本發(fā)明涉及dna存儲，尤其涉及一種納米孔測序快速讀出短片段的dna存儲方法。

背景技術(shù)：

1、隨著信息技術(shù)的數(shù)字化、網(wǎng)絡(luò)化、智能化趨勢不斷深化，數(shù)據(jù)量呈現(xiàn)爆發(fā)式增長。傳統(tǒng)的介質(zhì)面臨成本、能耗等諸多挑戰(zhàn)，無法滿足快速增長的數(shù)據(jù)存儲需求。dna數(shù)據(jù)存儲具有超高物理存儲密度、介質(zhì)長期穩(wěn)定性，已經(jīng)成為一個非常有潛力的未來存儲介質(zhì)。隨著dna高通量合成技術(shù)與測序技術(shù)的快速發(fā)展，利用dna序列存儲數(shù)字信息，并從測序讀段中恢復(fù)原始數(shù)字信息，已經(jīng)具備技術(shù)可行性。2021年美國半導(dǎo)體產(chǎn)業(yè)學(xué)會發(fā)布《半導(dǎo)體10年計(jì)劃》，dna存儲成為未來大量數(shù)據(jù)存儲的四種主要介質(zhì)之一。dna是一種生物大分子，具有良好的穩(wěn)定性。與現(xiàn)有的磁、光、電為介質(zhì)的存儲媒介相比，dna作為數(shù)據(jù)存儲介質(zhì)具有體積小、密度大，介質(zhì)可用時間持久等特點(diǎn)。在密度方面，哥倫比亞大學(xué)在science發(fā)表論文證實(shí)dna的存儲密度可以達(dá)到215pb/g；天津大學(xué)采用復(fù)雜度更低的乘積編碼，合成27萬多條短鏈dna，實(shí)現(xiàn)了dna數(shù)據(jù)存儲密度125pb/g(《中國科學(xué)·生命科學(xué)》，2020)。在存儲穩(wěn)定性方面，grass等證實(shí)若將編碼信息的dna封裝在二氧化硅等材料中則可以保存數(shù)千年。

2、dna數(shù)據(jù)存儲是采用現(xiàn)代信息編碼技術(shù)將二進(jìn)制數(shù)字信息轉(zhuǎn)化為dna序列，通過高通量dna合成實(shí)現(xiàn)數(shù)據(jù)寫入實(shí)體的dna，通過高通量dna測序技術(shù)實(shí)現(xiàn)大量dna分子的并行讀出。其介質(zhì)的存儲形態(tài)為寡核苷酸池，可以以干粉、溶液或者其他強(qiáng)化封裝的形式實(shí)現(xiàn)介質(zhì)保存。數(shù)據(jù)讀出時一般采用二代高通量測序如illumina、ion?torrent平臺，均基于邊合成邊測序技術(shù)，測序過程耗時。而第三代納米孔測序可實(shí)現(xiàn)實(shí)時單分子測序r10芯片以每秒400個堿基的速率讀出，可以快速讀出短片段dna序列。近年來，隨著固態(tài)納米孔技術(shù)的快速發(fā)展，由于納米孔測序的通量不斷提高，采用納米孔實(shí)現(xiàn)大規(guī)模dna分子池的快速讀出成為一種非?？尚械姆桨?。

3、但是，納米孔測序具有較高的初始錯誤率，包括：難以處理的堿基插入刪節(jié)錯誤。yazdi等采用一種針對長片段dna序列的約束編碼和均聚物校驗(yàn)碼的編碼方案，在200×測序覆蓋度下實(shí)現(xiàn)數(shù)據(jù)無錯恢復(fù)。天津大學(xué)提出一種ldpc碼疊加偽隨機(jī)序列構(gòu)造的水印碼，該方法針對長度為254kb的酵母人工染色體，利用前向-后向算法計(jì)算偏移路徑，識別并糾正堿基的插入刪節(jié)錯誤，在16.8×測序覆蓋度下可恢復(fù)數(shù)據(jù)。該方法基于水印與稀疏化編碼的方法，可糾正大量的插入與刪節(jié)方法，是一種系統(tǒng)化的方法，研究者實(shí)現(xiàn)了利用納米孔快速測序讀出存儲在一條長度為254kb的酵母人工染色體中的數(shù)據(jù)。press等開發(fā)一種級聯(lián)碼編碼方案，內(nèi)碼為貪婪搜索解碼的哈希編碼(hedges)，也可以用于糾正插入刪節(jié)錯誤，但是該方法沒有在三代納米孔測序的試劑環(huán)境進(jìn)行測試。

4、針對納米孔測序，研究者提出一種滾環(huán)連環(huán)共識(r2c2)方法，可生成高準(zhǔn)確性的納米孔測序共識序列。微軟的研究者利用聚合酶鏈反應(yīng)和gibson組裝技術(shù)將短片段dna序列組裝成大的dna片段，該方法在22×測序覆蓋度下實(shí)現(xiàn)數(shù)據(jù)恢復(fù)，但復(fù)雜的樣本制備降低了dna數(shù)據(jù)存儲的實(shí)用性。然而，利用納米孔測序直接對短片段dna序列進(jìn)行測序讀出尚無有效方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明提供了一種納米孔測序快速讀出短片段的dna存儲方法，本發(fā)明對納米孔測序得到的測序讀段副本執(zhí)行基于概率的多序列合并，實(shí)現(xiàn)了數(shù)據(jù)快速、無錯恢復(fù)，詳見下文描述：

2、一種納米孔測序快速讀出短片段的dna存儲方法，所述方法包括以下步驟：

3、(1)將待存儲的數(shù)據(jù)采用分組糾錯碼c1(n1,k1)進(jìn)行編碼，k1為待存儲數(shù)據(jù)長度，n1為分組糾錯碼碼字長度，碼字交織后進(jìn)行分段，將部分分段碼字稀疏化后序列疊加偽噪聲序列，組合等長的另外分段，按照預(yù)設(shè)的映射規(guī)則映射為數(shù)據(jù)dna序列，標(biāo)號部分采用偽隨機(jī)序列伴隨的短分組糾錯碼c2(n2,k2)，k2為標(biāo)號部分編碼前的比特長度，n2為短分組糾錯碼碼字長度，標(biāo)號范圍為為區(qū)分?jǐn)?shù)據(jù)塊，編碼dna序列兩端分別添加引物序列；

4、(2)合成后的寡核苷酸池進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)實(shí)現(xiàn)樣本擴(kuò)增，對dna樣本進(jìn)行建庫和三代測序；

5、(3)識別測序讀段的雙端引物，截取讀段有效的數(shù)據(jù)部分，利用標(biāo)號部分的水印序列w2循環(huán)移位識別并糾正標(biāo)號序列中的插入刪節(jié)錯誤，標(biāo)號識別用于讀段分簇，簇內(nèi)每條讀段解映射為雙層比特序列，其中上層比特序列集合為r，下層比特序列集合為s，利用數(shù)據(jù)部分水印序列w1推導(dǎo)簇內(nèi)上層比特序列的編碼碼字概率v，并基于多概率合并的方式實(shí)現(xiàn)多序列合并，修正插入刪節(jié)錯誤，得到一致性上層序列，將其用于修正簇內(nèi)下層比特序列，得到一致性下層序列，將修正后的碼字送入譯碼器執(zhí)行軟判決糾錯譯碼，恢復(fù)原始數(shù)據(jù)。

6、其中，所述步驟(1)的具體為：

7、(1.1)采用分組糾錯碼c1(n1,k1)對長度為k1的待存儲數(shù)據(jù)進(jìn)行編碼，生成長度為n1的碼字序列，長度為n1的碼字序列交織后，分為長度相等的p段；

8、(1.2)分段碼字分割為上下兩層比特序列，上層比特序列長度為4m，下層比特序列長度為5m，將上層比特序列按照4比特轉(zhuǎn)5比特的方式稀疏化處理，然后疊加等長的水印序列，n1為9m的整數(shù)倍；

9、(1.3)按照映射規(guī)則：00→a，01→t，10→g，11→c將上層比特序列與下層比特序列映射為編碼dna序列；

10、(1.4)采用短分組糾錯碼c2(n2,k2)對范圍為的標(biāo)號進(jìn)行編碼，k2為標(biāo)號部分編碼前的比特長度，n2為短分組糾錯碼碼字長度，編碼后的碼字序列與水印序列按照與步驟(1.3)相同的映射規(guī)則，得到具有強(qiáng)糾錯能力的標(biāo)號dna序列；

11、(1.5)添加標(biāo)號dna序列到數(shù)據(jù)dna序列左端，并在兩端添加用于擴(kuò)增的引物序列。

12、其中，所述步驟(3)的具體步驟為：

13、(3.1)根據(jù)讀段與雙端引物的編輯距離，篩選測序讀段，截取位于兩端引物間的標(biāo)號部分和數(shù)據(jù)部分，將標(biāo)號部分解映射得到對應(yīng)已知偽隨機(jī)序列的部分，利用循環(huán)移位和動態(tài)規(guī)劃識別并修正標(biāo)號部分的插入、刪節(jié)錯誤后執(zhí)行糾錯譯碼，將測序讀段分簇；

14、(3.2)將簇內(nèi)c個讀段副本解映射為雙層比特序列，其中上層比特序列集合r＝{r1,r2,…,rc}，下層比特序列集合s＝{s1,s2,…,sc}，從集合r依次取ri作為觀測向量，結(jié)合水印序列w1，執(zhí)行基于隱馬爾可夫模型的前向-后向算法，估計(jì)每個狀態(tài)的前向度量和后向度量，以及包含符號軟信息的中間度量，輸出簇內(nèi)c個讀段的長度一致的符號概率結(jié)果v＝{v1,v2,…,vc}，進(jìn)一步利用基于概率合并的多序列合并策略，得到簇內(nèi)共識符號概率vc，依據(jù)每個符號位置的最大可能概率，推斷上層符號，得到共識上層比特序列；

15、(3.3)將糾錯后的共識上層比特序列與簇內(nèi)c個讀段得到的上層比特序列集合比對，識別錯誤位置，依次修正下層比特序列集合的插入刪節(jié)錯誤，將簇內(nèi)修正后的下層比特序列執(zhí)行多數(shù)投票判決得到共識下層比特序列，與糾錯后的上層比特序列拼接，生成軟判決譯碼的概率信息，執(zhí)行糾錯譯碼，恢復(fù)原始數(shù)據(jù)。

16、其中，所述步驟(3.1)的具體步驟為：

17、(3.1.1)將測序讀段與設(shè)計(jì)的雙端引物進(jìn)行比對，篩選測序讀段，并確定雙端引物在測序讀段中的邊界位置；

18、(3.1.2)截取標(biāo)號部分，利用相關(guān)檢測識別水印序列窗口，將與窗口對應(yīng)的標(biāo)號序列解映射得到受損的水印序列r0和受損的標(biāo)號比特序列s0；

19、(3.1.3)將受損的水印序列r0和無錯的水印序列w2依次循環(huán)移位，利用動態(tài)規(guī)劃識別插入刪節(jié)位置，用于對應(yīng)修正受損的標(biāo)號比特序列s0，修正后的結(jié)果執(zhí)行糾錯譯碼，據(jù)此將讀段分簇。

20、其中，所述步驟(3.2)的具體步驟為：

21、(3.2.1)根據(jù)納米孔測序的錯誤特性，估計(jì)測序讀段插入錯誤概率p，刪除錯誤概率

22、i?pd，和替代錯誤概率ps構(gòu)建錯誤傳輸模型，上層讀出序列ri，i∈[1,c]，作為觀測向量，堿基偏移量作為隱藏狀態(tài)，執(zhí)行基于隱馬爾可夫模型的前向-后向算法，估計(jì)每個狀態(tài)的前向度量和后向度量，以及包含符號軟信息的中間度量；

23、(3.2.2)對于長度為n的dna序列，符號個數(shù)為n/5，利用軟判決的前向-后向算法，計(jì)算簇內(nèi)每條讀段的符號概率分布v＝{p1,p2,…,pn/5}，其中pj為第j個符號的概率分布，pj＝(pj,0,pj,1...,pj,k)，

24、(3.2.3)根據(jù)每一簇內(nèi)計(jì)算的概率信息v＝{v1,v2,…,vc}，對應(yīng)位置依次相乘并歸一化，輸出每一簇合并后的共識符號概率vc＝{p1′,p2′,…,pn/5′}，其中pj′為第j個符號的概率分布，pj′＝(pj,0′,pj,1′...,pj,k′)，

25、(3.2.4)依據(jù)每個符號位置的最大可能概率max(pj,0′,pj,1′,…,pj,15′)，推斷上層符號序列，得到共識上層比特序列。

26、其中，所述步驟(3.3)的具體步驟為：

27、(3.3.1)將糾錯后的共識上層比特序列與簇內(nèi)c個測序讀段解映射的原始攜帶錯誤的上層比特序列進(jìn)行比對，識別每條讀段發(fā)生插入刪除錯誤的位置；

28、(3.3.2)根據(jù)識別出的插入刪節(jié)錯誤位置，輔助修正對應(yīng)下層的受損碼字序列，將簇內(nèi)所有修正后的下層比特序列執(zhí)行多數(shù)投票判決，計(jì)算得到共識下層比特序列；

29、(3.3.3)組合共識上層比特序列和共識下層比特序列，計(jì)算用于軟判決譯碼的概率軟信息；

30、(3.3.4)將概率軟信息送入譯碼器，執(zhí)行對數(shù)域置信傳播碼算法，糾正剩余的替代錯誤，得到譯碼碼字，恢復(fù)原始數(shù)據(jù)。

31、本發(fā)明提供的技術(shù)方案的有益效果是：

32、1、本發(fā)明利用一種數(shù)據(jù)部分具有高編碼效率，標(biāo)號部分具有強(qiáng)糾錯能力的編碼策略，將數(shù)據(jù)文件編碼成dna序列；合成寡核苷酸池作為數(shù)據(jù)存儲介質(zhì)，利用納米孔測序快速獲取測序讀段；利用雙端引物識別與高可靠的標(biāo)號識別實(shí)現(xiàn)測序讀段快速分簇；

33、2、本發(fā)明針對高插入刪節(jié)錯誤問題，利用軟判決前向-后向算法計(jì)算的符號概率，實(shí)現(xiàn)基于概率的多序列合并，使糾錯算法能夠更準(zhǔn)確地發(fā)揮作用；

34、3、本發(fā)明為寡核苷酸池存儲使用納米孔測序技術(shù)實(shí)現(xiàn)快速讀出提供了解決方案。