz?2b(2-疊氮乙酰基-n-半乳糖胺)，如wo?2007/095506、ep?2911699?b1和van?geel等人中公開的。另一種強大的組合需要6-疊氮基galnac?2d與天然galnac轉移酶，如pct/ep2016/059194中所公開的。另一種有用的組合需要glcnaz與α-1,3-甘露糖基-糖蛋白-2-β-n-乙酰葡糖胺基轉移酶(mgat1)，如wo2021/248048中所公開的。

5、用于無金屬點擊化學的各種環(huán)辛炔是本領域已知的(圖4)。特別地，各種環(huán)辛炔如dibo(i)、dbco/dibac(j)、s-dibo(k)、bcn(l)和tmthsi(t)經常用于與疊氮化物的綴合。

6、adc的有效載荷通常是高細胞毒性分子，其ic50值在低納摩爾或皮摩爾范圍內，特別是低至中等分子量化合物(例如約200至約2500da)。適合adc的細胞毒素類別的實例包括蒽環(huán)類、喜樹堿、紫杉烷類、微管溶素、烯二炔類、抑制肽、鵝膏蕈堿、倍癌霉素、美登木素生物堿、奧瑞他汀、艾日布林、半星芒體、bcl-xl抑制劑、ksp抑制劑、tlr激動劑、二氫吲哚并苯并二氮雜二聚體或吡咯并苯并二氮雜二聚體(pbd)及其類似物或前藥。圖5描繪了一組代表性的細胞毒性分子和/或其合成衍生物或前藥，其具有用于綴合至單克隆抗體的合適連接點。

7、適合應用于adc的蒽環(huán)類的具體實例包括(但不限于)阿霉素、柔紅霉素、新霉素和pnu-159,682。

8、適合應用于adc的喜樹堿的具體實例包括(但不限于)sn-38、依喜替康、依喜替康-s、拓撲替康、silatecan、cositecan、勒托替康、吉馬替康、貝洛替康、魯比替康、amdcpt、g-amdcpt和其他合成喜樹堿，它們的結構如圖6所示。ep0296597、wo2019/236954、wo2020/200880、wo2020/219287、cn113816969、cn113710277和us20180200273中公開了多種新型喜樹堿。

9、適合應用在adc中的烯二炔的具體實例包括(但不限于)卡奇霉素、埃斯培拉霉素、shishijimicin和namenamicin以及galm等人，chem.rev.2005,105,739-758中總結的其他烯二炔。

10、適合應用在adc中的奧瑞他汀的具體實例包括(但不限于)mmad、mmae、mmaf和pf-06380101以及maderna等人，mol.pharmaceutics?2015，12，1798-1812中總結的其他奧瑞他汀。

11、屬于ceacam亞組的7種基因在不同細胞類型上顯示出不同的表達模式，但具有結構同源性，因為它們的胞外結構域(ecd)由ig可變樣結構域和恒定樣結構域組成，如kuespert等人curr.opin.cell.biol.2006，18，565–571，和beauchemin等人，cancermetastasis?rev.2013，doi?10.1007/s10555-013-9444-6報道，見圖8。

12、基因癌胚抗原相關細胞粘附分子5(ceacam5)，又稱cd66e，是ceacam家族的創(chuàng)始成員，并且于1965年首次由gold和freedman鑒定。ceacam5編碼稱為癌胚抗原(cea)的蛋白質，參見hefta等人proc.nat.acad.sci.1988，85，4648-4652。cea是一種參與細胞粘附的糖蛋白，并且尤其在結直腸、胃、肺和子宮腫瘤細胞的表面高度表達。ceacam5?cdna編碼一種蛋白質，該蛋白質具有一個可變(v)樣結構域(被鑒定為n結構域)，隨后是三個重復單元，總共包含6個恒定c2樣結構域(稱為a1、b1、a2、b2、a3和b3，見圖8。ig結構域之前是34個氨基酸的信號肽。此外，cea?cdna結構預測形成ig折疊核心的12個半胱氨酸殘基和28個n連接糖基化位點，與純化蛋白的高碳水化合物含量一致。

13、全長人ceacam5(包括信號肽(位置1-34)和前肽(位置686-702))的參考序列可從genbank數(shù)據(jù)庫獲得，登錄號為aaa51967.1。人ceacam5的結構域組織如下：人ceacam5結構域位置

14、結構域n?35-142

15、結構域a1?143-237

16、結構域b1?238-320

17、結構域a2?321-415

18、結構域b2?416-498

19、結構域a3?499-593

20、結構域b3?594-685

21、因此，人ceacam5的a3-b3結構域由位置499至685處的氨基酸組成。

22、ceacam5在正常成人組織中表達有限，但在胃腸道癌、泌尿生殖系統(tǒng)癌和呼吸系統(tǒng)癌以及乳腺癌中過度表達，如以下報道：hammarstrom，semin.cancer?biol.1999，9，67-81。因此，ceacam5(cea)可能構成適合腫瘤特異性靶向方法、例如免疫綴合物或抗體藥物綴合物(adc)的治療靶點。

23、在健康成人中，血清中的循環(huán)cea幾乎檢測不到(<5ng/ml)，但會直接或通過淋巴管從腫瘤中脫落，并且然后在血清中檢測到。由于這一特性，血清cea水平已被用作診斷癌癥和篩查癌癥復發(fā)的臨床標志物，該癌癥特別是結直腸癌(goldenberg等人，int.j.biol.mark.1992，7，183-188；chau等人j.clin.oncol.2004，22，1420-1429；flamini等人clin.cancer?res.2006，12，6985-6988。

24、相對于正常組織中的cea的高腫瘤表達水平，使得這種糖蛋白成為單克隆抗體靶向治療策略的有吸引力的受體。因此，已經產生了多種針對cea的單克隆抗體，并在各種情況下進行人源化，用于研究目的、作為診斷工具和用于治療目的，參見例如總結抗cea抗體的各種評論，例如，nap等人，cancer?res.1992，52，2329-2339；sheahan等人，am.j.clin.path.1990，94，157-164?？筩ea抗體具體報道：us9,695,250(a5/a240vl和d8/a240vl)；richman等人，int.j.cancer?1987，39，317-32，stewart等人，cancerimmunol.immunother.1999，47，299-306，ashraf等人，br.j.canc.2009，101，1758-1768，wo199506067和ep0721470(pr1a3)，bacac等人clin.canc.res.2016，22，3286-3297，us8,642,742和us9,068,008(基于vh?ch1a1a/ch7a或ch1a1b/ch7a和vl?pac18/2f1的抗體)；wo2021053587(ab17、ab72和ab73)；us9,068,008；sakurai等人，j.surg.oncol.，1989，42，39-46(抗體ncc-co-413，308，432，411)；harwood等人，br.j.cancer.1982，54，72；ledermann，br.j.cancer，1988，58，654；pedley等人，br.j.cancer，1993，68，69-73；boxer等人，br.j.cancer，1992，65，825-831和us8,394,926(抗體a5b7)；baek等人canc.lett.2022，525，97-107(抗體1g9)；hansen等人，cancer?1993，71，347，us5,874,540及其人源化形式，如us7,803,372、us8,778,342、wo2004032857a2和wo2015069430a2中所述(hmn-14或拉貝珠單抗)；us7,776,330(源自鼠t84.66的抗體m5a和m5b)。chester等人從噬菌體展示文庫中分離出單鏈抗cea抗體(mfe-23)，用于放射免疫檢測和放射免疫治療(us5,876,691)，并且隨后將該抗體人源化(為sm3e)，如us7,232,888和us20050147614中所述)。shinmi等人canc.med.2017，6，798-808和iwano等人drug?metab.dispos.2019，47，1240-1246已經分離并用于靶向化療的抗cea抗體12-140-1和15-1-32?？筩ea抗體cea6和其他變體cea1-cea5和cea7(源自vh序列t06d10、hba11、hbb11、hbb6和vl序列t06d4、t06d8、t06d12)已從人噬菌體展示文庫獲得(wo1997020932a1和us5,872,215)?？筩ea抗體769-cea-4通過免疫產生并人源化，如us9,617,345和us10,457,739中所述(特賽妥單抗或sar408377)。micromet的mt111抗體(也稱為medlmmune的medi-565抗體)是一種基于a5b7的雙特異性抗體，用于結合人ceacam5和人cd3，如peng等人，plos?one?2012，7，e3641和wo2007071426報道。

25、另一個ceacam家族成員ceacam6(也稱為cd66c)編碼稱為nca-90的蛋白質。ceacam6是一種非特異性交叉反應糖蛋白抗原，與ceacam5共享一些抗原決定簇，如kuroki等人在以下中所述：biochem.biophys.res.comm.1992，182，501-506。ceacam6也在來自各種器官的粒細胞和上皮細胞上表達，并且與正常粘膜相比，在增生性結腸息肉和腺瘤的增殖細胞中具有更廣泛的表達區(qū)域，并且被許多人癌癥表達。發(fā)現(xiàn)肺癌、胰腺癌、乳腺癌、結直腸癌和肝細胞癌患者的nca-90血清水平相對較高。ceacam6的量與ceacam5表達的量不相關，如kuroki等人在以下中所述：anticancer.res.1999，19，5599-5606。除了結構同源性之外，ceacam還具有序列相似性，特別是ceacam5和ceacam6的ecd具有85.7％的序列同一性。

26、針對ceacam6的治療性抗體是本領域已知的。有些對人ceacam6沒有選擇性(例如來自neogenix的immunomedics?mn-3、neo201/h16c3；兩者也與人ceacam5結合)。單域抗體2a3及其融合突變體(wo2012040824和niu等人，j.contr.rel.2012，10，18-24)尚未表征對于猴ceacam5的選擇性和交叉反應性。小鼠抗體9a6(genovac/aldevron)是唯一被描述能夠調節(jié)ceacam6免疫抑制活性的抗體(witzens-harig等人blood?2013，121，4493-4503)。wo2016150899中公開了用于癌癥免疫治療的有效抗cecam6抗體，包括tpp-3310。

27、靶向ceacam5的adc是本領域已知的。例如，govindan等人clin.canc.res.2009，15，6052-6061報道了一種名為拉貝珠單抗-govetican的adc的臨床前和臨床評估，該adc是通過使用帶有sn-38有效載荷的cl2a接頭藥物修飾hmn-14獲得的。此外，shinmi等人canc.med.2017，6，798-808和iwano等人drug?metab.dispos.2019，47，1240-1246對基于抗體12-140-1和15-1-32的與mmae有效載荷綴合的抗cea?adc進行了臨床前評估。第三，decary等人clin.canc.res.2020，26，6589-6599報道了用dm4有效載荷衍生的抗cea抗體sar408377的衍生化和臨床評估，這種adc稱為sar408701或特賽妥單抗-ravtansine。

28、針對ceacam6的adc是本領域已知的，例如以下報道的美登木素生物堿抗ceacam6抗體：genentech?strickland等人，j.pathol.2009，218，380，其在一項非人靈長類動物研究中顯示可誘導ceacam6依賴性造血毒性。這種毒性歸因于抗體藥物綴合物在骨髓中的積累以及粒細胞及其細胞前體的消耗，作者認為這是一個主要的安全問題。

技術實現(xiàn)思路

1、發(fā)明人已經開發(fā)出非常適合靶向表達cea的細胞、特別是腫瘤的抗體綴合物。因此，根據(jù)本發(fā)明的抗體綴合物非常適合治療cea陽性癌癥，尤其是結直腸癌、胃癌、肺癌、子宮癌或胰腺癌。

2、在第一方面，本發(fā)明涉及抗體綴合物。與此相關，在第二方面，本發(fā)明涉及用于制備根據(jù)本發(fā)明的抗體綴合物的方法。在第三方面，本發(fā)明涉及用于靶向表達cea的細胞的方法。與之相關的是根據(jù)本發(fā)明的抗體綴合物的第一醫(yī)藥用途，以及用于治療癌癥的第二醫(yī)藥用途。在最后一個方面，本發(fā)明涉及用于增加抗體綴合物在表達cea的腫瘤的治療中的治療指數(shù)的綴合模式的用途。